CN109298034B - 选择性识别氯霉素的分子印迹电化学传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种选择性识别氯霉素的分子印迹电化学传感器及其制备方法，属于新材料领域。本发明以氯霉素为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，N,N‑亚甲基丙烯酰胺为交联剂，利用石墨烯基复合金属纳米材料引发聚合反应，结合电引发自由基聚合技术，在电极表面直接制备分子印迹聚合薄膜，能够对复杂基质中的氯霉素进行快速识别，高灵敏定量检测。本发明解决了困扰分子印迹电化学传感器制备过程中的两难问题，既实现了分子印迹材料的直接成膜，又保证了其导电性。

Description

选择性识别氯霉素的分子印迹电化学传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及新材料领域，具体涉及一种选择性识别氯霉素的分子印迹电化学传感器及其制备方法。

背景技术

近年来，抗生素滥用问题在临床及水产和畜禽养殖过程中广泛存在，伴随交叉介质转移过程，残留的抗生素在环境介质中不断迁移和转化，经过食物链的富集和传递，这些药物以游离或结合形式残留在动物组织中，最终进入人体，破坏人胃肠道菌群生态平衡，引起心跳加速、肌肉震颤、神经过敏，致畸致癌致突变等不良反应，造成抗生素耐药和“瘦肉精”中毒等公共卫生事件。不仅严重威胁人体健康，而且对我国蜂蜜、水产和畜禽类等动物源性食品出口造成巨大冲击。例如，2002年1月，由于抗生素残留超标，欧盟禁止进口我国包括蜂产品在内的动物源性食品。随着我国对食品安全重视程度的不断提升，我国食品安全状况整体趋向稳定，然而要想从根本上控制兽药残留保障动物源性食品安全，就必须进行源头控制并实施有效的检测，尤其是对饲料、饲料添加剂中违禁、违规药物的快速检测研究。氯霉素是一种常用的广谱抗生素，具有抗菌效果明显、价格低廉等优点，因此广泛应用于畜牧业中。近年来，许多研究表明氯霉素的国度摄入会威胁人类健康，它能抑制人体的造血系统，引起血细胞减少、灰婴综合征和再生障碍性贫血，甚至还有可能对人类致癌，因此，我国、欧盟、美国、日本等国家和地区均规定食品中禁止使用氯霉素。然而氯霉素的违规使用依然广泛存在，为有效监控食品中氯霉素的含量，有必要对氯霉素进行严格的检测，建立一种复杂基质中痕量残留氯霉素的检测技术。

目前，实验室主要采用高效液相色谱法、色谱质谱联用法测定动物组织中氯霉素含量，但这些方法样品预处理复杂，操作技术要求高，仪器化程度高，仪器造价高昂，不适合药物残留快速检测和基层推广。开发一种灵敏度高、成本低廉、操作简便的氯霉素残留的现场大批量快速检测方法，十分必要。分子印迹技术是指通过制备与某一特定分子在空间和结合位点上完全匹配的聚合物，具有灵敏度高，性能稳定，抗外界干扰性好等优点，实现氯霉素的高选择性识别。分子印迹电化学传感器就是将电化学传感器检测快速、操作简单的优势与分子印迹技术相结合，用于痕量氯霉素的高通量、低成本检测。

但是，分子印迹电化学传感器的制备方法目前尚不成熟。

专利(CN201510440984.X)提出一种氯霉素分子印迹电化学发光传感器，但是印迹材料的制备是利用邻苯二胺为单体，自聚合而成。但是这类材料由于缺乏活性功能基团(邻苯二胺既是交联剂也是单体)，选择性识别能力不高，抗干扰能力较弱。文献和专利中高选择性印迹材料依然是首选甲基丙烯酸类单体，偶氮二异丁腈为引发剂制备的高分子聚合物。然而，由于印迹聚合物的导电性能很差，这类材料不能直接应用于电化学传感器。改进方法在于，一方面直接掺杂其它导电材料，但势必降低方法的抗干扰能力和灵敏度；另一方面在导电材料表面修饰一层功能膜提供活性基团，进而将引发剂接枝在膜表面，最后制备出分子印迹/导电材料复合物。但是功能膜的修饰也会影响传感器的导电性和灵敏度，而且膜表面引发剂的接枝方法非常繁琐、复杂。

因此，现有的分子印迹电化学传感器都存在导电性或灵敏度方面的问题。

发明内容

针对现有技术所存在的问题，本发明的目的在于提供了选择性识别氯霉素的分子印迹电化学传感器的制备方法。采用本发明方法所制备的分子印迹电化学传感器抗干扰能力强、灵敏度高并且导电性能不会像采用修饰功能膜方式那样受到影响。

由于分子印迹没有导电性，但是选择性很好，是电化学传感器最需要的，能够有效降低基质干扰。因此，如何把高导电性纳米材料(提高导电性)和分子印迹相结合是一个难题，因为高导电性纳米材料表面没有基团，没办法直接生长分子印迹薄膜。

在某一次实验过程中，申请人意外地发现了本发明的方法，成功的解决了电极无法将分子印迹聚合材料在其上形成牢固的分子印迹聚合膜的问题。

一般分子印迹材料的制备，需要模板(靶标分子)、功能单体、交联剂和引发剂，聚合机理就是自由基引发的双键交联反应(一般单体一个双键和交联剂两个双键)。因此传统方法是将高导电材料表面修饰功能基团(一层膜)，进而把引发剂固定上去，引发印迹材料的制备。

然后，本申请的发明人发现石墨烯金属氧化物复合材料在分子印迹材料的引发过程中，具有类酶催化特性，我们发现它可以作为引发剂，与过氧化氢、乙酰丙酮构成一个引发体系。在过氧化氢作用下，石墨烯金属氧化物复合材料可以催化乙酰丙酮，产生大量的自由基，同时这些自由基可以吸附在石墨烯金属氧化物复合材料表面，表现出高催化特性，因而无需修饰活性基团和固定引发剂，就可以引发印迹材料的聚合，制备出分子印迹/石墨烯金属氧化物复合材料，保障了分子印迹材料的选择性和石墨烯类材料的导电性，形成高效的分子印迹传感器传感器。

因此，本发明以氯霉素为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，N,N-亚甲基丙烯酰胺为交联剂，利用石墨烯基复合金属纳米材料引发聚合反应，结合电引发自由基聚合技术，在电极表面直接制备形成分子印迹聚合薄膜，所形成的聚合薄膜牢固、均匀稳定，能够对复杂基质中的氯霉素进行快速识别，高灵敏定量检测。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种选择性识别氯霉素的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将氧化石墨烯材料与金属离子化合物在有机溶剂中混合，去除有机溶剂，获得石墨烯基复合材料；

(2)将步骤(1)中所制备的石墨烯基复合材料分散到二甲基甲酰胺溶液中，并滴涂在电极表面，烘干处理；

(3)将功能单体和模板分子氯霉素溶解在2mL以上的乙腈中，混合均匀，室温孵育10分钟以上；

(4)将交联剂以及引发剂加入上述混合溶液中，再加入0.1～2倍纯水稀释，将步骤(2)中修饰后的电极插入混合溶液中，在-0.08～0.15V电场下聚合1小时以上，用乙醇洗去模板氯霉素后，得到了分子印迹电化学传感器。

优选地，所述步骤(3)中的功能单体为甲基丙烯酸，所述步骤(4)中的交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，引发剂为过氧化氢和乙酰丙酮。

优选地，步骤(3)中的甲基丙烯酸、氯霉素的摩尔比为1～6:1，步骤(4)中的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过氧化氢和乙酰丙酮的摩尔比为100～300:10～90:1。

优选地，步骤(1)中的石墨烯基复合金属纳米材料包括纳米金、血晶素、氧化锌、氧化铜、四氧化三铁与石墨烯形成的复合物。

另一方面，本发明提供一种分子印迹电化学传感器，其特征在于：通过所述的方法制备得到。

另一方面，本发明提供一种所述分子印迹电化学传感器的应用，其特征在于：所述分子印迹电化学传感器用于食品样本中氯霉素的选择性识别和定量检测。

优选地，所述分子印迹电化学传感器用于氯霉素的选择性萃取或者用于氯霉素的定量检测

另一方面，本发明提供一种氯霉素检测设备，其特征在于：所述检测设备包括权利要求1所述的分子印迹电化学传感器。一种选择性识别氯霉素的分子印迹电化学传感器的制备方法，具体如下：

本发明的所述分子印迹电化学传感器既可以用于氯霉素的选择性萃取，也可以用于氯霉素的定量检测。

本发明与背景技术中所介绍的文献和其他专利具有如下优点和有益效果：

本发明制备的分子印迹电化学传感器是集合石墨烯基复合金属纳米材料的吸附氯霉素能力、引发烯类单体聚合特性和苯环单层结构于一体，结合电聚自由基聚合技术，利用其优异的导电性能，直接在电极表面直接形成聚合物薄膜。具体表现在：(1)单位面积内印迹位点的数目大，进而具有高的选择性识别能力。(2)本发明采用石墨烯基复合金属纳米材料，直接引发烯类单体聚合反应，不需要再修饰其他功能薄膜和引发剂的接枝，不仅保障传感器的导电性和灵敏度，而且方法简单、高效，无需其他试剂。(3)石墨烯基复合金属纳米材料的苯环单层结构，导电/催化性能极高，能够实现电引发自由基聚合技术。相比于传统的紫外/热引发过程(24小时)，电引发效率高，时间短、稳定性好，能够在一个小时内制备出高效的分子印迹材料，能够实现复杂样本中目标分子的快速识别与定量检测。将制备时间可以缩短至原来的1/24。

本发明所制备的分子印迹电化学传感器对氯霉素的检测限为0.1ng/mL，线性范围为0.5-100ng/mL。

附图说明

图1是裸玻碳电极(A)和本发明的选择性识别氯霉素分子印迹电化学传感器(B)的电镜图。

图2是裸玻碳电极(A)、分子印迹传感(B)和非分子印迹传感(C)电极在表征溶液中的循环伏安曲线

图3峰电流差与氯霉素标准溶液浓度的关系曲线。

图4分子印迹电化学传感器对氯霉素及其结构类似物的识别性能。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)引发剂石墨烯-血晶素复合物的制备

将单层氧化石墨烯(0.83mmol，片径50-200nm)和血晶素(0.015mmol)溶解在20ml50％的乙醇溶液中，用1mol/L氢氧化钠溶液将pH调节至10.0，超声30分钟后，100度条件下回流1小时，冷却后避光保存；

(2)分子印迹电化学传感器的制备

2.1)将制备的石墨烯-血晶素复合物分散到二甲基甲酰胺中，配成1mg/mL的溶液，取10μL滴涂在玻碳电极表面，红外灯下烘干。

2.2)将功能单体甲基丙烯酸(4mmol)和模板分子氯霉素(1mmol)溶解2.5ml乙腈中，超声10分钟，室温孵育1小时；

2.3)将步骤2.1)制备的石墨烯-血晶素修饰电极插入到交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(10mmol)以及引发剂过氧化氢(1.96mmol)和乙酰丙酮(0.035mmol)的混合溶液中，再加入2.5ml纯水稀释，在-0.08V下聚合1小时，用乙醇溶液洗去模板氯霉素后，得到了分子印迹电化学传感器

非分子印迹电化学传感器(空白对照)的制备过程同上所述，只是制备过程中不加入模板氯霉素。

血晶素是含铁红蛋白的体外纯化形式，可以和氧化石墨烯形成具有协同效应的石墨烯基复合金属纳米材料，用作在电极表面直接合成分子印迹聚合薄膜的基底材料和引发剂。图1示出了实施例1制备的选择性识别氯霉素分子印迹电化学传感器的电镜图。电镜图显示：氯霉素分子印迹薄膜均匀的覆盖在玻碳电极表面。

实施例2

将实施例1制备的分子印迹电化学传感电极、非分子印迹电化学传感电极和裸玻碳电极依次与铂对电极和参比电极组成的三电极体系插入10ml5mmol L^-1K₃Fe(CN)₆水溶液中，在-0.3～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描10圈，扫描速度为50mV s^-1，得到相应的循环伏安曲线。结果如图2所示，玻碳电极表面修饰分子印迹聚合薄膜后，电流响应变小，而修饰了非分子印迹聚合薄膜的玻碳电极的几乎没有电流响应。这是因为氯霉素分子印迹薄膜部分阻挡了探针分子铁氰化钾在玻碳电极表面的氧化还原电化学行为，但是由于模板分子被洗脱，仍然有部分印迹孔穴被暴露出来，所以电流响应只是部分减少。而分子印迹薄膜没有模板分子洗脱后留下的孔穴结构，几乎完全阻挡了探针分子的电化学行为，所以峰电流几乎降为0.

实施例3

将实施例1制备的分子印迹电化学传感电极、铂对电极和参比电极组成的三电极体系插入10ml含氯霉素的5mmol L^-1K₃Fe(CN)₆水溶液中，氯霉素的浓度分别为0-100μg/L。磁力搅拌10分钟后，在-0.3～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描10圈，扫描速度为50mV s^-1，得到与裸玻碳电极峰电流响应差值均值，得到峰电流差与氯霉素标准溶液浓度的关系曲线。结果如图3所示，在浓度0.5-100ng/mL的范围内，峰电流响应与氯霉素浓度保持良好的线性，检测限为0.1ng/mL，能够实现食物样品中氯霉素的快速，高通量检测。

实施例4

将实施例1制备的分子印迹电化学传感电极、铂对电极和参比电极组成的三电极体系分别插入10ml含氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、硝基苯的5mmol L^-1K₃Fe(CN)₆水溶液中，浓度为50ng/mL，磁力搅拌10分钟后，在-0.3～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描10圈，扫描速度为50mV s^-1，得到分子印迹电化学传感器对各种氯霉素类药物的选择性识别响应。结果如图4所示，虽然由于氯霉素类药物分子结构的相似性，分子印迹电化学传感器对氯霉素类药物都有一定的响应，但是对与目标分子氯霉素的响应最为明显，这也证明了电极表面分子印迹聚合物的成功制备，以及分子印迹电化学传感器对氯霉素的特异性识别能力。

实施例5

(1)将石墨烯-纳米金复合物分散到二甲基甲酰胺中，配成5mg/mL的溶液，取2μL滴涂在玻碳电极表面，红外灯下烘干。

(2)将功能单体甲基丙烯酸(6mmol)和模板分子氯霉素(1mmol)溶解5ml乙腈中，超声30分钟，室温孵育4小时；

(3)将步骤2.1)制备的石墨烯-血晶素修饰电极插入到交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(3.5mmol)以及引发剂过氧化氢(3.15mmol)和乙酰丙酮(0.035mmol)的混合溶液中，再加入5ml纯水稀释，在-0.1V下聚合2小时，用乙醇溶液洗去模板氯霉素后，得到了分子印迹电化学传感器。

实施例6

(1)将石墨烯-四氧化三铁复合物分散到二甲基甲酰胺中，配成1mg/mL的溶液，取4μL滴涂在玻碳电极表面，红外灯下烘干。

(2)将功能单体甲基丙烯酸(5mmol)和模板分子氯霉素(1mmol)溶解20ml乙腈中，超声50分钟，室温孵育8小时；

(3)将步骤2.1)制备的石墨烯-血晶素修饰电极插入到交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺(10.5mmol)以及引发剂过氧化氢(0.35mmol)和乙酰丙酮(0.035mmol)的混合溶液中，再加入5ml纯水稀释，在-0.14V下聚合6小时，用乙醇溶液洗去模板氯霉素后，得到了分子印迹电化学传感器。

从上面的实施例可以看出，申请人采用其他离子化合物(包括纳米金、氧化锌、氧化铜、四氧化三铁)替代等量或近似量的血晶素采用上述方法进行了类似实验，也能够获得分子印迹电化学传感器。但是，经过实验测试发现，利用含铜离子化合物制备的复合材料进行的测试实验，其引发性能优于含铁化合物制备的复合材料50％以上，含铁化合物又优于其他金属化合物。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (7)

1.一种选择性识别氯霉素的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将氧化石墨烯材料与含金属离子化合物混合，通过水热反应制备石墨烯基复合材料；

(2)将步骤(1)中所制备的石墨烯基复合材料分散到二甲基甲酰胺溶液中，并滴涂在电极表面，烘干处理；

(3)将功能单体和模板分子氯霉素溶解在2mL以上的乙腈中，混合均匀，室温孵育第一预定时间；

(4)将交联剂以及引发剂加入上述混合溶液中，再加入0.1～2倍纯水稀释，将步骤(2)中修饰后的电极插入混合溶液中，在电场下聚合第二预定时间，用乙醇洗去模板氯霉素后，得到了分子印迹电化学传感器，

其中，步骤(1)中的石墨烯基复合金属纳米材料包括纳米金、血晶素、氧化锌、氧化铜或四氧化三铁与石墨烯形成的复合物，所述步骤(3)中的功能单体为甲基丙烯酸，所述步骤(4)中的交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，引发剂为石墨烯基复合材料、过氧化氢和乙酰丙酮。

2.根据权利要求1所述的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的甲基丙烯酸、氯霉素的摩尔比为1～6:1，步骤(4)中的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过氧化氢和乙酰丙酮的摩尔比为100～300:10～90:1。

3.根据权利要求1所述的分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于：所述第一预定时间大于等于10分钟，所述第二预定时间大于等于1小时。

4.一种分子印迹电化学传感器，其特征在于：通过权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。

5.一种权利要求1中所述的分子印迹电化学传感器的应用，其特征在于：所述分子印迹电化学传感器用于食品样本中氯霉素的选择性识别和定量检测。

6.根据权利要求5中所述的应用，其特征在于：分子印迹电化学传感器用于氯霉素的选择性萃取或者用于氯霉素的定量检测

7.一种氯霉素检测设备，其特征在于：所述检测设备包括权利要求1所述的分子印迹电化学传感器。

Images