CN109152797A - 新的细胞培养方法、细胞培养系统及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种方法，其中将人器官细胞(例如肝细胞)在人血浆培养基(例如70％‑100％人血浆)中培养，所述人血浆培养基替换常规使用的非人浆细胞培养生长培养基。该培养方法允许人器官细胞处于与体内环境非常相似的环境中，其中使细胞浸泡在人血浆中。此外，本文公开了在细胞培养容器中含有人器官细胞和人血浆培养基的细胞培养系统。细胞培养系统的用途包括应用培养的人器官细胞来评价测试化合物的特性，包括药物的药理学、药代动力学和毒理学作用，器官疾病进展，例如肝脏疾病进展，包括乙型肝炎感染或丙型肝炎感染，或细胞生物学过程，基因表达、蛋白质合成或对激素的反应，其可以直接转换至人的体内。

Description

新的细胞培养方法、细胞培养系统及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月24日提交的美国临时专利申请号62/340,702的权益，其内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本公开的发明一般涉及细胞培养方法、细胞培养系统和使用所培养的细胞评价药物的药理学活性、药物代谢、药物-药物相互作用和药物毒性的方法。
发明背景
本发明涉及器官细胞(例如肝细胞)在人血浆中的细胞培养方法，以及这些培养细胞用于评价药物药理学活性、药物代谢、药物-药物相互作用和药物毒性的用途。
体外细胞培养实验系统通常用于生物医学研究。细胞培养物与体内哺乳动物生物体之间的主要差异在于细胞培养在含有人工营养物水平并且通常补充有动物产品例如胎牛血清的培养基中进行。
迄今为止，已经通过化学方式设计了用于人细胞的细胞培养基以维持存活率和增殖。已经提供了化学上确定的细胞培养基的改进，以支持肝细胞系、遗传转化的肝细胞和从肿瘤来源获得的肝细胞的克隆生长。那些复杂的培养环境可包括肝细胞生长促进物质，例如烟酰胺、氨基酸，转铁蛋白、激素、地塞米松、痕量金属、碳水化合物、缓冲剂和白蛋白，其中一些或全部对于所培养的细胞可能是外源性的。一个主要挑战在于原代细胞-来源于正常组织的细胞的培养，以保留在体内所观察到的细胞功能。
与体外细胞培养相反，在体内动物或人中，通过循环血液营养每个器官中的细胞，所述循环血液由内源性血浆和血细胞组成。环境的差异使得使用细胞培养系统进行的观察难以直接外推至体内事件。
重要的细胞培养系统是原代培养的人肝细胞，其通常被认为是用于体外评价药物特性如药物代谢、药物-药物相互作用和药理学作用的“金标准”。主要挑战在于在肝细胞培养物中观察到的事件向体内转换，因为已知在人工培养基中维持的人肝细胞的性质与体内肝脏不同。另一个复合因素是被研究药物与血浆蛋白的结合。
本文公开的发明通过使用人血浆培养人器官细胞(例如人肝细胞)来解决包含人工和/或外源性成分的常规细胞培养基的那些缺陷。
发明概述
本文提供了培养人器官细胞的方法，包括人血浆培养基和人器官细胞的细胞培养系统，以及使用该系统评价测试化合物特性、肝脏疾病进展或细胞生物学过程的方法。在实施方案中，提供了培养人器官细胞的方法，其中该方法包括以下步骤：在非人血浆培养基中培养人器官细胞；用人血浆培养基替换非人血浆培养基；在人血浆培养基中培养人器官细胞，其中每一(1)至十五(15)天或更长时间用新的人血浆培养基将人血浆培养基更新至少一次。在实施方案中，大约每2至3天替换人血浆培养基以补充营养物并除去废物。
可以将人器官细胞在人血浆培养基中培养延长的时间期限，并且与在非人血浆细胞培养基中培养人器官细胞的时间长度相比提供了改善。参见实施例1。在实施方案中，将人器官细胞在人血浆培养基中培养至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少45天，至少60天或至少90天。这是在其中细胞在第14天开始崩解并且在第29天几乎全部死亡的在非人血浆培养基中培养人器官细胞(例如人肝细胞)的改进。参见图1。本文公开的细胞培养方法提供细胞培养系统，其能够用于评价测定，持续时间超过两周，例如15天或更长时间。在实施方案中，将人器官细胞在人血浆培养基中培养至多15天，至多20天，至多25天，至多30天，至多45天，至多60天或至多90天，其中人器官细胞在培养期间保持活力。人肝细胞特别适用于长期体外代谢研究，其能够被转换成理解人体内肝脏代谢。
在实施方案中，人器官细胞是新鲜分离的、预先冷冻保存的或从连续培养的细胞系获得。如果是预先冷冻保存的，则该方法包括首先在正常培养条件下解冻细胞，然后用非人血浆细胞培养基培养一段时间期限。该时间期限典型地至少为20分钟，但可能是几小时到一天或更长时间。
在实施方案中，人血浆培养基由100％血浆组成。在某些实施方案中，人血浆培养基包含70％至100％人血浆、或约80％至100％人血浆、或约90％至约100％人血浆、或约95％至约100％人血浆。在实施方案中，人血浆培养基包含约70％，约75％，约80％，约85％，约90％或约95％人血浆。
在实施方案中，人器官细胞选自肝细胞、肾细胞、肺上皮细胞、肠细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、神经元、淋巴细胞、红细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、肾上腺细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、结缔组织细胞、睾丸细胞、卵巢细胞或其组合。在某些实施方案中，人器官细胞是人肝细胞。
在实施方案中，提供了用于培养人肝细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：在非人血浆培养基中培养人肝细胞；用人血浆培养基替换非人血浆培养基；和，在人血浆培养基中培养人器官细胞，其中每一(1)至十五(15)天或以上用新的人血浆培养基将人血浆培养基更新至少一次。
在实施方案中，将人肝细胞在人血浆培养基中培养至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少45天，至少60天或至少90天。在实施方案中，人肝细胞在人血浆培养基中培养至多15天，至多20天，至多25天，至多30天，至多45天，至多60天或至多90天，其中人类肝细胞在培养期间保持活力。
在实施方案中，将人肝细胞在由100％血浆组成的人血浆培养基中培养。在某些实施方案中，将人肝细胞在包含70％至100％人血浆、或约80％至100％人血浆、或约90％至约100％人血浆、或约95％至约100％人血浆的人血浆培养基中培养。在实施方案中，将人肝细胞在包含约70％，约75％，约80％，约85％，约90％或约95％人血浆的人血浆培养基中培养。
在实施方案中，人肝细胞是新鲜分离的(来自供体)、预先冷冻保存的或从连续培养的细胞系获得。如果是预先冷冻保存的，则该方法包括首先在正常培养条件下解冻人肝细胞，然后用非人血浆细胞培养基培养一段时间期限。该时间期限典型地少为20分钟，但可能是几小时到一天或更长时间。
对于新鲜分离的人肝细胞，可以用胶原酶消化来自供体的肝脏的碎片，导致肝脏实质解离为个体肝细胞，其能够被纯化和培养用于在人血浆培养基中的各种应用。新鲜分离的人肝细胞并不便利，但通常也是常规使用的。
在实施方案中，提供了用于培养人肝细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：从人肝脏分离人肝细胞；在非人血浆培养基中培养人肝细胞；用人血浆培养基替换非人血浆培养基；和，在人血浆培养基中培养人器官细胞，其中每一(1)至十五(15)天或以上用新的人血浆培养基将人血浆培养基更新至少一次。
在实施方案中，将从人肝脏分离的人肝细胞在人血浆培养基中培养至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少45天，至少60天或至少90天。在实施方案中，将从人肝脏分离的人肝细胞在人血浆培养基中培养至多15天，至多20天，至多25天，至多30天，至多45天，至多60天或至多90天，其中人肝细胞在培养期间保持活力。
在实施方案中，将人肝细胞在由100％血浆组成的人血浆培养基中培养。在某些实施方案中，将人肝细胞在人血浆培养基中培养，所述人血浆培养基包含70％至100％人血浆、或约80％至100％人血浆、或约90％至约100％人血浆、或约95％至约100％人血浆。在实施方案中，将人肝细胞在人血浆培养基中培养，所述人血浆培养基包含约70％，约75％，约80％，约85％，约90％或约95％人血浆。
在实施方案中，提供了用于评价测试化合物特性、肝脏疾病进展或细胞生物学过程的细胞培养系统，其中所述细胞培养系统包含细胞培养容器，其包含一个或多个测定孔，其中所述测定孔包含人血浆培养基和人器官细胞。在实施方案中，细胞培养系统还包含病毒，例如肝炎病毒。在实施方案中，细胞培养系统还包含测试化合物。测试化合物可选自药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品和化学品。
在实施方案中，测试化合物特性包括测试化合物的药物代谢、药物-药物相互作用和药理学。在实施方案中，肝脏疾病包含甲型肝炎感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。在实施方案中，细胞生物学过程包含基因表达、蛋白质合成或对激素的反应。
在实施方案中，细胞培养系统包含人器官细胞，其为新鲜分离的(来自供体的)、预先冷冻保存的或从连续培养的细胞系获得。在实施方案中，细胞培养系统包含由100％血浆组成的人血浆培养基。在某些实施方案中，细胞培养系统包含人血浆培养基，其包含70％至100％人血浆、或约80％至100％人血浆、或约90％至约100％人血浆、或约95％至约100％人血浆。在实施方案中，细胞培养系统包含人血浆培养基，其包含约70％，约75％，约80％，约85％，约90％或约95％人血浆。在实施方案中，人血浆由获自人供体的血液制备。在某些实施方案中，人血浆汇集自多个供体。
在实施方案中，细胞培养系统包含选自肝细胞、肾细胞、肺上皮细胞、肠细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、神经元、淋巴细胞、红细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、肾上腺细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、结缔组织细胞、睾丸细胞、卵巢细胞或其组合的人器官细胞。在某些实施方案中，细胞培养系统包含人肝细胞。
在实施方案中，细胞培养系统包含细胞培养容器，其是单孔板。在替代实施方案中，细胞培养系统包含细胞培养容器，其是多孔板。
在实施方案中，提供了用于评价测试化合物特性、肝脏疾病进展或细胞生物学过程的细胞培养系统，其中所述细胞培养系统包含细胞培养容器，其包含一个或多个测定孔，其中所述测定孔包含人血浆培养基和人肝细胞。在实施方案中，细胞培养系统包含人肝细胞，并且还包含病毒，例如肝炎病毒。在实施方案中，细胞培养系统包含人肝细胞，并且还包含测试化合物。测试化合物可选自药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品和化学品。
在实施方案中，测试化合物性质包括测试化合物的药物代谢、药物-药物相互作用和药理学。在实施方案中，肝脏疾病包含甲型肝炎感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。在实施方案中，细胞生物学过程包含基因表达、蛋白质合成或对激素的反应。
在实施方案中，细胞培养系统包含人肝细胞，其是从肝脏新鲜分离的、预先冷冻保存的或从连续培养的细胞系获得。在实施方案中，细胞培养系统包含人肝细胞和由100％血浆组成的人血浆培养基。在某些实施方案中，细胞培养系统包含人肝细胞和人血浆培养基，所述人血浆培养基包含70％至100％人血浆、或约80％至100％人血浆、或约90％至约100％人血浆、或约95％至约100％人血浆。在实施方案中，细胞培养系统包含人肝细胞和人血浆培养基，所述人血浆培养基包含约70％，约75％，约80％，约85％，约90％或约95％人血浆。
在实施方案中，提供了用于评价测试化合物特性、肝脏疾病进展和/或细胞生物学过程的方法，其中该方法包括以下步骤：将测试化合物导入存在的本发明细胞培养系统的测定孔中，在33至40℃下将测试的化合物孵育0.5h-10天；和，进行人细胞或细胞培养基的终点测定以确定测试化合物的特性、疾病进展或细胞生物学过程。在实施方案中，将系统在37℃、5％CO2下孵育。
在实施方案中，测试化合物是药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品或化学品。在实施方案中，测试化合物特性包括测试化合物的药物代谢、药物-药物相互作用和药理学。
在替代实施方案中，本文提供了不将测试化合物添加到细胞培养系统中的方法。在实施方案中，所述方法包括向细胞培养系统中添加病毒但不添加测试化合物。在某些实施方案中，该方法包括向细胞培养系统中添加病毒，然后向细胞培养系统中添加测试化合物。在实施方案中，终点测定法包含测定细胞存活率、细胞功能、基因表达、蛋白质表达、代谢物形成或代谢物特性。在某些实施方案中，终点测定包括测定测试化合物的消失和代谢物的出现，测定第一测试化合物对共同施用的第二测试化合物的代谢的影响，或测定对人器官细胞的药理学作用。
在用于评价肝脏疾病进展的方法中，进行人肝细胞或细胞培养基的终点测定以评价与疾病进展相关的人肝细胞的细胞生物学、化学和/或分子生物学。在实施方案中，肝脏疾病包含甲型肝炎感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。在实施方案中，用于评价肝脏疾病的方法包括使用包含人肝细胞的细胞培养系统，和添加病毒。在实施方案中，病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。在某些实施方案中，用于评价肝脏疾病进展的方法还包含在将病毒加入细胞培养系统后添加测试化合物。
在评价细胞生物学过程的方法中，例如响应于测试化合物或疾病进展，进行人肝细胞或细胞培养基的终点测定以评价与正在研究的细胞生物学过程相关的人肝细胞的细胞生物学、化学和/或分子生物学。
附图简要说明
图1提供了来自在第7、14和24天在William E培养基和人血浆培养基中培养的供体的人肝细胞的细胞形态。在William E培养基中培养的人肝细胞在第14天开始崩解并继续崩解至第24天。在人血浆培养基中培养的人肝细胞直至第24天仍然保持完整并具有优异的上皮细胞形态。
图2提供了在人血浆培养基和William E培养基中培养29天的人肝细胞的形态。在William E培养基中培养的人肝细胞几乎全部死亡，而在人血浆培养基中培养的人肝细胞显示出优异的细胞形态。
图3提供了在第7、14、24和29天在人血浆培养基和无蛋白质肝细胞培养基(HIM)中培养的人肝细胞的细胞形态。
图4提供了来自在人血浆培养基或HIM中培养的人肝细胞中CYP1A2(通过奥美拉唑)、CYP2B6(通过苯巴比妥)和CYP2A4(通过利福平)的CYP酶诱导(通过mRNA测定)倍数增加的表格。
图5提供了用黄曲霉毒素B1体外在人血浆培养基中培养的人肝细胞的急性和亚慢性肝毒性的评价，黄曲霉毒素B1需要代谢活化以获得肝毒性。图5显示黄曲霉毒素B1对人血浆培养基中培养的人肝细胞具有细胞毒性。
图6提供了在人血浆培养基或HIM中培养的来自单个供体的人肝细胞中通过mRNA测定的CYP3A4基因表达的剂量依赖性利福平诱导。
图7提供了在人血浆培养基或HIM中培养的来自单个供体的人肝细胞中通过mRNA测定的CYP3A4基因表达的剂量依赖性利福平诱导。
发明详述
本文提供了用于在人血浆培养基中培养人器官细胞的方法、组合物和试剂盒，在细胞培养容器中包含人器官细胞和人血浆的细胞培养系统，以及培养的人器官细胞用于评价测试化合物特性、器官疾病进展和/或细胞生物学过程的用途。在实施方案中，该方法包括在人血浆培养基中培养人器官细胞，所述人血浆培养基包含70％至100％人血浆。在某些实施方案中，该方法包括在非人血浆培养基中培养人器官细胞，用人血浆培养基替换非人血浆培养基，并在人血浆培养基中培养人器官细胞，其中每隔一(1)至十五(15)天或以上将人血浆培养基用新的人血浆培养基更新至少一次。在实施方案中，将人血浆培养基更换为新鲜的人血浆培养基，例如，每2-3天，以补充营养物和清除废物。在某些实施方案中，人器官细胞是人肝细胞。在另外某些实施方案中，人器官细胞是在100％人血浆培养基中培养的肝细胞。
本文的方法通过将人器官细胞在人血浆培养基中培养延长的时间期限，例如1至约30天或更长(例如至多约90天)来进行。培养的长度将取决于它们在评价测试化合物特性、器官疾病进展和/或细胞生物学过程的方法中的用途，其中本领域技术人员理解特定测定所需的细胞培养的持续时间。在实施方案中，将人血浆培养基中的人器官细胞培养至少15天。在其它实施方案中，将人血浆培养基中的人器官细胞培养至多约15天。在实施方案中，将人器官细胞在人血浆培养基中培养至少15天，至少20天，至少25天，至少30天，至少45天，至少60天或至少90天。在实施方案中，将人器官细胞在人血浆培养基中培养至多15天，至多20天，至多25天，至多30天，至多45天，至多60天或至多90天，其中人器官细胞在培养期间保持活力。
在实施方案中，人血浆培养基由100％血浆组成。在某些实施方案中，人血浆培养基包含约70％至100％人血浆、或约80％至100％人血浆、或约90％至约100％人血浆、或约95％至约100％人血浆。在实施方案中，人血浆培养基包含约70％，约75％，约80％，约85％，约90％或约95％人血浆。
本文在人血浆培养基中培养人器官细胞的方法提供了比在非人血浆生长细胞培养基中培养相同细胞的时间存活长数天和数周的人器官细胞，其具有优异的细胞形态。参见实施例1和图1-3。当将人肝细胞在非人细胞培养基如William E培养基中培养时，细胞在第14天开始崩解，并且在一个月内在第29天几乎全部死亡。相反，将在人血浆培养基中培养的人肝细胞在一个月的细胞培养后具有优异的细胞形态，其中人血浆培养基每2至3天更换一次。该细胞培养方法提供了改进的用于评价测试化合物特性、器官疾病进展和/或细胞生物学过程的细胞培养系统。
在实施方案中，组合物包含用于评价测试化合物特性、器官疾病进展(例如肝脏疾病)和/或细胞生物学过程的细胞培养系统，其包含细胞培养容器，其包含一个或多个测定孔，其中测定孔包含人血浆培养基和人器官细胞。在某些实施方案中，细胞培养系统用于高通量筛选以测试代谢作用或对一系列测试化合物的反应。在那种情况下，细胞培养系统包含细胞培养容器，其是多孔板，例如6孔；12孔；24孔；48孔，96孔；384孔，1536孔板或其任何组合。在替代实施方案中，外源性代谢系统包含具有单个测定孔的细胞培养容器。
在某些实施方案中，通过向细胞培养系统添加测试化合物或测试制品来进行本文的细胞培养系统的使用。将测试化合物导入测定孔中，孵育，然后进行人器官细胞或细胞培养基的终点测定以确定测试化合物的特性，包括受测试化合物影响的细胞生物学过程。在实施方案中，测试化合物特性包括测试化合物的药物代谢、药物-药物相互作用和药理学。在替代实施方案中，没有测试化合物被导入细胞培养系统。在这种情况下，将人器官细胞在人血浆培养基中培养，并进行人器官细胞或细胞培养基的终点测定，以评价与待评价的细胞生物学过程或器官疾病进展相关的细胞生物学、化学和分子生物学。在实施方案中，器官疾病是肝脏疾病，例如甲型肝炎、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。在实施方案中，细胞生物学过程包含基因表达、蛋白质合成或对激素的反应。
在某些实施方案中，通过向细胞培养系统添加病毒评价疾病进展来进行本文的细胞培养系统的使用。在实施方案中，将肝炎病毒添加至包含人肝细胞和人血浆培养基的细胞培养系统。在实施方案中，随后将测试化合物添加至包含人肝细胞、人血浆培养基和肝炎病毒的细胞培养系统。在实施方案中，进行人肝细胞或细胞培养基的终点测定以评价与待评价的细胞生物学过程或肝脏疾病进展相关的接的细胞生物学、化学和分子生物学。
用于本发明的测试化合物包含但不限于药物、候选药物、生物制剂、食物成分、草药或植物成分、蛋白质、肽、寡核苷酸、DNA和RNA。在实施方案中，测试化合物是药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品、疫苗制剂、细胞毒性化学品、诱变剂、致癌物、激素、抑制性化合物、化疗剂或化学品。测试化合物可以是天然存在的或合成的，并且可以是有机的或无机的。本领域技术人员将认识到测试化合物可以在适当的溶剂或缓冲液中添加到细胞培养系统中存在的人血浆培养基中。
在实施方案中，测试化合物是药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品或化学品。
在实施方案中，人器官细胞选自肝细胞、肾细胞、肺上皮细胞、肠细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、神经元、淋巴细胞、红细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、肾上腺细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、结缔组织细胞、睾丸细胞、卵巢细胞或其组合。在某些实施方案中，人器官细胞是在人血浆培养基中培养的人肝细胞。应理解，提及“人器官细胞”是指任何上述个体器官细胞，例如肝细胞或肠细胞，如同它们在相关文本中具体公开一样。
在实施方案中，在人血浆培养基中培养的人器官细胞是新鲜分离的、预先冷冻保存的或从连续培养的细胞系获得。因此，在实施方案中，在非人血浆培养基中培养人器官细胞之前，可首先将器官细胞解冻并在培养基例如非人血浆培养基中培养。在某些实施方案中，可以将器官细胞在培养基中培养足以使器官细胞贴壁于细胞培养容器表面的时间期限。在实施方案中，该时间期限是至少约20分钟，但可以至多四(4)小时或更长。在某些实施方案中，人器官细胞是来自供体的预先冷冻保存的人肝细胞，其可以作为来自一个供体的个体批次或作为来自多个供体的库冷冻保存。
在实施方案中，人器官细胞是原代细胞或细胞系，冷冻保存或新鲜制备。在某些实施方案中，人器官细胞来自负责体内药物代谢的器官，例如肝脏(肝细胞)、肠(肠细胞)和肾脏(肾细胞)。在实施方案中，人器官细胞是用于肝脏代谢的肝细胞、用于肠代谢的肠细胞或用于肾脏代谢的肾近端管细胞。在某些实施方案中，单独使用不同的器官细胞来定义每种器官对测试化合物代谢的作用。换句话说，肠细胞可用于模拟口服摄入的测试化合物的肠代谢，肺上皮细胞可用于模拟吸入的测试化合物的代谢，肾近端小管细胞可用于模拟肾脏排泄的测试化合物的肾脏代谢。在替代实施方案中，组合使用不同的器官细胞以理解测试化合物的总体代谢。在某些实施方案中，测试化合物确定本细胞培养系统中使用的人器官细胞的类型。在实施方案中，对于其中口服是主要施用途径的测试化合物，可以选择肠细胞作为人器官细胞。或者，如果测试化合物是肾脏排泄的，则可以选择肾近端小管细胞作为人器官细胞。因此，细胞培养系统包含细胞培养容器、人血浆培养基和人肝细胞、肠细胞或肾近端小管细胞。
在某些实施方案中，人器官细胞是人肝细胞。参见Li,A.P.(2007)Humanhepatocytes:isolation,cryopreservation and applications in drugdevelopment.Chemico-biological interactions,168(1),16-29。通过标准方法从人肝脏获得的新鲜制备的人器官细胞或冷冻保存的细胞(例如肝细胞)可用作人器官细胞。参见Hewitt,Nicola J.等人"Primary hepatocytes:current understanding of theregulation of metabolic enzymes and transporter proteins,and pharmaceuticalpractice for the use of hepatocytes in metabolism,enzyme induction,transporter,clearance,and hepatotoxicity studies."Drug metabolism reviews39.1(2007):159-234。肝细胞可以以悬浮液的形式使用或铺在含有适当生长培养基(例如非人血浆培养基)的适合培养板上。
本领域技术人员理解如何选择适合的非人血浆细胞培养生长培养基。对于肝细胞，细胞培养生长培养基包括但不限于William E培养基和Dulbecco改良Eagle基本培养基。
在实施方案中，人器官细胞是肝细胞(肝脏的实质细胞)。已知肝脏代谢是代谢依赖性异生生物毒性的主要决定因素。P450和非P450第1阶段氧化酶途径主要负责将相对惰性的母体化合物生物活化为反应性(毒性/致癌/诱变)代谢物。第2阶段缀合途径主要负责将有毒母体化合物或代谢物生物转化为毒性较低的化合物。第1阶段和第2阶段途径都存在于肝细胞中-肝细胞是负责肝脏代谢的关键肝细胞类型。在实施方案中，肠细胞可用于模拟口服摄入的毒物的肠道代谢。在其它实施方案中，肾近端小管细胞可用于模拟肾代谢。在某些其它实施方案中，肠细胞可用于模拟肠代谢。
在某些实施方案中，人器官细胞是重组细胞，其中例如，它们已被改造以包含药物代谢酶。在某些实施方案中，人器官细胞经改造以含有细胞色素P450异形体。参见Doehmer,J.,Battula,N.,C.,Kudla,C.,Keita,Y.和Staib,A.H.,1992.Biotransformationof caffeine and theophylline in mammalian cell lines genetically engineeredfor expression of single cytochrome P450isoforms.Biochemical pharmacology,43(2),pp.225-235；Donato,M.T.,Jiménez,N.,Castell,J.V.,&Gómez-Lechón,M.J.(2004).Fluorescence-based assays for screening nine cytochrome P450(P450)activitiesin intact cells expressing individual human P450enzymes.Drug Metabolism andDisposition,32(7),699-706。
在实施方案中，用人血浆培养基培养稳定细胞系如HepG2，所述人血浆培养基用于本细胞培养系统和测定测试化合物代谢的方法中。HepG2是源自患有分化良好的肝细胞癌的15岁高加索人男性的肝脏的永久细胞系。由于体外形态学和功能的高度分化，HepG2细胞可以成为体外研究人肝细胞中胆小管和窦膜蛋白(bile canalicular and sinusoidalmembrane protein)和脂质的细胞内运输和动力学的适合模型。参见Ihrke等人,WIF-Bcells:an in vitro model for studies of hepatocyte polarity.Journal of CellBiology 123(6),1761-1775,1993。在某些实施方案中，用人血浆培养基培养稳定细胞系如HepaRG，所述人血浆培养基用于本发明的细胞培养系统和测定测试化合物代谢的方法中。参见Guillouzo,A.,Corlu,A.,Aninat,C.,Glaise,D.,Morel,F.和Guguen-Guillouzo,C.,2007.The human hepatoma HepaRG cells:a highly-differentiated model forstudies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.Chemico-biologicalinteractions,168(1),pp.66-73。
在实施方案中，可以对本发明的人器官细胞进行遗传改变或修饰，以便含有非天然“重组”(也称为“外源”)核酸序列，或通过反义技术修饰以提供遗传功能的获得或丧失。用于产生遗传修饰细胞的方法是本领域已知的，参见例如“Current Protocols inMolecular Biology,”Ausubel等人，编辑,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,2000。
因此，在实施方案中，用人血浆培养基培养人器官细胞的方法适用于任何器官细胞类型，包括原代细胞，干细胞，祖细胞，正常的细胞系，遗传修饰的细胞系，遗传改变的细胞系，无限增殖化的细胞系，和转化的细胞系。本发明适用于单细胞类型或细胞系，或不同细胞类型的组合。细胞可以是任何组织类型(例如，心脏，胃，肾脏，肠，肺脏，肝脏，脂肪，骨，软骨，骨骼肌，平滑肌，心肌，骨髓，肌肉，脑，胰腺)和细胞类型(例如，上皮，内皮，间充质，脂肪细胞，造血)。
在实施方案中，组合物包含用于评价测试化合物特性、肝脏疾病进展或细胞生物学过程的细胞培养系统，其包含细胞培养容器，其包含一个或多个测定孔，其中测定孔包含人血浆培养基和人器官细胞。在实施方案中，使用细胞培养系统，其中将测试化合物导入测定孔中，将测试化合物在33-40℃孵育0.5h-10天，然后进行确定测试化合物的特性的人细胞或细胞培养基的终点分析。在人血浆培养基中培养的人器官细胞可用于评价药物药理活性、药物代谢、药物-药物相互作用和药物毒性，其结果能够被直接转换成人内。
在实施方案中，细胞从多种遗传多样化的个体培养，所述个体可以对生物学和药理学试剂作出不同的反应。遗传多样性可能对测试化合物的代谢产生间接和直接影响。在实施方案中，人器官细胞是来自多个个体或供体的细胞库。在某些实施方案中，人器官细胞反映了个体群体的异质性。
在实施方案中，人器官细胞参与药学活性化合物的解毒和代谢，例如肝脏细胞，包括肝细胞；肾脏细胞包括小管细胞；脂肪细胞包含能够长时间保留有机化合物的脂肪细胞。在实施方案中，这些细胞能够在细胞培养系统中与参与呼吸和氧合过程的细胞如肺细胞组合。
在实施方案中，将预先冷冻保存的、从供体器官或从连续培养的细胞系新鲜分离的人器官细胞在非人浆细胞培养基中培养(所述非人浆细胞培养基用人血浆培养基替换)至少20分钟和至多几小时或一天或更长时间。人血浆培养基包含约70％至100％人血浆。在某些实施方案中，人血浆培养基由100％人血浆组成。在某些实施方案中，人血浆培养基可以由约70％，约75％，约80％，约85％，约90％或约95％人血浆和余量为常规使用的细胞培养基组成。在某些实施方案中，将人器官细胞在人血浆培养基中培养，所述人血浆培养基包含约75％至100％人血浆、约80％至100％人血浆，约85％至100％人血浆，约90％至100％人血浆和约95％至100％人血浆。可以从多个供体或从个体供体汇集人血浆。在实施方案中，从至少5个供体汇集人血浆。在实施方案中，人血浆获自人血液。参见实施例1，其中将人肝细胞在100％人血浆培养基中培养29天，其中培养基每2-3天更换一次，并在第29天显示出优异的细胞形态。相比之下，在非人血浆培养基(例如William E培养基)中培养的人肝细胞在第14天显示出一些崩解，并且在第29天几乎全部死亡。
在实施方案中，可以将人血浆培养基中的人器官细胞培养至少15天，至少20天，至少29天，至少30天，至少45天，至少60天或至少90天。在某些实施方案中，可以将人血浆培养基中的人器官细胞培养至少1天，至少2天，至少5天，至少10天或至少15天。在某些实施方案中，可以将人血浆培养基中的人器官细胞培养至多5天，至多10天，至多15天，至多约30天，至多45天，至多60天或至多90天。
在某些实施方案中，将人肝细胞在人血浆培养基中培养，其中所述步骤包含在非人血浆培养基中培养人肝细胞；用人血浆培养基替换非人血浆培养基；在人血浆培养基中培养人器官细胞，其中人血浆培养基每隔一(1)至十五(15)天或更长时间用新的人血浆培养基更新至少一次。在实施方案中，将人肝细胞冷冻保存，解冻，然后在非人血浆培养基中培养。在其它实施方案中，人肝细胞在人血浆培养基中培养，其中所述步骤包含从人肝脏分离人肝细胞；在非人血浆培养基中培养人肝细胞；用人血浆培养基替换非人血浆培养基；和，在人血浆培养基中培养人器官细胞，其中人血浆培养基每隔一(1)至十五(15)天或更长时间用新的人血浆培养基更新至少一次。在实施方案中，人肝细胞在人血浆培养基中培养至少一周，两周，三周或至少约一个月(例如，四周或约29-31天)。在实施方案中，细胞培养条件尽可能地复制生理条件。本文所用的术语“生理条件”定义为非常特异地监测细胞培养条件，以尽可能接近地模拟体内特定类型细胞的天然组织条件。
在实施方案中，提供了在细胞培养容器中包含人器官细胞和人血浆培养基的细胞培养系统用于评价测试化合物特性、器官疾病进展和/或细胞生物学过程的用途。
在实施方案中，测试化合物被认为是输入变量，并且在本文中可与细胞培养系统的测试化合物互换使用。通过将测试化合物添加至基于药代动力学的培养系统(例如，现有的外源代谢系统)针对生物活性筛选测试化合物，然后评估目标细胞(或培养基)的感兴趣的输出变量的变化，例如O2的消耗，CO2产生，细胞存活率，感兴趣的蛋白质的表达(蛋白质表达)，细胞功能，感兴趣的基因的表达(基因表达)，代谢物形成或代谢物谱。典型地将测试化合物以溶液或易溶形式加入到培养细胞的人血浆培养基中。可以使用流通系统添加测试化合物，或者可选地，将浓注添加到另外的静态溶液中。在流通系统中，使用两种流体，其中一种是生理上中性的溶液，另一种是添加了测试化合物的相同溶液。第一种流体通过细胞，然后是第二种。在单一溶液方法中，将大剂量的测试化合物添加到细胞周围的培养基体积中。培养基的总体组成随着快速浓注的添加不会显著改变，或者在流通方法中在两种溶液之间不会显著改变。
在实施方案中，测试化合物包括药理学活性药物或候选药物和遗传活性分子。感兴趣的测试化合物包括化疗剂、抗炎剂、激素或激素拮抗剂、离子通道改性剂和神经活性剂。适用于本发明的药剂的示例是如下文献中描述的那些：“The Pharmacological Basisof Therapeutics,”Goodman and Gilman,McGraw-Hill,New York,N.Y.,(1996),第9版,如下章节中:Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites；DrugsActing on the Central Nervous System；Autacoids:Drug Therapy of Inflammation；Water,Salts and Ions；Drugs Affecting Renal Function and ElectrolyteMetabolism；Cardiovascular Drugs；Drugs Affecting Gastrointestinal Function；Drugs Affecting Uterine Motility；Chemotherapy of Parasitic Infections；Chemotherapy of Microbial Diseases；Chemotherapy of Neoplastic Diseases；DrugsUsed for Immunosuppression；Drugs Acting on Blood-Forming Organs；Hormones andHormone Antagonists；Vitamins,Dermatology；and Toxicology。还包括毒素和生物和化学战剂，例如，参见Somani,S.M.(编辑),“Chemical Warfare Agents,”Academic Press,New York,1992)。
在实施方案中，测试化合物包括本文公开的所有类别的分子，并且可以进一步或分别包含未知含量的样品。虽然许多样品将包含溶液中的化合物，但也可以测定可以溶解在适合溶剂中的固体样品。含有感兴趣的测试化合物的样品包含环境样品，例如地下水、海水或采矿废物；生物样品，例如由作物或组织样品制备的裂解物；制造样品，例如药物制备过程中的时间过程；以及为分析准备的化合物库等。感兴趣的样品包括待评估具有潜在治疗价值的测试化合物，例如来自植物或真菌细胞的候选药物。
测试化合物从多种来源获得，包含合成或天然化合物库。例如，许多方法可用于随机和定向合成各种各样的有机化合物和生物分子，包含随机化寡核苷酸和寡肽的表达。或者，可以获得或容易地生产细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库。另外，天然或合成产生的库和化合物易于通过常规化学、物理和生物化学方法修饰，并可用于产生组合库。可以对已知的药理学试剂进行定向或随机化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化以产生结构类似物。
在实施方案中，在将细胞培养系统与测试化合物一起孵育后，进行终点分析以确定测试化合物的特性，包括疾病进展和细胞生物学过程。在实施方案中，终点分析鉴定细胞培养系统的输出变量(例如测试化合物的特性)。在实施方案中，输出变量是细胞的可定量要素，特别是能够在细胞培养系统中准确测定的要素。输出变量可以是任何细胞成分或细胞产物，包含例如存活率、呼吸、代谢、细胞表面决定因子、受体、蛋白质或其构象或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、mRNA、DNA或来自这种细胞成分的部分。在实施方案中，输出变量直接或间接是测试化合物或其代谢物的结果。虽然大多数输出变量将提供定量读出(readout)，但在某些情况下，将获得半定量或定性结果。读出可以包含单个确定值，或者可以包含平均值、中值或方差。特征性地，将为每个输出获得一系列读出值。预期可变性，并且可以使用标准统计方法建立一组测试输出的一系列值。
可以使用各种方法来定量所选代谢标志物的存在。液相色谱(LC)、质谱(MS)和它们的组合(LC/MS-MS)常规用于代谢物的定量。对于存在的分子的量的非LC/MS测定，方便的方法是用可检测部分标记该分子，该可检测部分可以是荧光的、发光的、放射性的或酶活性的。荧光的和发光的部分很容易用于标记几乎任何生物分子、结构或细胞类型。可以引导免疫荧光部分不仅与特定蛋白质结合，还可以与特定构象、切割产物或磷酸化等位点修饰结合。可以将单个肽和蛋白质改造成自发荧光，例如通过将它们表达为细胞内的绿色荧光蛋白嵌合体(综述参见Jones等人(1999)Trends Biotechnol.17(12):477-81)。
输出变量可以通过免疫测定技术测量，例如免疫组织化学、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)和相关的非酶促技术。这些技术利用特异性抗体作为报告分子，由于它们对连接单个分子靶标的高度特异性，因此特别有用。基于细胞的ELISA或相关的非酶或基于荧光的方法使得能够测量细胞表面参数。来自此类测定的读出可以是与单个荧光抗体检测的细胞表面分子或细胞因子相关的平均荧光，或平均荧光强度、中值荧光强度、荧光强度的变化或这些之间的某种关系。对于毒性测定，输出可包括测量细胞存活率，例如酶释放，细胞ATP含量，活性氧物质形成，还原型谷胱甘肽的减少，蛋白质合成，蛋白质含量，DNA含量，染料排除，染料包含和细胞分离。对于药理学测定，可以使用特定疾病靶标相关的测定。
在实施方案中，筛选试验的结果可以与从参考化合物，浓度曲线，对照(有和没有代谢能力的细胞)等获得的结果进行比较。结果的比较通过使用适合的推导方案、AI系统、统计学比较、算法等来完成。
可以编译参考输出数据的数据库。这些数据库可包括来自已知药剂或药剂组合的结果，以及来自在环境条件下处理的细胞的分析的参考，其中单个或多个环境条件或参数被去除或特别地改变。可以生成数据矩阵，其中数据矩阵的每个点对应于来自输出变量的读出，其中每个输出的数据可以来自重复测定，例如相同类型的多个单独的细胞。
读出可以是与测量相关联的均值、平均值、中值或方差或其它统计或数学导出的值。可以通过与对应的参考读出的直接比较来进一步细化输出读出信息。在相同条件下为每个输出获得的绝对值将显示活生物系统中固有的变异性，并且还反映个体细胞变异性以及个体之间固有的变异性。
实施例
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何使用本文提供的实施方案的完整公开和描述，并且不旨在限制本公开的范围，也不旨在表示以下实施例是进行的所有实验或仅一些实验。已经尝试确保关于所使用的数值(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数按体积份数计，温度是摄氏度。应当理解，可以在不改变实施例旨在示例的基本方面的情况下进行所描述的方法的变化。
实施例1:人肝细胞在完整(100％)人血浆中的培养
在人体中，由血浆来营养所有细胞。因此，人血浆应是培养人细胞最适合的培养基。
将预先冷冻保存的100％汇合的可铺板的人肝细胞(HH1053/57/62；三个供体)在100％人血浆(来自五个供体汇集的轻微修饰的人类血浆)和William E培养基(ThermoFisher)中培养，William E培养基为用于成年大鼠肝脏上皮细胞的长期细胞培养但也可用于培养人肝细胞的减少血清补充培养基。将肝细胞在96孔板中总共培养29天，其中每周一、周三和周五更换培养基。
在第7、14、24和29天评价所培养的肝细胞的细胞形态，其中在William E培养基中培养的人肝细胞在第14天开始崩解并且继续崩解直至在第29天实验结束。相反，在100％人血浆培养基中培养的人肝细胞保持完整并具有正常的上皮细胞形态直至第24天。参见图1。在William E培养基中培养的人肝细胞在第29天几乎全部死亡，而在100％人血浆中培养的人肝细胞保持存活并具有正常的上皮细胞形态。参见图2。
可以在人血浆中培养人肝细胞一段延长的时间(超过4周)。相反，在用于肝细胞培养的最常用培养基William E培养基中培养的人肝细胞，细胞在约两周或14天时开始恶化。
实施例2:细胞色素P450诱导
将来自人供体的肝细胞(预先冷冻保存)铺板于100％人血浆(从供体合并的轻微修饰的人血浆培养基；HPZ-A)和无蛋白肝细胞培养基(HIM)中，总计持续29天。使用Universal Cryopreservation Plating Medium(UCPM)将肝细胞铺板于96孔胶原包被的组织培养板中。贴壁4小时后，将培养基更换为含有0.25mg/mL基质胶的HPZ-A和HIM。第二天将培养基更换为不含Matrigel的HPZ-A，之后每2-3天更换培养基，培养时间为29天。
图3显示了在第7、14、24和29天与HIM比较的人血浆培养基中培养的人肝细胞的形态。在人血浆培养基中培养的人肝细胞在第29天保持存活并具有正常的上皮细胞形态。因此，100％人血浆培养基(HPZ-A)能够成功用于培养人肝细胞至少29天或更长的延长的时间期限。
为了进行CYP诱导比较，使用4个批次的人肝细胞(HH1007；HH1026；HH1051；和HH1053)。细胞色素P450蛋白质是催化药物代谢中涉及的许多反应的单加氧酶。如上所述，在HIM和人血浆培养基中将肝细胞铺板于96孔板中，在铺板后第5天开始用典型诱导物处理。处理持续时间为3天。通过RT-PCR的基因表达用于测定CYP1A2(奥美拉唑)、CYP2B6(苯巴比妥)和CYP3A4(利福平)的诱导。
图4显示了在HIM和人血浆培养基中培养的四个批次的人肝细胞中的每个批次通过mRNA测定的CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4中每一个的诱导。在人血浆培养基中培养的人肝细胞对CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4诱导有响应，证明了完整P450诱导途径的保留。
对于长期细胞毒性，如上所述，将批次HH1062在人血浆培养基中培养，并在第2天和第10天用7种浓度的黄曲霉毒素B1(浓度范围为1μM至90μM)处理。基于细胞ATP含量定量存活率(ATPLite，Perkin-Elmer)。结果使用以下等式表示为相对存活率：
相对存活率(％)＝ATP(处理)/ATP(溶剂对照)×100。
图5显示了人血浆中的体外急性和亚慢性肝毒性评价。发现需要代谢活化肝毒性的黄曲霉毒素B1对人血浆培养基中培养的人肝细胞具有细胞毒性。在第10天处理持续时间后，黄曲霉毒素UC50值是在2天处理持续时间后观察到的值的十九分之一。结果表明，在人血浆中培养的人肝细胞可以激活一种前毒物(protoxicant)，并且可用于评价慢性肝毒性。
实施例3:细胞色素P450 3A4诱导
CYP3A4是酶的细胞色素P450超家族的成员。
如实施例2中所公开的，将来自两个人供体的肝细胞(预先冷冻保存)铺板并培养。为了进行CYP3A4诱导比较，使用多个批次人肝细胞(HH1051和HH1053)。对于在HIM中培养的肝细胞，在铺板后第2天加入利福平(浓度范围为1μM至20μM)，持续处理3天，并且对于在人血浆培养基中培养的肝细胞，在铺板后第5天加入利福平(浓度范围为10μM至200μM)，持续处理3天。通过RT-PCR的基因表达用于测定利福平对CYP3A4的诱导。
图6和7显示利福平对CYP3A4基因表达的剂量依赖性诱导。在评价的浓度下，发现在人血浆培养基中培养的肝细胞中的最大倍数诱导低于在HIM中培养的肝细胞观察到的最大倍数诱导。
实施例4:肝脏疾病机制和治愈的评价
在人血浆中培养的人肝细胞的潜在应用在于用于评价甲型肝炎、乙型肝炎和/或丙型肝炎。人血浆肝细胞培养物可以用纯化的病毒或含病毒的血浆(例如来自肝炎患者)感染。病毒复制和得到的肝细胞的变化能够帮助理解病毒感染和肝损伤的机制。病毒感染的肝细胞也能够用于筛选用于开发肝炎药物的抗肝炎候选药物。
本领域技术人员可以在本发明公开的发明的范围和精神内设计出许多变型和其它实施方案。实际上，本领域技术人员可以在不改变所公开的发明的基本方面的情况下，对所描述的材料、方法、附图、实验例和实施方案进行变化。任何公开的实施方案可以与任何其它公开的实施方案组合使用。
所公开的实施方案、实施例和实验不旨在限制本公开的范围，也不表示以下实验是全部进行或仅进行的实验。已经尝试确保关于所使用的数值(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。应当理解，可以在不改变实验旨在示例的基本方面的情况下进行所描述的方法的变化。

Claims (65)

1.培养人器官细胞的方法，包括：
a)在非人血浆培养基中培养人器官细胞；
b)用人血浆培养基替换非人血浆培养基；和
c)在人血浆培养基中培养人器官细胞，其中每一(1)至十五(15)天或以上用新的人血浆培养基将人血浆培养基更新至少一次。
2.权利要求1的方法，其中将人器官细胞在非人血浆培养基中培养至少20分钟。
3.权利要求1的方法，其中将人器官细胞在人血浆培养基中培养至少15天。
4.权利要求1的方法，其中将人器官细胞在人血浆培养基中培养至多约15天。
5.权利要求1的方法，其中人器官细胞是新鲜分离的、预先冷冻保存的、或从连续培养的细胞系中获得的。
6.权利要求1的方法，其中人血浆培养基包含70％至100％人血浆。
7.权利要求1的方法，其中人血浆培养基由100％血浆组成。
8.权利要求1的方法，其中人器官细胞选自肝细胞、肾细胞、肺上皮细胞、肠细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、神经元、淋巴细胞、红细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、肾上腺细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、结缔组织细胞、睾丸细胞、卵巢细胞或其组合。
9.培养人肝细胞的方法，包括：
a)在非人血浆培养基中培养人肝细胞；
b)用人血浆培养基替换非人血浆培养基；和
c)在人血浆培养基中培养人器官细胞，其中每一(1)至十五(15)天或以上用新的人血浆培养基将人血浆培养基更新至少一次。
10.权利要求9的方法，其中将人肝细胞在非人培养基中培养至少20分钟。
11.权利要求9的方法，其中将人肝细胞在人血浆培养基中培养至少15天。
12.权利要求9的方法，其中将人肝细胞在人血浆培养基中培养至多约15天。
13.权利要求9的方法，其中人肝细胞是新鲜分离的、预先冷冻保存的、或从连续培养的细胞系中获得的。
14.权利要求9的方法，其中人血浆培养基包含70％至100％人血浆。
15.权利要求9的方法，其中人血浆培养基由100％血浆组成。
16.培养人肝细胞的方法，包括：
a)从人肝脏分离人肝细胞；
b)在非人血浆培养基中培养人肝细胞；
c)用人血浆培养基替换非人血浆培养基；和
d)在人血浆培养基中培养人器官细胞，其中每一(1)至十五(15)天或以上用新的人血浆培养基将人血浆培养基更新至少一次。
17.权利要求16的方法，其中将人肝细胞在非人培养基中培养至少20分钟。
18.权利要求16的方法，其中将人肝细胞在人血浆培养基中培养至少15天。
19.权利要求16的方法，其中将人肝细胞在人血浆培养基中培养至多约15天。
20.权利要求16的方法，其中人血浆培养基包含70％至100％人血浆。
21.权利要求19的方法，其中人血浆培养基由100％血浆组成。
22.用于评价测试化合物特性、肝脏疾病进展和/或细胞生物学过程的细胞培养系统，包含：
细胞培养容器，其包含一个或多个测定孔，其中所述测定孔包含人血浆培养基和人器官细胞。
23.权利要求22的细胞培养系统，还包括测试化合物。
24.权利要求22的细胞培养系统，其中所述测试化合物是药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品或化学品。
25.权利要求22的细胞培养系统，其中所述测试化合物特性包括该测试化合物的药物代谢、药物-药物相互作用和药理学。
26.权利要求22的细胞培养系统，其中肝脏疾病包含甲型肝炎感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。
27.权利要求22的细胞培养系统，其中细胞生物学过程包含基因表达、蛋白质合成或对激素的反应。
28.权利要求22的细胞培养系统，其中人细胞是原代细胞或细胞系。
29.权利要求22的细胞培养系统，其中人器官细胞是预先冷冻保存的。
30.权利要求22的细胞培养系统，其中人器官细胞选自肝细胞、肾细胞、肺上皮细胞、肠细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、神经元、淋巴细胞、红细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、肾上腺细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、结缔组织细胞、睾丸细胞、卵巢细胞或其组合。
31.权利要求22的细胞培养系统，其中所述细胞培养容器是单孔板。
32.权利要求22的细胞培养系统，其中所述细胞培养容器是多孔板。
33.权利要求22的细胞培养系统，其中人血浆由获自人供体的血液制备。
34.权利要求22的细胞培养系统，其中人血浆汇集自多个供体。
35.权利要求22的细胞培养系统，其中人血浆培养基包含70％至100％人血浆。
36.权利要求22的细胞培养系统，其中人血浆培养基由100％血浆组成。
37.用于评价测试化合物特性、肝脏疾病进展和/或细胞生物学过程的细胞培养系统，包含：
细胞培养容器，其包含一个或多个测定孔，其中测定孔包含人血浆培养基和人肝细胞。
38.权利要求37的细胞培养系统，还包括测试化合物或病毒。
39.权利要求37的细胞培养系统，其中所述测试化合物是药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品或化学品。
40.权利要求37的细胞培养系统，其中所述测试化合物特性包括该测试化合物的药物代谢、药物-药物相互作用和药理学。
41.权利要求37的细胞培养系统，其中肝脏疾病包含甲型肝炎感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。
42.权利要求37的细胞培养系统，其中细胞生物学过程包括基因表达、蛋白质合成或对激素的反应。
43.权利要求37的细胞培养系统，其中人肝细胞是原代细胞或细胞系。
44.权利要求37的细胞培养系统，其中人肝细胞是预先冷冻保存的。
45.权利要求37的细胞培养系统，其中细胞培养容器是单孔板。
46.权利要求37的细胞培养系统，其中细胞培养容器是多孔板。
47.权利要求37的细胞培养系统，其中人血浆由获自人供体的血液制备。
48.权利要求37的细胞培养系统，其中人血浆汇集自多个供体。
49.权利要求37的细胞培养系统，其中人血浆培养基包含90-100％人血浆。
50.权利要求37的细胞培养系统，其中人血浆培养基由100％血浆组成。
51.评价测试化合物特性的方法，该方法包括：
a)提供权利要求22-50的细胞培养系统；
b)将测试化合物导入测定孔；
c)将测试化合物在33至40℃孵育0.5h-10天；和
d)进行人细胞或细胞培养基的终点测定以确定测试化合物的特性。
52.权利要求51的方法，其中终点测定包括测定细胞存活率、细胞功能、基因表达、蛋白质表达、代谢物形成或代谢物特性。
53.权利要求51的方法，其中终点测定包括测定测试化合物的消失和代谢物的出现，测定第一测试化合物对共同施用的第二测试化合物的代谢的影响，或测定对人器官细胞的药理学作用。
54.权利要求51的方法，其中在37℃、5％CO2下孵育所述系统。
55.权利要求51的方法，其中所述测试化合物特性包括该测试化合物的药物代谢、药物-药物相互作用和药理学。
56.权利要求51的方法，其中所述测试化合物是药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品或化学品。
57.评价肝脏疾病进展的方法，该方法包括：
a)提供权利要求22-50的细胞培养系统；
b)在人血浆培养基中培养人肝细胞；和
c)进行人肝细胞或细胞培养基的终点测定，用于评价与疾病进展相关的人肝细胞的细胞生物学、化学和/或分子生物学。
58.权利要求57的方法，其中肝脏疾病包含甲型肝炎感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染。
59.权利要求57的方法，还包括将肝炎病毒导入测定孔。
60.权利要求59的方法，还包括将测试化合物导入测定孔。
61.权利要求60的方法，其中所述测试化合物是药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品或化学品。
62.权利要求57的方法，其中在37℃、5％CO2下孵育所述系统。
63.用于评价细胞生物学过程的方法，该方法包括：
a)提供权利要求22-50的细胞培养系统；
b)在人血浆培养基中培养人器官细胞；和
c)进行人器官细胞或细胞培养基的终点测定，用于评价与所研究的细胞生物学过程相关的人器官细胞的细胞生物学、化学和/或分子生物学。
64.权利要求63的方法，还包括将测试化合物导入测定孔。
65.权利要求64的方法，其中所述测试化合物是药物、候选药物、工业化学品、环境污染物、杀虫剂、杀昆虫剂、生物化学品或化学品。
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