CN109289060B - 一种多模态微囊造影剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种多模态微囊造影剂及其制备方法和应用。本发明所述造影剂是以高分子材料为外壳包裹材料，内部包裹ICG、MB以及PFC气体的微囊，粒径在10微米以下。本发明通过双乳化法制备了一种多模态的微囊造影剂，其将三种材料互不影响地包裹在高分子材料中，在利用双波长荧光系统测量表面下荧光物体的深度的同时还可以利用超声造影的功能获取被测病灶对象的结构参数，其显影效果较普通的造影剂相比能够提供多种有用的模态信息，使FMT和超声两种不同模态之间相互配合提高测量精度。

Description

一种多模态微囊造影剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种多模态微囊造影剂及其制备方法和应用。
背景技术
在过去的二十年里，已经开发了几种体内荧光源的定位方法，包括基于时间的成像和基于结构光的成像以及荧光分子断层扫描(FMT)。目前，深度剖析的主要手段是FMT。FMT使用光源-探测器通过基于光强的相对变化求解逆问题，来提高深度分辨率。但是这些技术的数据采集通常是十分耗时而且需要昂贵的设备，特别是针对那些需要实时反馈的应用以及在测量荧光物体深度的同时又需获得荧光物体本身结构的空间分布信息。目前还缺少方便高效的方法和仪器。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种多模态微囊造影剂及其制备方法。使得所述造影剂可以同时适用于FMT和超声造影，并能够在利用双波长荧光系统测量表面下荧光物体的深度信号参数的同时还可以利用超声造影的功能获取被测病灶对象的结构参数；
本发明的另外一种目的在于提供上述造影剂在获取被测病灶对象荧光参数和结构参数中的相关应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种多模态微囊造影剂，其是以高分子材料为外壳包裹材料，内部包裹ICG、MB以及PFC气体的微囊，粒径在10微米以下。
本发明通过双乳法对两种FMT荧光材料进行两次乳化，然后再利用匀质进行高分子材料的固化，并对冻干以后的颗粒通过加压通入PFC气体，由于PFC气体的扩散作用和PLGA大分子之间的间隙所以会获得包裹的颗粒，以此完成高分子材料包裹ICG、MB以及PFC气体的微囊结构，使造影剂具备不会互相干扰的双近红外荧光波长段，且具有超声增强性质，可以同时实现FMT以及超声造影的检测，并且两种检测手段互不影响。
作为优选，所述PFC气体为C3F8或C4F10；
作为优选，所述高分子材料PLGA、ICG、MB和PFC气体质量比依次为500:1.25:6.25:40；在本发明具体实施方式中所述高分子材料PLGA、ICG、MB和C3F8质量比依次为500mg:1.25mg:6.25mg:40mg。
作为优选，所述高分子材料为PLGA，其分子量优选为10000。
本发明可通过控制制备过程中的某些参数如匀质时的转速，PLGA的分子量以及各不同溶剂的浓度，来控制造影剂粒径的大小；为了满足造影剂的注射要求，本发明的造影剂粒径在10微米以下，同时为了进一步考虑超声增强的性质不被影响，本发明选择3-6微米的粒径范围，整体平均粒径在4-5微米，如此能够同时保证两种检测手段的较佳检测结果。
本发明所述造影剂显影效果较普通的造影剂相比能够提供多种有用的模态信息，而且不同模态之间相互配合可以提高测量精度。因此，本发明提出了所述造影剂在获取待测病灶中间荧光参数以及中间结构参数中的应用或在制备FMT和超声联合造影试剂中的应用。
此外，本发明还提供所述造影剂的制备方法，包括：
步骤1、将溶解了ICG和MB的PVA溶液与溶解了PLGA的有机溶剂混合并均质，获得初始乳化液；
步骤2、所述初始乳化液与PVA溶液混合并均质，获得粗双乳化液；
步骤3、所述粗双乳化液与异丙醇溶液混合搅拌，然后过滤，滤液离心洗涤，取沉淀；
步骤4、将所得沉淀冷冻干燥，将冻干后的颗粒保存在抽真空的密闭容器中，再加压通入PFC气体到玻璃瓶中，获得所述造影剂。
其中，所述加压的压强为0.25Mpa；所述冷冻干燥先在零下80冰箱放置12小时，然后放入冻干机中在零下80度，真空度在20Pa以下进行冻干24h；
作为优选，所述ICG的浓度为1.25mg/mL PVA溶液，所述MB的浓度为6.25mg/mL PVA溶液。
作为优选，所述PVA溶液的质量百分比浓度为1-5％；在本发明具体实施方式中，步骤1中的PVA溶液的质量百分比浓度为1％，步骤2中的PVA溶液的质量百分比浓度为5％；
作为优选，所述溶解了PLGA的有机溶剂为溶解了PLGA的二氯甲烷；在本发明具体实施方式中，所述PLGA的浓度为50mg/mL二氯甲烷。而溶解了ICG和MB的PVA溶液与溶解了PLGA的有机溶剂的体积比优选为1:10；
作为优选，所述粗双乳化液与异丙醇溶液的体积比:8:5，在本发明具体实施方式中所述体积比为160ml:100ml。
作为优选，所述冻干后的颗粒与PFC气体的的质量比为50:4，在本发明具体实施方式中所述比例为500mg:40mg。
作为优选，所述均质的转速为5000-20000rpm，时间在3-5min；在本发明具体实施方式中，步骤1中的均质转速为20000rpm，时间为5min；步骤2中的均质转速为5000rpm，时间为3min。
由以上技术方案可知，本发明通过双乳化法制备了一种多模态的微囊造影剂，其将三种材料互不影响地包裹在高分子材料中，在利用双波长荧光系统测量表面下荧光物体的深度的同时还可以利用超声造影的功能获取被测病灶对象的结构信息，其显影效果较普通的造影剂相比能够提供多种有用的模态信息，使FMT和超声两种不同模态之间相互配合提高测量精度。
附图说明
图1所示为造影剂的结构信息；其中a是用SEM获得的颗粒的形状，成圆球状，图中标度尺为5微米；b是颗粒大小分布图，横坐标是颗粒直径，纵坐标是百分比；c是共聚焦显微镜的明场图；d是共聚焦显微镜的荧光图；e是本发明造影剂稳态/瞬态荧光光谱仪检测结果；
图2所示为将本发明的造影剂用于仿体中进行深度评估实验结果图；其中a是制备的具有特定光学吸收和散射系数的仿体模型；b是由超声模态获得超声结果图；c是不结合超声的结构参数时基于组织参数的预测的深度图；d是结合超声的结构参数作为先验参数指导基于组织参数的进行深度预测的结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种多模态微囊造影剂及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述造影剂及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的造影剂及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述多模态造影剂进行病灶大小评估和组织下深度预测的主要原理为：在生物组织中注入该多模态造影剂到病灶区域，首先可以利用超声成像获取病灶的中间结构参数(后续通过电脑分析计算输出最终的病灶结构和大小信息)；然后，外部分别用630nm或785nm(630nm激发光对应的695nm的荧光材料MB，785nm对应的810nm的荧光材料ICG)的激光照射以激发产生荧光，拍摄高光谱图像的荧光摄像头便可以通过滤光片转轮切换对应的滤光片以捕获组织中含有MB或ICG的组织图像，获取中间荧光参数。
接着，利用两个波长处检测到的荧光的比率的自然对数随深度线性变化关系，即上述中间荧光参数，对造影剂在组织下的深度进行定量计算。病灶深度信息和结构信息可以声音提示形式传达医生，为医生提供下刀深度和切除大小的信息；同时造影剂在切除过程中实时提供荧光图像，使医生在操作过程中能更加准确得对肿瘤组织进行定位和切除。
以下就本发明所提供的一种多模态微囊造影剂及其制备方法和应用做进一步说明。
实施例1：制备本发明多模态微囊造影剂
a.将溶解了1.25mg ICG和6.25mg MB的1mlPVA(1％，w/v)溶液添加到溶解了500mgPLGA的10ml二氯甲烷，然后在冰浴中，利用均质机以20000rpm均质5分钟，同时在均质过程中要将溶液匀速移动使均质更改充分，形成初始乳化液。
b.对于第二步乳化，首先将前面步骤a制备的乳化液中加入50mlPVA溶液(5％w/v)，然后在冰浴条件下，利用均质机以5000rpm均质3分钟形成粗双乳化液。
c.将步骤b获得粗双乳化液加入到100ml异丙醇溶液(2％v/v)中，利用磁力搅拌器搅拌2小时，一方面挥发有机试剂，另一方面让PLGA壳充分固化。
d.将步骤c的溶液重复进行过滤、离心洗涤3次。
e.将步骤d得到的沉淀冷冻干燥48小时。将冻干后的颗粒保存在以一定压强通入C3F8的玻璃瓶中，并用铝箔纸包裹。
通过上述步骤即可得到所需要的多模态微囊造影剂。
将制备的造影剂进行扫描电镜观察、荧光分析以及粒径分布分析，结果见图1。
由图1可以看出，本发明使用的包裹方法获得颗粒的形貌成圆球状(图1-a)，粒径大小在10um以下符合注射要求，粒径大小平均在4.5-5微米，可以同时保证两种检测手段的较佳检测结果(图1-b)；同时从共聚焦显微镜和稳态/瞬态荧光光谱仪获得光学结果(图1-c、图1-d、图1-e)显示本发明制备的微颗粒具有明显的双波长性质，造影剂的荧光波长信息分别是695nm和810nm；荧光材料被包裹在了微球内部，形貌符合a与b的观察，结构满足后面的深度实验要求。
实施例2：生物组织下深度测量实验
步骤1、使用琼脂糖粉末制备仿体模型，分别添加Intralipid和印度墨水作为光学散射剂和吸收剂，并在仿体中制备直径为3mm，深度为5mm的孔，如图2中的a。
步骤2、按实施例1的步骤制备所需的多模态造影剂，并将造影剂溶解在超纯水中浓度为3mg/ml，并注入制备的仿体孔中，表面覆盖特定光学参数的仿体厚度为1mm。
步骤3、首先用超声探头从仿体的侧面进行超声成像，如图2中的b。
步骤4、然后分别将仿体在695nm激发光和780nm激发光下进行荧光成像，然后利用两种波长下荧光信号比与荧光透过的表面的组织光学参数的线性关系逐像素点的进行深度预测，如图2中c为在没用利用超声获得的结构参数得到的深度评估图。
步骤5、利用步骤3获得的超声图像和步骤4获得荧光图像进行图像校正，如图2中d为执行校准后获得的造影剂的深度评估结果。
通过上述步骤即可利用实施例1制备的多模态造影剂实现生物组织下深度的评估测量。
由图2可以看出，本发明利用微包裹技术所制备的造影剂首先具有多模态造影功能包括超声模态和多波长荧光模态，两种模态互不影响，均能够获得预期的参数信息；同时，利用超声获得先验的结构信息用于指导双波长荧光信号比与通过的表层组织的光学参数的线性关系进行深度预测可以提高预测的结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种荧光分子断层扫描和超声多模态微囊造影剂，其特征在于，是以高分子材料PLGA为外壳包裹材料，内部包裹ICG、MB以及PFC气体的微囊，粒径在3-6微米，所述PFC气体为C3F8或C4F10。
2.根据权利要求1所述造影剂，其特征在于，所述高分子材料PLGA、ICG、MB和PFC气体质量比依次为500:1.25:6.25:40。
3.权利要求1-2任意一项所述造影剂在制备获取待测病灶中间荧光参数以及中间结构参数的试剂中的应用或在制备荧光分子断层扫描和超声联合造影试剂中的应用。
4.权利要求1所述造影剂的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1、将溶解了ICG和MB的PVA溶液与溶解了PLGA的有机溶剂混合并均质，获得初始乳化液；
步骤2、所述初始乳化液与PVA溶液混合并均质，获得粗双乳化液；
步骤3、所述粗双乳化液与异丙醇溶液混合搅拌，然后过滤，滤液离心洗涤，取沉淀；
步骤4、将所得沉淀冷冻干燥，将冻干后的颗粒保存在抽真空的密闭容器中，再加压通入PFC气体，获得所述造影剂。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述ICG的浓度为1.25mg/mL PVA溶液，所述MB的浓度为6.25mg/mL PVA溶液。
6.根据权利要求4或5所述制备方法，其特征在于，所述步骤2中PVA溶液的质量百分比浓度为1-5%。
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述溶解了PLGA的有机溶剂为溶解了PLGA的二氯甲烷。
8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述粗双乳化液与异丙醇溶液的体积比为8:5。
9.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述冻干后的颗粒与PFC气体的质量比为50:4。
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