CN109192252A - 共表达周期昼夜节律的转录组学在药物作用机制发现中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法，该方法通过分析深度测序昼夜时间序列转录组数据，结合生物信息学、共表达分析、机器学习和数据可视化技术成功的鉴定出药物作用的分子机制；利用mRNA表达数据构建mRNA表达网络并划分模块，利用超几何分布对各模块进行GO和KEGG的功能富集分析，提取克服自身周期节律的模块作为相应药物处理相关生物表型改变的内在分子机制的主要解释，综合药物处理后表型变化和功能分析，利用数据可视化全面解释和评估药物对相应生物表象的生理功能的分子机制。本发明还提供了该方法在寻找冠菌素抑制生长促进防御的作用机制及发掘农药、医药、兽药、水产用药作用机制及其毒副作用机制中的用途。

Description

共表达周期昼夜节律的转录组学在药物作用机制发现中的 用途

技术领域

本发明涉及药物作用机制研究和组学大数据分析技术领域，具体地说，涉及一种共表达周期昼夜节律的转录组学基因聚类分类寻找药物作用机制的方法。

背景技术

目前用于研究药物作用机制(MoA)的方法主要分为两大类。第一种方法包括几种依赖于与遗传操作相关的模式生物的策略，但可能由于多种耐药机制和靶标差异，许多药物在这些模式生物中可能无法表现出活性。第二类方法是基于药物与蛋白结合亲和力的方法如亲和纯化或亲和层析测定。这些方法需预先知道药物的结构活性关系且作用靶标蛋白在生物体内有合理的丰度而非负责化合物在组织中活性的全蛋白库。因此，这类方法可能错过某些间接效应物，可能具有期望的药理学性质或驱动不期望的副作用的低亲和力结合靶标。这些方法本质上大多是比较性的，不太适合作用机制(MOA)从头表征或者区分MOA之间的微妙差异，这些方法大多难度大，耗时较长。

确定药物结合的蛋白是生理学靶标，通常取决于体外结合或活性测定与蛋白敲除表型加以验证。由于药物与蛋白质结合可能非常快速，蛋白质的敲除表型可能是间接或由累积效应引起的，这些会使得确定药物靶标存在不确定性。高效准确确定植物中的药物作用机制仍然是一项重大的挑战。识别药物的作用靶标必须符合两条“黄金标准”：1)药物的作用效果会被突变体所抑制或者阻隔；2)这种突变体应该作用于药物和活性靶标。然而很少有药物能够满足这两条标准。同时生物体大且复杂的基因组限制了药物的突变体的无偏分析。并且作用机制并不等同于靶标识别，靶标识别是MOA研究的一个重要但不充分的组成部分。早期了解表型鉴定的小分子的MOA不仅有助于快速转化，也更可能获得成功。

确定小分子影响生物体生理学的机制是药物开发和研究的重要基础，然而在许多情况下，包括基于表型筛选获得的探针和药物分子，其靶标也是未知的。即使对于已知主要靶标的活性分子，其主要功效通常也难以预测，因为毒性或耐药性和代谢降解也是重要的影响因素。因此，系统的、准确的方法来确定MOA是药物创制必不可少的重要基础。MoA可用于新药的开发、了解新药的副作用、以及药物作用靶标的重新定位(repurpose)。然而，鉴定药物的MOA是资源密集性的活动，需要大型的实验装置。

系统生物学的兴起使药物的机制研究和新药的研发从传统的“单组分、单靶点、单疾病”研究模式向“多组学、多靶点、多途径”的方向发展。小分子药物处理后，根据mRNA在全基因组水平的变化可了解生物过程与功能的整体的变化；但基因的表达水平随时间而改变，在时间序列的转录组分析中，时间将引起整个转录水平的最大变化而非是药物的扰动。基因的差异表达变化会随着时间发生改变，即单一时间点的转录组差异表达分析并不能有效的探索药物的作用机制。因此，本发明创新型的构建了用于昼夜时间序列转录组数据的数据处理平台，即可视化的分析方法和流程；通过该平台揭示了能够克服原有周期节律表达的基因对药物作用表型的分子机制，在药物处理后保持稳定持续上调或下调的基因则是核心的调控基因，并能在极大的程度上过滤掉药物影响微弱的基因，缩小药物作用靶点研究的范围。

为寻找和发现更加高效、广谱、低毒、低生态风险并与现有杀菌剂无交互抗性的农药，作用机制的寻找十分重要，是新农药创制的难点，人用医药以及兽药及水产用药的研究开发同样也离不开作用机制的研究结果。本发明利用大数据分析的手段，开展了共表达周期昼夜节律的转录组学基因聚类分类寻找药物作用机制方法的研究，并将该方法成功应用到农药和医药及兽药及水产用药作用机制的寻找实践中，以期为新农药和医药及兽药及水产用药的创制研究提供更多的高活性侯选化合物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：本发明提供一种定性和定量的分析方法，

所述方法通过数据可视化定义药物处理以后，与对照药剂相比，能寻找到自身固有周期节律的并且持续上调或下调的基因为相应药物处理后表型变化的内在分子机制的基因。方法还可定性描述、定量区分比较药物处理前后基因的变化程度。以差异基因的功能寻找药物的作用机制，所述药物为农药或医药以及兽药及水产用药。

本发明解决该问题所采用的技术方案是：具有农用生物活性和医用生物活性以及兽用生物活性的药物作用机制研究方法，具体技术方案如下：

1.构建生物分子网络，并进行模块识别；

2.将药剂处理与对照分别做每个模块的单个基因者折线图，均值折线图，差异表达折线图，差异分布桑基图；

3.对所有模块进行生物学探索，基因本体分析，KEGG通路分析和基因功能富集分析；

4.基于技术方案2和技术方案3寻找克服自身固有周期的基因和持续上调和下调基因作为解释相应药物引起表型改变的内在分子作用机制。本发明提供一种具有良好的普适性和高精度、采用基于共表达网络构建、无监督机器学习分类、数据可视化和生物信息学生物意义探索全面解析药物作用机制的新方法，为药物或活性分子的作用机制及其副作用的评估提供了快速鉴定和识别的方法，同时还为药物作用机制的重定位和药物分子重新全面评估提供了可供借鉴的方法与手段。

解决该技术问题的具体方法如下：

一种基于时间序列转录组学共表达基因聚类分类寻找药物作用机制的方法，所述方法包括以下步骤：

构建共表达基础网络，根据特征基因的基因表达数据计算邻接矩阵，权重矩阵，距离矩阵，无监督机器学习划分子网络，过程如下：

1.将已经经过预处理与筛选的特征基因的基因表达数据作为构建共表达网络的源数据；

这里的源数据可以是RNAseq数据，也可是微阵列数据，也可以是代谢组学与转录组学的数据；

药物处理与对照时间应长于24小时，至少在24小时内有6个时间点上取样；

预处理包括过滤掉低于检测限以下基因蛋白；

预处理包括地数据的归一化处理和log2对数的转换使数据收敛；

预处理包括过滤掉在时间轴和处理与对象变化较弱的基因；

2.基于每对基因之间的相关性测量来定义基因之间的个体关系。

进行Pearson或Spearman的相关性，或者最小绝对误差回归，贝叶斯方法构建共表达网络。这些相似性也可用于蛋白质组学和代谢组学。

3.共表达关联用于构建网络，其中每一个节点代表一个基因，每一条边代表共表述关系的存在和强度

在基于相关性的共表达网络中，相关性度量具有-1(完全负相关)和1(完全正相关)之间值。在unsigned网络中，使用绝对相关值，这意味着两个负相关基因将被视为共表达。在signed网络中，通过将相关性值缩放到0和1之间来解决此问题，使得值＜0.5表示负相关，值＞0.5表示正相关。

在加权网络中，所有基因彼此相连，并且这些连接具有0到1之间的连续权重值，其指示基因之间共调节的强度。在未加权的网络中，基因对之间的相互作用是二元的，即0或1，并且基因是连接的或不连接的。可从加权网络来创建为加权网络，如通过考虑具有高于某个阈值的相关性来重新定义基因之间的连接和不连接。迄今为止，加权网络展示出更为强大的结果。

4.使用聚类技术鉴定模块(共表达基因的子网络)。共表达分析中的聚类用于将具有相似表达模式的基因分组。

需要考虑聚类方法，因为其极大的影响分析的结果和意义。可以使用的聚类方法，包括K均值聚类和层次聚类。

5.通过功能富集分析来解释模块的生物学意义

包括基因本体分析，KEGG通路分析，基因富集分析

6.数据可视化分析呈现基因表达随时间变化的趋势，提取药物处理组克服自身固有周期的和持续上调和下调的基因作为解释药物影响表观改变的内在分子机制，并对药物进行全面的评估。上调的作为相关生物学功能或过程的促进，下调为抑制。

与现有技术相比，本发明具有以下创新性和优点：

1.基于时间序列转录组学共表达基因聚类分类寻找药物作用机制，通过数据的预处理过滤掉对于药剂影响生物贡献度不大的大部分基因，通过数据的无监督分析将基因无偏差分为各个子类，然后通过数据的可视化比较各个子类相应药剂在时间轴上的变化，进一步的缩小相应药剂作用的基因的范围，主要将目标锁定在在药剂处理后，能克服固有周期的基因和持续上调或下调的基因作为药剂引起表型改变的内在分子作用机制。此种寻找药物作用机制的方法可快速、直观、可靠的获得解释药剂引起表型改变的内在作用机制，同时还可以预测药剂对于未测定相关表型的活性和对生物体的毒副作用。利用此种方法可快速的实现对未知功能药剂作用机制的快速识别和已知确定功能药剂的重新定位和评估。

2.本发发明公开了冠菌素作为茉莉酸甲酯的类似物能调节植物茉莉酸通路标记基因的上调和生长相关基因的下调，并且该类基因能够克服自身固有的周期纪律(对照)。冠菌素是由细菌假单胞菌(Pseudomonas syringae)产生，能引起多种植物弥散性黄萎病，其生理作用还包括植物的过度生长、枯萎症、蛋白酶抑制剂的积累、花青素的增加、诱导乙烯及叶绿素酶的产生，抑制根的生长以及抑制依靠气孔和水杨酸的防卫机制。但是，在低浓度作用下，具有调控生长、抑制衰老、促进细胞分化、提高叶绿素含量和植物抗逆性等广泛的生理功能。在冠菌素的作用下，茉莉酸的生物合成、应激和信号传导的相关基因，花青素合成的相关基因，植物抗虫抗病的标记基因呈现出逐渐上调，而与生长素、细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯相关的基因则呈现出下调，并且这些基因都克服了自身固有的周期节律性质。同时，被冠菌素处理过后的两周大的拟南芥叶片停止生长，抗虫和抗逆能力得到增强。冠菌素影响内在的分子机制功能与表观活性数据相吻合。从而为本方法扩展到研究其它药物如医药和兽药及水产用药以及活性分子的作用机制提供了重要参考和方法依据，也为其他药物作用机制和活性评估的发现提供了有益借鉴。

本发明还为评估药物活性及副作用提供了全面的解析。

我们通过分析深度测序昼夜时间序列转录组数据，结合生物信息学、共表达分析、机器学习和数据可视化技术成功的鉴定出冠菌素抑制生长促进植物免疫的药物作用的分子机制，并且这些分子层面的作用机制与冠菌素作用于植物的表型相一致，即在对两周大的拟南芥幼苗施用冠菌素以后，拟南芥幼苗生长会停止，而其抗虫和抗病的能力会得到增强。通过数据的可视化分析，我们得出结论：能够克服原有周期节律表达的基因能够对释药物作用表型的分子层面的合理解释，在药物处理后保持稳定持续上调或下调的基因则是核心调控基因。

鉴于目前并没有系统的方法来研究药物作用机制，我们的分析流程能系统全面阐述药物在基因表达层面的机制，并且结合生物信息学分析，能够准确的判断药物的作用效果，作用领域，以及潜在的副作用，能够为新农药、医药以及兽药及水产用药创制，其药效评估，药物重新定位提供系统全面的诊断说明和定位。

本发明的有益效是：构建药物作用机制寻找的体系和方法，并冠菌素为例开展农药作用机制寻找的研究，该方法能够推广到其他的药剂如医药和兽药及水产用药作用机制的寻找。

本发明通过特定方法的构建和冠菌素作用机制寻找的实施例更加具体说明农药作用机制的寻找并推广到医药和兽药及水产用药，所述实施例仅用于具体说明本发明而非限制本发明，具体实施方式如下：

实施例1：共表达周期昼夜节律转录组学的药物作用机制发掘工艺路线

凡是具有药物-生物表型的药物与生物体作用机制的研究平台为：利用mRNA表达数据构建mRNA表达网络并划分模块，然后利用超几何分布对每个模块进行GO功能和KEGG通路的功能富集分析，再提取克服自身周期节律的模块作为相应药物处理相关生物表型改变的内在分子机制的主要解释，最后综合药物处理后表型变化和功能分析并利用数据可视化进行药物对相应生物表象的生理功能的分子机制全面解释和评估；该工艺路线还可以进行药物毒副作用的机制研究；具体流程见说明书附图1。所述药物为农药、医药和兽药及水产用药；所述生物为昆虫、细菌、真菌、病毒等，实验动物：大鼠、兔子、小鼠、猴子、狗、猪、牛、养、马、鸡、鸭、鹅、鱼、虾等，野生动物：豺、狼、虎、豹、野驴、黄羊、鹅喉羚、野骆驼、貂、狐、水獭、貉、黄狼、北极熊、大熊猫、小熊猫、金丝猴、大猩猩、小猩猩；以及各种植物和农作物等。

实施例2：以冠菌素抑制生长促进防御作用机制为例的农药作用机制发掘方法

本实例将本发明应用于冠菌素处理两周大的拟南芥幼苗引起幼苗生长停止，对病原菌与虫害的抵抗能力增强的mRNA表达数据，时间跨度为0h，0.25h，0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h，4h，5h，6h，7h，8h，10h，12h，14h，16h，18h，20h，22h，24h，h是时间小时的缩写。按照药物处理将样本分为对照组，对照组用mock表示和实验组，实验组用COR表示，利用WGCNA方法构建对照组和处理组共同的基因共表达网络。

具体流程见说明书附图1。

本实施例中所用的试验原始数据下载自GEO(Gene Expression Omnibus)数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/，数据ID为PRJNA245231)，该数据集为用冠菌素作为茉莉酸甲酯类似物研究茉莉酸作用通路的激活对植物生长和光合作用的抑制作用。样本来源是拟南芥，本实施例选取83例样本，其中43例为对照组，另40例为实验组(COR)。对照组中在时间点6小时处只有一个重复。具体实施过程如下：

步骤1：mRNA表达数据的整理

将下载的数据整理成WGCNA分析所需的数据表格格式，表格的列是mRNA，表格的行是对照和处理的样本，相对应的单元格内数值是该mRNA(列)在该样本(行)中的表达值，基于mRNA的共表达情况，进行网络的构建和模块划分。

步骤2：网络构建和模块划分

同样用WGCNA工具构建所用样本的mRNA共表达网络并划分模块。在构建网络过程中将在80％以上的样品中低于检测限mRNA移除，在所有样品中有最大的中位数绝对偏差中的前30％的6569个mRNA被用来构建网络和模块划分。构建的网络将相关性大于50％的提取出来的网络见说明书附图2。共得到45个模块，模块的大小在20-1501个节点(mRNA)之间。经WGCNA识别得到的模块划分结果见说明书附图3。

步骤3：通过功能分析确定每个模块的独特生物学意义

利用超几何分布对每个模块进行GO功能和KEGG通路的功能富集分析，Bonferroni校正p-value值，以矫正后的p-value＜0.05为富集分析显著性阈值。将富集得到的GO生物过程术语监督分类做图见说明书附图4的左图，并做GO术语在模块之间出现的频率饼图见说明书附图4的右图。

步骤4：数据可视化，提取克服自身周期节律的模块作为相应药物处理拟南芥表型改变的内在分子机制的主要解释

作每个模块内所有基因均值的折线图，观测每个模块内对照与处理的基因的表达趋势，基因在24小时内的表达趋势按照表达波形的波峰和波谷可大致分为单波峰和多波动模块，处理与对照的差异表达变化则较为复杂，见说明书附图5；作每个模块内每个基因差异表达变化的折线图见说明书附图6，观测差异基因表达变化趋势；每个模块基因表达差异值分布的桑葚图见说明书附图7，观测每个模块内差异基因在各个差异表达的倍数区段占据的比例和变化。综合说明书附图5，6，7找出在时间序列上内克服自身周期节律，并且在处理和对照之间有显著稳定差异的模块作为冠菌素抑制植物生长和促进防御的分子机制解释和药物活性评估的候选模块。

步骤5：综合药物处理后表型变化和功能分析步骤3：与数据可视化步骤4：全面评估冠菌素抑制植物生长和促进抗病抗虫的分子机制解释。

在克服自身周期节律的模块中，药物处理后，基因表达持续上调的模块中大量富集到与茉莉酸合成，信号传递，下游调控应激以及抗病标和抗虫基因；在持续下调的模块中富集到了与生长素应激，赤霉素调控基因，油菜素内酯相关基因以及细胞分裂等与植物生长相关的基因和基因本体功能术语。这些与冠菌素作为茉莉酸的类似物能够抑制植物生长促进植物抗虫抗病的表型一致，即与文献报道的试验研究结果完全一致，也就是说我们的研究结果得到了试验研究结果的验证。

本实施例的方法应用到农药用于防治病虫草鼠害等作用机制的挖掘以及农药产生的毒副作用机制的研究具有同样效果。

实施例3：共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法及其工艺路线和操作步骤在医药领域用于发掘医药作用机制中的用途

利用实验医学动物和人类mRNA表达数据构建mRNA表达网络并划分模块，然后利用超几何分布对每个模块进行GO功能和KEGG通路的功能富集分析，再提取克服自身周期节律的模块作为相应医药处理相关实验医学动物和人类表型改变的内在分子机制的主要解释，最后综合医药处理后表型变化和功能分析并利用数据可视化进行药物对相应实验医学动物和人的生理功能的分子机制全面解释和评估；寻找构建出医药的作用机制或产生的毒副作用机制。

实施例4：共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法及其工艺路线和操作步骤在兽医药领域用于发掘兽药作用机制中的用途

利用兽类mRNA表达数据构建mRNA表达网络并划分模块，然后利用超几何分布对每个模块进行GO功能和KEGG通路的功能富集分析，再提取克服自身周期节律的模块作为相应兽药处理相关兽类表型改变的内在分子机制的主要解释，最后综合兽药处理后表型变化和功能分析并利用数据可视化进行兽药对相应兽类的生理功能的分子机制全面解释和评估；寻找构建出兽药的作用机制或产生的毒副作用机制。

实施例5：共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法及其工艺路线和操作步骤在水产领域用于发掘水产用药作用机制中的用途

利用水生生物mRNA表达数据构建mRNA表达网络并划分模块，然后利用超几何分布对每个模块进行GO功能和KEGG通路的功能富集分析，再提取克服自身周期节律的模块作为相应水产用药处理相关水生生物表型改变的内在分子机制的主要解释，最后综合水产用药处理后表型变化和功能分析并利用数据可视化进行水产用药对相应水生生物的生理功能的分子机制全面解释和评估；寻找构建出水产用药的作用机制或产生的毒副作用机制。

图1本发明所述基于时间序列转录组学共表达基因聚类分类寻找药物作用机制方法流程图

图2示出实施实例2中冠菌素处理拟南芥在24小时内对照与处理的基因共表达网络

图3示出实施实例2中冠菌素处理拟南芥在24小时内对照与处理的基因共表达模块

图4示出实施实例2中冠菌素处理拟南芥在24小时内对照与处理的基因共表达模块的基因本体分析(左图)和基因本体分析功能术语在各个模块之间重叠的频率饼图(右图)

图5示出实施实例2中冠菌素处理拟南芥在24小时内对照与处理的基因共表达模块内对照与处理的均值的变化折线图

图6示出实施实例2中冠菌素处理拟南芥在24小时内对照与处理的基因共表达模块内基因差异表达折线图

图7示出实施实例2中冠菌素处理拟南芥在24小时内对照与处理的基因共表达模块内基因差异表达分布桑葚图

Claims (10)

1.一种共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法，其特征在于：通过分析深度测序昼夜时间序列转录组数据，结合生物信息学、共表达分析、机器学习和数据可视化技术成功的鉴定出药物作用的分子机制。

2.根据权利要求1所述的共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法的工艺路线，其特征在于：利用mRNA表达数据构建mRNA表达网络并划分模块，然后利用超几何分布对每个模块进行GO功能和KEGG通路的功能富集分析，再提取克服自身周期节律的模块作为相应药物处理相关生物表型改变的内在分子机制的主要解释，最后综合药物处理后表型变化和功能分析并利用数据可视化进行药物对相应生物表象的生理功能的分子机制全面解释和评估。

3.根据上述权利要求1和2的共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法，具体步骤如下：

A.构建生物分子网络，并进行模块识别；

B.将药剂处理与对照分别做每个模块的单个基因者折线图，均值折线图，差异表达折线图，差异分布桑基图；

C.对所有模块进行生物学探索、基因本体分析、KEGG通路分析和基因功能富集分析；

D.基于体步骤B和体步骤C寻找克服自身固有周期的基因和持续上调和下调基因作为解释相应药物引起表型改变的内在分子作用机制；本发明提供一种具有良好的普适性和高精度、采用基于共表达网络构建、无监督机器学习分类、数据可视化和生物信息学生物意义探索全面解析药物作用机制的新方法，为药物或活性分子的作用机制及其副作用的评估提供了快速鉴定和识别的方法，同时还为药物作用机制的重定位和药物分子重新全面评估提供了可供借鉴的方法与手段。

4.根据上述权利要求1和2的共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法，

构建共表达基础网络，根据特征基因的基因表达数据计算邻接矩阵，权重矩阵，距离矩阵，无监督机器学习划分子网络，具体操作如下：

A.将已经经过预处理与筛选的特征基因的基因表达数据作为构建共表达网络的源数据：这里的源数据可以是RNAseq数据，也可是微阵列数据，也可以是代谢组学与转录组学的数据；药物处理与对照时间应长于24小时，至少在24小时内有6个时间点上取样；预处理包括过滤掉低于检测限以下基因蛋白；预处理包括地数据的归一化处理和log2对数的转换使数据收敛；预处理包括过滤掉在时间轴和处理与对象变化较弱的基因；

B.基于每对基因之间的相关性测量来定义基因之间的个体关系：进行Pearson或Spearman的相关性，或者最小绝对误差回归，贝叶斯方法构建共表达网络；这些相似性也可用于蛋白质组学和代谢组学；

C.共表达关联用于构建网络，其中每一个节点代表一个基因，每一条边代表共表达关系的存在和强度：在基于相关性的共表达网络中，相关性度量具有-1(完全负相关)和1(完全正相关)之间值；在unsigned网络中，使用绝对相关值，这意味着两个负相关基因将被视为共表达；在signed网络中，通过将相关性值缩放到0和1之间来解决此问题，使得值＜0.5表示负相关，值＞0.5表示正相关；在加权网络中，所有基因彼此相连，并且这些连接具有0到1之间的连续权重值，其指示基因之间共调节的强度；在未加权的网络中，基因对之间的相互作用是二元的，即0或1，并且基因是连接的或不连接的；可从加权网络来创建为加权网络，如通过考虑具有高于某个阈值的相关性来重新定义基因之间的连接和不连接；迄今为止，加权网络展示出更为强大的结果；

D.使用聚类技术鉴定模块即共表达基因的子网络，共表达分析中的聚类用于将具有相似表达模式的基因分组：需要考虑聚类方法，因为其极大的影响分析的结果和意义；可以使用的聚类方法，包括K均值聚类和层次聚类；

E.通过功能富集分析来解释模块的生物学意义：包括基因本体分析，KEGG通路分析，基因富集分析；

F.数据可视化分析呈现基因表达随时间变化的趋势，提取药物处理组克服自身固有周期的和持续上调和下调的基因作为解释药物影响表观改变的内在分子机制，并对药物进行全面的评估；上调的作为相关生物学功能或过程的促进，下调为抑制。

5.根据上述权利要求1、2、3的共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法及其工艺路线和具体操作步骤，其在冠菌素抑制生长促进防御的作用机制发掘中的应用，具体详细方法和操作如下：

应用于冠菌素处理两周大的拟南芥幼苗引起幼苗生长停止，对病原菌与虫害的抵抗能力增强的mRNA表达数据，时间跨度为0h，0.25h，0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h，4h，5h，6h，7h，8h，10h，12h，14h，16h，18h，20h，22h，24h，h是时间小时的缩写；按照药物处理将样本分为对照组，对照组用mock表示和实验组，实验组用COR表示，利用WGCNA方法构建对照组和处理组共同的基因共表达网络；

所用的试验原始数据下载自GEO(Gene Expression Omnibus)数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/，数据ID为PRJNA245231)，该数据集为用冠菌素作为茉莉酸甲酯类似物研究茉莉酸作用通路的激活对植物生长和光合作用的抑制作用；样本来源是拟南芥，本实施例选取83例样本，其中43例为对照组，另40例为实验组(COR)；对照组中在时间点6小时处只有一个重复；具体实施过程如下：

步骤1：mRNA表达数据的整理

将下载的数据整理成WGCNA分析所需的数据表格格式，表格的列是mRNA，表格的行是对照和处理的样本，相对应的单元格内数值是该mRNA在列中在该样本在行中的表达值，基于mRNA的共表达情况，进行网络的构建和模块划分；

步骤2：网络构建和模块划分

同样用WGCNA工具构建所用样本的mRNA共表达网络并划分模块；在构建网络过程中将在80％以上的样品中低于检测限mRNA移除，在所有样品中有最大的中位数绝对偏差中的前30％的6569个mRNA被用来构建网络和模块划分；构建的网络将相关性大于50％的提取出来的网络见说明书附图2；共得到45个模块，模块的大小在20-1501个节点，即mRNA之间；经WGCNA识别得到的模块划分；

步骤3：通过功能分析确定每个模块的独特生物学意义

利用超几何分布对每个模块进行GO功能和KEGG通路的功能富集分析，Bonferroni校正p-value值，以矫正后的p-value＜0.05为富集分析显著性阈值；将富集得到的GO生物过程术语监督分类做图，并做GO术语在模块之间出现的频率饼图；

步骤4：数据可视化，提取克服自身周期节律的模块作为相应药物处理拟南芥表型改变的内在分子机制的主要解释

作每个模块内所有基因均值的折线图，观测每个模块内对照与处理的基因的表达趋势，基因在24小时内的表达趋势按照表达波形的波峰和波谷可大致分为单波峰和多波动模块，处理与对照的差异表达变化则较为复杂；作每个模块内每个基因差异表达变化的折线图，观测差异基因表达变化趋势；每个模块基因表达差异值分布的桑葚图，观测每个模块内差异基因在各个差异表达的倍数区段占据的比例和变化；综合上述步骤2和步骤3的图找出在时间序列上内克服自身周期节律，并且在处理和对照之间有显著稳定差异的模块作为冠菌素抑制植物生长和促进防御的分子机制解释和药物活性评估的候选模块；

步骤5：综合药物处理后表型变化和功能分析步骤3：与数据可视化步骤4：全面评估冠菌素抑制植物生长和促进抗病抗虫的分子机制解释；

在克服自身周期节律的模块中，药物处理后，基因表达持续上调的模块中大量富集到与茉莉酸合成，信号传递，下游调控应激以及抗病标和抗虫基因；在持续下调的模块中富集到了与生长素应激，赤霉素调控基因，油菜素内酯相关基因以及细胞分裂等与植物生长相关的基因和基因本体功能术语；这些与冠菌素作为茉莉酸的类似物能够抑制植物生长促进植物抗虫抗病的表型一致，即与文献报道的试验研究结果完全一致；

本实施例的方法应用到农药用于防治病虫草鼠害等作用机制的挖掘具有同样效果。

6.权利要求1-3所述的共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法及其工艺路线和操作步骤在农药领域用于发掘农药作用机制中的用途。

7.权利要求1-3所述的共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法及其工艺路线和操作步骤在医药领域用于发掘医药作用机制中的用途。

8.权利要求1-3所述的表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法及其工艺路线和操作步骤在兽医药领域用于发掘兽药作用机制中的用途。

9.权利要求1-3所述的共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法及其工艺路线和操作步骤在水产领域用于发掘水产用药作用机制中的用途。

10.权利要求1-3所述的共表达周期昼夜节律的转录组学发掘药物作用机制的方法及其工艺路线和操作步骤在发掘农药、医药、兽药和水产用药产生的毒副作用机制中的用途。