CN109206371A

CN109206371A - 一种提高替莫唑胺药效的方法及Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物

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Publication number: CN109206371A
Application number: CN201811060467.XA
Authority: CN
Inventors: 冯福德; 黎晓
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2018-09-12
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2038-09-12
Also published as: CN109206371B

Abstract

本发明公开了一种提高替莫唑胺药效的方法及Cu‑MTIC去铁蛋白纳米复合物，属于生物化学技术领域。该方法是将替莫唑胺的第一步分解产物通过金属离子进行稳定后，再与铁蛋白纳米笼相结合，得到铁蛋白包载的纳米复合材料。其中铜离子对替莫唑胺药效的提高是通过与替莫唑胺降解后烷基化活性更高的MTIC的结合和稳定。本发明所得金属‑药物纳米复合物的金属‑药物负载效率高，MTIC稳定性大大提高，在生理pH条件下能够持续稳定存在，可在谷胱甘肽存在下可控释放MTIC，通过去铁蛋白的富集和包载，提高细胞摄取效率，延长了其在动物模型中的体内循环时间，增强药物的作用效率，且制备简单，易操作，在恶性肿瘤治疗领域有广泛应用前景。

Description

一种提高替莫唑胺药效的方法及Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物

技术领域

本发明属药物输送和生物基纳米材料的合成与制备领域，涉及一种提高替莫唑胺药效方法和铁蛋白包载Cu-MTIC的生物纳米材料及制备方法和应用。

背景技术

替莫唑胺(TMZ)是抗恶性胶质瘤和黑色素瘤的一线化疗药物，其通过在生理环境条件下开环分解，生成中间产物MTIC，TMZ半衰期约为1.37h，MTIC 的半衰期仅为2min，随后分解生成AIC和甲基重氮正离子，甲基重氮正离子进一步分解为氮气和甲基正离子自由基，甲基正离子自由基是高活性物质，能对基因组DNA特别是其鸟嘌呤片段部分进行甲基化作用，导致DNA的错误复制和蛋白质表达受限，从而引起细胞信息紊乱进而导致细胞凋亡，因此TMZ对于快速分裂增殖的恶性细胞具有更大的抑制生长和杀伤作用。由于TMZ在生理条件下的不稳定性，其循环时间较短，并且该分子不具有靶向性，恶性胶质瘤细胞系和黑色素瘤细胞系对TMZ具有一定的抗药性，需要通过提高药物浓度来实现药效，而与此同时即会对正常组织细胞造成伤害，如引发肝损伤等。提高TMZ或 MTIC的稳定性，构建具有靶向性输送和可控释放的纳米复合体系能有效解决这一问题。

蛋白质纳米笼是一类广泛存在于生物体系中的生物蛋白基纳米材料，因其是由氨基酸序列组建成的，且具有纳米尺度的壳核形笼状结构而得名。不同的蛋白纳米笼在生物体内扮演不同的角色，发挥各异的功能。最早的蛋白质纳米笼提取和制备，主要用于研究其在生理条件下的特有功能。随着生物技术的不断发展，其与化学学科的融合过程也进一步加深。生物化学领域中，充分利用普遍存在的天然生物基纳米颗粒，将其作为化学药物、合成功能材料等的载体，从而构建多功能的载送体系已成为一种趋势。

铁蛋白作为一种普遍存在于生物体内并维持生理条件下铁平衡的功能蛋白，属于蛋白质纳米笼家族中的一类。它尺寸规整，单分散性好，内径7～8nm，外径 10～12nm。铁蛋白的蛋白外壳由24个亚基组成，在酸性pH条件下亚基解离为分散的结构，当调节体系pH至碱性时，亚基自组装还原为原来的蛋白笼状结构。铁蛋白的外壳上形成有三重和四重通道，用于铁蛋白内外的物质交换。去铁蛋白内部的疏水性区域常用于包载疏水性药物、有机金属配合物和量子点等，蛋白外壳可以同时进行基因改造、靶向基团修饰和荧光分子修饰等，所得到的纳米颗粒在保持蛋白本身的生物特性的同时，兼具包载物和修饰物赋予的多重功能，可应用于细胞成像、定点靶向和癌症治疗等领域。

发明内容

发明目的：本发明的目的之一是提供一种Cu-MTIC复合物及其制备方法和应用；本发明的目的之二是提供一种Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物及其制备方法和应用；本发明的目的之三是提供一种提高替莫唑胺药效或稳定MTIC的方法。该Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物在具备所包载的金属-药物复合物的原有性质的同时，提高了其稳定性和生物相容性等，金属-药物负载效率高，MTIC的稳定性大大提高，在生理pH条件下能够持续稳定存在，通过去铁蛋白的富集和包载，提高了细胞摄取效率，延长了其在动物模型中的体内循环时间，增强了药物的作用效率，且制备过程简单，易操作，在恶性肿瘤治疗领域有广泛应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的Cu-MTIC复合物的制备方法，包括：使Cu²⁺与MTIC结合。

MTIC通常为替莫唑胺分解的中间产物，这种结合可为替莫唑胺开环为 MTIC后与Cu²⁺结合，通过原位合成Cu-MTIC复合物。替莫唑胺开环为MTIC 的条件为中性或碱性pH条件。

所述结合的pH条件为7.4～9.2，进一步优选pH为8；Cu²⁺与MTIC的摩尔比值不低于1，如可为1～2；若比值低于1，则MTIC未充分被稳定，一般比值过高除了会增加体系中的Cu浓度外，不会对MTIC的稳定有负面影响。

具体的，所述的Cu-MTIC复合物的制备方法，包括：将替莫唑胺分散于缓冲溶液中，然后加入氯化铜混合，调节混合液pH为7.4～9.2，进一步优选pH为 8，搅拌，得到Cu-MTIC复合物。其中，搅拌在室温条件下进行，时间为1～4h，至TMZ完全分解后的MTIC完全与Cu²⁺结合；分散替莫唑胺的初始缓冲液的pH 只要保证其处于较稳定的状态即可，防止替莫唑胺过早分解为MTIC并进一步分解AIC，例如可以为7.0～7.4。

本发明提供了一种Cu-MTIC复合物，根据上述制备方法制备得到。

本发明还提供了一种Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物，Cu-MTIC被包载入去铁蛋白的内腔，Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的直径为10～13nm。去铁蛋白具有笼状结构。利用去铁蛋白的纳米笼状结构来包载Cu-MTIC，可以在不折损 Cu-MTIC原有性质和功能的条件下，提高其生物相容性、基质稳定性和细胞靶向性。

Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物中，铜离子、替莫唑胺和去铁蛋白的摩尔比为100：200：1～200：200：1。

本发明还提供了所述的Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物的制备方法，包括：

(1)制备去铁蛋白，使去铁蛋白处于的缓冲溶液中；

(2)搅拌下，向去铁蛋白溶液中加入替莫唑胺和氯化铜，调节溶液pH至 7.4～9.2，反应后得到Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物。

步骤(1)中，去铁蛋白可采用常规方法进行制备，所述缓冲溶液的pH条件为7.0～7.4。

步骤(2)中，一般先加替莫唑胺，再加氯化铜，加入两者时，可先将两者溶解于少量的水中以溶液的形式加入；反应时间为1～4h；初始的pH条件下， TMZ分解为MTIC的速度较慢，不能在1～4h充分分解为MTIC并与Cu²⁺结合，提高包载过程中的pH至7.4～9.2进一步为8左右有利于TMZ在合适的速度分解为MTIC，实现与Cu²⁺的结合，pH过高则TMZ分解速度过快，所得的MTIC来不及与Cu²⁺结合而被稳定。

本发明在Cu-MTIC复合物、Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物制备中，所述缓冲溶液为HEPES缓冲溶液或PBS缓冲溶液。

本发明还提供了所述的Cu-MTIC复合物、所述的Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物在制抗肿瘤药物中的应用。

本发明又提供了一种提高替莫唑胺药效或稳定MTIC的方法，包括：使铜离子与替莫唑胺的开环产物MTIC结合形成所述的Cu-MTIC复合物；或使铜离子与替莫唑胺的开环产物MTIC结合后与去铁蛋白进行结合形成所述的Cu-MTIC 去铁蛋白纳米复合物。

发明原理：在TMZ中性或碱性pH条件分解生成MTIC的过程中，通过引入金属离子Cu²⁺，直接对MTIC进行稳定，提高了TMZ发挥药效的中间产物的稳定性，再将其载入到去铁蛋白纳米空腔中，通过去铁蛋白靶向识别转铁蛋白受体TfR1和由其介导的细胞摄取，来提高药物的靶向性和细胞摄取效率，使TMZ 的药效得到大幅提升。

有益效果：

(1)本发明验证了金属Cu²⁺能对TMZ的开环产物MTIC进行结合和使之在生理pH条件下稳定存在，并且这种稳定化在如谷胱甘肽(GSH)存在的条件下可以解除来释放MTIC；

(2)本发明所用原料是为生物基原料，本身具有规整的纳米尺寸和笼状结构，且水溶性和生物相容性良好，对恶性细胞具有一定的靶向性，符合作为生物纳米载体材料的要求；

(3)本发明的包载方法中，采用了TMZ在生理pH条件和弱碱性条件下生成MTIC后，原位地与Cu²⁺以及铁蛋白进行结合，提高了MTIC的结合率和稳定性的同时，可以提高细胞对Cu-MTIC的摄取，有助于其药效的提高；

(4)本发明所制备的复合物具有纳米尺寸，结构完整，单分散性好，水溶液中稳定性好；

(5)本发明制备的纳米复合物保持有蛋白质纳米材料的生物性质的同时，也保留有Cu-MTIC的基本性质；

(6)本发明制备过程简单易操作，包载效率高，实用性强。

附图说明

图1为Cu-MTIC的制备工艺流程图；

图2为AIC的紫外吸收光谱图；

图3为CuCl₂和AIC混合物的紫外吸收光谱图；

图4为TMZ在pH＝5.0缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图5为TMZ在pH＝7.4缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图6为TMZ在pH＝9.2缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图7为MTIC在pH＝5.0缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图8为MTIC在pH＝7.4缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图9为MTIC在pH＝9.2缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图10为CuCl₂和TMZ混合后在pH＝5.0缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图11为CuCl₂和TMZ混合后在pH＝7.4缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图12为CuCl₂和TMZ混合后在pH＝9.2缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图13为Cu-MTIC在pH＝5.0缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图14为Cu-MTIC在pH＝7.4缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图15为Cu-MTIC在pH＝9.2缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图16为Cu-MTIC中加入Na₂S后不同时间点的紫外吸收光谱图；

图17为Cu-MTIC用Na₂S夺去铜后的质谱图；

图18为AIC的超高效液相色谱图；

图19为TMZ的超高效液相色谱图；

图20为MTIC的超高效液相色谱图；

图21为CuCl₂和TMZ在NaHCO₃溶液中转变为Cu-MTIC的超高效液相色谱图；

图22为TMZ的核磁共振氢谱图；

图23为Cu-MTIC(从TMZ制备而来)的核磁共振氢谱图；

图24为MTIC的核磁共振氢谱图；

图25为Cu-MTIC(从MTIC制备而来)的核磁共振氢谱图；

图26为Cy5.5和Cy5.5-铁蛋白分别被U87MG细胞摄取的细胞成像图；

图27为Cy5.5和Cy5.5-铁蛋白分别被T98G细胞摄取的细胞成像图；

图28为Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的制备工艺流程图；

图29为Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的高分辨透射电子显微镜图；

图30为铁蛋白和Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的粒径分布图；

图31为铁蛋白和Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的圆二色谱图；

图32为Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物在pH＝7.4缓冲溶液中不同时间点的紫外吸收光谱图；

图33为Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物在pH＝7.4缓冲溶液中与GSH作用后的紫外吸收光谱图；

图34为不同浓度的TMZ、Cu²⁺、CuMTIC和Cu-MTIC去铁蛋白复合物对 U87MG的细胞毒性图；

图35为不同浓度的TMZ和Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物对U87MG的细胞毒性图；

图36为不同浓度的TMZ、Cu²⁺、CuMTIC和Cu-MTIC去铁蛋白复合物对 T98G的细胞毒性图；

图37为不同浓度的TMZ和Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物对T98G的细胞毒性图；

图38为不同浓度的TMZ对T98G的细胞毒性流式图；

图39为不同浓度的Cu-MTIC对U87MG的细胞毒性流式图；

图40为不同浓度的对Cu-MTIC铁蛋白复合物U87MG的细胞毒性流式图；

图41为不同浓度的TMZ对T98G的细胞毒性流式图；

图42为不同浓度的Cu-MTIC对T98G的细胞毒性流式图；

图43为不同浓度的Cu-MTIC铁蛋白复合物对T98G的细胞毒性流式图；

图44为小鼠模型的肿瘤体积变化图；

图45为小鼠模型的体重变化图；

图46为小鼠模型的肿瘤明场成像图；

图47为小鼠模型的肿瘤质量统计图；

图48为小鼠模型的肿瘤组织切片H&E染色图；

图49为小鼠模型的肿瘤组织切片Tunel和DAPI染色图；

图50为小鼠模型的肝脏组织切片H&E染色图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

下述的实现方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

实施例1.金属离子对MTIC的稳定作用及溶液酸碱性对其稳定性的影响

Cu-MTIC的制备工艺流程图如图1所示，所得的Cu-MTIC在不同pH条件下的稳定性能说明其稳定的有机配体为MTIC。配制不同pH的20mM HEPES 或PBS缓冲溶液，通过pH计对缓冲溶液pH进行测定，得到pH分别为5.0、7.4 和9.2的缓冲溶液，在这些缓冲溶液中分别测定AIC、TMZ、MTIC和Cu-MTIC 的紫外吸收光谱随时间的变化情况。

Cu-MTIC的制备方法包括：将替莫唑胺溶解于一定pH的缓冲溶液，并加入氯化铜溶液(氯化铜用少量水溶解)混合，Cu²⁺：MTIC的摩尔比＝2：1，调节溶液pH至8后，室温下搅拌(1～4h)，得到Cu-MTIC。

(1)金属离子和溶液酸碱度对AIC吸收光谱的影响

在上述不同的pH 5.0、7.4和9.2的缓冲溶液中加入AIC，AIC的浓度是100 μM，测定溶液酸碱度对AIC吸收光谱的影响，之后向各自的溶液中加入氯化铜， Cu²⁺离子浓度为200μM，测定金属离子对AIC吸收光谱的影响。

在不同pH条件的缓冲溶液中，AIC的紫外最大吸收峰为263nm，如图2所示(三种pH的缓冲溶液中所得图谱相似，图2所取的是pH 7.4中测得的，AIC 的测定浓度为100μM，所有紫外光谱图都在该浓度条件下测定，但经过了吸光度的归一化处理后得到图列中的图)。AIC中加入Cu²⁺后，溶液转变为棕黑色，紫外吸收的最大特征吸收峰位移保持不变，在200～250nm之间是受到Cu²⁺影响 (在紫外图中，单纯的CuCl₂会对短波段的吸收有一定影响，即浓度越高，该波段的吸收值越强，但不会影响300～500nm的吸收，即不影响之后的分析)，吸收值增强，如图3所示(加入的Cu²⁺离子浓度为200μM)。综上所述，Cu²⁺的加入不影响AIC及长波段300～500nm的吸收，该波段可用于Cu²⁺对TMZ或MTIC 的稳定性影响的分析。

(2)金属离子和溶液酸碱度对TMZ吸收光谱的影响

在上述不同的pH 5.0、7.4和9.2的缓冲溶液中加入TMZ，TMZ的浓度是 100μM，测定溶液酸碱度对TMZ吸收光谱的影响。

在pH＝5.0的HEPES缓冲溶液中，测定TMZ(浓度为100μM，紫外图归一化处理)的紫外吸收光谱随时间的变化，如图4所示。TMZ在330nm的最大特征吸收峰不发生位移和形状的变化，说明TMZ在酸性pH条件下非常稳定。

在pH＝7.4的HEPES缓冲溶液中，测定TMZ(浓度为100μM，紫外图归一化处理)的紫外吸收光谱随时间的变化，如图5所示。TMZ在330nm的最大特征吸收峰不发生位移变化，但吸收强度随着时间的递增而缓慢衰减，而263nm 处的AIC的特征吸收峰随之增强，说明TMZ在中性pH条件下稳定性减弱，并逐渐转变为AIC。

在pH＝9.2的HEPES缓冲溶液中，测定TMZ(浓度为100μM，紫外图归一化处理)的紫外吸收光谱随时间的变化，如图6所示。TMZ在330nm的最大特征吸收峰不发生位移和形状变化，但吸收强度随着时间的递增而快速衰减，同时 263nm处的AIC的特征吸收峰随之增强，说明TMZ在碱性pH条件下稳定性差，将快速分解转变为AIC。

以Cu²⁺：TMZ的摩尔质量比为2:1的比例，将CuCl₂溶液滴加到上述不同酸碱度的TMZ溶液中，测定溶液紫外分吸收光谱随时间的变化。另，发明人还探讨了Cu²⁺：TMZ的摩尔质量比为1:1的比例，结果差异不大，下面以2:1的比例详细说明。

在pH＝5.0的HEPES缓冲溶液中，测定CuCl₂和TMZ混合溶液的紫外吸收光谱随时间的变化，如图7所示。混合溶液的最大特征吸收峰为与TMZ相同的在330nm的最大吸收峰，且该峰在此条件下不发生位移和形状的变化，结合TMZ 在酸性pH条件下稳定的特性，说明Cu²⁺与TMZ无相互作用。

在pH＝7.4的HEPES缓冲溶液中，测定CuCl₂和TMZ混合溶液的紫外吸收光谱随时间的变化，如图8所示。随着时间的推移，混合溶液的最大特征吸收峰从330nm处开始缓慢红移，且吸收峰强度略微增强，说明此条件下TMZ的降解产物MTIC与Cu²⁺有一定的相互作用。在此条件下TMZ缓慢开环为MTIC，但并未直接转变为AIC，而是以Cu-MTIC的形式得以稳定，溶液颜色从无色转变为淡绿色。

在pH＝9.2的HEPES缓冲溶液中，测定CuCl₂和TMZ混合溶液的紫外吸收光谱随时间的变化，如图9所示。随着时间的推移，混合溶液的最大特征吸收峰从330nm处红移至350nm左右，且吸收峰强度增强，说明此条件下TMZ降解速度加快，同时加速了其降解产物MTIC与Cu²⁺的结合，溶液颜色从无色更快地转变为淡绿色。

(3)金属离子和溶液酸碱度对MTIC吸收光谱的影响

在上述不同的pH 5.0、7.4和9.2的缓冲溶液中加入MTIC，MTIC的浓度是 100μM，测定溶液酸碱度对MTIC吸收光谱的影响。

在pH＝5.0的HEPES缓冲溶液中，测定MTIC的紫外吸收光谱随时间的变化，如图10所示，MTIC快速分解为AIC，说明MTIC在酸性pH条件下极不稳定。

在pH＝7.4的HEPES缓冲溶液中，测定MTIC的紫外吸收光谱随时间的变化，如图11所示。MTIC在324nm的最大特征吸收峰强度随着时间快速下降，而 263nm处的AIC的特征吸收峰随之增强，说明MTIC在中性pH条件下稳定性比酸性pH条件下的稳定性稍强，但也快速转变为AIC。

在pH＝9.2的HEPES缓冲溶液中，测定MTIC的紫外吸收光谱随时间的变化，如图12所示。MTIC在324nm的最大特征吸收峰强度随着时间快速下降，而 263nm处的AIC的特征吸收峰随之增强，说明MTIC在中性pH条件下稳定性比酸性pH条件下的稳定性稍强，但也快速转变为AIC。

将氯化铜和MTIC分别用少量水溶解后，以Cu²⁺：MTIC的摩尔质量比为 2:1的比例混合，可直接得到绿色Cu-MTIC溶液，将Cu-MTIC溶液用不同酸碱度的缓冲溶液进行稀释1000倍，MTIC的浓度为100μM，测定溶液紫外分吸收光谱随时间的变化。

在pH＝5.0的HEPES缓冲溶液中，测定Cu-MTIC溶液的紫外吸收光谱随时间的变化，如图13所示。混合溶液的最大特征吸收峰为与MTIC相同的在324nm 的最大吸收峰，且该峰快速衰减，说明Cu²⁺与MTIC的相互作用在酸性条件下减弱，MTIC快速降解，即与Cu²⁺产生相互作用的成分是MITC而非TMZ。

在pH＝7.4或pH＝9.2的HEPES缓冲溶液中，测定Cu-MTIC溶液的紫外吸收光谱随时间的变化，如图14和15所示。混合溶液的最大特征吸收峰为 Cu-MTIC相同的在350nm的最大吸收峰，且该峰强度显示Cu-MTIC比TMZ或 MTIC都更稳定，说明Cu²⁺与MTIC的相互作用能使MTIC在中性和偏碱性溶液中稳定存在。

(4)金属离子在Cu-MTIC稳定过程中的作用(紫外表征)

Cu-MTIC的制备方法包括：将替莫唑胺溶解于一定pH的缓冲溶液(本实验为pH7.4的HEPES缓冲溶液)，并加入氯化铜溶液(氯化铜用少量水溶解)混合， Cu²⁺：MTIC的摩尔比＝2：1，调节溶液pH至8后，室温下搅拌(1～4h)，得到 Cu-MTIC复合物。

在Cu-MTIC中加入Na₂S后，测定溶液在加入Na₂S前后的紫外吸收光谱随时间的变化，如图16所示。加入Na₂S前，溶液的紫外最大吸收峰为Cu-MTIC 在350nm左右的特征吸收峰；将Na₂S溶解于pH＝7.4的缓冲溶液中得到浓度为1M的溶液，在100μM的Cu-MTIC中加入终浓度为1mM的Na₂S后，溶液的紫外最大吸收峰为MTIC在324nm左右的特征吸收峰，并且该峰强度随时间迅速降低，即为Cu-MTIC被Na₂S夺去Cu²⁺后所剩的MTIC在溶液中发生快速降解。

(5)金属离子在Cu-MTIC稳定过程中的作用(质谱表征)

在Cu-MTIC中加入Na₂S后，用质谱进行测定，得到的质谱如图17所示：结果显示所得的主峰为MTIC的峰(MTIC分子量为168，图示为MTIC+Na⁺的离子峰)，即说明Cu-MTIC在加入Na₂S后所得的是MTIC，即与Cu²⁺进行稳定的对象是MTIC而非TMZ。

实施例2.Cu²⁺对MTIC稳定化过程的超高效液相色谱检测

为了进一步确定Cu²⁺对MTIC的稳定，通过超高效液相色谱对该过程进行检测。在室温下进行AIC、TMZ等样品的超高效液相色谱测定，流动相为水和乙腈，柱温为40℃，紫外检测器的检测波长为263nm和330nm。

AIC的超高效液相色谱图如图18所示，其263nm紫外检测下的保留时间为0.36min，为对称的单峰，AIC在330nm处无吸收。

TMZ的超高效液相色谱图如图19所示，其263nm和330nm紫外检测下的保留时间为0.69min，为对称的单峰。

MTIC的超高效液相色谱图如图20所示，其263nm和330nm紫外检测下的保留时间约为0.55min，为不对称的峰形，可能与其三氮烯上的活泼氢解离有关。

TMZ和Cu²⁺在pH 8.6的HEPES缓冲溶液(TMZ溶解于HEPES缓冲溶液中得到100μM的溶液，CuCl₂溶解于水溶液中得到100mM的溶液，在100μM的以上TMZ溶液中加入氯化铜溶液使得溶液中的Cu²⁺浓度为200μM)，混合0min、 2min、8min和16min后，用超高效液相色谱进行检测，结果如图21所示。实验结果表明：TMZ在偏碱条件下分解得到MTIC，随后被铜离子稳定下来，虽然表现出来的保留时间位置和MTIC极其相近，但其峰型十分对称，在TMZ转化为MTIC过程中，未及时被铜离子稳定下来的MTIC也将分解为AIC。

实施例3.Cu²⁺对MTIC的稳定形式检测

为了探讨Cu²⁺与MTIC的结合方式，对TMZ、MTIC和Cu-MTIC进行了400 兆核磁共振氢谱表征。

取适量TMZ、MTIC和Cu-MTIC分别溶解后通过¹H NMR(400M Hz, ⁶d-DMSO)对其结构进行表征，分别如图22、图23、图24和图25所示，对比结果显示铜离子对MTIC的结合可能是多位点的。

TMZ的¹H NMR,δ(ppm):8.82(s,1H),7.80/.67(d,2H),3.87(s,3H)。

Cu-MTIC(从TMZ制备而来)的¹H NMR,δ(ppm):8.93(s,1H),7.89(s,1H), 7.68(d,2H),3.87(s,3H)。

MTIC的¹H NMR,δ(ppm):12.61(s,1H),10.70(s,1H),7.54(s,1H),7.48/.37(d,2H),2.98(d,3H)。

Cu-MTIC(从MTIC制备而来)的¹H NMR,δ(ppm):8.93(s,1H),7.89(s,1H), 7.68(d,2H),3.87(s,3H)。

实施例4.去铁蛋白的制备及其细胞摄取成像

1、U87MG细胞

(1)去铁蛋白的制备

将蛋白浓度为2μM的40mL铁蛋白与体积含量为1.5％硫代乙醇酸进行混合，在4℃冰箱中静置条件下作用16h。期间，硫代乙醇酸将铁蛋白中的水铁矿还原成二价铁离子，铁蛋白溶液由深棕色转变为无色。将50mg 2,2’-联吡啶溶解于 1mL无水乙醇后，加入到上述所得的无色蛋白溶液中，蛋白溶液颜色转变为暗红色。将所得暗红色蛋白溶液转移到7000Da透析袋中，在pH 7.4的PBS磷酸盐缓冲溶液中进行透析，每6h更换一次透析液，经过4天透析后，得到无色的去铁蛋白溶液，可通过BCA蛋白测试试剂盒对所得的蛋白溶液进行定量分析。

(2)去铁蛋白的细胞摄取情况分析

将近红外染料分子Cy5.5的活性酯(Cy5.5-NHS)溶于水，去铁蛋白中的PBS 缓冲溶液通过透析的方法更换为0.1M NaHCO₃，以摩尔比为Cy5.5：去铁蛋白＝10:1的比例，将Cy5.5-NHS加入到去铁蛋白中，在4℃冰箱中轻柔搅拌反应过夜，通过PD-10脱盐柱对Cy5.5和被标记的Cy5.5-去铁蛋白进行分离收集。

U87MG(恶性胶质瘤细胞株)接种到玻底培养皿(Φ＝40mm)中，密度为每孔5×10⁴个细胞，并在含有10％胎牛血清、5％CO₂的37℃培养箱中孵育24 h。然后，将相同Cy5.5含量的Cy5.5和Cy5.5-去铁蛋白分别与U87MG细胞孵育1h和4h，去除孵育液，细胞用PBS清洗两次，加入4％多聚甲醛室温下固定15min，再用5μg/mL蓝色细胞核探针Hoechest 33342进行染色，染色时间为 15min。染色后，细胞用PBS清洗两次，用激光共聚焦显微镜进行观察和成像，其中用405nm激发光激发并收集425～465nm发射波长以观察细胞核探针的蓝色荧光，用633nm激发光激发并收集643～750nm发射波长以观察Cy5.5或Cy5.5- 去铁蛋白的红色荧光。

Cy5.5和Cy5.5-去铁蛋白的细胞成像图如图26所示，结果显示：Cy5.5-去铁蛋白的摄取量远高于细胞分子Cy5.5，随着摄取时间的增长，Cy5.5和Cy5.5-去铁蛋白的摄取量都随之增大；以去铁蛋白为载体能有效得提高小分子的细胞摄取，增强其与细胞的融合，对于药物分子，细胞摄取的增强有利于提高其利用效率从而提高药效。

2、T98G细胞

T98G细胞(抗药性恶性胶质瘤细胞)对Cy5.5和Cy5.5-去铁蛋白摄取同上述方法，成像如图27所示。结果显示：Cy5.5-去铁蛋白的摄取量远高于细胞分子Cy5.5，随着摄取时间的增长，Cy5.5和Cy5.5-去铁蛋白的摄取量都随之增大；以去铁蛋白为载体能有效得提高小分子的细胞摄取，增强其与细胞的融合，对于药物分子，细胞摄取的增强有利于提高其利用效率从而提高药效。

实施例5.Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物的制备

如图28所示，将TMZ和CuCl₂与去铁蛋白以投料摩尔比为200:400:1，TMZ 和CuCl₂溶解于去离子水中后，分别逐滴加入到去铁蛋白溶液(去铁蛋白溶液的制备同实施例4，为避免氯化铜形成沉淀，一般先滴加TMZ)中，滴加结束后缓慢调节溶液pH至8，在室温下搅拌2h，然后在4℃冰箱中静置2h，得到的混合溶液在pH＝7.4PBS缓冲溶液体系中透析2天，最后得到所需的Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物(之后的测定均以该Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物溶液进行，调整浓度用相同的PBS进行稀释)，通过铁蛋白与细胞的受体-配体作用促进 Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的细胞摄取以提高药效。

实施例6.Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物的结构性能检测

(1)Cu-MTIC去铁蛋白复合物的透射电子显微镜成像

HR-TEM测试：将实施例5所得的Cu-MTIC去铁蛋白复合物溶液滴至铜网上，静置5min后，用0.8％醋酸铀染色5min后，洗除染色剂后，晾干。

所得的铁蛋白和Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的HR-TEM成像如图29所示，所得结果说明：Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的直径约为13nm左右，非染色条件下内核的直径约为6nm，说明Cu-MTIC被包载入去铁蛋白的内腔，这个包载过程不会破坏去铁蛋白的笼状结构，得到的是单一分散的实心蛋白纳米复合物。

(2)Cu-MTIC去铁蛋白复合物的粒径检测

DLS测试：使用配备有动态光散射的Zetasizer纳米仪在25℃下测量光活性纳米复合物的流体动力学直径和表面电荷，测试重复进行3×30次。对于数据分析，使用25℃下纯水的粘度(0.8905mPas)和折射率(1.333)。铁蛋白和Cu-MTIC 铁蛋白纳米复合物的流体动力学直径由斯托克斯-爱因斯坦方程计算，并用聚合物微球作为标准纳米粒子进行尺寸校准。

所得的铁蛋白和Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的粒径分布如图30所示，所得结果说明：铁蛋白和Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的粒径均为13nm左右，铁蛋白对Cu-MTIC未改变铁蛋白本身的纳米结构。

(3)Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物的圆二色光谱检测

圆二色谱是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。

测定并对比去铁蛋白和Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物的圆二色光谱，如图 31所示。实验结果表明：两者的谱线几乎重合，铁蛋白包载Cu-MTIC后，其蛋白质亚基的折叠结构能够维持原状，即铁蛋白可用于载送Cu-MTIC。

(4)Cu-MTIC去铁蛋白复合物的稳定性检测

通过紫外可见分光光度计检测Cu-MTIC去铁蛋白复合物在200～500nm的吸收光谱，测定其在4℃室温下保存1天、2天和3天后，吸收光谱的变化，如图 32所示。

实验结果表明：在保存过程和测试过程中，Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物在 350nm左右吸收峰的强度和形状均不发生明显改变，说明Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物是非常稳定的体系，去铁蛋白的包载能进一步稳定Cu-MTIC。

(5)Cu-MTIC去铁蛋白复合物与GSH的相互作用

在浓度为100μM Cu-MTIC去铁蛋白复合物中分别加入1mM GSH(谷胱甘肽)，通过紫外吸收光谱来检测其中Cu-MTIC浓度的变化，如图33所示。

实验结果表明，在细胞内环境的浓度条件下，GSH能夺去Cu-MTIC去铁蛋白复合物并释放MTIC，MTIC在缓冲溶液中进一步分解，说明Cu-MTIC去铁蛋白复合物可能通过细胞中较高浓度的GSH来实现体系中有效药物MTIC的释放，从而提高药效。

实施例6.Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物在细胞水平上的性能检测

(1)Cu-MTIC去铁蛋白复合物MTT法检测细胞毒性

Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物可通过受体介导内吞的方式促进细胞对药物的摄取从而提高药效，因此通过噻唑蓝(MTT)与流式细胞检测技术等方法检测 Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的细胞毒性水平，以期在癌症治疗领域获得应用。

MTT法是实验室常用的检测细胞存活度的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。将细胞接种到黑色96孔板(每孔1×10⁴个)中，并在含有10％胎牛血清、5％CO₂的37℃培养箱中孵育24h。然后，将U87MG细胞与不同浓度的TMZ、Cu²⁺、Cu-MTIC和Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物共孵育48h，弃去培养基并用PBS缓冲液洗涤2次后，向每个孔中加入含有MTT(100μL， 0.5mg/mL)的新鲜培养基，并在培养条件下孵育4h。弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤，然后加入DMSO(150μL)以溶解甲瓒，用酶标仪检测在490nm、 560nm和720nm紫外吸光度，通过比值计算可间接反映活细胞力水平。

Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物的U87MG细胞毒性结果如图34和图35所示，结果显示：随着Cu-MTIC铁蛋白浓度的增大，该纳米复合物处理后的细胞存活率显著降低，具有高的细胞杀伤能力；而相同浓度下的TMZ、Cu²⁺和 Cu-MTIC处理后的细胞活性在70％以上，即细胞杀伤性较低(表1)。

表1细胞存活率数据

不同浓度的TMZ、Cu²⁺、CuMTIC和Cu-MTIC-去铁蛋白纳米复合物与T98G 细胞进行孵育后。通过MTT法检测T98G的细胞存活率的方法同上所示，实验结果如图36和37所示。结果表明，相同浓度条件下，Cu-MTIC-去铁蛋白复合物的细胞杀伤性更强。

(2)Cu-MTIC去铁蛋白复合物的Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染检测

在正常的细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。膜联蛋白V(Annexin V)是与PS有高度的亲和力的磷脂结合蛋白，故其可以通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素标记，以标记了的Annexin V-FTIC作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V-FTIC与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

对于细胞凋亡分析，将U87MG细胞接种到6孔板中(2×10⁶/孔)，并在含有10％胎牛血清、5％CO₂的37℃培养箱中孵育24h。然后，将U87MG细胞与不同浓度的TMZ(1000μM、100μM和50μM)、Cu-MTIC(100μM、50μM和 5μM)和Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物(100μM、50μM、20μM、10μM和5μM) 共孵育24h，弃去培养基并用PBS缓冲液洗涤2次后，通过无EDTA的胰蛋白酶在37℃培养箱中消化1min并离心收集，用PBS重悬清洗两侧，通过Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒染色，并通过流式细胞术分析。

流式测试结果如图38～40所示，结果表明：TMZ在高浓度条件下能对恶性肿瘤细胞有比较大的杀伤力，而Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物在更低的浓度条件下则可以产生更强的杀伤效果，但是Cu-MTIC的杀伤能力相对较弱，主要原因是铁蛋白包载能够促进细胞对Cu-MTIC的摄取(表2)。

表2

不同浓度的TMZ、Cu²⁺、CuMTIC和Cu-去铁蛋白Annexin V-FITC/PI凋亡检测法检测T98G的细胞存活率的方法同上所示，实验结果如图41～43所示。结果表明，Cu-MTIC-去铁蛋白纳米复合物具有更强的恶性细胞杀伤力。

综上所述，Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物通过对TMZ药效产生过程中的MTIC 进行稳定，并有效促进细胞对药物的摄取，有望在恶性肿瘤疾病治疗方面获得应用。

实施例6.Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物在活体水平上的性能检测

(1)Cu-MTIC去铁蛋白复合物小鼠肿瘤模型中的治疗效果检测

在4～8周的质量约为22g雌性裸鼠的腋下皮下打入U87MG(1×10⁶个)细胞悬液，经过1～2周的生长后，得到带有肿瘤体积约为100～200cm³的小鼠模型，将这些小鼠随机分为四组，分别将TMZ(1.2mM)和Cu-MTIC-去铁蛋白复合物(1.2mM)通过尾部静脉注射，TMZ(25mM)灌胃给药入小鼠体内，对照组注射等体积PBS，注射体积为200μL，注射时间间隔为48h。每天记录肿瘤的最长径(a)和最短径(b)以及小鼠体重，通过公式V＝1/2×a×b×b计算小鼠肿瘤体积，并观察小鼠的整体状态。

TMZ和Cu-MTIC-去铁蛋白复合物的小鼠肿瘤模型治疗的肿瘤体积变化曲线如图44所示，结果显示：临床所用的高浓度TMZ(25mM)的抑制肿瘤生长的效果最佳；在相同替莫唑胺浓度条件下，Cu-MTIC-去铁蛋白复合物(1.2mM) 比TMZ(1.2mM)抑制肿瘤生长的效果更佳，其中Cu-MTIC-去铁蛋白复合物 (1.2mM)组、TMZ(1.2mM)组和TMZ(25mM)组处理的肿瘤体积分别是对照组肿瘤体积的47.09％、86.00％和32.07％，说明在铜离子对MTIC的稳定以及去铁蛋白导向的纳米载体在肿瘤部位的富集有利于促进药效。

TMZ和Cu-MTIC-去铁蛋白复合物的小鼠肿瘤模型治疗的小鼠体重变化曲线如图45所示，结果显示：各组的小鼠体重在治疗过程中均趋于平稳，说明肿瘤的生长以及治疗过程中，小鼠的体质状态稳定。

TMZ和Cu-MTIC-去铁蛋白复合物的小鼠肿瘤模型治疗的小鼠肿瘤明场成像图如图46所示，肿瘤质量统计结果如图47所示，结果显示：高浓度TMZ(25mM) 组所得的肿瘤体积最小；在相同替莫唑胺浓度条件下，Cu-MTIC-去铁蛋白复合物(1.2mM)比TMZ(1.2mM)的肿瘤体积更小，其中Cu-MTIC-去铁蛋白复合物(1.2mM)组、TMZ(1.2mM)组和TMZ(25mM)组处理的肿瘤质量分别是对照组肿瘤质量的48.45％、89.04％和33.12％，并且各组的肿瘤大小分布均匀，从图中可以直观的看出差异，说明Cu-MTIC-去铁蛋白复合物在该小鼠模型上的治疗效果较好，并具有一定的普适性。

(2)Cu-MTIC去铁蛋白复合物小鼠肿瘤模型的免疫组化分析

持续给药时间20天后，解剖小鼠并对肿瘤进行成像，对肿瘤和肝脏组织进行切片后，所得切片进行苏木精-伊红染色法(H&E)染色；所得肿瘤组织切片进行Tunel和DAPI染色。

H&E染色是石蜡切片技术里常用的染色法之一。其中苏木精染液为碱性染料，可使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色，而伊红为酸性染料，可使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。因此，各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。Tunel染色和观测原理是，细胞在发生凋亡时，会激活DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA；基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的催化下加上荧光素 (FITC)标记的dUTP(FITC-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。

TMZ和Cu-MTIC-去铁蛋白复合物的小鼠肿瘤模型治疗的肿瘤组织切片H&E染色明场成像图如图48所示，结果显示：TMZ(1.2mM)和对照组的组织致密性都很高，组织内细胞完整，没有明显损伤；高浓度TMZ(25mM)组的肿瘤组织致密性明显降低；Cu-MTIC-去铁蛋白复合物(1.2mM)组的组织出现了不同程度的松散，并且细胞核的完整性降低，说明该复合物能深入到肿瘤组织达到治疗效果。

TMZ和Cu-MTIC-去铁蛋白复合物的小鼠肿瘤模型治疗的肿瘤组织切片 Tunel和DAPI染色荧光成像图如图49所示，结果显示：对照组和TMZ(1.2mM) 组中Tunel通道中几乎没有绿色荧光；而高浓度TMZ(25mM)组和Cu-MTIC- 去铁蛋白复合物(1.2mM)组的Tunel通道中的绿色荧光都非常明显，说明 Cu-MTIC-去铁蛋白复合物破坏肿瘤组织细胞核的能力相当，具有强的肿瘤生长的抑制效果。

TMZ和Cu-MTIC-去铁蛋白复合物的小鼠肿瘤模型治疗的肝脏组织切片 H&E染色明场成像图如图50所示，结果显示：高浓度TMZ(25mM)组的六只小鼠中有一只小鼠的肝脏组织出现一定程度的坏死现象，说明高浓度TMZ虽然治疗效果较好，但对小鼠的代谢器脏有较强的损伤作用，不宜进行长时间的高浓度药物治疗；与对照组和TMZ(1.2mM)组相同，Cu-MTIC-去铁蛋白复合物 (1.2mM)组的肝脏细胞正常，说明Cu-MTIC-去铁蛋白复合物在治疗过程中不会造成主要代谢器官如肝脏的损伤，其生物安全性更好。

Claims

1.一种Cu-MTIC复合物的制备方法，其特征在于，包括：使Cu²⁺与MTIC结合。

2.根据权利要求1所述的Cu-MTIC复合物的制备方法，其特征在于，包括：替莫唑胺开环为MTIC后与Cu²⁺结合。

3.根据权利要求1所述的Cu-MTIC复合物的制备方法，其特征在于，所述结合的pH条件为7.4～9.2；Cu²⁺与MTIC的摩尔比值不低于1。

4.根据权利要求1所述的Cu-MTIC复合物的制备方法，其特征在于，包括：将替莫唑胺分散于缓冲溶液中，然后加入氯化铜混合，调节混合液pH为7.4～9.2，搅拌，得到Cu-MTIC复合物。

5.一种Cu-MTIC复合物，其特征在于，根据权利要求1～4任一项所述制备方法制备得到。

6.一种Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物，其特征在于，Cu-MTIC被包载入去铁蛋白的内腔，Cu-MTIC铁蛋白纳米复合物的直径为10～13nm。

7.根据权利要求6所述的Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括：

(1)制备去铁蛋白，使去铁蛋白处于的缓冲溶液中；

(2)搅拌下，向去铁蛋白溶液中加入替莫唑胺和氯化铜，调节溶液pH至7.4～9.2，反应后得到Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物。

8.根据权利要求6所述的Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为HEPES缓冲溶液或PBS缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH条件为7.0～7.4；反应时间为1～4h。

9.权利要求5所述的Cu-MTIC复合物、权利要求6所述的Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物在制抗肿瘤药物中的应用。

10.一种提高替莫唑胺药效或稳定MTIC的方法，其特征在于，使铜离子与替莫唑胺的开环产物MTIC结合形成权利要求5所述的Cu-MTIC复合物；或使铜离子与替莫唑胺的开环产物MTIC结合后与去铁蛋白进行结合形成权利要求6所述的Cu-MTIC去铁蛋白纳米复合物。