CN109310764A - 高亲和力b7-h6抗体和抗体片段 - Google Patents

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Abstract

在一些实施方案中，本文提供了特异性结合B7同源物6的抗体、抗原结合抗体片段、嵌合抗原受体(CAR)和双特异性T细胞衔接物(BiTE)。本文还提供了使用其的方法和包含其的细胞。

Description

高亲和力B7-H6抗体和抗体片段
相关申请
本申请依照35U.S.C.§119(e)要求2016年4月15日申请的美国临时申请号62/323,039的权益，所述申请以其整体通过引用并入本文。
联邦资助的研究
本发明在美国国立卫生研究院授予的P30GM103415下的政府支持进行。政府在本发明中具有某些权利。
背景
B7配体在许多不同细胞类型(包括抗原呈递细胞(APC))的细胞表面上表达。B7配体与T细胞上的受体分子的相互作用提供调节T细胞活化和耐受的活化信号或抑制性信号。一些抑制性B7配体也在肿瘤细胞上表达，导致免疫应答的抑制。刺激或减弱B7配体及其受体的相互作用对于自身免疫性疾病和癌症具有治疗潜能。B7同源物6(B7-H6)是NK细胞-活化受体NKp30的特异性配体。B7-H6在各种类型的原发性人类肿瘤(包括白血病、淋巴瘤和胃肠道间质瘤)上表达，但其不在正常组织上组成型表达。
概述
本文提供了特异性结合B7同源物6(B7-H6)的抗体和抗原结合抗体片段，并且在一些实施方案中，相对于先前可得的特异性结合B7-H6的抗体和抗原结合抗体片段具有更高的亲和力。此外，本公开的抗体和抗原结合抗体片段结合B7-H6的表位，其不同于先前可得的特异性结合B7-H6的抗体结合的表位。应当理解，除非另有说明，术语“抗体”涵盖结合抗原抗体片段。因此，如果一个实施方案涵盖具有特定特性的抗体，应当理解，相同的实施方案还涵盖具有相同特定特性的抗原结合抗体片段。
特异性结合B7-H6的scFv分子的实例提供于图2和表2中。
scFv g2.5-9的特征在于SEQ ID NO:1-9，其中SEQ ID NO:1是完整scFv g2.5-9氨基酸序列(包括重链和轻链)，SEQ ID NO:2是完整scFv g2.5-9重链序列，SEQ ID NO:3是完整scFv g2.5-9轻链序列，SEQ ID NO:4是scFv g2.5-9重链的CDR1序列，SEQ ID NO:5是scFv g2.5-9重链的CDR2序列，SEQ ID NO:6是scFv g2.5-9重链的CDR3序列，SEQ ID NO:7是scFv g2.5-9轻链的CDR1序列，SEQ ID NO:8是scFv g2.5-9轻链的CDR2序列，且SEQ IDNO:9是scFv g2.5-9轻链的CDR3序列。
scFv g2.5-6的特征在于SEQ ID NO:10-18，其中SEQ ID NO:10是完整scFv g2.5-6氨基酸序列(包括重链和轻链)，SEQ ID NO:11是完整scFv g2.5-6重链序列，SEQ ID NO:12是完整scFv g2.5-6轻链序列，SEQ ID NO:13是scFv g2.5-6重链的CDR1序列，SEQ IDNO:14是scFv g2.5-6重链的CDR2序列，SEQ ID NO:15是scFv g2.5-6重链的CDR3序列，SEQID NO:16是scFv g2.5-6轻链的CDR1序列，SEQ ID NO:17是scFv g2.5-6轻链的CDR2序列，且SEQ ID NO:18是scFv g2.5-6轻链的CDR3序列。
scFv g2.5-3的特征在于SEQ ID NO:19-27，其中SEQ ID NO:19是完整scFv g2.5-3氨基酸序列(包括重链和轻链)，SEQ ID NO:20是完整scFv g2.5-3重链序列，SEQ ID NO:21是完整scFv g2.5-3轻链序列，SEQ ID NO:22是scFv g2.5-3重链的CDR1序列，SEQ IDNO:23是scFv g2.5-3重链的CDR2序列，SEQ ID NO:24是scFv g2.5-3重链的CDR3序列，SEQID NO:25是scFv g2.5-3轻链的CDR1序列，SEQ ID NO:26是scFv g2.5-3轻链的CDR2序列，且SEQ ID NO:27是scFv g2.5-3轻链的CDR3序列。
scFv g2.5-1的特征在于SEQ ID NO:28-36，其中SEQ ID NO:28是完整scFv g2.5-1氨基酸序列(包括重链和轻链)，SEQ ID NO:29是完整scFv g2.5-1重链序列，SEQ ID NO:30是完整scFv g2.5-1轻链序列，SEQ ID NO:31是scFv g2.5-1重链的CDR1序列，SEQ IDNO:32是scFv g2.5-1重链的CDR2序列，SEQ ID NO:33是scFv g2.5-1重链的CDR3序列，SEQID NO:34是scFv g2.5-1轻链的CDR1序列，SEQ ID NO:35是scFv g2.5-1轻链的CDR2序列，且SEQ ID NO:36是scFv g2.5-1轻链的CDR3序列。
因此，在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段特异性结合B7-H6且包含(a)重链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:4的CDR1、(ii)SEQ ID NO:5的CDR2和(iii)SEQ ID NO:6的CDR3，和(b)轻链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:7的CDR1、(ii)SEQ ID NO:8的CDR2和(iii)SEQ ID NO:9的CDR3。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:2的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:3的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段特异性结合B7-H6且包含(a)重链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:13的CDR1、(ii)SEQ ID NO:14的CDR2和(iii)SEQ ID NO:15的CDR3，和(b)轻链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:16的CDR1、(ii)SEQ ID NO:17的CDR2和(iii)SEQ ID NO:18的CDR3。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:11的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:12的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段特异性结合B7-H6且包含(a)重链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:22的CDR1、(ii)SEQ ID NO:23的CDR2和(iii)SEQ ID NO:24的CDR3，和(b)轻链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:25的CDR1、(ii)SEQ ID NO:26的CDR2和(iii)SEQ ID NO:27的CDR3。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:20的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:21的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段特异性结合B7-H6且包含(a)重链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:31的CDR1、(ii)SEQ ID NO:32的CDR2和(iii)SEQ ID NO:33的CDR3，和(b)轻链可变区，其包含(i)SEQ ID NO:34的CDR1、(ii)SEQ ID NO:35的CDR2和(iii)SEQ ID NO:36的CDR3。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:29的重链可变结构域。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:30的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段具有重链可变区，其包括与SEQ IDNO:2、11、20或29同一(相同)的氨基酸序列。在其它实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段具有重链可变区，其包括与SEQ ID NO:2、11、20或29具有至少90％同一性的氨基酸序列。例如，与SEQ ID NO:2、11、20或29共有90％同一性的重链可变区可以包括SEQ ID NO:2、11、20或29中(至少一个)框架区中的(至少一个)突变。框架区是重链(或轻链)的区域，其不对应于CDR区域。
因此，在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段包含(a)包含氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:2、11、20或29相同(具有100％同一性)，或(ii)与SEQ ID NO:2、11、20或29具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由分别SEQ ID NO:2、11、20或29中至少一个框架区中的至少一个突变组成，和(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:3、12、21或30相同，或(ii)与SEQ ID NO:33、12、21或30具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由分别SEQ ID NO:3、12、21或30中至少一个框架区中的至少一个突变组成。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含与SEQ IDNO:2、11、20或29具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列，且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3、12、21或30具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:2相同，或(ii)与SEQ ID NO:2具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由SEQ ID NO:2中至少一个框架区中的至少一个突变组成，且(b)所述轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:3相同，或(ii)与SEQ ID NO:3具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由SEQ ID NO:3中至少一个框架区中的至少一个突变组成。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列，且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列，且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:11相同，或(ii)与SEQ ID NO:11具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由SEQ ID NO:11中至少一个框架区中的至少一个突变组成，且(b)所述轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:12相同，或(ii)与SEQ ID NO:12具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由SEQ ID NO:12中至少一个框架区中的至少一个突变组成。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:11相同的氨基酸序列，且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:12相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:11具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列，且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:12具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:20相同，或(ii)与SEQ ID NO:20具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由SEQ ID NO:20中至少一个框架区中的至少一个突变组成，且(b)所述轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:21相同，或(ii)与SEQ ID NO:21具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由SEQ ID NO:21中至少一个框架区中的至少一个突变组成。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:20相同的氨基酸序列，且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:21相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:20具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列，且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:21具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:29相同，或(ii)与SEQ ID NO:29具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由SEQ ID NO:29中至少一个框架区中的至少一个突变组成，且(b)所述轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:30相同，或(ii)与SEQ ID NO:30具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由SEQ ID NO:30中至少一个框架区中的至少一个突变组成。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:29相同的氨基酸序列，且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:30相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:29具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列，且(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:30具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列。
本文还提供了重组T细胞，其包含本公开的特异性结合B7-H6的抗体或抗原结合抗体片段。
本文进一步提供了药物组合物，其包含本公开的特异性结合B7-H6的抗体或抗原结合抗体片段。
在一些实施方案中，本文还提供了试剂盒，其包含本公开的特异性结合B7-H6的抗体或抗原结合抗体片段。
在一些实施方案中，本文提供了嵌合抗原受体，其包含(a)本公开的特异性结合B7-H6的抗原结合抗体片段，(b)跨膜结构域，和(c)胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，重组T细胞包含嵌合抗原受体，其包含本公开的特异性结合B7-H6的抗原结合抗体片段，(b)跨膜结构域，和(c)胞内T-细胞受体信号传导结构域。
本文还提供了双特异性T-细胞衔接物，其包含(a)本公开的特异性结合B7-H6的抗原结合抗体片段，和(b)结合T-细胞抗原的抗原结合结构域。
本公开的一些实施方案提供了在受试者中杀死表达B7同源物6的细胞或抑制表达B7同源物6的细胞的生长的方法，其包括施用有效量的本发明的特异性结合B7-H6的抗体或抗原结合抗体片段，由此在受试者中杀死表达B7-H6的细胞或抑制表达B7-H6的细胞的生长。
本公开的一些实施方案提供了减少受试者中表达B7同源物6的癌细胞的生长的方法，所述方法包括向具有表达B7同源物6的癌细胞的受试者施用有效量的本公开的特异性结合B7-H6的抗体或抗原结合抗体片段。
附图简述
图1是显示酵母展示的scFv与可溶性B7H6-Ig抗原的结合表明纳摩尔范围内的大量文库KD的图。荧光团APC和PE分别反映表达标签和抗原结合信号。显示对于抗原结合(PE+)和表达和抗原结合两者(APC+PE+)门控的文库群体的图。对于双阳性vs.单阳性门没有观察到显著差异。
图2显示分离的B7H6scFv序列比对。显示不同的分离克隆g2.5-9scFv(SEQ ID NO:1)、g2.5-6scFv(SEQ ID NO:10)、g2.5-3scFv(SEQ ID NO:19)和g2.5-1scFv(SEQ ID NO:28)与共有序列(SEQ ID NO:37)的比较。注释如通过VBASE2定义的CDR。
图3A显示代表性分离物g2.5-11scFv-Fc(在氨基酸水平上等效于g2.5-3)与表达抗原的RMA-B7H6和阴性对照RMA细胞的细胞结合曲线。图3B显示图3中呈现的滴定曲线的原始流式细胞术数据，表明RMA-B7H6在单一浓度(500nM)下对RMA的特异性。
图4A和4B显示针对g2.5-11scFV-Fc和鼠TZ47与RMA-B7H6细胞的结合的竞争性测定的结果。图4A显示g2.5-11的染色且图4B显示TZ47的染色(通过FITC测量)。
图5显示通过Octet BioLayer干涉测量(BLI)测量法显示g2.5-11scFV-Fc与可溶性抗原B7H6Ig的结合。全局拟合动力学常数如下：KD＝2.57E-08M(25.7nM)，R2＝0.996178，Kon＝1.37E+4/Ms，和Kdis＝3.50E-04.
图6显示转导和选择之后第8天分析的转导的鼠T细胞上CD4和CD3的表达。T细胞上的CD19表达指示病毒转导。
图7显示如通过ELISA测定的无细胞培养基中IFN-γ的量。将T细胞与培养基、RMA或RMA-B7H6肿瘤细胞共培养过夜。B7H6特异性CAR用作T细胞上的阳性对照(pos ctrlCAR)，并测试g2.5-6CD28-3z CAR。
图8A和8B显示具有CD3ζ胞质结构域和CD28共刺激结构域、Dap10共刺激结构域或4-1BB共刺激结构域的g2.5-6CAR T细胞在RMA B7H6肿瘤细胞存在的情况下表现出抗肿瘤裂解活性(图8A)，但在RMA细胞存在的情况下则不是如此(图8B)。
描述
本文提供了特异性结合B7同源物6(B7-H6)的抗体和抗原结合抗体片段，所述B7同源物6(B7-H6)在各种类型的原发性人类肿瘤(包括白血病、淋巴瘤和胃肠道间质瘤)上表达。例如，抗原结合抗体片段显示以大于先前可得的抗-B7-H6抗体的亲和力结合B7-H6，并显示结合的表位不同于先前可得的抗-B7-H6抗体结合的表位。在一些实施方案中，如本文提供的抗原结合抗体片段用于产生嵌合抗原受体和双特异性T细胞衔接物(BiTE)，其用于例如治疗癌症和自身免疫性病症。
特异性结合B7-H6的scFv抗体片段的实例提供于图2和表2中。图2显示四种不同scFV抗体片段相对于共有序列(SEQ ID NO:37)的氨基酸比对。本公开涵盖图2和表2的scFV抗体片段的B7-H6结合变体。
“特异性结合”B7-H6或其它靶标或表位的抗体或抗原结合结构域(例如，scFV)是本领域中理解的术语，并且确定这种特异性结合的方法也是本领域已知的。如果分子与特定靶抗原的反应或缔合比其与替代靶标的反应或缔合相比更频繁、更快速且持续时间更长和/或亲和力更大，则其被称为表现出“特异性结合”。特异性结合第一靶抗原的抗原结合结构域(例如，scFV)可以或可以不特异性结合第二靶抗原。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可以包括)排他性结合。
在一些实施方案中，特异性结合B7-H6的抗体和抗原结合抗体片段具有SEQ IDNO:2、11、20或29的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合B7-H6的抗体和抗原结合抗体片段具有与SEQ ID NO:2、11、20或29具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合B7-H6的抗体和抗原结合抗体片段具有SEQ ID NO:3、12、21或30的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合B7-H6的抗体和抗原结合抗体片段具有与SEQ ID NO:3、12、21或30具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的重链可变(VH)区具有SEQ ID NO:4、13、22或31的CDR1序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的重链可变(VH)区具有与SEQ ID NO:4、13、22或31具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的CDR1序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的重链可变区具有SEQID NO:5、14、23或32的CDR2序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:5、14、23或32具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的CDR2序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的重链可变区具有SEQID NO:6、15、24或33的CDR3序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:6、15、24或33具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的CDR3序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:7、16、25或34的CDR1序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的轻链可变(VL)区具有与SEQ ID NO:7、16、25或34具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的CDR1序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:8、17、26或35的CDR2序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的轻链可变(VL)区具有与SEQ ID NO:8、17、26或35具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的CDR2序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的轻链可变(VL)区具有SEQ ID NO:9、18、27或36的CDR3序列。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的轻链可变(VL)区具有与SEQ ID NO:9、18、27或36具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的CDR3序列。
本文还提供了图2和表2中提供的scFv抗体片段的功能变体。因此，在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的重链可变区与SEQ ID NO:2、11、20或29具有至少80％(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性。在一些实施方案中，抗体或抗体片段的重链可变区与SEQ ID NO:2、11、20或29具有至少80％(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由分别SEQ ID NO:2、11、20或29中至少一个框架区中的至少一个突变组成。
在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段的轻链可变区与SEQ ID NO:33、12、21或30具有至少80％(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性。在一些实施方案中，抗体或抗体片段的轻链可变区与SEQ ID NO:33、12、21或30具有至少80％(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性且由分别SEQ ID NO:3、12、21或30中至少一个框架区中的至少一个突变组成。
功能变体能够结合B7-H6分子，特别是人B7-H6分子。在一些实施方案中，所述变体相对于图2和表2中提供的B7-H6scFv具有相似的抗原结合亲和力(例如，所述变体和B7H6之间的KD是100pM至1μM)。
在一些实施方案中，上述功能变体在VH的框架区(FR)中相对于SEQ ID NO:2、11、20或29含有一个或多个突变(例如，保守取代)。在一些实施方案中，上述功能变体在FR VL中相对于SEQ ID NO:33、12、21或30含有一个或多个突变(例如，保守取代)。在一些实施方案中，这些突变不发生在经预测与CDR中的一个或多个相互作用的残基处。FR内的突变不可能影响抗体或抗原结合抗体片段的抗原结合活性。在一些实施方案中，本文所述的功能变体在CDR区中的至少一个内含有至少一个(例如，1、2或3个)突变。在一些实施方案中，这些功能变体保留与亲本相同的负责抗原结合的区域/残基，诸如相同的CDR内的特异性决定残基。
两个氨基酸序列的“百分比同一性”可以使用Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990(如Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中所修订)的算法来确定。将这种算法并入Altschul,等人.J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中。例如，可以用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与目标蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在缺口的情况下，可以利用Gapped BLAST，例如，如Altschul等人,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述。在一些实施方案中，当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本文提供了全长抗体和抗原结合抗体片段(包括单链抗体)。在一些实施方案中，特异性结合B7-H6的抗体片段是scFV抗体片段。抗体片段的其它实例包括但不限于F(ab)2、Fv、scFv、F(ab′)2、F(ab)、VL、VH、dsFv、Fv、scFv-Fc、(scFv)2、双抗体和二价抗体。
抗体(或抗原结合抗体片段)可以是，例如，多克隆、单克隆、重组、嵌合或人源化的。在一些实施方案中，抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM同种型。本公开涵盖其它同种型。在一些实施方案中，特异性结合B7-H6的抗体是IgA，诸如IgA1或IgA2，或者是IgG，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或合成IgG。在一些实施方案中，抗体(或抗体的抗原结合片段)是合成抗体，诸如非耗尽IgG抗体、T-体或抗体的其它Fc或Fab变体。
在一些实施方案中，抗体是分离的抗体。
在一些实施方案中，抗体和抗原结合抗体片段对B7-H6具有100pM至1μM的亲和力。在一些实施方案中，抗体对B7-H6具有100pM至1nM的亲和力。例如，抗体可以对B7-H6具有100-200pM、100-300pM、100-400pM、100-500pM、100-600pM、100-700pM、100-800pM或100-900pM的亲和力。在一些实施方案中，抗体对B7-H6具有1-10nM、1-100nM或1-1000nM(1μM)的亲和力。例如，抗体可以对B7-H6具有1-5nM、1-25nM、1-50nM、1-75nM、1-150nM、1-200nM、1-300nM、1-400nM、1-500nM、1-600nM、1-700nM、1-800nM或1-900nM的亲和力。
在一些实施方案中，抗体对B7-H6具有10nM至50nM(例如，10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM或50nM)的亲和力。在一些实施方案中，抗体对B7-H6具有至少10nM的亲和力。例如，抗体可以对B7-H6具有至少15nM、至少20nM、至少30nM、至少40nM、至少45nM或至少50nM的亲和力。在一些实施方案中，抗体对B7-H6具有15nM至50nM、20nM至50nM或30nM至50nM的亲和力。在一些实施方案中，抗体对B7-H6具有小于10nM的亲和力。
可以使用已知技术测量亲和力。可以通过测量抗体的KD来测定抗体的亲和力。KD是抗体和其抗原之间的平衡解离常数(koff/kon的比率)，其中Koff是抗体解离速率(抗体从其抗原解离的速率)，且Kon是抗体缔合速率(抗体结合其抗原的速率)。KD和亲和力反关系。KD值与抗体浓度有关-KD值越低(浓度越低)，抗体的亲和力越高。
在一些实施方案中，抗体和抗原结合抗体片段对B7-H6具有1μM至10nM的亲和力。在一些实施方案中，抗体对B7-H6具有10μM或更低的亲和力。例如，抗体可以对B7-H6具有5μM或更低、2μM或更低、1μM或更低、500nM或更低、400nM或更低、300nM或更低或200nM或更低的的亲和力。在一些实施方案中，抗体对B7-H6具有100nM或更低、75nM或更低、50nM或更低、25nM或更低、10nM或更低或5nM或更低的亲和力。亲和力是指个别抗体-抗原结合相互作用的多种亲和力的累积强度(与描述单一相互作用的强度的亲和力相比)。可以使用技术诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或检测系统来测量亲和力。
可以使用真核表达系统或非真核表达系统产生抗体和抗原结合抗体片段。在一些实施方案中，使用哺乳动物表达系统产生抗体。在一些实施方案中，所述抗体(或抗体片段)由选自SEQ ID NO:38-41中任一个的DNA序列编码。在一些实施方案中，使用细菌表达系统产生抗体。例如，细菌表达系统可用来产生抗体片段，诸如F(ab)2、Fv、scFv、F(ab′)2、F(ab)、VL、VH、dsFv、Fv、scFv-Fc、(scFv)2和双抗体。用于改变DNA编码序列以产生此类片段的技术是已知的。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段与合成分子缀合。在一些实施方案中，合成分子是靶向(识别和结合)特定细胞或细胞类型、诸如肿瘤细胞(例如，癌肿瘤细胞)或转移细胞的分子。
在一些实施方案中，合成分子是治疗性分子，诸如细胞毒性分子(例如，从植物、真菌或细菌获得的蛋白质毒素)、细胞抑制分子、抗血管生成分子或放射性同位素。
治疗性分子的实例包括但不限于美登木素生物碱类(例如，美登醇或DM1美登木素生物碱)、紫杉烷类、卡里奇霉素、长春新碱和泼尼松。在一些实施方案中，治疗性分子是：抗代谢物(例如，抗叶酸剂，诸如甲氨蝶呤，氟嘧啶，诸如5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷，或嘌呤或腺苷的类似物)；嵌入剂(例如，蒽环霉素，诸如阿霉素，道诺霉素，表柔比星，伊达比星，丝裂霉素-C，放线菌素D或光神霉素)；铂衍生物(例如，顺铂或卡铂)；烷基化剂(例如，氮芥，美法仑，苯丁酸氮芥，白消安，环磷酰胺，异环磷酰胺亚硝基脲或噻替哌)；抗有丝分裂剂(例如，长春花生物碱，诸如长春新碱，或紫杉烷，诸如紫杉醇或多西他赛)；拓扑异构酶抑制剂(例如，依托泊苷和替尼泊苷，安吖啶，拓扑替康)；细胞周期抑制剂(例如，flavopyridol)；或微管剂(例如，埃坡霉素，圆皮海绵内酯类似物或eleutherobin类似物)。在一些实施方案中，治疗性分子是蛋白酶体抑制剂或拓扑异构酶抑制剂，诸如硼替佐米、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷或多柔比星。
细胞毒性分子的实例包括但不限于澳瑞他汀类、美登素类、卡里奇霉素类、多卡霉素类(duocarymycins)、PBD二聚体和α-鹅膏蕈碱。细胞毒性/免疫抑制分子的实例包括但不限于环磷酰胺(例如，Cytoxan)、硫唑嘌呤(例如，Imuran)和甲氨蝶呤。
抗血管生成剂的实例包括但不限于利诺胺、贝伐珠单抗(bevacuzimab)、血管抑素和雷佐生。合成分子可以是另一种抗体，诸如利妥昔单抗或贝伐珠单抗。
治疗性放射性同位素的实例包括但不限于钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac))、铋(212Bi镨)、砹(21lAt)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)和铑(188Rh)。
在一些实施方案中，合成分子是例如通过常规重组蛋白质表达系统和方法产生的融合蛋白质。
在一些实施方案中，合成分子是标记物。标记物可用于诊断应用，并且可以包括例如造影剂。造影剂的实例包括但不限于放射性同位素标记物，诸如碘(131I或125I)，铟(In)，锝(99Tc)，磷(32P)，碳(14C)，氚(3H)和上面列出的其它放射性同位素(例如，放射性离子)；不透射线的分子，磁共振成像(MRI)分子，超声成像分子，和适合于通过对动物体成像的装置进行检测的任何其它造影分子。在一些实施方案中，合成分子是荧光标记物、生物活性酶标记物、发光标记物或发色团标记物。
在一些实施方案中，合成分子是磁性纳米颗粒、控释聚合物纳米颗粒或脂质组合物。磁性纳米颗粒的实例包括但不限于铁(例如，Fe3O4或Fe2O4)、钴、锌、镉、镍、钆、铬、铜、锰、铽、铕、金、银、铂及其合金。控释聚合物纳米颗粒可以使用常规方法从例如以下产生：可生物降解或不可生物降解的聚合物，例如聚(乳酸)、聚(乳酸)的衍生物、聚乙二醇化聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)的衍生物、聚乙二醇化聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚酸酐、聚(原酸酯)、聚(原酸酯)的衍生物、聚乙二醇化聚(原酸酯)、聚(己内酯)、聚(己内酯)的衍生物、聚乙二醇化聚(己内酯)、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸)的衍生物、聚(乌拉坦)、聚(乌拉坦)的衍生物或其组合)。类似地，可以使用常规方法产生脂质组合物(例如，脂质体、固体脂质纳米颗粒等)。
可使用任何类型的合适的缀合方法将抗-B7-H6抗体或抗原结合抗体片段与合成分子缀合。例如，可以使用重组工程改造和并入的硒半胱氨酸(例如，如WO2008/122039中所述)来缀合合成分子。其它缀合方法包括，但不限于，共价偶联至天然或工程改造的赖氨酸侧链胺或半胱氨酸侧链硫醇。参见例如，Wu,等人.(2005)Nat.Biotechnol.23:1137-1146。
本文还提供了嵌合抗原受体(CAR)。表达CAR的T细胞被称为“CAR T细胞”。在一些实施方案中，CAR T细胞受体包含T-细胞受体(TcR)复合物的信号传导结构域和B7-H6-识别结构域(例如，图2或表2的单链片段(scFv))(Enblad等人,Human Gene Therapy.2015；26(8):498-505)。
存在四代CAR，其各自含有不同的组分。第一代CAR通过铰链和跨膜结构域将抗体衍生的scFv连接至T-细胞受体的CD3ζ(ζ或z)胞内信号传导结构域。第二代CAR并入额外结构域，例如CD28、4-1BB(41BB)或ICOS，以提供共刺激信号。第三代CAR含有两个与TcR CD3-ζ链融合的共刺激结构域。第三代共刺激结构域可以包括例如CD3z、CD27、CD28、4-1BB、ICOS、DAP-10或OX40的组合。在一些实施方案中，CAR含有胞外域(例如，CD3ζ)(其通常衍生自单链可变片段(scFv))、铰链、跨膜结构域和具有一个(第一代)、两个(第二代)或三个(第三代)衍生自CD3Z和/或共刺激分子的信号传导结构域的胞内域(Maude等人,Blood.2015；125(26):4017-4023；Kakarla和Gottschalk,Cancer J.2014；20(2):151-155)。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)是针对细胞因子活性重新定向的T-细胞(例如，TRUCK)，也称为第四代CAR。TRUCK是用作触发CAR T细胞的效应活性的媒介物的CAR-重新定向的T-细胞，并且另外产生和释放在靶向的组织(例如，表达B7-H6的肿瘤组织)中累积的转基因细胞因子(例如，IL-12)。转基因细胞因子组成型制备或在靶标的CAR衔接后释放。TRUCK细胞可以在靶位点处沉积多种治疗细胞因子。这可以导致在靶向的位点处的治疗性浓度并避免这些相同细胞因子的全身毒性。
CAR的功能特性通常不同。T-细胞受体的CD3ζ信号传导结构域当衔接时将活化并诱导T-细胞的增殖，但可以导致无效能(身体的防御机制缺乏反应，导致外周淋巴细胞耐受的直接诱导)。当淋巴细胞不能对其特异性抗原响应时，它们被认为是无效能的。在第二代CAR中添加共刺激结构域改善了修饰T-细胞的复制能力和持久性。在体外用CD28或4-1BBCAR观察到类似的抗肿瘤作用，但临床前体内研究表明4-1BB CAR可以产生优异的增殖和/或持久性。临床试验表明，这两种第二代CAR均能够在体内诱导显著的T-细胞增殖，但含有4-IBB共刺激结构域的CAR似乎持续更长。第三代CAR组合多个信号传导结构域(共刺激)以增强效力。第四代CAR额外用转基因细胞因子的组成型或诱导型表达盒修饰，其由CAR T-细胞释放以调节免疫应答。参见，例如，Enblad等人,Human Gene Therapy.2015；26(8):498-505；Chmielewski和Hinrich,Expert Opinion on Biological Therapy.2015；15(8):1145-1154.
在一些实施方案中，嵌合抗原受体是第一代CAR。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是第二代CAR。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是第三代CAR。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是第四代CAR或被重新定向以产生额外细胞因子(TRUCK)的T细胞。
嵌合抗原受体(CAR)可以包含胞外结构域，其包含B7-H6结合结构域、跨膜结构域和胞质结构域。在一些实施方案中，CAR是完全人的。“间隔区”结构域或“铰链”结构域可以位于CAR的胞外结构域(包含抗原结合结构域)和跨膜结构域之间，或CAR的胞质结构域和跨膜结构域之间。“间隔区结构域”是指发挥功能将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域和/或胞质结构域的任何寡肽或多肽。“铰链结构域”是指发挥功能以为CAR或其结构域提供柔性或防止CAR或其结构域的空间位阻的任何寡肽或多肽。在一些实施方案中，间隔区结构域或铰链结构域可以包含最多达300个氨基酸(例如，10至100个氨基酸，或5至20个氨基酸)。在一些实施方案中，一个或多个间隔区结构域可以包括于CAR的其它区域中。
在一些实施方案中，CAR包含对B7-H6特异性的抗原结合结构域，诸如单链Fv(scFv)。
在一些实施方案中，表达CAR的T细胞经遗传修饰以识别多种靶标或抗原，这允许识别肿瘤细胞上的独特靶标或抗原表达模式。可以结合多种靶标的CAR的实例包括：“分裂信号CAR”，其将完全T细胞活化限于表达多种抗原的肿瘤；“串联CAR”(TanCAR)，含有具有两个scFv的胞外域；和“通用胞外域CAR”，其并入抗生物素蛋白或异硫氰酸荧光素(FITC)特异性scFv，以识别已经与标记的单克隆抗体(Mab)一起孵育的肿瘤细胞。
如果CAR识别两种不同的抗原(具有两个不同的抗原识别结构域)，则其被认为是“双特异性的”。在一些实施方案中，双特异性CAR包含在单个转基因受体上串联存在的两个不同的抗原识别结构域(被称为TanCAR；参见，例如，Grada Z等人Molecular TherapyNucleic Acids 2013；2:e105，其通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，CAR是抗原特异性抑制性CAR(iCAR)，其可以用于例如以避免肿瘤外毒性(Fedorov,VD等人.Sci.Transl.Med.2013年12月11日在线发表，其通过引用并入本文)。iCAR含有抗原特异性抑制受体，例如，以阻断非特异性免疫抑制，其可能由肿瘤外靶标表达导致。iCAR可以基于例如抑制性分子CTLA-4或PD-1。在一些实施方案中，这些iCARS阻断来自通过其内源性T细胞受体或活化CAR活化的T细胞的T细胞应答。在一些实施方案中，该抑制作用是暂时的。
在一些实施方案中，CAR可用于过继性细胞转移中，其中从受试者移取免疫细胞并进行修饰，使得它们表达对B7-H6特异性的受体。然后可以识别并杀死癌细胞的修饰的免疫细胞被重新引入受试者中(Pule,等人,Cytotherapy.2003；5(3):211-226；Maude等人,Blood.2015；125(26):4017-4023，其各自通过引用并入本文)。
可以使用标准的重组蛋白质技术使用CD3-ζ和本领域已知的其它共刺激分子的序列来制备CAR。例如，人CD3-ζ序列可以以GENBANK登录号NP_932170(例如，截至2016年3月18日的条目)得到，人CD28序列可以以GENBANK登录号NP_006130(例如，截至2016年3月18日的条目)得到，人OX40序列可以以GENBANK登录号NP_003318(例如，截至2016年3月18日的条目)得到，并且人CD19序列可以以GENBANK登录号AAA69966(例如，截至2016年3月18日的条目)得到。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合抗体片段还对除了B7-H6以外的一种或多种抗原具有特异性。例如，可以将所述抗体工程改造(例如，作为二价双抗体或缀合的Fab二聚体或三聚体)以具有对B7-H6和另一肿瘤抗原(例如，与淋巴瘤、白血病、黑色素瘤或肉瘤相关的抗原)的特异性。在一些实施方案中，将抗体工程改造以具有对B7-H6和促进其它细胞(诸如细胞毒性效应细胞或T细胞)的活化或靶向的抗原的特异性。因此，本公开还包括BiTES(双特异性T细胞衔接物)和DARTS(双亲和力再靶向试剂)。
BiTE是指具有两个抗原结合结构域的单一多肽链分子，所述抗原结合结构域之一结合T-细胞抗原(例如CD3)，且所述抗原结合结构域的另一个结合靶细胞的表面上存在的抗原(WO 05/061547；Baeuerle,等人.(2008)Drugs of the Future 33:137-147；Bargou,等人.(2008)Science321:974-977)。已构建BiTE抗体以靶向各种抗原，包括CD19、EpCAM、Her2/neu、EGFR、CD66e(或CEA、CEACAM5)、CD33、EphA2和MCSP(或HMW-MAA)(Baeuerle,等人.(2009)Curr.Opin.Mol.Ther.11:22-30)。BiTE抗体的关键特征(其以其组合将它们与其它双特异性抗体构建体区别开)包括高效力的重新导向的裂解，EC50值范围为0.1至50pmol/L(2-1,000pg/mL)(Baeuerle,等人.(2009)supra)；T细胞的严格靶细胞依赖性活化(Brischwein,等人.(2007)J.Immunother.30:798-807)；以及活化的T细胞对系列裂解的支持(在低E:T比率下的活性)。BiTE抗体通常作为高等真核细胞系分泌的重组糖基化蛋白质而产生。因此，在本公开的一些实施方案中，抗B7-H6抗体片段(例如scFv)是BiTE的组分。在一个具体实施方案中，BiTE由通过接头(例如(G4S)3接头)融合在一起的抗B7-H6抗体片段和抗CD3抗体片段构成。
DART是指包括至少两条缔合(尤其通过共价相互作用)以形成至少两个表位结合位点的多肽链的免疫球蛋白分子，所述表位结合位点可以识别相同的表位或不同的表位。DART的每条多肽链包括免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，但这些区域不相互作用以形成表位结合位点。相反，DART多肽链之一(例如第一)的免疫球蛋白重链可变区与不同(例如第二)DART多肽链的免疫球蛋白轻链可变区相互作用以形成表位结合位点。类似地，DART多肽链之一(例如第一)的免疫球蛋白轻链可变区与不同(例如第二)DART多肽链的免疫球蛋白重链可变区相互作用以形成表位结合位点。DART可以是单特异性的、双特异性的或三特异性的，例如，因此它们能够同时结合一个、两个、三个(或更多个)不同的表位(其可以是相同的抗原或不同的抗原的表位)。DART可以另外是单价的、二价的、三价的、四价的、五价的或六价的，例如，因此能够同时结合一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个分子。可以组合DART的这两种特征(特异性的程度和化学价)，例如以产生四价(例如，能够结合四组表位)的双特异性抗体(能够结合两个表位)。构建DART分子的方法的实例公开于WO 2006/113665、WO 2008/157379和WO 2010/080538中。因此，在一些实施方案中，抗B7-H6抗体片段是DART的组分。
本公开进一步提供了经重组工程改造以产生特异性结合B7-H6的抗体或抗原结合抗体片段的真核细胞或非真核细胞。真核细胞或非真核细胞可例如用作表达系统以产生所述抗体。在一些实施方案中，本公开提供了经工程改造以重组表达B7-H6特异性抗体的B7-H6靶向的免疫细胞(例如，T细胞或B细胞)。例如，可以工程改造T-细胞以表达特异性结合B7-H6的抗体或抗原结合抗体片段(例如，scFv、scFv-Fc、(scFv)2)。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段连接至具有以下结构域的合成分子：间隔区结构域或铰链结构域(例如，CD28或IgG铰链结构域)、跨膜结构域(例如，跨膜经典结构域)和胞内信号传导结构域(例如，T-细胞受体(TCR)信号传导结构域或FcR-γ胞内信号传导结构域)，由此形成CAR。可被包括于CAR中的胞内信号传导结构域的实例包括但不限于CD3ζ、FcR-γ和Syk-PTK信号传导结构域以及CD28、4-1BB和CD134共信号传导结构域。用于产生表达CAR的T-细胞(和其它免疫细胞)的方法是已知的。参见例如，Marcu-Malina,et al.(2009)Exp.Opin.Biol.Ther.9:579-91。
本公开还提供了通过使表达B7-H6的细胞(B7-H6细胞)与特异性结合B7-H6的抗体、抗原结合抗体片段或融合蛋白质(例如，BiTE)接触(施用于所述细胞或具有所述细胞的受试者)来杀死所述细胞、抑制所述细胞的生长(例如，增殖)或抑制所述细胞的活性的方法。“抑制”B7-H6-阳性细胞生长或活性可以包括阻断或减少生长或活性(例如某些分子的分泌)。在一些实施方案中，所述抗体与合成分子缀合(连接)。在一些实施方案中，抗体与细胞毒性分子(例如，假单胞菌外毒素A(PE38))、细胞抑制分子、抗血管生成分子或放射性同位素缀合。方法可用于体外或体内(在受试者、诸如人受试者中)杀死或抑制B7-H6细胞的生长。因此，在一些实施方案中，本文还提供了治疗具有特征在于细胞B7-H6表达水平升高的病况、怀疑具有特征在于细胞B7-H6表达水平升高的病况或处于特征在于细胞B7-H6表达水平升高的病况的风险的受试者的方法。“治疗”可以包括治愈或减轻与特定病况相关的症状。因此，治疗不一定意味着100％或完全治疗。相反，存在不同程度的治疗，本领域普通技术人员认为其具有潜在益处或治疗效果。本公开提供的治疗可以包括治疗所治疗的疾病的一种或多种病况或症状。
“细胞B7-H6表达量增加”通常相对于表达很少或不表达B7-H6的正常(健康)细胞。例如，在正常(健康)细胞不表达可检测水平的B7-H6并且患病细胞的确表达可检测水平的B7-H6的情况下，患病细胞表达的B7-H6的特征在于“增加”。通常，治疗的方法包括将治疗有效量的抗体、抗体片段或融合蛋白质施用于受试者。治疗有效量可以由医学专业人员通过已知方法确定。例如，可以将抗体以10μg/kg至1mg/kg的剂量递送至受试者。可以将双特异性分子以例如100ng/kg至100mg/kg的剂量递送至受试者。可以将包含抗体或抗体片段的细胞以例如5x107–5x109(例如，5x108)个细胞的量递送至受试者。在一些实施方案中，有效量是使表达B7-H6(例如，癌性)的细胞的生长相对于未处理的对照细胞有效减少至少20％的量。例如，有效量可以是使表达B7-H6的细胞的生长有效减少至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的量。在一些实施方案中，有效量是使表达B7-H6的细胞的生长有效减少10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-1005、80-100％或90-100％的量。
在一些实施方案中，接触的B7-H6细胞可以例如在与B7-H6的异常表达或量相关的病症的细胞培养物或动物模型中。这些方法可例如用于对该抗体对特定B7-H6细胞类型的抑制活性进行测量和/或分级(相对于另一抗体)。抗体、抗体片段或融合蛋白质(例如，BiTE)的细胞毒性可以使用任何常规的测定法进行评价，所述测定法包括例如乳酸脱氢酶细胞毒性测定法，诸如可从商业获得的CYTOTOX非放射性细胞毒性测定法。
如本文提供的使用的抗体或抗原结合抗体片段可以是本公开的任何抗-B7-H6抗体或抗原结合抗体片段。因此，所述抗体可以是例如嵌合抗体、人源化抗体、合成抗体、F(ab)2、Fv、scFv、F(ab')2、F(ab)、VL、VH、dsFv、Fv或(scFv)2。在一些实施方案中，所述方法包括施用靶向表达B7-H6的细胞的IgG、scFv、dsFv、F(ab')2、双抗体、二价抗体、CAR、BiTE或DART。
在一些实施方案中，施用抗-B7-H6抗体或抗原结合抗体片段的受试者是具有癌症、自身免疫性病症或免疫缺陷病症的受试者(例如，肖格伦综合征，参见，例如，Rusakiewicz等人.Science Translational Medicine,5(195):195,2013)。例如，受试者可以具有淋巴瘤(例如，T-细胞淋巴瘤或B-细胞淋巴瘤)、白血病(例如，髓样白血病、急性非淋巴细胞性白血病、T-细胞急性成淋巴细胞性白血病)、黑色素瘤或肉瘤(例如，胃肉瘤)。在一些实施方案中，施用抗-B7-H6抗体或抗原结合抗体片段的受试者是具有以下疾病的受试者：髓性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、乳腺癌、宫颈癌、透明细胞肾细胞癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肉瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤、平滑肌肉瘤、侵袭性导管乳腺癌、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、卵巢浆液性表面乳头状癌、胰腺癌、前列腺癌、T-细胞急性淋巴细胞性白血病或T-细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，向受试者施用工程改造(例如，重组)免疫细胞(例如，T细胞)，其表达特异性结合B7-H6的抗体或抗原结合抗体片段(例如，过继性转移)。在一些实施方案中，免疫细胞(例如，T细胞)包含选择性结合B7-H6(例如，由图2或表2的scFV结合的B7-H6的表位)的CAR或BiTE。例如，重组技术可用于将编码CAR或编码BiTE的遗传物质引入任何合适的免疫细胞(例如，来自受试者的T细胞、诸如效应记忆T-细胞)。在一些实施方案中，使用利用病毒递送、转座子、质粒和/或mRNA的方法在T细胞上表达CAR。这些和其它表达方法是本领域已知的，并且不意图是限制性的。如果我们需要更多具体细节，也可以这样做。可以扩增携带遗传物质的T-细胞(例如，在细胞因子存在的情况下)。可以通常通过输注将重组T-细胞转移至受试者。转移的T-细胞然后可以针对受试者中的表达B7-H6的细胞产生免疫应答。过继性转移方法可以例如用于治疗具有或被怀疑具有如本文提供的癌症、自身免疫性病症或免疫缺陷病症的受试者。
在一些实施方案中，方法进一步包括针对与升高的B7-H6相关的病症共同施用第二治疗剂。例如，方法可以进一步包括共同施用适合于治疗癌症的细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗血管生成剂。如果所述癌症是B-细胞淋巴瘤，则所述方法可以进一步包括例如共同施用利妥昔单抗、阿仑单抗或CHOP(环磷酰胺、羟基道诺霉素、安可平(oncovin)和泼尼松(或泼尼松龙)化学治疗方案。
为了用于治疗中，本公开还提供了包含特异性结合B7-H6的抗体或抗原结合抗体片段(例如，图2或表2的scFv)的组合物(例如，药物组合物)。组合物可以从本文描述的任何抗体制备。药物组合物的一个实例包括经由柔性接头与抗CD3e scFv融合的抗B7-h6scFv(BiTE)。药物组合物的又一个实例包括与CD28的铰链结构域、跨膜结构域和胞内结构域和CD3ζ的胞内结构域融合的抗B7-H6scFv(即CAR)。
在一个实施方案中，组合物(例如，药物组合物)包括所述抗体的载体，诸如药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是任何合适的药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指一种或多种适合于施用于人或兽医受试者中的相容性固体或液体填料、稀释剂、其它赋形剂或包封物质(例如，生理上可接受的载体或药理学上可接受的载体)。术语“载体”表示天然或合成的有机或无机成分，所述活性成分与之组合以促进应用。可以将药学上可接受的载体与活性组分(例如，杂合分子)中的一种或多种共混，并且当组合物中存在多于一种药学上可接受的载体时可以与彼此共混，其方式使得基本上不损害期望的药物效力。“药学上可接受的”材料通常能够施用于患者，而不产生显著的不期望的生理效应，诸如恶心、头晕、皮疹或胃部不适。例如，合意的是包含药学上可接受的载体的组合物当为了治疗目的而施用于人患者时不是免疫原性的。
在一些实施方案中，药物组合物可以含有合适的缓冲剂，包括例如盐中的乙酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。药物组合物还可以含有合适的防腐剂，诸如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞或其组合。
药物组合物可以单位剂型呈现，并且可以通过任何合适的方法(其中许多是众所周知的)制备。此类方法包括使抗-B7-H6抗体与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，组合物通过如下制备：使活性剂与液体载体、细分的固体载体或两者结合，且然后，如果必要，将组合物成形。
适合用于胃肠外施用的组合物包括例如所述组合物的无菌含水制剂，其优选与接受者的血液等渗。这种含水制剂可以根据已知方法使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。在一些实施方案中，配制和预包装抗-B7-H6抗体组合物，用于以笔(例如，一次性笔)或注射器(例如，一次性注射器)的形式进行皮下注射。本公开涵盖其它形式的制备和递送系统。
“受试者”可以是动物受试者，诸如人受试者。动物受试者包括，但不限于，与升高的B7-H6表达相关的病况或病症(诸如上述那些)的动物模型、诸如哺乳动物模型。
本文还提供了抗-B7-H6抗体在测试样品中检测B7-H6(例如，细胞表面B7-H6)例如相对于对照的变化量的用途。测试样品可以来自细胞培养物或来自测试受试者，例如来自具有特征在于受试者中B7-H6的异常表达的疾病或病况、怀疑具有特征在于受试者中B7-H6的异常表达的疾病或病况或处于具有特征在于受试者中B7-H6的异常表达的疾病或病况的风险的受试者的血浆或组织样品。对照量可以对应于使用相同的抗体在来自一个或多个对照培养物或受试者的相应样品中检测的B7-H6量。使用抗-B7-H6抗体以测定B7-H6量的方法可以包括任何免疫测定法诸如免疫印迹法(western)印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)和流式细胞术，例如荧光活化的细胞分选(FACS)分析。
另外，B7-H6检测可用于监测与B7-H6表达相关的病症的进展。相对于对照显著升高或降低的B7-H6的量分别指示受试者的病症正在恶化或改善。
前述筛选可用于鉴定病症(包括上述那些)的存在或监测病症(包括上述那些)的进展。
本发明还提供了适合用于实施本发明的方法的试剂盒。通常，试剂盒包括两个或多个进行本发明的治疗或检测方法所需的组分。试剂盒组分包括，但不限于，一种或多种本发明的抗体、适当的试剂和/或设备。
本文提供的试剂盒是可以包括抗-B7-H6抗体和适合用于检测B7-H6(例如通过ELISA或FACS)的免疫测定缓冲液的试剂盒。试剂盒还可以包括至少一个微量滴定板、标准品、测定稀释剂、洗涤缓冲液、粘性板盖和/或用于使用所述试剂盒实施方法的说明书。所述试剂盒可以包括与基底(例如多孔板或芯片)结合的抗体，所述基底被合适地包装且可用于检测B7-H6。在一些实施方案中，试剂盒包括与标记物(诸如，荧光标记物、生物活性酶标记物、发光标记物或发色团标记物)缀合的抗-B7-H6抗体。试剂盒可以进一步包括用于使缀合的抗体可视化的试剂，例如该酶的底物。在一些实施方案中，试剂盒包括与造影剂缀合的抗-B7-H6抗体，和任选可用于对受试者中的抗体成像的一种或多种试剂或设备部件。通常，试剂盒中的本发明的抗体被合适地包装，例如包装在小瓶、小袋、安瓿和/或任何适合于治疗或检测方法的容器中。试剂盒组分可以作为可以在使用前进一步稀释的浓缩物(包括冻干的组合物)提供，或者它们可以以使用浓度提供。当抗-B7-H6抗体用于体内使用时，可以在具有期望量和浓度的试剂的灭菌容器中提供单个剂量。
通过以下非限制性实施更详细地描述本公开的实施方案。
实施例
实施例1：靶向肿瘤抗原B7H6的人scFv
针对肿瘤抗原B7H6的完全人scFv由克隆并在酵母表面上表达的109个人抗体scFv片段的非免疫文库产生。使用具有结合B7H6-Ig(包含B7H6的胞外部分和小鼠IgG2a的Fc部分的融合蛋白质)的阳性选择以及结合正常小鼠IgG的多克隆混合物的阴性选择的磁珠和单细胞分选方法。还进行一轮随机诱变以分离下述克隆。
表示为第2.5代(Lib g2.5)的scFv显示10-50nM亲和力，如图1中所表明。从该代，将属于相同克隆家族(定义为具有相同CDR3长度的共有IgH VJ(具体地IgHV1&IgHJ3/4)和IgL VJ(IgLV2&IGLJ7/3)使用的scFV)的四种不同的scFv(图2中显示的序列比对和表2中列出的完全序列)亲和力成熟/回归以产生一组完全人B7H6靶向scFv，其具有对嵌合抗原-受体(CAR)-T细胞测试的一定范围的亲和力。表1表明分离的scFv之间的氨基酸差异的数量，其范围为1-4个残基差异。另外，这些scFv识别与小鼠抗体TZ47不同的表位，如图4中显示的竞争性结合测定所表明。
表1.蛋白质序列距离矩阵：每对变体之间的氨基酸差异的数量。
g2.5-9 g2.5-6 g2.5-3 g2.5-2
g2.5-9 -- 3 1 3
g2.5-6 3 -- 2 4
g2.5-3 1 2 -- 2
g2.5-1 3 4 2 --
作为可溶性scFv-Fc蛋白质的scFv的实验验证.
将分离的scFv移植至VRC01IgG1抗体重链恒定区(CH1-CH3)上以获得可溶性scFv-Fc用于测试。在人胚肾(HEK)细胞中重组表达一种代表性克隆g2.5-11(在氨基酸水平上等效于Fg2.5-3)用于可溶性分泌。然后筛选纯化的scFv-Fc蛋白质与表达B7H6的细胞系和可溶性B7H6抗原两者的结合。
Fv-Fc的产生/纯化.
重组表达代表性g2.5-11scFv-Fc并纯化。简言之，将106个细胞/mL的密度的HEK-293F细胞用1.0mg/L的浓度的pCMVR-g2.5-11-Fc质粒转染，并培养5天，然后蛋白质A纯化细胞培养上清液。将培养物以3,000x g离心15分钟，并将上清液通过1.0mL蛋白质A树脂柱。然后将柱用10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，然后用100mM甘氨酸(pH 3)洗脱。然后将洗脱液使用Amicon-30K超速离心管缓冲液交换回PBS中。
g2.5-11scFv-Fc以KD～30nM亲和力结合表达B7H6的细胞系RMA-B7H6，并且不结合阴性对照RMA细胞系.
Miltenyi Biotech流式细胞仪用于细胞结合测定。为了获得实验性KD，将2.5E5个RMA-B7H6(表达B7H6)或RMA(阴性对照)细胞/孔用PBS+0.1％BSA(PBS-F)洗涤3次，然后与0-500nM g2.5-11预孵育。然后将细胞用PBS-F洗涤3次，然后添加第二检测试剂。在用PBS-F最后洗涤之后，将细胞重悬浮于200mL PBS-F/孔中，然后在Miltenyi流式细胞仪上读取。图3A和3B中显示的结果表明与RMA-B7H6细胞的结合(KD～20nM)和与RMA细胞的可忽略的结合。
g2.5-11scFv-Fc结合B7H6上不同于鼠抗体TZ47的表位.
对于竞争测定，将2.5E5个RMA-B7H6细胞/孔用PBS+0.1％BSA(PBS-F)洗涤3次，然后与500nM的g2.5-11scFv-Fc、鼠TZ47或两者孵育1小时。然后将细胞用PBS-F洗涤3次，然后添加第二检测试剂以测量g2.5-11scFv-Fc(APC)和竞争性鼠TZ47(FITC)的信号的增益或丢失。在用PBS-F最后洗涤之后，将细胞重悬浮于200mL PBS-F/孔中，然后在Miltenyi流式细胞仪上读取。图4A和4B表明每种scFv-Fc/抗体的结合不受添加其它scFv-Fc/抗体显著影响。
g2.5-11scFv-Fc结合可溶性B7H6Ig抗原.
将抗人CH1尖端用0.05mg/mL g2.5-11scFv-Fc蛋白质活化600秒以确保用抗原饱和尖端。然后将尖端转移质含有PBS+0.1％Tween(PBS-T)的孔，用于在转移至范围为0-500nM B7H6-Ig的含抗原孔之前scFv-Fc上样的尖端的基线测量。将样品使用仅含有未活化的尖端的孔和仅含有PBS-T的孔进行双重参考。Octet分析软件用于全局动力学拟合，其使用所有测试浓度的缔合和解离曲线测定每种抗原的单一KD测量值。拟合质量通过R2关联系数确定，并报告于图5中。
测试g2.5-6作为嵌合抗原受体(CAR)的Fv结合区。
将来自克隆g2.5-6的Fv区克隆至与CD3z的胞质区域连接的CAR骨架中，所述CAR骨架含有来自人CD28的铰链、跨膜和胞质区域。这种新的CAR含有g2.5-6与B7H6的结合，来自CD28的共刺激信号和经由CD3ζ的T细胞的初始信号。使用逆转录病毒载体在T细胞中表达该CAR，所述逆转录病毒载体还含有用于细胞追踪的截短的小鼠CD19基因。如图6中所示，基于g2.5-6的CAR载体在转导后在鼠T细胞中表达(参见CD19表达)。将这些g2.5-6CAR T细胞与RMA或RMA-B7H6肿瘤细胞或培养基共培养24小时，并通过ELISA测定产生的IFN-γ的量。只有当B7H6在肿瘤细胞上表达时才产生IFN-γ(图7)。作为阳性对照，使用另一种也识别B7H6的CAR。
Fg2.5CAR T细胞对B7H6+肿瘤细胞的特异性裂解.
Fg2.5CAR T细胞对B7H6+肿瘤细胞的特异性裂解.
将效应T细胞与RMA(图8A)或RMA-B7H6(图8B)肿瘤细胞培养24小时。T细胞表达具有不同共刺激结构域(CD28、Dap 10或4-1BB)和CD3ζ胞质结构域的B7H6特异性CAR。肿瘤细胞表达荧光素酶。光信号(RLU)的减少表明更少的肿瘤存活(肿瘤细胞裂解)。B7H6特异性CAR T细胞能够杀死B7H6+肿瘤细胞，但不杀死B7H6阴性肿瘤细胞。对照CAR(Ctrl CAR)是人B7H6特异性CAR(基于来自TZ47鼠抗体的Fv)，其识别B7H6上的不同表位。模拟T细胞是不表达CAR的活化T细胞。这些数据显示B7H6特异性CART细胞表现出抗肿瘤裂解活性。
表2：抗体scFv氨基酸序列
表3：抗体scFv核酸序列
序列表
<110> 达特茅斯大学理事会
<120> 高亲和力B7-H6抗体和抗体片段
<130> T0636.70004WO00
<140> 尚未分配
<141> 2017-04-14
<150> US 62/323,039
<151> 2016-04-15
<160> 42
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Gly Thr Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Ile Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Arg Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Ala Thr Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu
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Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Lys Phe Val Ser
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Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp
180 185 190
Val Thr Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Lys
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225 230 235 240
Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Gly Thr Tyr
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Thr Leu His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Ile Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Arg Leu
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<223> 合成多肽
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Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ser Tyr
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65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr Tyr Ala Leu
1 5 10
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Gly Thr Tyr
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu
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Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Gly Thr Tyr
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Thr Leu His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Ile Glu Trp Met
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
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Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ser Tyr
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Lys Phe Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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<220>
<223> 合成多肽
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Gly Tyr Thr Leu Gly Thr Tyr Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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<223> 合成多肽
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1 5
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<223> 合成多肽
<400> 18
Cys Leu Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr Tyr Ala Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Gly Thr Tyr
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Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Arg Phe
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<223> 合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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Tyr Thr Tyr Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
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<223> 合成多肽
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Gly Tyr Thr Leu Gly Thr Tyr Thr
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<220>
<223> 合成多肽
<400> 23
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<212> PRT
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<400> 24
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Asp Val Thr
1
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
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<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Ile Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Ala Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Ala Thr Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Arg Ala Pro Val Arg Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Lys Phe Val Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp
180 185 190
Val Thr Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
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<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr Tyr Thr
20 25 30
Leu His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Ile Glu Trp Met Gly
35 40 45
Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Arg Phe Gln
50 55 60
Ala Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Ala Thr Thr Thr Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Thr Asp Arg Ala Pro Val Arg Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Lys Phe Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Thr Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp
85 90 95
Tyr Thr Tyr Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
100 105 110
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Gly Tyr Thr Leu Gly Thr Tyr Thr
1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Ile Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Thr
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Ala Thr Asp Arg Ala
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Ser Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Lys Phe
1 5
<210> 35
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Asp Val Thr
1
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr Tyr Ala Leu
1 5 10
<210> 37
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Gly Thr Tyr
20 25 30
Thr Leu His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Ile Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Ser Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Asn Arg Asp Thr Ser Ala Thr Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Arg Ala Pro Val Arg Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Lys Phe Val Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp
180 185 190
Val Thr Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr Thr Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
245 250
<210> 38
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 38
caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg cttctggata caccctcggt acctacactc tgcactggat gcgccaggcc 120
cccggacaaa ggattgagtg gatgggatgg atcaaccctg gcaatggtta cacaaaatat 180
tcacagaggc tccagggcag agtcaccatt aatagggaca catccgcgac cacaacgtac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtat atttctgtgc gacagatagg 300
gctccagttc gtcgtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
ggaattctag gatccggtgg cggtggcagc ggcggtggtg gttccggagg cggcggttct 420
cagtctgttc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc ggtcaccatc 480
tcctgcactg gcaccagcag tgacattggt tcttataaat ttgtctcctg gtaccaacat 540
caccccggca aagcccccaa actcatgatt tatgacgtca ctcagcggcc ctcaggggtc 600
ccttatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 660
caggctgaag atgaggctga ttattactgc tgctcatatg caggcgacta cacttatgct 720
ctattcggag gaggcaccca gctgaccgtc ctctcc 756
<210> 39
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 39
caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaagatt 60
ccctgcaagg cttctggata caccctcggt acctacactc tgcactggat gcgccaggcc 120
cccggacaaa ggattgagtg gatgggatgg atcaaccctg gcaatggtta cacaaaatat 180
tcacagaggt tccagggcag agtcaccatt aatagggaca catccgcgac cacaacgtac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtat atttctgtgc gacagatagg 300
gctccagttc gtcgtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
ggaattctag gatccggtgg cggtggcagc ggcggtggtg gttccggagg cggcggttct 420
cagtctgttc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc ggtcaccatc 480
tcctgcactg gcaccagcag tgacattggt tcttataaat ttgtctcctg gtaccaacat 540
caccccggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca ctcagcggcc ctcaggggtc 600
ccttatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 660
caggctgaag atgaggctga ttattactgc tgcttatatg caggcgacta cacttatgct 720
ctattcggag gaggcaccca gctgaccgtc ctctcc 756
<210> 40
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 40
caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg cttctggata caccctcggt acctacactc tgcactggat gcgccaggcc 120
cccggacaaa ggattgagtg gatgggatgg atcaaccctg gcaatggtta cacaaaatat 180
tcacagaggt tccagggcag agtcaccatt aatagggaca catccgcgac cacaacgtac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtat atttctgtgc gacagatagg 300
gctccagttc gtcgtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
ggaattctag gatccggtgg cggtggcagc ggcggtggtg gttccggagg cggcggttcc 420
cagtctgttc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctgggcagtc ggtcaccatc 480
tcctgcactg gcaccagcag tgacattggt tcttataaat ttgtctcctg gtaccaacat 540
caccccggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca ctcagcggcc ctcaggggtc 600
ccttatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggctt ccctgaccat ctctgggctc 660
caggctgaag atgaggctga ttattactgc tgctcatatg caggcgacta cacttatgct 720
ctattcggag gaggcaccca gctgaccgtc ctctcc 756
<210> 41
<211> 755
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 41
aggtccagct tgtacagtct ggggctgagg tgaagaagcc tggggcctca gtgaagattt 60
cctgcaaggc ttctggatac acccccggta cctacactct gcactggatg cgccaggccc 120
ccggacaaag gattgagtgg atgggatgga tcaaccctgg caatggttac acaaaatatt 180
cacagaggtt ccaggccaga gtcaccatta atagggacac atccgcgacc acaacgtaca 240
tggagctgag cagcctgaga tctgaagaca cggctgtata tttctgtgcg acagataggg 300
ctccagttcg tcgtgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc gtctcttcag 360
gaattctagg atccggtggc ggtggcagcg gcggtggtgg ttccggaggc ggcggttctc 420
agtctgttct gactcagcct gcctccgtgt ctgggtctcc tggacagtcg gtcaccatct 480
cctgcactgg caccagcagt gacattggtt cttataaatt tgtctcctgg taccaacatc 540
accccggcaa agcccccaaa ctcatgattt atgatgtcac tcagcggccc tcaggggtcc 600
cttatcgctt ctctggctcc aagtctggca acacggcctc cctgaccatc tctgggctcc 660
aggctgaaga tgaggctgat tattattgct gctcatatgc aggcgactac acttatgctc 720
tattcggagg aggcacccag ctgaccgtcc tctcc 755
<210> 42
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 42
caggtccagc ttgtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg cttctggata caccctcggt acctacactc tgcactggat gcgccaggcc 120
cccggacaaa ggattgagtg gatgggatgg atcaaccctg gcaatggtta cacaaaatat 180
tcacagaggt tccagggcag agtcaccatt aatagggaca catccgcgac cacaacgtac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtat atttctgtgc gacagatagg 300
gctccagttc gtcgtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
ggaattctag gatccggtgg cggtggcagc ggcggtggtg gttccggagg cggcggttct 420
cagtctgttc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc ggtcaccatc 480
tcctgcactg gcaccagcag tgacattggt tcttataaat ttgtctcctg gtaccaacat 540
caccccggca aagcccccaa actcatgatt tatgatgtca ctcagcggcc ctcaggggtc 600
ccttatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 660
caggctgaag atgaggctga ttattactgc tgctcatatg caggcgacta cacttatgct 720
ctattcggag gaggcaccca gctgaccgtc ctctcc 756

Claims (69)

1.抗体或抗原结合抗体片段，其特异性结合B7同源物6(B7-H6)且包含
(a)重链可变区，其包含，
(i)SEQ ID NO:4的CDR1，
(ii)SEQ ID NO:5的CDR2，和
(iii)SEQ ID NO:6的CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包含，
(i)SEQ ID NO:7的CDR1，
(ii)SEQ ID NO:8的CDR2，和
(iii)SEQ ID NO:9的CDR3。
2.权利要求1的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:2的重链可变结构域。
3.权利要求1或2的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3的轻链可变结构域。
4.抗体或抗原结合抗体片段，其特异性结合B7同源物6(B7-H6)且包含
(a)重链可变区，其包含，
(i)SEQ ID NO:13的CDR1，
(ii)SEQ ID NO:14的CDR2，和
(iii)SEQ ID NO:15的CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包含，
(i)SEQ ID NO:16的CDR1，
(ii)SEQ ID NO:17的CDR2，和
(iii)SEQ ID NO:18的CDR3。
5.权利要求4的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:11的重链可变结构域。
6.权利要求4或5的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:12的轻链可变结构域。
7.抗体或抗原结合抗体片段，其特异性结合B7同源物6(B7-H6)且包含
(a)重链可变区，其包含，
(i)SEQ ID NO:22的CDR1，
(ii)SEQ ID NO:23的CDR2，和
(iii)SEQ ID NO:24的CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包含，
(i)SEQ ID NO:25的CDR1，
(ii)SEQ ID NO:26的CDR2，和
(iii)SEQ ID NO:27的CDR3。
8.权利要求7的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:20的重链可变结构域。
9.权利要求7或8的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:21的轻链可变结构域。
10.抗体或抗原结合抗体片段，其特异性结合B7同源物6(B7-H6)且包含
(a)重链可变区，其包含，
(i)SEQ ID NO:31的CDR1，
(ii)SEQ ID NO:32的CDR2，和
(iii)SEQ ID NO:33的CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包含，
(i)SEQ ID NO:34的CDR1，
(ii)SEQ ID NO:35的CDR2，和
(iii)SEQ ID NO:36的CDR3。
11.权利要求10的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:29的重链可变结构域。
12.权利要求10或11的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:30的轻链可变结构域。
13.抗体或抗原结合抗体片段，其特异性结合B7同源物6(B7-H6)且包含
(a)包含氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:2、11、20或29相同，或(ii)与SEQ ID NO:2、11、20或29具有至少90％同一性且由分别SEQ ID NO:2、11、20或29中至少一个框架区中的至少一个突变组成；和
(b)包含氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:3、12、21或30相同，或(ii)与SEQ ID NO:33、12、21或30具有至少90％同一性且由分别SEQ ID NO:3、12、21或30中至少一个框架区中的至少一个突变组成。
14.权利要求13的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2、11、20或29具有至少95％同一性的氨基酸序列；且
(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3、12、21或30具有至少95％同一性的氨基酸序列。
15.权利要求13的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:2相同，或(ii)与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性且由SEQ ID NO:2中至少一个框架区中的至少一个突变组成；且
(b)所述轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:3相同，或(ii)与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性且由SEQ ID NO:3中至少一个框架区中的至少一个突变组成。
16.权利要求15的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列；且
(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列。
17.权利要求15的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；且
(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列。
18.权利要求13的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:11相同，或(ii)与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性且由SEQ ID NO:11中至少一个框架区中的至少一个突变组成；且
(b)所述轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:12相同，或(ii)与SEQ ID NO:12具有至少90％同一性且由SEQ ID NO:12中至少一个框架区中的至少一个突变组成。
19.权利要求18的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:11相同的氨基酸序列；且
(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:12相同的氨基酸序列。
20.权利要求18的抗体或抗原结合抗体片段，
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的氨基酸序列；且
(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的氨基酸序列。
21.权利要求13的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:20相同，或(ii)与SEQ ID NO:20具有至少90％同一性且由SEQ ID NO:20中至少一个框架区中的至少一个突变组成；且
(b)所述轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:21相同，或(ii)与SEQ ID NO:21具有至少90％同一性且由SEQ ID NO:21中至少一个框架区中的至少一个突变组成。
22.权利要求21的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:20相同的氨基酸序列；且
(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:21相同的氨基酸序列。
23.权利要求21的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:20具有至少95％同一性的氨基酸序列；且
(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:21具有至少95％同一性的氨基酸序列。
24.权利要求13的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:29相同，或(ii)与SEQ ID NO:29具有至少90％同一性且由SEQ ID NO:29中至少一个框架区中的至少一个突变组成；且
(b)所述轻链可变区包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:30相同，或(ii)与SEQ ID NO:30具有至少90％同一性且由SEQ ID NO:30中至少一个框架区中的至少一个突变组成。
25.权利要求24的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:29相同的氨基酸序列；且
(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:30相同的氨基酸序列。
26.权利要求24的抗体或抗原结合抗体片段，其中：
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:29具有至少95％同一性的氨基酸序列；且
(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:30具有至少95％同一性的氨基酸序列。
27.权利要求1-26中任一项的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体是全长抗体。
28.权利要求27的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述全长抗体是IgG分子。
29.权利要求1-26中任一项的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体的抗原结合片段是scFv片段。
30.权利要求1-29中任一项的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体或抗原结合抗体片段与合成分子缀合。
31.权利要求30的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体或抗原结合抗体片段是嵌合抗原受体，且所述合成分子包含跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
32.权利要求31的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述胞内信号传导结构域是T细胞受体胞内信号传导结构域。
33.权利要求32的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述跨膜结构域和所述胞内T细胞受体信号传导结构域获得自CD3ζ。
34.权利要求31的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述胞内信号传导结构域是FcR-γ胞内信号传导结构域。
35.权利要求31-35中任一项的抗体或抗原结合抗体片段，其进一步包含共刺激蛋白质受体的胞内结构域。
36.权利要求35的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述共刺激蛋白质受体是CD27、CD28、4-1BB、ICOS、DAP-10或OX40。
37.权利要求31-36中任一项的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述嵌合抗原受体进一步包含铰链结构域。
38.权利要求37的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述铰链结构域是CD28铰链结构域或CD8铰链结构域。
39.权利要求30-38中任一项的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体或抗原结合抗体片段是双特异性T-细胞衔接物，且所述合成分子包含结合T-细胞抗原的抗原结合结构域。
40.权利要求39的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗原结合结构域包含特异性结合CD3的抗体片段。
41.权利要求30-40中任一项的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述合成分子是标记物。
42.权利要求30-41中任一项的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述合成分子是细胞毒性剂或治疗性放射性同位素。
43.重组T细胞，其包含权利要求30-42中任一项的抗体或抗原结合抗体片段。
44.药物组合物，其包含权利要求30-42中任一项的抗体或抗原结合抗体片段和药学上可接受的载体。
45.试剂盒，其包含权利要求30-42中任一项的抗体或抗原结合抗体片段。
46.权利要求45的试剂盒，其中所述抗体或抗原结合抗体片段与标记物缀合。
47.嵌合抗原受体，其包含
(a)权利要求1-42中任一项的抗原结合抗体片段，
(b)跨膜结构域，和
(c)胞内信号传导结构域。
48.权利要求47的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域是T细胞受体胞内信号传导结构域。
49.权利要求48的嵌合抗原受体，其中所述跨膜结构域和胞内T-细胞受体信号传导结构域来自CD3ζ。
50.权利要求47的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导结构域是FcR-γ胞内信号传导结构域。
51.权利要求47-50中任一项的嵌合抗原受体，其进一步包含共刺激蛋白质受体的跨膜结构域或胞内信号传导结构域。
52.权利要求51的嵌合抗原受体，其中所述共刺激蛋白质受体是CD27、CD28、4-1BB、ICOS、DAP-10或OX40。
53.权利要求H1-H6中任一项的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体进一步包含铰链结构域。
54.权利要求53的嵌合抗原受体，其中所述铰链区是CD28铰链结构域或CD8铰链结构域。
55.重组T细胞，其包含权利要求47-54中任一项的嵌合抗原受体。
56.双特异性T-细胞衔接物，其包含
(a)权利要求1-29中任一项的抗原结合抗体片段，和
(b)结合T-细胞抗原的抗原结合结构域。
57.权利要求56的双特异性T-细胞衔接物，其中所述抗原结合结构域包含特异性结合CD3的抗体片段。
58.方法，其包括将有效量的权利要求1-42中任一项的抗体或抗原结合抗体片段施用于有需要的受试者。
59.权利要求58的方法，其中所述有效量是在受试者中有效杀死表达B7同源物6的细胞或减少表达B7同源物6的细胞的生长的量。
60.权利要求59的方法，其中所述有效量是使细胞的生长相对于未处理的对照细胞有效减少至少20％的量。
61.权利要求60的方法，其中所述有效量是使细胞的生长相对于未处理的对照细胞有效减少至少50％的量。
62.权利要求58-61中任一项的方法，其中所述细胞是癌细胞。
63.权利要求62的方法，其中所述受试者具有髓性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、乳腺癌、宫颈癌、透明细胞肾细胞癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肉瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤、平滑肌肉瘤、侵袭性导管乳腺癌、恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、卵巢浆液性表面乳头状癌、胰腺癌、前列腺癌、T-细胞急性淋巴细胞性白血病或T-细胞淋巴瘤。
64.权利要求58的方法，其中所述有效量是在受试者中有效诱导针对表达B7同源物6的细胞的免疫应答的量。
65.权利要求64的方法，其中所述受试者具有自身免疫性病症。
66.权利要求65的方法，其中所述自身免疫性病症是肖格伦综合征。
67.权利要求58-66中任一项的方法，其进一步包括共同施用包含第二治疗剂的药物组合物。
68.权利要求1-42中任一项的分离的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体或抗原结合抗体片段和B7H6之间的平衡解离常数(KD)是100pM至1μM。
69.权利要求68的分离的抗体或抗原结合抗体片段，其中所述抗体或抗原结合抗体片段和B7H6之间的KD是1nM至100nM。
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