CN109069872A

CN109069872A - 用于治疗疾病的聚合物药物递送系统

Info

Publication number: CN109069872A
Application number: CN201680081255.2A
Authority: CN
Inventors: C·李; 赵俊; 贾森·弗莱明
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2036-12-09
Also published as: US20200246264A1; US11026889B2; WO2017100533A1; CN109069872B

Abstract

提供了可用于例如向对象递送治疗性化合物的组合物和纳米粒制剂。在一些实施方案中，所述纳米粒可用于递送一种或更多种化学治疗剂以治疗癌症，例如胰腺导管腺癌。

Description

用于治疗疾病的聚合物药物递送系统

发明背景

本申请要求于2015年12月9日提交的美国临时专利申请No.62/265,167的权益，其全部内容通过引用并入本文。

1.技术领域

本发明一般地涉及药物递送和纳米粒的领域。更特别地，其涉及用于递送化学治疗性化合物的聚合物及其聚合物胶束。

2.背景技术

尽管在过去的数十年期间对胰腺癌进行了有力的研究，但这种疾病依然是最致命的癌症类型之一。胰腺癌患者的总5年生存率低于5％；因此，迫切需要开发用于这种疾病的有效治疗(Tempero等，2011)。胰腺肿瘤的特征是过多的结缔组织增生性基质(Feig等，2012)，这是由胰腺星形细胞(也称为成纤维细胞)产生的纤维沉积。结缔组织增生性基质保护肿瘤细胞免受辐射，限制化学治疗药物向肿瘤中的递送，并促进肿瘤进展和转移(Rucki和Zheng，2014)。因此，已经研究了基质消耗作为胰腺癌的潜在治疗。然而，单独的基质消耗迄今尚未成功。

音猬因子(sonic hedgehog，SHH)信号转导途径在胰腺癌的起始和进展中发挥关键作用，并且该途径的持续活化有助于肿瘤基质的过度沉积和肿瘤起始细胞的维持(Thayer等，2003；Geng等，2007；Watkins和Peacock，2004；Onishi和Katano，2014)。许多临床前研究已表明，SHH途径抑制剂(例如环杷明(cyclopamine，CPA)、莎丽德吉(saridegib)和维莫德吉(vismodegib))有效地对抗胰腺癌(Chen等，2002；Kim等，2014)。CPA是具有针对SHH途径中平滑(smoothened，SMO)受体之强效拈抗剂活性的天然植物产品。CPA可消耗癌症干细胞(cancer stem cell，CSC)，破坏肿瘤基质，并增强肿瘤对电离辐射的响应(Shafaee等，2006；Kelleher，2011)。CPA也提高紫杉醇(PTX)在表达SHH的胰腺癌细胞中的细胞毒性作用(Shafaee等，2006)。然而，在许多情况下，CPA单一治疗仅延迟胰腺肿瘤生长(Chitkara等，2012；You等，2015)。而且，CPA和PTX二者均不溶于水并且是高度毒性的，这带来潜在的共施用问题。已经通过CPA的共价缀合或物理包封制备了数种基于聚合物的纳米制剂(Chitkara等，2012；You等，2015；Cho等，2013；Zhou等，2012)，并且这样的制剂已显示出针对不同肿瘤类型的有希望的抗肿瘤效力。然而，这些制剂在生理条件下经过24-h孵育期表现出不期望的突释作用或快速释放曲线。也难以实现大于按重量计5％的CPA有效载荷。这些缺点可限制这些CPA纳米粒制剂的进一步开发。因此，仍然需要用于向癌症(例如胰腺癌)施用的递送CPA和其他化学治疗剂的改进方法。

发明内容

在一些方面，本公开内容提供用于递送治疗剂的聚合物及其聚合物胶束。在一些实施方案中，这些药物递送系统可用于治疗癌症，例如胰腺癌。

本发明的一个方面涉及聚合物，其中所述聚合物是嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含具有多个PEG侧链和多个ε-己内酯侧链的聚丙烯酸主链。PEG侧链组分可包含5至50个、3至40个、3至20个、或者3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40个或可从其中来源的任何范围的乙二醇单体。在一些实施方案中，PEG侧链用甲基封端。在一些实施方案中，ε-己内酯侧链包含2至20个、2至15个、或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或可从其中来源的任何范围的ε-己内酯重复单元。在一些实施方案中，ε-己内酯侧链用琥珀酸基团酯化。ε-己内酯侧链可通过乙二醇接头与聚丙烯酸主链连接。在一些实施方案中，聚丙烯酸主链用N-(2-羟乙基)氨基甲酸苄酯或乙醇胺基团封端。在一些实施方案中，聚丙烯酸主链以卤素基团终止。在一些实施方案中，聚合物由下式进一步限定：

其中：R₁是烷基_(C1-18)、环烷基_(C1-18)、芳基_(C1-18)或这些基团中任一种的经取代形式；或被经保护的胺基团取代的烷基_(C1-18)；R₂是下式的基团：

其中：R₃和R₃′各自独立地是氢、烷基_(C1-6)或经取代的烷基_(C1-6)；并且x是1至10；m是5至40或10至40；n是10至40；p是5至40或5至20；q是1至20或1至10；y是1至10；并且Y₁是羧基、膦酸/膦酸根(phosphonate)或羟基磺酰基；或其可药用的盐。

在一些实施方案中，所述聚合物还包含下式的第二聚合物：

其中：m是5至40或10至40；n是10至40；p是5至30；R₁和R2各自独立地是烷二基(alkanediyl)_(C1-8)、芳二基(arenediyl)_(C6-12)或这些基团中任一种的经取代形式；R₃、R₃′和R₃″各自独立地是烷基_(C1-8)、芳基_(C3-12)或这些基团中任一种的经取代形式；并且X₁和X₂各自独立地是一价阴离子；或其药用盐。在一些实施方案中，m是5至25、15至25、8至10或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，n是15至25、18至20或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，p是5至25、18至22、5至15或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，q是5至10。在一些实施方案中，x是5至10，5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，R₃和R₃′是氢。在一些实施方案中，R₃和R₃′是氢并且x是5。R₁可以是亚乙基。R₂可以是亚乙基。在一些实施方案中，R₃、R₃′和R₃″各自是甲基。X₁可以是卤素(halide)(例如，氯(chloride))。X₂可以是卤素(例如，氯)。

在一些实施方案中，聚合物具有以下结构：

在一些实施方案中，第二聚合物具有以下结构：

本发明的另一个方面涉及药物组合物，其包含：(a)胶束、脂质体或纳米粒；以及(b)治疗剂(例如，一种或两种治疗剂)；其中所述胶束、脂质体或纳米粒包含本发明或如上限定的第一聚合物，并且所述胶束、脂质体或纳米粒包封所述治疗剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含赋形剂，例如单糖或二糖(例如，蔗糖)。所述胶束、脂质体或纳米粒还包含第二聚合物。在一些实施方案中，第一聚合物包含净阴离子电荷。在一些实施方案中，第一聚合物由下式进一步限定：

其中：R₃和R₃′各自独立地是氢、烷基_(C1-6)或经取代的烷基_(C1-6)；并且x是1至10；m是5至40或10至40；n是10至40；p是5至40或5至20；q是1至20或1至10；y是1至10；并且Y₁是羧基、膦酸/膦酸根或羟基磺酰基；或其可药用的盐。在一些实施方案中，第一聚合物是：

或其可药用的盐。在一些实施方案中，第二聚合物包含净阳离子电荷。在一些实施方案中，第二聚合物由以下结构进一步限定：

其中：m是5至40或10至40；n是10至40；p是5至30；R₁和R₂各自独立地是烷二基_(C1-8)、芳二基_(C6-12)或这些基团中任一种的经取代形式；R₃、R₃′和R₃″各自独立地是烷基_(C1-8)、芳基_(C3-12)或这些基团中任一种的经取代形式；并且X₁和X₂各自独立地是一价阴离子；或其药用盐。在一些实施方案中，第二聚合物由下式进一步限定：

或其可药用的盐。在一些实施方案中，第一聚合物具有以下结构：

并且其中第二聚合物具有以下结构：

或其可药用的盐。在一些实施方案中，第一聚合物与第二聚合物的比例为约100∶1w/w至约1∶10w/w、约100∶1w/w至约1∶1、约100∶1w/w至约10∶1、约10∶1w/w至约1∶1w/w，或者约100∶1w/w、50∶1w/w、10∶1w/w、5∶1w/w或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，药物组合物包含各自独立地治疗或者选择性地靶向或结合肿瘤细胞和/或肿瘤基质细胞的两种治疗剂(例如，两种化学治疗剂)。治疗剂可以是化学治疗剂，例如紫杉醇或环杷明。在一些实施方案中，药物组合物包含紫杉醇和环杷明。在一些实施方案中，化学治疗剂是GANT58、GANT61、维生素D或17-N-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17-AAG)。在一些实施方案中，药物组合物包含：(i)GANT58和紫杉醇、(ii)GANT61和紫杉醇、(iii)维生素D和紫杉醇、(iv)GANT58和17-AAG、(v)GANT61和17-AAG、或(vi)维生素D和17-AAG。在一些实施方案中，药物组合物配制成用于静脉内、动脉内、腹膜内、肠胃外、皮下或肿瘤内施用。在一些实施方案中，药物组合物还包含赋形剂。赋形剂可以是单糖或二糖(例如，蔗糖)。在一些实施方案中，单糖或二糖的浓度为约1％至约10％(w/w)。在一些实施方案中，赋形剂的浓度为约5％(w/w)。

本发明的另一个方面涉及在哺乳动物对象中治疗疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本发明或如上限定的药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。所述癌症可以是胰腺癌，例如胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)。在一些实施方案中，胰腺癌是其中音猬因子信号转导途径中的一种或更多种蛋白质有缺陷(例如，音猬因子信号转导途径上调)的胰腺癌。在一些实施方案中，胰腺癌是其平滑受体(SMO)失调(例如，上调)的胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症是肝癌(例如，肝细胞癌)。在一些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。卵巢癌可以是高等级浆液性癌(high grade serouscarcinoma)。在一些实施方案中，所述癌症是基底细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是髓母细胞瘤。在一些实施方案中，药物组合物包含紫杉醇或环杷明。在一些实施方案中，药物组合物包含紫杉醇和环杷明。在一些实施方案中，哺乳动物对象是人。在一些实施方案中，药物组合物可与第二治疗剂或抗癌治疗(例如，检查点抑制剂、免疫治疗(例如，治疗性抗体、抗体片段或免疫毒素)或放射治疗组合施用于对象。在一些实施方案中，所述方法还包括向对象施用检查点抑制剂、免疫治疗或放射治疗。

在一些实施方案中，药物组合物可与一种或更多种另外的治疗剂组合施用于患者。例如，另外的治疗剂可以是免疫治疗(例如，用用治疗癌症)。例如，一种或更多种治疗性抗体、抗体片段(例如，scFv等)或免疫毒素可与如本文中所述的纳米粒或胶束组合施用于对象，例如人患者。

如本文中所用，就特定组分而言，本文中使用“基本上不含”来意指特定组分全部都没有被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何无意识的污染导致的特定组分的总量低于0.05％。当在本文中使用时，术语“更基本上不含”意指低于0.01％。在一些实施方案中，当术语“基本上不含”用于描述组合物时，其中使用标准分析方法不能检测到任何量的特定组分。

如在本文说明书中所用，没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。如在本文权利要求书中所用，当与词语“包括/包含”结合使用时，没有数量词修饰的名词表示一个/种或多于一个/种。

除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案相互排斥，否则术语“或”在权利要求书中的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义。如本文中所用，“另一个/种”可意指至少第二个/种或更多个/种。

在本申请通篇，术语“约”用于指示数值包括装置的误差的固有变化，该方法用于确定该值或存在于研究对象之间的变化。

通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实例尽管表示本发明的一些优选实施方案但是仅通过举例说明给出，因为通过该详细描述，在本发明的精神和范围内的不同变化和修改对于本领域技术人员将变得明显。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步示出本发明的某些方面。通过参照这些附图中的一个或更多个并结合本文中给出的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。

图1A至1D：用于配制胶束的聚合物的化学结构和¹H-NMR谱。(A和C)阴离子聚合物(A)和阳离子聚合物(C)的化学结构。(B和D)阴离子聚合物(B)和阳离子聚合物(D)的¹H-NMR谱。粗体小写字母表示质子的特征性化学位移。

图2A至2G：聚合物胶束M-CPA(A)、M-PTX(B)和M-CPA/PTX(C)的TEM显微照片；以及载药胶束在37℃下的药物释放曲线(D至G)。TEM用乙酸铀酰阴性染色完成。每种释放研究重复三次。数据以平均值±SD表示。

图3A至3I：M-CPA和M-PTX对Miapaca-2细胞的影响。(A)用M-CPA孵育24-h之后，抑制CPA-BODIPY与SMO受体的结合。(B和C)未用M-CPA孵育(B)和用20μM M-CPA孵育(C)的经CPA-BODIPY处理的细胞的代表性荧光显微图像。绿色，CPA-BODIPY；蓝色，细胞核；比例尺＝20μm。(D)用M-CPA孵育48-h之后归一化的Gli-1表达。(E和F)用CPA或M-CPA(E)或者PTX、M-PTX或M-CPA/PTX(F)孵育72-h之后的细胞生存力。(G)用CPA或M-CPA孵育10天之后形成的集落的归一化数量。(H和I)用3μM CPA(H)或3μM M-CPA(I)孵育之后的集落的代表性图像。

图4A至4J：M-CPA和/或M-PTX处理Miapaca-2细胞对CD133表达和肿瘤球形成的影响。(A至D)暴露于CTL(A)、10μM M-CPA(B)、10nM M-PTX(C)或10μM M-CPA+10nM M-PTX(D)48-h之后CD133表达的代表性流式细胞术图。CD133⁺细胞是位于多边形内的那些。(E)经指定处理之后CD133⁺细胞的百分比(N＝3)。与对照相比，M-PTX处理显著地富集了CD133⁺群(p＜0.001)；与对照相比，M-CPA和M-CPA/PTX显著地使CD133⁺群消耗(p＜0.001)。(F)经指定处理之后每1000个细胞形成肿瘤球的数量(＞50μm)(N＝6)。对照组和M-PTX组具有比M-CPA或M-CPA/PTX组显著更多的肿瘤球(p＜0.001)。(G至J)用对照(CTL)(G)、10μM M-CPA(H)、10nM M-PTX(I)或10μM M-CPA+10nMM-PTX(J)处理的细胞的代表性显微照片。

图5A至5E：载药胶束对HPSC增殖和SHH途径活性的影响。(A)用M-CPA或游离CPA(浓度以CPA等价物计)孵育72-h之后的细胞生存力(N＝6)。(B)用M-PTX或M-CPA/PTX(浓度以PTX等价物计)孵育72-h之后的细胞生存力(N＝6)。M-CPA/PTX具有相等的CPA和PTX载量。(C)用M-CPA孵育48-h之后HPSC的归一化Gli-1表达。结果是来自两个独立的western印迹分析的平均值，并针对β-肌动蛋白进行归一化。(D)在含有或不含10μM M-CPA并存在SHH配体的情况下孵育72-h之后的细胞生存力(N＝6)。(E)在含有或不含1.5μg/mL SHH并存在M-CPA的情况下孵育48-h之后HPSC的归一化Gli-1表达。结果是来自两个独立的western印迹分析的平均值，并针对β-肌动蛋白进行归一化。

图6A至6D：M-CPA、M-PTX和M-CPA/PTX在小鼠的原位Miapaca-2/HPSC异种移植物模型中的抗肿瘤效力。(A)通过生物发光测量的相对肿瘤生长(N＝9)。剂量如下：M-CPA和M-PTX，10mg/kg/注射，1周内注射3次；M-CPA/PTX，10mg/kg/药物/注射，1周内注射3次。注射时间用箭头标出。M-CPA/PTX组中肿瘤生长比任何其他组更慢(p＜0.01)。(B和C)来自对照和经M-CPA/PTA处理的小鼠的苏木精-伊红染色的肿瘤切片的代表性显微照片。(B)来自未经处理的对照小鼠的肿瘤切片充满活肿瘤细胞和肿瘤基质(用白色箭头勾勒的边界)。(C)来自经M-CPA/PTX处理的小鼠的肿瘤切片的部分显示肿瘤细胞的松散分布。(D)来自用M-CPA/PTX处理的无肿瘤小鼠的胰的苏木精-伊红染色切片的代表性显微照片显示没有残留的肿瘤细胞。

图7A至7O：经不同处理之后MiaPaca肿瘤切片的免疫组织化学染色。(A至E)在(A)对照、(B)M-CPA、(C)M-PTX和(D)M-CPA/PTX组中的增殖肿瘤细胞的Ki67⁺染色和(E)处理组之间每20×显微镜视野Ki67⁺细胞核数的对比。所有三个处理组具有比对照组更少的Ki67⁺细胞核(p＜0.001)；M-CPA/PTX组具有比M-CPA组更少的Ki67⁺细胞核(p＜0.05)。(F至J)在(F)对照、(G)M-CPA、(H)M-PTX和(I)M-CPA/PTX组中的肿瘤脉管系统(vasculature)的CD31染色和(J)处理组之间脉管系统密度的对比。与对照相比，M-CPA/PTX使肿瘤脉管系统提高了超过10倍(p＜0.001)，而M-CPA使肿瘤脉管系统提高了3.6倍(p＜0.05)。(K至O)在(K)对照、(L)M-CPA、(M)M-PTX和(N)M-CPA/PTX组中活化的基质的α-SMA染色和(O)处理组之间活化的基质组合物的对比。与对照相比，M-CPA和CPA/M-PTX显著地降低α-SMA染色(p＜0.001)，而与对照相比，M-PTX没有引起显著变化(p＞0.05)。对于每个组分析了至少15个随机选择的20×视野。

图8：用于制备阴离子聚合物聚(PEGMA)₁₉-聚[HEMA-g-(CL₇)-单-琥珀酸酯)]₂₀的示意图。

图9：2-溴-异丁酸2-(苄氧羰基氨基)乙酯(引发剂1)的¹H-NMR谱。氢原子及其相应的峰积分用小写字母标记。

图10：P(PEGMA)₁₉-b-P(HEMA)₂₀(聚合物2)的¹H-NMR谱。氢原子及其相应的峰积分用小写字母标记。

图11：聚(PEGMA)₁₉-b-聚[HEMA-g-(ε-己内酯)₇]₂₀(聚合物3)的¹H-NMR谱。氢原子及其相应的峰积分用小写字母标记。

图12：聚(PEGMA)₁₉-聚[HEMA-g-(ε-己内酯)₇-单-琥珀酸酯)]₂₀(聚合物4)的¹H-NMR谱。氢原子及其相应的峰积分用小写字母标记。

图13：用于制备阳离子聚合物聚(PEGMA)₁₉-聚(MeDMA)₂₀(聚合物5)的示意图。

图14：在反应结束时阳离子聚合物聚(PEGMA)₁₉-聚(MeDMA)₂₀(聚合物5)的反应混合物的¹H-NMR谱。

图15：用M-CPA处理48小时之后，Miapaca-2、L3.6pl和Panc-1细胞中的相对Gli-1表达。

图16A至16B：在用不同浓度的M-CPA孵育期间L3.6pl细胞(A)和Panc-1细胞(B)的集落形成。

图17A至17D：Miapaca-2细胞(A)、L3.6pl细胞(B)、HPSC(C)和Panc-1细胞(D)中SMO(绿色)的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst(蓝色)复染。

图18：具有Kras突变(Kras*)的原位鼠PDAC肿瘤的存活。培养基存活为：(1)CTL16.5天，(2)M-CPA/PTX 16.5天，(3)抗-PD1 23天，(4)M-CPA/PTX+抗-PD1 31天，以及(5)M-CPA/PTX+抗-PD1+抗-CD8α14.5天。第4组的存活显著长于第3组(p＝0.0013)。

图19：Kras*肿瘤的肿瘤重量。通过*(p＜0.05)、**(p＜0.01)或ns(不显著)指出差异。在开始处理之后10天，用M-CPA/PTX+抗-PD1处理的肿瘤显著地小于其他三组。

图20A至20B：肿瘤引流淋巴结和Kras*肿瘤中的⁶⁴Gu-抗-PD1。图20A，肿瘤引流淋巴结和Kras*肿瘤中的⁶⁴Cu-抗-PD1的量化，显示在M-CPA/PTX处理之后识别PD1+T细胞的抗体的分布提高的趋势。图20B，在静脉内注射⁶⁴Cu-抗-PD1之后24小时时获得的Kras*肿瘤的放射自显影图，示出在M-CPA/PTX处理之后识别PD1+T细胞的抗体更均匀性分布。

图21：M-CPA/PTX对体内肿瘤的T细胞浸润的影响。与未经处理的CTL肿瘤相比，经处理的肿瘤具有显著更多的T细胞浸润。数据表示为平均值±平均值的标准误差。使用不成对t检验比较两组之间的差异。**表示p值＜0.01。

图22：KPC-Luc小鼠的胰腺中具有自发PDAC的转基因小鼠模型中M-CPA/PTX的抗肿瘤效力。在95至100日龄，登记具有阳性生物发光信号的小鼠。以每次注射5mg/kg/药物给予M-CPA/PTX。处理方案为：前2周每周3次静脉内注射，然后每周2次腹膜内注射直至死亡或开始处理90天。保持未经处理的小鼠作为对照(CTL)。使用吉西他滨和abraxane作为标准治疗。每隔一天以100mg/kg腹膜内注射吉西他滨直至死亡。按照与M-CPA/PTX相同的方案以5mg/kg/注射给予Abraxane。

图23：从未经处理的对照小鼠和用M-CPA/PTX处理的KPC-Luc小鼠中摘除的肿瘤的组织学分析。将肿瘤变得可触知的约125日龄的小鼠纳入研究。M-CPA/PTX处理组中的每只小鼠在2周中给予6次静脉内注射M-CPA/PTX(5mg/kg/药物/注射)。在最后一次注射之后24小时，处死小鼠以收集肿瘤并进行组织学评价。

具体实施方式

在一些方面，本公开内容提供用于形成用于递送药物的胶束的梳状(comb-like)聚合物结构。这些胶束可用于通过提高体内一种或更多种治疗剂的递送来治疗例如癌症的疾病。在一些实施方案中，这些聚合物还减缓体内一种或更多种治疗剂的释放。

I.聚合物组合物

在一些方面，本公开内容提供包含聚丙烯酸酯主链的聚合物，所述聚丙烯酸酯主链包含多个PEG侧链和多个由开环聚合产生的侧链的嵌段。在一些实施方案中，聚丙烯酸酯主链以传统特征为自由基聚合技术(例如原子转移自由基聚合(atom-transfer radicalpolymerization，ATRP))的基团终止。这样的化学基团的一些非限制性实例包括氢、羟基或卤化物。在一些实施方案中，聚丙烯酸酯主链可用C1-C8氨基烷基(例如乙醇胺或胺保护的氨基烷基(例如，N-(2-羟基乙基)氨基甲酸苄酯(N-Cbz-乙醇胺)))封端。本文中所述的聚合物可包含聚丙烯酸主链或聚丙烯酰胺主链。在一些实施方案中，聚合物的主链是聚丙烯酸主链。在一些实施方案中，聚丙烯酸主链的羧酸用聚乙二醇基团酯化以获得PEG侧链。聚乙二醇是乙二醇重复单元的聚合物，其末端是羟基或用甲基封端。本文中所述的聚合物包含具有10个至40个具有PEG侧链之单体的聚丙烯酸酯主链。在一些实施方案中，具有PEG侧链的单体的数量为16至22个单体。本公开内容的聚合物中单体的数量优选为10、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、32、34、36、38至40或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，具有PEG侧链的单体的数量为19。

在一些实施方案中，聚丙烯酸酯主链还包含其中羧酸已与来源于内酯开环的聚合物酯化的单体。在一些实施方案中，由开环产生的聚合物是聚己内酯。聚己内酯可通过乙二醇接头或环酐酯化成羧酸。在一些实施方案中，具有聚己内酯侧链的单体的数量为10至40个单体，更优选地为16至22个单体。本公开内容的聚合物中单体的数量为10、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、35至40，或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，具有聚己内酯侧链的单体的数量为20。在一些实施方案中，聚己内酯的末端用与在生理pH下具有净负电荷的另一基团连接的羧酸酯化。在一些实施方案中，该基团是膦酸/膦酸根、磺酸/磺酸根或第二羧酸。在一些实施方案中，聚己内酯的末端用丁二酸(琥珀酸)、戊二酸或己二酸酯化。在一些实施方案中，聚己内酯的末端用琥珀酸酯化。在一些方面，聚合物具有净负电荷。在一些实施方案中，本公开内容提供下式的聚合物：

其中：

R₁是烷基_(C1-18)、环烷基_(C1-18)、芳基_(C1-18)或这些基团中任一种的经取代形式；或被经保护的胺基团取代的烷基_(C1-18)；

R2是下式的基团：

其中：

R₃和R₃′各自独立地是氢、烷基_(C1-6)或经取代的烷基_(C1-6)；并且

x是1至10；

m是5至40或10至40；

n是10至40；

p是5至40或5至20；

q是1至20或1至10；

y是1至10；并且

Y₁是羧基、膦酸/膦酸根或羟基磺酰基；

或其药用盐。

在一些非限制性实例中，式I是聚[低聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯]-b-聚[2-(甲基丙烯酰氧基)乙氧基-低聚(ε-己内酯)-4-氧代丁酸]或

在一些方面，本公开内容提供包含一种或更多种聚丙烯酸酯的第二聚合物，所述聚丙烯酸酯具有多个PEG侧链和多个以季胺终止的侧链。在一些实施方案中，第二聚合物中的聚丙烯酸主链的羧酸用聚乙二醇基团酯化以获得PEG侧链。聚乙二醇是乙二醇重复单元的聚合物，其末端是羟基或用甲基封端。本文中所述的聚合物包含具有10个至40个具有PEG侧链之单体的聚丙烯酸酯主链。在一些实施方案中，具有PEG侧链的单体的数量为16至22个单体。本公开内容的聚合物中单体的数量为10、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、35至40，或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，具有PEG侧链的单体的数量为19。

在一些实施方案中，第二聚合物中聚丙烯酸主链的羧酸用季胺基团酯化。本文中所述的聚合物包含具有10个至40个具有以季胺终止之侧链的单体的聚丙烯酸酯主链。本公开内容的聚合物中单体的数量为10、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、35至40，或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，具有胆碱侧链的单体的数量为20。在一些实施方案中，本文中所述的聚合物包含具有10个至40个具有胆碱侧链之单体的聚丙烯酸酯主链。在一些实施方案中，第二聚合物包含净正电荷。在一些实施方案中，本公开内容提供下式的第二聚合物：

其中：

m是5至40或10至40；

n是10至40；

p是5至30；

R₁和R₂各自独立地是烷二基_(C1-8)、芳二基_(C6-12)或这些基团中任一种的经取代形式；

R₃、R₃′和R₃″各自独立地是烷基_(C1-8)、芳基_(C3-12)或这些基团中任一种的经取代形式；并且

X₁和X₂各自独立地是一价阴离子；

或其药用盐。

例如，结构II可以是铵封端的聚[低聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯]-b-聚{[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵}，如下所示：

II.胶束组合物

在一些方面，本公开内容提供由本文中所述的聚合物制备的纳米粒或胶束。在本公开内容的上下文中，术语胶束和纳米粒可互换使用。在一些实施方案中，纳米粒或胶束包含第一聚合物和第二聚合物的混合物，其中第一聚合物具有净负电荷并且第二聚合物具有净正电荷。这些纳米粒或胶束可包含以下比例的第一聚合物与第二聚合物的混合物：约100∶1、90∶1、80∶1、70∶1、60∶1、55∶1、50∶1、45∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9至约1∶10，或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，该比例为约10∶1至约1∶1或约100∶1至约10∶1。

在一些方面，胶束负载有一种或更多种治疗剂。在一些实施方案中，这些治疗剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，胶束负载有一种治疗剂。在另一些实施方案中，胶束负载有两种或更多种治疗剂。在一些实施方案中，两种治疗剂可协同作用以获得期望的治疗结果。另外，两种治疗剂可靶向与疾病或病症相关的不同分子机制。

在一些方面，用不同治疗剂制备的胶束可显示约25nm至约250nm的数均尺寸。在一些实施方案中，尺寸为约40nm至约150nm。在一些实施方案中，胶束的尺寸可以是约30nm、40nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nih至约150nm，或可从其中来源的任何范围。此外，胶束可具有小于0.20的多分散指数(polydispersity index，PDI)。在一些实施方案中，胶束可具有0.05至0.15的PDI。在一些实施方案中，胶束具有小于0.2的PDI。使用本领域技术人员已知的方法，使用粒子电泳系统，通过在90°散射角处的动态光散射可确定胶束尺寸和PDI二者。

在一些实施方案中，胶束具有高相对负载的治疗剂。治疗剂的相对负载收率可以大于85％。在一些实施方案中，其可大于95％。在一些实施方案中，其可大于98％。此外，负载于胶束中的每种治疗剂的量可包含约1％w/w至约15％w/w。在一些实施方案中，治疗剂的量为1％、2％、2.5％、3％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、7％、8％、9％、10％w/w至15％，或可从其中来源的任何范围。在一些实施方案中，每种治疗剂的量为约5％至10％w/w。在另一些实施方案中，当使用两种或更多种治疗剂时，每种治疗剂包含约2.5％至5％w/w的聚合物之一。

在一些实施方案中，本公开内容中所述的胶束可具有提高的稳定性。在储存90天之后，胶束可显示小于10％的治疗剂损失。在一些实施方案中，胶束在90天储存期之后显示小于5％的损失。在一些实施方案中，胶束显示小于5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％或1％的损失。此外，当储存约90天的时间时，颗粒显示在尺寸和PDI方面的变化小于30％。在一些实施方案中，在尺寸和PDI方面的变化小于25％。

III.药物制剂

在一些实施方案中，胶束可配制成适于预期应用的药物或治疗性组合物。本实施方案的治疗性组合物以作为液体溶液剂或混悬剂的可注射组合物的形式施用；也可制备适合在注射之前溶解于或混悬于液体中的固体形式。这些制剂还可被乳化。

短语“可药用的或药理学上可接受的”是指适当时当施用于动物(例如人)时不产生不利反应、变态反应或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含另外的活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员将是已知的。在一些非限制性实例中，药物组合物可在胶束、纳米粒或脂质体的表面上进一步包含肽或抗体，或者可作为共同治疗施用。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解，制剂应符合FDA生物标准办公室(FDAOffice of Biological Standards)所要求的无菌性、致热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。

如本文中所用，如本领域普通技术人员会已知的，“可药用的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐水溶液、胃肠外载剂(例如氯化钠、林格右旋糖等))、非水溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯(例如油酸乙酯))、分散介质、包衣、表面活性剂、单糖和/或二糖、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等张剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养补充剂等材料及其组合。根据公知的参数调节药物组合物中多种组分的pH和精确浓度。

术语“单位剂量”或“剂量”是指适合用于对象的物理上离散的单元，每个单位含有预定量的治疗性组合物，所述预定量经计算产生与其施用(即，合适的途径和治疗方案)相关的以上讨论的期望响应。根据治疗数量和单位剂量二者，待施用的量取决于所期望的效果。施用于患者或对象的本发明实施方案的组合物的实际剂量可通过身体和生理因素(例如对象的体重、年龄、健康状况和性别，被治疗疾病的类型，疾病渗透程度，先前或同时的治疗性干预，患者的特发病，施用途径，以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性)来确定。例如，剂量还可包含每次施用约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(这样的范围包括干预剂量)或更多，以及可从其中来源的任何范围。在可从来自本文中所列数字来源的范围的一些非限制性实例中，可施用约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。无论如何，负责施用的从业者都将确定组合物中活性成分的浓度和用于个体对象的合适剂量。

考虑了药剂的单剂量或多剂量。本领域普通技术人员仅使用常规实验可确定用于递送多剂量的期望时间间隔。作为一个实例，可以以约12小时的间隔每天向对象施用两个剂量。在一些实施方案中，每天施用一次药剂。

可按照常规时间表施用药剂。如本文中所用，常规时间表是指预定的指定时间段。只要时间表是预定的，常规时间表可涵盖长度相同或不同的时间段。例如，常规时间表可包括每天两次、每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或其间的任何设定天数或周数施用。或者，预定的常规时间表可包括第一周每天两次，然后数月每天一次等。在另一些实施方案中，本发明提供可口服并且其时间选择依赖或不依赖于食物摄入的药剂。因此，例如，可每天早上和/或每天晚上服用药剂，而不管对象何时吃过或将要吃。

活性化合物可配制成用于肠胃外施用，例如配制成用于通过静脉内、动脉内、肌内，皮下或甚至腹膜内途径注射。通常来说，这样的组合物可制备成液体溶液或混悬剂；也可制备适合用于在注射前添加液体后制备溶液或混悬剂的固体形式；并且，制剂还可被乳化。

适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油、碘化油或含水丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是达到其可容易地注射之程度的流体。其在制造和储存条件下也应该是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。

治疗性组合物可配制成中性或盐形式。可药用的盐包括酸加成盐(例如与聚合物的游离氨基形成的那些)，并且其是与无机酸(例如盐酸或磷酸)，或者与有机酸(例如乙酸、三氟乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐也可来自于无机碱(例如钠、钾、铵、钙或三价铁的铁氢氧化物)以及有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。另外，药物或治疗性组合物可包含一种或更多种聚阳离子肽或蛋白质(例如鱼精蛋白、聚赖氨酸或聚精氨酸)，以使治疗剂配制成中性盐或含有显著降低之电荷的复合物。

药物组合物可包括含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、以及植物油的溶剂或分散介质。例如，可通过使用例如卵磷脂的包衣，通过在分散的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，将优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。在一些实施方案中，使用的糖是5％蔗糖。可通过在组合物中使用延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。

治疗性化合物还可表面施用于皮肤、眼睛、耳或黏膜。表面施用的治疗性化合物可包括作为表面用溶液剂、洗剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、泡沫剂、透皮贴剂或酊剂的化合物制剂。当治疗性化合物配制成用于表面施用时，可将化合物与提高化合物通过所施用组织之渗透性的一种或更多种药剂组合。

IV.癌症

在一些实施方案中，如本文中所述的一种或更多种纳米粒或胶束可用于治疗癌症。癌症可以是实体瘤、转移癌或非转移癌。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌，例如胰腺导管腺癌。例如，在一些实施方案中，本发明的纳米粒或胶束可用于递送化学治疗剂(例如，紫杉醇和环杷明)的组合以治疗胰腺癌、卵巢癌或肝癌。

预期纳米粒可用于治疗哺乳动物对象(例如人患者)中的很多种癌症。例如，可用根据一些实施方案的细胞靶向结构治疗的癌细胞包括但不限于来自以下的细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食管、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。另外，癌症可特别地是以下组织学类型，但不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；联合肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉病的腺癌；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管-肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺腺癌；盯聍腺腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；具有鳞状化生的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性成雄细胞瘤(androblastoma)；塞托利细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚瘤；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑脊膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；副肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥胖细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；原巨核细胞白血病；髓样肉瘤；毛细胞白血病和髓母细胞瘤。

除了癌症之外，本发明的纳米粒或胶束可用于递送治疗剂以治疗其他疾病。本发明可用于治疗其中将药物、小分子治疗剂、治疗性蛋白质、治疗性核酸、小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)或微RNA(microRNA，mRNA)递送至对象的细胞或组织的疾病被认为具有治疗益处的任何疾病。此类疾病的实例包括过度增殖性疾病、炎性疾病、感染性疾病、退行性疾病和自身免疫病。

V.治疗剂

在一些实施方案中，如本文中所述的纳米粒或胶束可用于向对象(例如哺乳动物对象或人)递送治疗剂，例如小分子治疗剂，或基因治疗(例如，siRNA、miRNA、反义、治疗性基因等)，或其他治疗剂。

a.化学治疗剂

在一些实施方案中，一种或更多种抗癌治疗剂、抗癌药物或化学治疗剂可包含在如本文中所述的纳米粒或胶束中。例如，在一些方面，化学治疗剂是蛋白激酶抑制剂，例如EGFR、VEGFR、AKT、Erb1、Erb2、ErbB、Syk、Bcr-Abl、JAK、Src、GSK-3、PI3K、Ras、Raf、MAPK、MAPKK、mTOR、c-Kit、eph受体或BRAF抑制剂。蛋白激酶抑制剂的非限制性实例包括阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、博舒替尼、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、厄洛替尼、福他替尼(Fostamatinib)、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、木利替尼、尼洛替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼、兰尼单抗、鲁索替尼、塞卡替尼、索拉非尼、舒尼替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、AP23451、维莫非尼、MK-2206、GSK690693、A-443654、VQD-002、米替福新、哌立福辛、CAL101、PX-866、LY294002、雷帕霉素、坦罗莫司、依维莫司、地磷莫司、Alvocidib、金雀异黄素、司美替尼、AZD-6244、瓦他拉尼、P1446A-05、AG-024322、ZD1839、P276-00、GW572016或其混合物。

另外的组合化学治疗包括例如：烷化剂类，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲蜜胺；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱类(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓虫素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇类；海绵抑制素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；达因霉素，包括达因霉素A；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素类；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，例如米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素类；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2，2′，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨、卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法尼基-蛋白质转移酶抑制剂、反铂，以及上述任意一种的可药用的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，本文中提供的组合物可与吉非替尼组合使用。在另一些实施方案中，本发明的一些实施方案可与格列卫(Gleevac)组合实施。在某些实施方案中，一种或更多种化学治疗剂可与本文中提供的组合物组合使用。

在一些实施方案中，治疗剂是转录因子抑制剂，例如刺猬途径(hedgehogpathway)抑制剂或NF-κB抑制剂。刺猬途径抑制剂的非限制性实例包括GANT61、GANT58、LDE225(索尼德吉)、LEQ 506、PF-04449913(Glasdegib)、TAK-441、IPI-926(莎丽德吉)、BMS833923、LY2940680(Taladegib)和GDC-0449(维莫德吉)。在一些实施方案中，治疗剂是维生素。维生素的非限制性实例包括维生素D和维生素D类似物。治疗剂可以是天然抗癌剂。例如，这样的天然药剂的非限制性实例包括格尔德霉素及其衍生物17-N-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17-AAG)、雷公藤甲素、及相关类似物。

b.基因治疗

在另一个实施方案中，基因治疗(例如，siRNA、miRNA、反义、治疗性基因、编码治疗性蛋白质的核酸等)可包含在如本文中所述的纳米粒或胶束中。

c.抗炎剂

在一些实施方案中，一种或更多种抗炎剂可包含在如本文中所述的纳米粒或胶束中。抗炎剂可以是甾体或非甾体抗炎剂。非甾体抗炎剂包括用于治疗炎症和疼痛的一类药物。这类药物的确切作用方式是未知的。这类药剂的成员的实例包括但不限于布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、萘丁美酮、吡罗昔康、萘普生、双氯芬酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、依托度酸、氟芬那酸、二氟尼柳、奥沙普秦、罗非昔布和塞来昔布。本领域的普通技术人员将熟悉这些药剂。此类中包括水杨酸盐类和水杨酸盐类的衍生物，例如乙酰水杨酸、水杨酸钠、水杨酸胆碱、水杨酸胆碱镁和二氟尼柳。

其他抗炎剂包括抗风湿剂，例如金盐(例如，硫代苹果酸金钠、硫金代葡萄糖和金诺芬)、抗风湿剂(例如，氯喹、羟氯喹和青霉胺)、抗组胺剂(例如，苯海拉明、氯苯那敏、氯马斯汀、羟嗪和曲普利啶)和免疫抑制剂(例如，甲氨蝶呤、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、环孢菌素和硫唑嘌呤)。考虑的其他免疫抑制剂包括他克莫司和依维莫司。他克莫司抑制与T细胞活化相关的白介素-2产生，抑制细胞毒性T细胞的分化和增殖。本领域的普通技术人员将熟悉这些药剂和这类药剂的其他成员，以及这些药剂的作用机理和使用这些药剂的适应症。

VI.化学定义

当在化学基团的情况下使用时：“氢”意指-H；“羟基”意指-OH；“氧代”意指＝O；“羰基”意指-C(＝O)-；“羧基”意指-C(＝O)OH(也写作-COOH或-CO2H)；“卤代”独立地意指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”意指-NH₂；“羟基氨基”意指-NHOH；“硝基”意指-NO₂；亚氨基意指＝NH；“氰基”意指-CN；“异氰酸酯”意指-N＝C＝O；“叠氮基”意指-N₃；在一价情况下，“磷酸/磷酸根”意指-OP(O)(OH)₂或其去质子化形式；“膦酸/膦酸根”意指-P(O)(OH)₂或其去质子化形式；在二价情况下，“磷酸/磷酸根”意指-OP(O)(OH)O-或其去质子化形式；“巯基”意指-SH；且“硫代”意指＝S；“磺酰基”意指-S(O)₂-；“羟基磺酰基”意指-S(O)₂OH或其去质子化形式；“磺酰胺”意指-S(O)₂NH₂；并且“亚磺酰基”意指-S(O)-。

在化学式的情况下，符号“-”意指单键，“＝”意指双键，并且“≡”意指三键。符号代表任选的键，其如果存在的话是单键或双键。符号代表单键或双键。因此，例如，式包括并且应理解，没有一个这样的环原子构成多于一个双键的一部分。此外，要注意的是，当连接一个或两个立体原子(stereogenic atom)时，共价键符号“-”不表示任何优选的立体化学。相反，它涵盖了所有的立体异构体及其混合物。当通过键垂直地绘制(例如，对于甲基)时，符号表示该基团的连接点。要注意的是，对于较大的基团，通常仅以这种方式确定连接点，以便帮助读者明确地确定连接点。符号意指其中与楔形物厚端连接的基团“脱离页面”的单键。符号意指其中与楔形物厚端连接的基团“进入页面”的单键。符号意指其中双键周围的几何结构(例如，E或Z)未限定的单键。因此，这两种选择及其组合都是预期的。在本申请中所示结构的原子上的任何未限定化合价隐含地表示与该原子键合的氢原子。碳原子上的加粗圆点表示与该碳连接的氢定向地脱离纸面。

当基团“R”被描述为环体系上的“浮动基团”时，例如在下式中：

则只要形成稳定的结构，R可取代与任何环原子连接的任何氢原子，包括所描述的、隐含的或明确限定的氢。当基团“R”被描述为稠合环体系上的“浮动基团”时，如例如在下式中：

则除非另外指明，否则R可取代与任一稠环的任何环原子连接的任何氢。只要形成稳定的结构，可取代的氢包括所描述的氢(例如，与上式中的氮连接的氢)、隐含的氢(例如，未示出但理解为存在的上式的氢)、明确限定的氢和其存在取决于环原子身份的任选氢(例如，当X等于-CH-时，与基团X连接的氢)。在所描述的实例中，R可位于稠合环体系的5元环或6元环上。在上式中，紧跟在括号内的基团“R”后面的下标字母“y”表示数字变量。除非另外指明，否则该变量可以是0、1、2或大于2的任何整数，仅受环或环体系的可取代氢原子的最大数量限制。

对于化学基团和化合物种类，基团或种类中的碳原子数量如下所示：“Cn”限定了基团/种类中碳原子的确切数量(n)。对于所涉基团/种类，“C≤n”限定了可在基团/种类中的碳原子的最大数量(n)，关于最小数量尽可能小，例如，可理解的是，“烯基_(C≤8)”或“烯_(C≤8)”类中的碳原子的最小数量是2。与指定具有1至10个碳原子的烷氧基的“烷氧基_(C≤10)”相比。“Cn-n′”限定基团中碳原子的最小数量(n)和最大数量(n′)二者。因此，“烷基_(C2-10)”指定具有2至10个碳原子的那些烷基。这些碳数指标可在其修饰的化学基团或种类之前或之后，并且其可以或可以不括在括号中，而不表示含义上的任何改变。因此，术语“C5烯烃”、“C5-烯烃”、“烯烃_(C5)”和“烯烃_C5”全部是同义的。

当用于修饰化合物或化学基团时，除了如下所指，术语“饱和的”意指化合物或化学基团不具有碳-碳双键并且不具有碳-碳三键。当该术语用于修饰原子时，其意指该原子不是任何双键或三键的一部分。在饱和基团的取代形式的情况下，可存在一个或更多个碳氧双键或碳氮双键。而且当存在这样的键时，则不排除可作为酮-烯醇互变异构或亚胺/烯胺互变异构的一部分出现的碳-碳双键。当术语“饱和的”用于修饰物质的溶液时，其意指不能有更多的该物质再溶解在该溶液中。

当不与“取代的”修饰语一起使用时，术语“脂肪族”表示如此修饰的化合物或化学基团是无环或环状的但非芳烃化合物或基团。在脂肪族化合物/基团中，碳原子可以以直链、支链或非芳香族环(脂环族)连接在一起。脂肪族化合物/基团可以是饱和的，其通过单个碳-碳键连接(烷烃/烷基)，或不饱和的，其具有一个或更多个碳-碳双键(烯烃/烯基)或具有一个或更多个碳-碳三键(炔烃/炔基)。

当用于修饰化合物或化学基团原子时，术语“芳香族”意指化合物或化学基团含有通过形成环的键的相互作用而稳定化的原子的平面不饱和环。

当不与“取代的”修饰语一起使用时，术语“烷基”是指具有碳原子作为连接点、直链或支链无环结构且不含除了碳和氢以外的原子的一价饱和脂肪族基团。基团-CH₃(Me)、-CH₂CH₃(Et)、-CH₂CH₂CH₃(n-Pr或丙基)、-CH(CH₃)₂(i-Pr、ⁱPr或异丙基)、-CH₂CH₂CH₂CH₃(n-Bu)、-CH(CH₃)CH₂CH₃(仲丁基)、-CH₂CH(CH₃)₂(异丁基)、-C(CH₃)₃(叔丁基、t-丁基，t-Bu或^tBu)和-CH₂C(CH₃)₃(新戊基)是烷基的非限制性实例。当不与“取代的”修饰语一起使用时，术语“烷二基”是指具有一个或两个饱和碳原子作为连接点、直链或支链无环结构、不含碳-碳双键或三键且不含除了碳和氢以外的原子的二价饱和脂肪族基团。基团-CH₂-(亚甲基)、-CH₂CH₂-、-CH₂C(CH₃)₂CH₂-和-CH₂CH₂CH₂-是烷二基的非限制性实例。当不与“取代的”修饰语一起使用时，术语“亚烷基”是指其中R和R′独立地为氢或烷基的二价基团＝CRR′。亚烷基的非限制性实例包括：＝CH₂、＝CH(CH₂CH₃)和＝C(CH₃)₂。如该术语在以上限定的，“烷烃”是指具有式H-R的一类化合物，其中R是烷基。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被以下基团替换：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH₂、-NO₂、-CO₂H、-CO₂CH₃、-CN、-SH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-C(O)CH₃、-NHCH₃、-NHCH₂CH₃、-N(CH₃)₂、-C(O)NH₂、-C(O)NHCH₃、-C(O)N(CH₃)₂、-OC(O)CH₃、-NHC(O)CH₃、-S(O)₂OH或-S(O)₂NH₂。以下基团为取代烷基的非限制性实例：-CH₂OH、-CH₂Cl、-CF₃、-CH₂CN、-CH₂C(O)OH、-CH₂C(O)OCH₃、-CH₂C(O)NH₂、-CH₂C(O)CH₃、-CH₂OCH₃、-CH₂OC(O)CH₃、-CH₂NH₂、-CH₂N(CH₃)₂和-CH₂CH₂Cl。术语“卤代烷基”是取代的烷基的亚类，其中氢原子替换限于卤素(即，-F、-Cl、-Br或-I)，使得除了碳、氢和卤素之外不存在其他原子。基团-CH₂Cl是卤代烷基的非限制性实例。术语“氟代烷基”是取代的烷基的亚类，其中氢原子替换限于氟，使得除了碳、氢和氟之外不存在其他原子。基团-CH₂F、-CF₃和-CH₂CF₃是氟代烷基的非限制性实例。

当不与“取代的”修饰语一起使用时，术语“环烷基”是指具有碳原子作为连接点(所述碳原子构成一个或更多个非芳香族环结构的一部分)、不含碳-碳双键或三键且不含除了碳和氢以外的原子的单价饱和脂肪族基团。非限制性实例包括：-CH(CH₂)₂(环丙基)、环丁基、环戊基或环己基(Cy)。当不与“取代的”修饰语一起使用时，术语“环烷二基”是指具有两个碳原子作为连接点、不含碳-碳双键或三键，并且不含除了碳和氢以外的原子的二价饱和脂肪族基团。基团是环烷二基的非限制性实例。如该术语在以上限定的，“环烷烃”是指具有式H-R的一类化合物，其中R是环烷基。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被以下基团替换：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH₂、-NO₂、-CO₂H、-CO₂CH₃、-CN、-SH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-C(O)CH₃、-NHCH₃、-NHCH₂CH₃、-N(CH₃)₂、-C(O)NH₂、-C(O)NHCH₃、-C(O)N(CH₃)₂、-OC(O)CH₃、-NHC(O)CH₃、-S(O)₂OH或-S(O)₂NH₂。

当不与“取代的”修饰语一起使用时，术语“芳基”是指具有芳香族碳原子作为连接点的一价不饱和芳香族基团，所述碳原子构成一个或更多个六元芳香族环结构的一部分，其中所述环原子全部是碳，并且其中所述基团不由除了碳和氢以外的原子组成。如果存在多于一个的环，则该环可以是稠合的或未稠合的。如本文中所用，该术语不排除与第一芳香族环或存在的任何另外的芳香族环连接的一个或更多个烷基或芳烷基(碳数限制允许)的存在。芳基的非限制性实例包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C₆H₄CH₂CH₃(乙基苯基)、萘基和来自于联苯的一价基团。当不与“取代的”修饰语一起使用时，术语“芳二基”是指具有两个芳香族碳原子作为连接点的二价芳香族基团，所述碳原子构成一个或更多个六元芳香族环结构的一部分，其中所述环原子全部是碳，并且其中单价基团不由除了碳和氢以外的原子组成。如本文中所用，该术语不排除与第一芳香族环或存在的任何另外的芳香族环连接的一个或更多个烷基、芳基或芳烷基(碳数限制允许)的存在。如果存在多于一个环，则该环可以是稠合的或未稠合的。未稠合的环可通过以下中的一个或更多个连接：共价键、烷二基或烯二基(碳数限制允许)。芳二基的非限制性实例包括：

如该术语在以上限定的，“芳烃”是指具有式H-R的一类化合物，其中R是芳基。苯和甲苯是芳烃的非限制性实例。当这些术语中的任一个与“取代的”修饰语一起使用时，一个或更多个氢原子已经独立地被以下基团替换：-OH、-F、-C1、-Br、-I、-NH₂、-NO₂、-CO₂H、-CO₂CH₃、-CN、-SH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-C(O)CH₃、-NHCH₃、-NHCH₂CH₃、-N(CH₃)₂、-C(O)NH₂、-C(O)NHCH₃、-C(O)N(CH₃)₂、-OC(O)CH₃、-NHC(O)CH₃、-S(O)₂OH或-S(O)₂NH₂。

“胺保护基”在本领域中是充分了解的。胺保护基是在反应期间防止胺基团之反应性的基团，其修饰分子的一些其他部分并且可容易地被去除以产生期望的胺。至少在Greene和Wuts，1999中可找到胺保护基，该文献在此通过引入并入本文。氨基保护基的一些非限制性实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；烷氧基-或芳氧基羰基(其与受保护的胺形成尿烷)例如苄氧羰基(Cbz)、对氯苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、2-硝基苄氧羰基、对溴苄氧羰基、3，4-二甲氧基苄氧羰基、3，5-二甲氧基苄氧羰基、2，4-二甲氧基苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苄氧羰基、3，4，5-三甲氧基苄氧羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α--二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基(Boc)、二异丙基甲氧羰基、异丙氧基羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙氧基羰基(Alloc)、2，2，2-三氯乙氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙基氧基羰基(Teoc)、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧羰基(Fmoc)、环戊氧基羰基、金刚烷氧基羰基、环己氧基羰基、苯基硫代羰基等；芳烷基，例如苄基、三苯甲基、苄氧基甲基等；以及甲硅烷基，例如三甲基硅烷基等。另外，“胺保护基”可以是二价保护基，使得伯胺上的两个氢原子均被单一保护基替换。在这样的情况下，胺保护基可以是邻苯二甲酰亚胺(phth)或其取代的衍生物，其中术语“取代的”如上限定。在一些实施方案中，卤化邻苯二甲酰亚胺衍生物可以是四氯邻苯二甲酰亚胺(TCphth)。术语“受保护的胺基团”是指在包含一个或更多个单价胺保护基或二价胺保护基的另一基团上被取代的胺自由基。

VII.实施例

包括以下实施例以示出本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在下面的实施例中公开的技术呈现本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，并因此可被认为构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在公开的具体实施方案中做出许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。

实施例1-材料和方法

材料。常见的化学试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)或VWR(West Chester，PA)并原样使用。CPA-BODIPY购自Toronto Research Chemicals Inc.(Toronto，Canada)。¹H和¹³C NMR谱用Bruker Avance 600光谱仪(Billerica，MA)以四甲基硅烷作为内标物记录。

负载有CPA和/或PTX的胶束的制备。用于配制胶束的阴离子聚合物和阳离子聚合物(图1)使用原子转移自由基聚合和开环聚合制备。在实施例2中描述了聚合和聚合物表征的详细操作。为了制备负载CPA的胶束(M-CPA)，将5mg的CPA添加至200μL的乙醇，并将溶液温热至50℃以完全溶解CPA。将阴离子聚合物(100mg)溶解于0.8mL的四氢呋喃中，将该溶液添加至CPA-乙醇溶液，并将所得溶液在室温、搅拌下孵育10分钟。将阳离子聚合物(20mg)溶解于2mL的去离子水中，并将该溶液在室温、剧烈涡旋下移液到CPA-阴离子聚合物溶液中。添加阳离子聚合物完成后，将混合物再涡旋1分钟。在45℃下在130mBar下在旋转蒸发仪上去除四氢呋喃和乙醇10分钟，然后通过在4℃下针对去离子水进行透析来纯化聚合物。通过在5000RPM下离心5分钟去除未包封的药物。收集上清液并在使用前通过无菌0.22-μm尼龙过滤器过滤。为了长期储存，将胶束与蔗糖溶液(在水中按重量计50％，体积比为9∶1)混合，并随后在-80℃冰箱中冷冻。负载有PTX或者CPA和PTX二者的胶束类似地制备。

载药胶束的表征。表征载药胶束的尺寸、表面电荷、药物负载、药物释放和形态。用ZetaPlus粒子电泳系统(Brookhaven Instruments Corp.，Holtsville，NY)使用90°散射角的动态光散射来测量粒度和表面电荷。为了确定药物负载，将胶束混悬液在乙醇中解离并超声处理5分钟以释放包封的药物。在13,000RPM下离心15分钟之后，使用Agilent 1100系列高效液相色谱(HPLC)(Santa Clara，CA)分析上清液。使用梯度(溶剂B在30分钟中从5％至95％v/v)，流动相为0.1％三氟乙酸(溶剂A)和乙腈(溶剂B)的混合物。柱是带有5-μm颗粒的Agilent C18色谱柱(4.6×250mm)。流量为1.0mL/min，并且对于CPA，检测波长为210nm，且对于PTX，检测波长为227nm。为了确定药物释放，将胶束添加至微透析器(截留分子量～3000)，并在37℃、搅拌下在PBS(pH 7.4)或乙酸钠缓冲液(pH6.0和pH 5.2)中孵育。在预定的时间点，取出透析器内20μL溶液并以5000RPM离心5分钟。使用HPLC分析等分的上清液(10μL)以确定CPA和PTX的浓度。CPA和PTX的保留时间分别为14.7分钟和19.6分钟。

通过透射电子显微术(transmission electron microscopy，TEM)检查载药胶束的形态。将样品置于用聚-L-赖氨酸处理的100目涂覆有formvar的铜网格上并保持1小时。将网格用滤纸吸干以去除过量样品，并随后用过滤的1％乙酸铀酰染色1分钟。用滤纸从网格上吸干染料，并使样品干燥。用JEM 1010透射电子显微镜(JEOL USA，Inc.，Peabody，MA)以80kV的加速电压进行TEM。使用AMT成像系统(Advanced Microscopy Techniques Corp.，Danvers，MA)收集数字图像。

细胞系。三种胰腺癌细胞系获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)：Miapaca-2(高CPA敏感性)、L3.6pl(中度CPA敏感性)(Feldmann等，2007)和Panc-1(CPA抗性)(Feldmann等，2007)。

细胞增殖和克隆形成的测定。将细胞以2000个细胞/孔接种在96孔板中并在37℃下处理72小时，然后进行MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑]测定。将活细胞的比例相对于未经处理细胞的比例进行标准化，并表示为平均值±平均值的标准误差(n＝6)。如先前报道的那样进行克隆形成测定(Shoemaker等，1985)。将细胞在生长培养基中以1000个细胞每10-cm平板接种过夜，并在37℃下处理10天。在这10天时间结束时，将集落用福尔马林固定并用结晶紫染色。对具有多于20个细胞的集落进行计数。

SMO竞争测定。使用商业荧光SMO配体CPA-BODIPY进行SMO竞争测定(Bee等，2012)。将96孔板中的细胞首先在37℃下用M-CPA处理24小时。然后向细胞添加CPA-BODIPY(10nM)，并将细胞再孵育4小时。然后去除处理溶液，并用PBS清洗细胞并用DMSO裂解。记录每个孔的残余荧光(λ_ex＝480nm，λ_em＝525nm)。对于荧光图像，将细胞用甲醇固定，用Hoechst复染，并使用Zeiss Axio Observer.Z1荧光显微镜(Carl Zeiss MicroImaging GmbH，Thornwood，NY)进行观察。

Western印迹分析。将细胞裂解物分级并将其转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Billerica，MA)。膜用兔抗人单克隆Gli-1抗体(Abcam Inc.，Cambridge，MA，1∶1000稀释)进行印迹并使用荧光IRDye 680RD山羊抗兔IgG(H+L)(LI-COR，Lincoln，NE，1∶5000稀释)进行可视化。β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich)用作内部对照以确保相等的蛋白质负载。

CD133干细胞标志物和肿瘤球形成的流式细胞术分析。用M-CPA和/或M-PTX以浓度接近其各自的IC₅₀值的浓度处理Miapaca-2细胞：M-CPA为10μM，且M-PTX为10nM。分离经处理的细胞，并用小鼠抗人CD133抗体-藻红蛋白缀合物(Miltenyi Biotec Inc.，San Diego，CA)染色。小鼠IgG-藻红蛋白用作阴性对照。使用流式细胞术(BD FACSCalibur，San Jose，CA)分析细胞悬液。如先前报道的，将肿瘤球在24孔超低附着板中培养(Hermann等，2007)。将单层中的Miapaca-2细胞分离并以1000个细胞/孔重悬于由含有B-27、N-2、20ng/mL表皮生长因子、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和4μg/mL肝素的DMEM/F-12组成的成球培养基中。在孵育开始时添加M-CPA和/或M-PTX。孵育10天后，在显微镜下对每个孔中大于50μm的肿瘤球进行计数。

具有原位异种移植物的小鼠中的抗肿瘤效力的测定。所有动物研究均经德克萨斯大学MD安德森癌症中心的机构动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care andUse Committee of The University of Texas MD Anderson Cancer Center)批准，并根据机构指南进行。在雌性NCR裸鼠(Taconic，Hudson，NY)中建立原位Miapaca-2-1uc胰腺肿瘤异种移植物。在每只小鼠的左侧腹部做出小切口。直接向胰腺中注射在Hank平衡盐溶液和Matrigel的1∶1体积混合物中的50μL细胞悬液(1×10⁶个Miapaca-2-1uc细胞和3×10⁶个HPSC)。切口用可吸收缝线封闭，并且允许肿瘤生长4周，然后进行处理。将小鼠随机分配至四个不同的组，每组由9只小鼠组成，并用以下进行处理：(1)盐水(对照)；(2)M-CPA，10mg/kg/注射，1周内注射3次；(3)M-PTX，10mg/kg/注射，1周内注射3次；或(4)M-CPA/PTX，10mg/kg/药物/注射，1周内注射3次。根据制造商的说明书每周通过腹膜内注射D-萤光素(150mg/kg)监测萤光素酶活性。在注射D-荧光素酶之后记录长至20分钟的发光信号，并使用Xenogen IVIS-200光学系统(Perkin Elmer，Waltham，MA)记录峰值。

免疫组织化学染色。将福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤切片脱蜡并再水化。抗原修复之后，将载片用含10％山羊血清的PBS封闭，并在4℃下用一抗孵育过夜。抗体稀释度如下：α-平滑肌肌动蛋白，1∶100；CD31，1∶50；Ki67，1∶400和Gli-1，1∶100(Abcam Inc.)。将载片洗涤并与生物素化的山羊抗兔IgG(1∶200)(Vector Labs，Burlingame，CA)和链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(DAKO，Carpinteria，CA)一起孵育各30分钟。通过暴露于3，3’-二氨基联苯胺检测到阳性反应。载片用苏木精复染并在显微镜下可视化。使用至少10个随机选择的20×视野对染色进行量化。对于Ki67染色，在每个视野中计数并记录阳性染色的细胞核。对于CD31和α-SMA染色，使用Image J软件记录每个视野内总像素中阳性染色像素的百分比。

统计。数值表示为平均值±平均值的标准误差。数据使用t检验或单因素方差分析进行评价。小于0.05的p值被认为是统计学显著的。

实施例2-聚合物的制备

2-溴-异丁酸2-(苄氧基羰基氨基)乙酯(引发剂1)。将Cbz-N-乙醇胺2.0g(10.2mmol)和三乙胺(1.6mL，11.3mmol)溶解在25mL的乙酸乙酯中并用冰水浴冷却。在剧烈搅拌下，在5mL乙酸乙酯中的2-溴异丁酰溴(1.3mL，10.7mmol)缓慢滴入。将混合物在室温下再搅拌4小时，并随后过滤以去除沉淀物。随后将乙酸乙酯溶液用饱和NaHCO₃、5％HCl和双蒸水洗涤；经无水MgSO₄干燥；并在35℃下真空冷凝。使用乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂经快速硅胶柱纯化粗制产物以得到无色黏性油状物3.1g(88％)。¹H-NMR(ppm)：7.3～7.5(5H)，5.05(2H)，4.15(2H)，3.30(2H)，1.87(6H)(图9)。

聚[低聚(乙二醇)单甲醚甲基丙烯酸酯]₁₉-b-聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)₂₀(聚合物2)。向圆底烧瓶中添加引发剂1(24.2mg，70.2μmol)、低聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯(PEGMA，MW～50，1.0g，2.1mmol)、2，2’-联吡啶(21.9mg，140.4μmol)和0.5mL的无水甲醇。将烧瓶用无水氩冲洗20分钟并浸入50℃的油浴中。在氩气保护下快速添加CuBr(10.0mg，70.2μmol)，并使反应进行30分钟。将甲基丙烯酸2-羟基乙酯(0.25mL，2.1mmol)在0.5mL甲醇中的单独的混合物脱氧并添加到反应混合物中。使聚合在50℃下继续18小时，并随后暴露于空气中停止。用四氢呋喃稀释反应混合物，经过碱性铝柱以去除催化剂，并在50℃下真空冷凝以产生作为黏性油状物的嵌段共聚物2，1.2g(94％)。¹H-NMR显示聚合物2含有19个单元的PEGMA和20个单元的甲基丙烯酸2-羟基乙酯(HEMA)(图10)。聚合物2缩写为P(PEGMA)₁₉-b-P(HEMA)₂₀。

聚(PEGMA)₁₉-b-聚[HEMA-g-(ε-己内酯)₇]₂₀(聚合物3)。聚合物2(2.0g，2.8mmol-OH)通过在110℃下与甲苯共沸蒸馏进行干燥。在真空下去除过量的甲苯。然后将化合物2溶于4mL的无水甲苯中并转移到火焰干燥的烧瓶中。添加无水ε-己内酯(CL，1.6mL，14.1mmol)和2-乙基己酸锡(II)(Sn(Oct)₂，9μL，28.1μmol)。将烧瓶用无水氩气冲洗并在110℃下加热过夜。聚合混合物在己烷中沉淀两次以产生3.1g(产率＝85％)作为白色蜡状物的嵌段共聚物3。¹H-NMR显示每个低聚(ε-己内酯)侧链聚合物2含有7个ε-己内酯单元(图11)。聚合物3缩写为P(PEGMA)₁₉-b-P(HEMA-CL₇)₂₀。

聚(PEGMA)₁₉-聚[HEMA-g-(CL₇)-单-琥珀酸酯)]₂₀(聚合物4)。将聚合物3(1.0g，0.78mmol-OH)溶解在5mL的无水甲苯中。然后添加3-异氰酸根合丙基三乙氧基硅烷(0.2mL，0.78mmol)和二月桂酸二丁基锡(，5μL，7.8μmol)。在氩气保护下将烧瓶在40℃下加热过夜。将反应混合物在乙醚/己烷中沉淀，并在室温下真空干燥以产生阴离子聚合物4，其缩写为P(PEGMA)₁₉-b-P(HEMA-CL₇-SAn)₂₀。¹H-NMR显示每种聚合物含有约20个单元的琥珀酸酯(图12)。

阳离子聚合物聚(PEGMA)₁₉-聚(MeDMA)₂₀的制备。引发剂2-溴异丁酸2-氨基乙酯的三氟乙酸盐通过公开的方案(Tempero等，2011)合成。简单地说，向50-mL烧瓶中添加引发剂(22.7mg，70.2μmol)、2，2′-联吡啶(21.9mg，140.4μmol)、甲氧基-PEG-甲基丙烯酸酯(PEGMA，MW 500)(1.00g，2.10mmol)和0.5mL的无水异丙醇。将烧瓶经三次冷冻-泵-融化循环脱氧并重新填充N₂，然后快速添加CuBr(10.0mg，70.2μmol)。通过在50℃的油浴中加热烧瓶开始聚合。30分钟后，向反应混合物中快速添加在水中的按重量计40％的2-(甲基丙烯酰氧基)乙基三甲基氯化铵(MeDMA)(1.77g，4.21mmol)的预脱氧溶液。使聚合在50℃下持续2小时。¹H-NMR显示转化率＞98％(图14)。将反应混合物对去离子水透析3天以去除未反应的单体和催化剂。冷冻干燥之后获得固体粉末。

实施例3-聚离子聚合物和载药胶束的合成和表征

阴离子聚合物和阳离子聚合物的化学结构示于图1中。阴离子聚合物(图1A)由亲水刷状聚乙二醇(PEG)嵌段和具有生物可降解的低聚(ε-己内酯)侧链的疏水嵌段组成。琥珀酸酯缀合至己内酯侧链的末端。阴离子聚合物的¹H-NMR谱如下(图1B)：1.6ppm(己内酯单元的β和δ-CH₂-)，2.6ppm(琥珀酸酯的-CH₂-)和3.4ppm(PEG刷的末端-OCH₃)。¹H-NMR谱的积分(图9至12)表明每个阴离子大分子具有19个PEG刷和20个己内酯侧链；疏水嵌段中的每个侧链含有七个己内酯单体和一个琥珀酸酯端基。阳离子聚合物(图1C)由亲水刷状PEG嵌段和聚(2-[(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵)的阳离子嵌段组成。

阳离子聚合物的¹H-NMR谱如下(图1D)：3.3ppm(PEG刷的末端-OCH₃)和3.5ppm(铵的N⁺-CH₃)。每种聚合物具有大约19个PEG刷和20个单元的2-[(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵。完整的聚合方案和¹H-NMR谱在图8至14中给出。如表1中所示，所有载药胶束的尺寸为60至125nm，具有稍微负的表面电荷，且载药效率高于95％。每种类型的胶束的代表性TEM显微照片示于图2A至2C中。M-PTX和M-CPA/PTX(图2C)中胶束核心处的深色可由阴离子聚合物的羧酸根(carboxylate)螯合的铀酰离子引起。药物释放(图2D至2G)曲线显示，在pH 7.4时，胶束保留超过80％的包封的CPA或PTX长至3天。随着孵育缓冲液的pH值降低，所有三种制剂中CPA和PTX二者的释放均提高。当载药胶束在-80℃储存90天时，在胶束尺寸或药物负载方面，第0天和第90天之间未注意到任何变化(表2)。

表1.载药胶束的物理化学表征

特征	M-CPA<sup>1</sup>	M-PTX<sup>2</sup>	M-CPA/PTX<sup>3</sup>
				尺寸，nm<sup>4</sup>	74.7±1.5	121.6±2.1	61.5±1.9
PDI	0.148	0.124	0.131
				ζ电位，mV	-13.5±10.1	-6.9±3.5	-9.7±4.1
载药效率	＞95％	＞95％	＞95％

PDI，多分散指数。

¹CPA/阴离子聚合物＝按重量计5％。

²PTX/阴离子聚合物＝按重量计5％。

³CPA/阴离子聚合物＝按重量计2.5％；PTX/阴离子聚合物＝按重量计2.5％。

⁴数均尺寸。在所有试样中按重量计，阴离子聚合物/阳离子聚合物＝5/1。

表2.载药聚合物胶束¹在-80℃下的长期稳定性

PDI，多分散指数。

¹胶束在5％蔗糖存在的情况下快速冷冻。

²CPA/阴离子聚合物＝按重量计5％。

³pTX/阴离子聚合物＝按重量计5％。

⁴CPA/阴离子聚合物＝按重量计2.5％；PTX/阴离子聚合物＝按重量计2.5％。

⁵数均尺寸。在所有试样中按重量计，阴离子聚合物/阳离子聚合物＝5/1。

实施例4-载药胶束对胰腺癌细胞系中SHH途径信号转导分子、增殖和干细胞群的影响

CPA通过与SMO结合来抑制SHH活性。图3A显示M-CPA可与CPA-BODIPY(SMO的荧光配体)竞争。用1.3±0.3μM M-CPA预处理Miapaca-2细胞导致CPA-BODIPY结合损失50％(EC₅₀＝1.3±0.3μM)。L3.6pl和Panc-1细胞中M-CPA的EC₅₀值分别为0.9±0.2和0.35±0.05μM(表3)。荧光显微照片证实经CPA-BODIPY处理的细胞的荧光在不存在M-CPA的情况下是强的(绿色，图3B)，但在存在20μM M-CPA的情况下削弱(图3C)。

表3.M-CPA对SMO受体结合和细胞增殖的影响。

¹CPA和PTX相等地负载于胶束中。

Gli-1是SHH途径中SMO的下游靶标。M-CPA处理以剂量依赖性方式降低了Miapaca-2细胞中的Gli-1表达(图3D)。与具有未处理(对照)的Gli-1表达相比，分别用5、10、20和50μM M-CPA处理之后相对Gli-1表达(％)为75.5±2.5、52.6±2.2、33.4±7.0和7.3±0.7。在L3.6pl细胞中观察到类似的M-CPA诱导的Gli-1下调；M-CPA在Panc-1细胞中略微下调Gli-1(图15)。

接下来，评估药物处理期间的细胞增殖。在Miapaca-2(图3E)和L3.6pl细胞(表3)中，M-CPA比CPA更具细胞毒性，但这两种处理对Panc-1细胞均无效(表3)。M-PTX和PTX二者均显示出对所有三种细胞系的优异细胞毒性(表3)。当CPA和PTX相等地负载于胶束中时，所得M-CPA/PTX对所有三种细胞系具有比M-PTX稍高的细胞毒性(图3F，表3)。在Miapaca-2细胞中的集落形成测定显示M-CPA比CPA在更高浓度下更有效地抑制集落形成(图3G至3I)。与未处理(对照)相比，3μMCPA使集落数降低18.2±1.3％，并且3μM M-CPA使集落数降低57.7±2.3％。尽管只有L3.6pl在较低药物浓度(0至3μM)下显示出剂量依赖性响应，但M-CPA在高等价药物浓度(30μM)下还抑制了针对L3.6pl细胞和Panc-1细胞的集落形成(图16)。

CD133是胰腺癌中CSC的表面标志物(Simeone，2008)。图4A至4E中总结了处理对Miapaca-2细胞的CD133阳性(CD133+)群的影响。CD133+细胞的百分比为：对照为12.2±0.2，M-CPA为2.1±0.1，M-PTX为18.9±0.2，且M-CPA+M-PTX为2.2±0.1。与对照相比，M-PTX处理显著富集了CD133+群(p＜0.001)，而与对照相比，M-CPA和M-CPA/PTX二者均显著使CD133+群降低(p＜0.001)。M-CPA和M-CPA/PTX处理之间在CD133+的消耗方面没有显著差异。M-CPA/PTX还降低了肿瘤球的形成(图4F至4J)。每1000个细胞肿瘤球(尺寸＞50μm)的数量为：对照为28±5，M-CPA为12±2，M-PTX为25±5，且M-CPA/PTX为6±2。对照组和M-PTX组具有比M-CPA组或M-CPA/PTX组显著更多的肿瘤球(p＜0.001)。图4G至4J中示出了肿瘤球的代表性显微照片。

实施例5-M-CPA对HPSC的影响

胰腺癌因其丰富的主要由活化的星形细胞产生的基质组织而闻名。在体外检查了M-CPA针对产生基质之HPSC的效力。图5A和5B示出了在不同处理期间HPSC增殖。CPA的IC₅₀值为13.3±1.2μM，M-CPA为12.7±1.1μM，M-PTX为4.4±0.2nM，且M-CPA/PTX为3.3±0.1nM(以PTX等价物计)。M-CPA以剂量依赖性方式降低了HPSC的Gli-1表达：分别用2、5、10和20μM M-CPA处理后相对Gli-1表达(％)为100.2±2.6、96.9±10.9、48.4±4.3和15.2±3.6(图5C)。可通过外源性SHH配体刺激HPSC的增殖。

然而，在使用无血清培养基15的细胞培养中，M-CPA通过外源SHH配体中和HPSC增殖的刺激(图5D)。在不存在M-CPA的情况下，与未处理(对照)相比，用0.5、1和2μg/mL SHH配体刺激的HPSC的活细胞相对比例(％)分别为122.2±9.3、144.5±4.1和149.5±4.7。然而，在存在10μM M-CPA的情况下，在任何受试SHH浓度下孵育72-h之后没有细胞存活。M-CPA对HPSC生存力的这些作用伴随着降低的Gli-1表达(图5E)。与未处理(对照)相比，1.5μg/mLSHH配体将Gli-1表达(％)提高至143.7±14.7。M-CPA取消SHH配体的刺激作用：在存在SHH配体的情况下，在用5、10和20μM M-CPA处理之后，相对Gli-1表达(％)为132.6±8.5、116.3±10.4和83.3±6.8。

实施例6-载药胶束对体内肿瘤生长的影响

图6A示出了未处理(对照)、M-CPA、M-PTX和M-CPA/PTX的Miapaca-2-luc异种移植物模型中的相对肿瘤生长曲线，其中所述相对肿瘤生长被定义为在每个时间点的生物发光通量(每秒的光子)与处理开始之前的通量的比值。抗肿瘤效力为M-CPA/PTX＞M-PTX＞M-CPA的顺序。在初始注射之后5周，对照、M-CPA、M-PTX和M-CPA/PTX方案的相对肿瘤生长分别为19.1±2.2、5.2±2.3、1.2±0.2和0.4±0.1倍。M-CPA/PTX组具有比任何其他组慢的肿瘤生长(p＜0.01)。在初始处理之后5周，对小鼠实施安乐死，并取回肿瘤用于组织学分析。苏木精和伊红染色的切片揭示对照小鼠中的肿瘤充满了活肿瘤细胞并具有致密的基质区室(白色箭头)(图6B)，而在经M-CPA/PTX处理的小鼠中的肿瘤具有松散填充的肿瘤细胞(图6C)。值得注意的是，M-CPA/PTX组中的9只小鼠中有4只没有肿瘤(图6D)，而其他组中的所有小鼠都有残留肿瘤。

免疫组织化学分析。对肿瘤切片的Ki67(增殖)、CD31(脉管系统)和α-SMA(活化的癌症相关成纤维细胞)的表达进行染色。结果总结于图7中；显微照片是来自至少15个随机选择的20×视野的代表性图像。Ki67染色结果示于图7A至7E中。Ki67⁺细胞核的频率为对照＞M-CPA＞M-PTX＞M-CPA/PTX的顺序。所有三个处理组具有比对照组更少的Ki67⁺细胞核(p＜0.001)。来自经M-CPA/PTX处理的小鼠的肿瘤具有比来自经M-CPA处理的小鼠的肿瘤更少的Ki67+细胞核(p＜0.05)。CD31染色结果示于图7F至7J中。与对照相比，用M-CPA/PTX处理使肿瘤脉管系统增多超过10倍(p＜0.001)；用M-CPA处理使肿瘤脉管系统增多3.6倍(p＜0.05)。M-PTX没有诱导微血管密度的显著变化(p＞0.05)。α-SMA染色结果示于图7K至7O中。M-CPA和M-CPA/PTX分别将α-SMA+像素显著降低至总像素的4.8±0.7％和3.6±0.4％，而对照组中的α-SMA+像素为13.0±1.0％(p＜0.001)。M-PTX(α-SMA+像素10.0±1.0％)未引起相对于对照的显著变化(p＞0.05)。

以上数据支持M-CPA通过SHH信号转导途径抑制胰腺癌细胞和HPSC增殖的想法。此外，数据表明，M-CPA选择性地消耗胰腺CSC群并抑制肿瘤球的形成。双重作用M-CPA/PTX在体外有效地杀伤肿瘤细胞和HPSC并消耗CSC。双重作用M-CPA/PTX提高肿瘤脉管系统密度，重塑肿瘤基质，并延迟体内原位人胰腺癌Miapaca-2异种移植物肿瘤的生长。

在这里报道的公开内容中，制备了聚离子复合物胶束体系以包封CPA。本公开内容中呈现的胶束可具有以下独特性质。第一，胶束的主要组分(图1A)是阴离子聚合物，其由刷状PEG嵌段和具有向外伸出的低聚(ε-己内酯)链的疏水嵌段组成。预期PEG刷状物提供网状内皮系统识别屏蔽并延长胶束的血液循环。第二，琥珀酸在低聚(ε-己内酯)侧链的末端缀合，其羧酸根可通过CPA的仲胺与CPA相互作用。第三，为了进一步提高胶束的胶体稳定性，除了疏水性相互作用之外，还添加阳离子嵌段聚合物(图1C)以通过静电相互作用交联胶束核。第四，发现所产生的载药胶束可在-80℃下冷冻并储存长至3个月，而没有显著的胶束尺寸提高或药物负载降低(表2)。这些颗粒的长期稳定性是将胶束转化为临床应用的可用特性。当载药胶束在37℃孵育时，CPA和PTX的释放在pH 7.4下最小，这将防止在血液循环期间过早的药物释放(图2)。在pH 5.2和pH 6.0缓冲液中研究酸性条件下的药物释放。由于异常的代谢，肿瘤微环境趋于酸性(～pH 6)(Estrella等，2013)；而溶酶体和内体中的pH值为4.5至6.0(Sorkin和von Zastrow，2002)。在酸性pH下，PTX缓慢释放而CPA释放快得多，可能是因为CPA在低pH下质子化，并因此在pH 5.2和pH 6.0下变为水溶性。

在这些实验中，首先评估M-CPA是否保留了针对SHH途径的CPA功能。在所有三种胰腺癌细胞系以及HPSC中观察到SMO表达(图17)。发现在所有三种细胞系中，M-CPA可与CPA-BODIPY竞争SMO结合，表明包封的CPA的SMO亲和力得以保留。此外，M-CPA处理成功下调Miapaca-2和L3.6pl细胞中的Gli-1表达，但是在Panc-1细胞中不行，可能是因为Panc-1细胞具有SMO下游的突变或其他可以活化Gli-1的信号转导途径，并因此对CPA处理具有抗性(Steg等，2010)。因此，M-CPA在72-h孵育期中抑制了Miapaca-2和L3.6pl细胞的增殖，但不抑制Panc-1细胞的增殖(表3)。M-CPA比游离CPA更高效地抑制了Miapaca-2集落的形成(图3G至3I)。不希望受任何理论束缚，认为这种提高的效率可以是由于改善的CPA溶解度和药物可用性。

与其他化学治疗剂(例如吉西他滨)相比，CSC可被CPA消耗。使用CD133作为CSC标志物评估M-CPA和/或M-PTX对Miapaca-2细胞的CSC亚群的作用。尽管M-PTX以高效率抑制了Miapaca-2的增殖(IC₅₀＝1.3±0.1nM，图3F)，但它没有消除CD133⁺细胞；相反，与未处理(对照)相比，M-PTX使CD133⁺群富集59％(图4A至4E)。相比之下，M-CPA使CD133⁺群消耗。单独用M-CPA处理也降低了Miapaca-2细胞形成肿瘤球的能力，其为癌细胞干性(stemness)的量度(图4F至4J)。

在本公开内容中，数据表明M-CPA恢复了SHH配体对HPSC的这些刺激作用。M-CPA通过SHH信号转导途径抑制HPSC的增殖(图5A和5B)。另外，M-CPA消除了外源性SHH配体对细胞增殖和Gli-1表达的刺激作用(图5C至5D)。体内研究还显示M-CPA通过增多肿瘤内脉管系统和降低活化的基质来改变肿瘤基质(图7F至7O)。因为预期CPA或M-CPA作为单一药剂主要影响胰腺癌的基质和癌症相关的成纤维细胞，不希望受任何理论束缚，所以认为通过将CPA和PTX共包封在相同的聚离子胶束中，产生癌症相关成纤维细胞的基质和肿瘤细胞二者可同时受到攻击，导致抗肿瘤效力提高。如所预期的，M-CPA/PTX对在体外已显示药物诱导的Gli1下调的3种胰腺癌细胞系中的2种和HPSC具有细胞毒性(图3和表3)。与M-CPA类似，M-CPA+M-PTX消耗CD133⁺Miapaca-2细胞并降低肿瘤球的形成(图4)。这些数据表明，CPA与PTX的共包封可消除单独用M-PTX处理引起的CD133⁺细胞的富集。

在用原位人胰腺癌Miapaca-2异种移植物模型的公开内容中，M-CPA/PTX比对照、M-PTX或M-CPA表现出更好的抗肿瘤效力(图6A)。此外，用M-CPA/PTX处理的9只小鼠中的4只呈现出在组织学上无肿瘤(图6D)。用M-CPA/PTX观察到的增强的抗肿瘤活性伴随着脉管系统密度的提高、肿瘤基质的重塑和肿瘤细胞增殖的降低(图7)。

接下来，在PDAC的原位Kras*(具有Kras突变)同基因小鼠模型上测试载药胶束。测试了具有Kras*同基因PDAC肿瘤的小鼠的存活(图18)。用胰中的鼠Kras*PDAC肿瘤接种C57BL/6小鼠。一旦肿瘤可触知(直径～5mm)，则小鼠接受处理。将小鼠随机分入以下组：(1)CTL：不处理。(2)抗-PD1：每48小时以100μg进行腹膜内注射，直至死亡。(3)M-CPA/PTX：连续三天每天以5mg/kg/药物进行静脉内注射，然后监测直至死亡。(4)M-CPA/PTX+抗-PD1：连续三天每天以5mg/kg/药物进行静脉内注射。小鼠休息1天，并且每48小时接受100μg/小鼠的抗-PD1抗体直至死亡。(5)M-CPA/PTX+抗-PD1+抗-CD8α：与抗-PD1抗体一起以100μg/剂量腹膜内注射抗-CD8抗体。其他处理与第(4)组相同。每组有9至10只小鼠。每天监测小鼠，且如果濒死或肿瘤负荷过重，则将其处死。在实验结束时，即在处理开始之后40天处死所有小鼠。将不同组的小鼠存活率拟合到Kaplan-Meier曲线中并使用对数秩检验进行比较。小于0.05的p值表示显著性差异。如图18中所示，培养基存活为：(1)CTL为16.5天，(2)M-CPA/PTX为16.5天，(3)抗-PD1为23天，(4)M-CPA/PTX+抗-PD1为31天，以及(5)M-CPA/PTX+抗-PD1+抗CD8α为14.5天。第4组的存活显著长于第2组(p＝0.0013)。

测试了使用PDAC的Kras*同基因模型的载药胶束对肿瘤重量的影响。一旦肿瘤可触知(～5mm)(设定为第0天)，则将接种过的小鼠随机分入如下4组：(1)CTL：不处理。(2)M-CPA/PTX：小鼠在第0、1和2天每天静脉内注射5mg/kg/药物一次。(3)抗-PD1：小鼠在第4、6、8和10天每天腹膜内注射100μg抗体。(4)M-CPA/PTX+抗-PD1：小鼠在第0、1和2天每天静脉内注射5mg/kg/药物一次；然后在第4、6、8和10天每天腹膜内注射100μg抗体。在第10天，最后一次注射抗体后4小时处死小鼠。收集肿瘤并立即称重。每组有10只小鼠。数据表示为平均值±平均值的标准误差。使用单因素ANOVA与ad-hoc Tukey多重比较检验比较肿瘤重量。由*(p＜0.05)、**(p＜0.01)或ns(不显著)指出差异。结果示于图19中。如图19中所示，在开始处理之后10天时，用M-CPA/PTX+抗-PD1处理的肿瘤为0.39±0.05g，显著地小于其他三组：CTL(0.82±0.16g)，M-CPA/PTX(0.97±0.12g)和抗-PD1(0.87±0.16g)。对照组和单一治疗组之间没有差异。

一旦肿瘤可触知(～5mm)(设定为第0天)，则将接种过的、携带Kras*肿瘤的小鼠随机分入如下两组：(1)CTL：不处理。(2)M-CPA/PTX：小鼠在第0、1和2天每天静脉内注射5mg/kg/药物一次。这两组均在第4天静脉内注射⁶⁴Cu标记的抗-PD1抗体。在抗体注射之后24小时处死小鼠，收集肿瘤和淋巴结。用γ计数器测量与肿瘤或淋巴结相关的放射性。每个器官中的肿瘤摄取以每克组织注射的放射性的百分比(％ID/g)计算，并表示为(平均值±标准偏差)。每组有4只小鼠。扫描肿瘤的冷冻切片进行放射自显影以显示⁶⁴Cu标记的抗-PD1抗体的肿瘤内分布。如图20A中所示，在M-CPA/PTX处理之后，肿瘤引流淋巴结和Kras*肿瘤中⁶⁴Cu-抗-PD1的量化显示识别PD1+T细胞之抗体的提高分布的趋势。如图20B中所示，在M-CPA/PTX处理之后，观察到在静脉内注射⁶⁴Cu-抗-PD1之后24小时获得的Kras*肿瘤的放射自显影，结果是识别PD1+T细胞之抗体的更均匀分布。

基因改造的小鼠PDAC模型(KPC-luc小鼠模型)也用于测试载药胶束对肿瘤的作用。研究中使用125至130日龄的KPC-luc小鼠。将小鼠分配到两个不同的组：(1)未经处理的对照小鼠(CTL)，或(2)在两周中以5mg/kg/药物/剂量静脉内注射6个剂量的M-CPA/PTX的小鼠。然后在最后一个剂量之后24小时处死小鼠。将肿瘤收集、切片并针对CD3⁺T细胞进行染色。拍摄以200×放大的20个随机视野，并对CD3⁺细胞的数量进行计数。结果显示在图21中。如图21中所示，经处理的肿瘤具有比未经处理的CTL肿瘤显著更多的T细胞浸润。与每200×视野具有32±3个CD3⁺细胞的CTL肿瘤相比，经处理的肿瘤每200×视野具有55±5个CD3⁺细胞(p＜0.01)。

基因改造的小鼠PDAC模型(KPC-luc小鼠模型)也用于在存活研究中测试载药胶束对肿瘤的抗肿瘤效力。研究中使用在95至100日龄时显示阳性发光(＞1×10⁹个光子/秒)的KPC-luc小鼠。将小鼠分配到四个不同的组：(1)具有未经处理的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的小鼠(对照组)，(2)每隔一天以100mg/kg静脉内注射吉西他滨直至死亡的小鼠，(3)以5mg/kg/注射给予Abraxane的小鼠，以及(4)每次注射以5mg/kg/药物给予M-CPA/PTX。Abraxane和M-CPA/PTX的处理方案为：前2周每周3次静脉内注射，然后每周2次腹膜内注射直至死亡或开始处理后90天。如图22中所示，CTL、吉西他滨和abraxane组的中位生存期分别为139、167和155天。M-CPA/PTX组在167日龄时出现其首次死亡。其中位生存期为236.5天，显著长于其他组(p＜0.0001，对数秩检验)。

图23显示了从未经处理的对照小鼠和用M-CPA/PTX处理的KPC-Luc小鼠中摘除的肿瘤的组织学分析。在该研究中，具有可触知肿瘤的小鼠(约125日龄)或者未经处理(对照组，CTL)或者用M-CPA/PTX处理(2周中以5mg/kg/药物/注射进行6次静脉内注射)。在最后一次注射之后24小时，处死小鼠以收集肿瘤。肿瘤组织病理学特征分析显示，与CTL相比，M-CPA/PTX使低分化的PDAC降低82％(p＝0.037)，中度分化的PDAC降低92％(p＜0.0001)。它使良性胰提高了3.7倍(p＜0.0001)。

***

根据本公开内容，可在没有过度实验的情况下制造和执行本文中公开和要求保护的所有方法。虽然已根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将明显的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对本文中所述的方法和步骤中或方法的步骤顺序中进行变化。更具体地说，明显的是，化学和生理学二者相关的某些药剂可替代本文中所述的药剂而获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有此类类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。

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Claims

1.聚合物，其中所述聚合物是嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含具有多个PEG侧链和多个ε-己内酯侧链的聚丙烯酸主链。

2.权利要求1所述的聚合物，其中所述PEG侧链组分包含5个至50个乙二醇单体。

3.权利要求2所述的聚合物，其中所述聚丙烯酸主链包含3个至40个具有所述PEG侧链的重复单元。

4.权利要求3所述的聚合物，其中所述聚丙烯酸主链包含3个至20个具有所述PEG侧链的重复单元。

5.权利要求4所述的聚合物，其中所述PEG侧链用甲基封端。

6.权利要求1所述的聚合物，其中所述ε-己内酯侧链包含2个至20个ε-己内酯重复单元。

7.权利要求1所述的聚合物，其中所述ε-己内酯侧链包含2个至15个ε-己内酯重复单元。

8.权利要求7所述的聚合物，其中所述ε-己内酯侧链用琥珀酸基团酯化。

9.权利要求1所述的聚合物，其中所述ε-己内酯侧链通过乙二醇接头与所述聚丙烯酸主链连接。

10.权利要求1所述的聚合物，其中所述聚丙烯酸主链用N-(2-羟基乙基)氨基甲酸苄酯或乙醇胺基团封端。

11.权利要求1所述的聚合物，其中所述聚丙烯酸主链以卤素基团终止。

12.权利要求1所述的聚合物，其中所述聚合物由下式进一步限定：

其中：

R₂是下式的基团：

其中：

x是1至10；

m是5至40；

n是10至40；

p是5至40；

q是1至20；

y是1至10；并且

Y₁是羧基、膦酸/膦酸根或羟基磺酰基；

或其可药用的盐。

13.权利要求1所述的聚合物，其中所述聚合物还包含下式的第二聚合物：

其中：

m是5至40；

n是10至40；

p是5至30；

X₁和X₂各自独立地是一价阴离子；

或其药用盐。

14.权利要求12或权利要求13所述的聚合物，其中m是5至25。

15.权利要求14所述的聚合物，其中m是8至10。

16.权利要求12或权利要求13所述的聚合物，其中n是15至25。

17.权利要求16所述的聚合物，其中n是18至20。

18.权利要求12、权利要求13或权利要求16中任一项所述的聚合物，其中p是5至25。

19.权利要求18所述的聚合物，其中p是18至22。

20.权利要求18所述的聚合物，其中p是5至15。

21.权利要求12所述的聚合物，其中q是5至10。

22.权利要求12所述的聚合物，其中x是5至10。

23.权利要求22所述的聚合物，其中x是5。

24.权利要求12、22和23中任一项所述的聚合物，其中R₃和R₃′是氢。

25.权利要求24所述的聚合物，其中R₃和R₃′是氢并且x是5。

26.权利要求13所述的聚合物，其中R₁是亚乙基。

27.权利要求13所述的聚合物，其中R₂是亚乙基。

28.权利要求13所述的聚合物，其中R₃、R₃′和R₃″各自是甲基。

29.权利要求13所述的聚合物，其中X₁是卤素。

30.权利要求29所述的聚合物，其中X₁是氯。

31.权利要求13所述的聚合物，其中X₂是卤素。

32.权利要求31所述的聚合物，其中X₂是氯。

33.权利要求1或权利要求12所述的聚合物，其中所述聚合物具有以下结构：

34.权利要求13所述的聚合物，其中所述第二聚合物具有以下结构：

35.药物组合物，其包含：

(a)胶束、脂质体或纳米粒；以及

(b)治疗剂；

其中所述胶束、脂质体或纳米粒包含权利要求1至34中任一项所述的第一聚合物，并且所述胶束、脂质体或纳米粒包封所述治疗剂。

36.权利要求35所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含赋形剂。

37.权利要求36所述的药物组合物，其中所述赋形剂是单糖或二糖。

38.权利要求37所述的药物组合物，其中所述赋形剂是蔗糖。

39.权利要求35所述的药物组合物，其中所述胶束、脂质体或纳米粒还包含第二聚合物。

40.权利要求39所述的药物组合物，其中所述第一聚合物包含净阴离子电荷。

41.权利要求40所述的药物组合物，其中所述第一聚合物由下式进一步限定：

其中：

R₂是下式的基团：

其中：

x是1至10；

m是5至40；

n是10至40；

p是5至40；

q是1至20；

y是1至10；并且

Y₁是羧基、膦酸/膦酸根或羟基磺酰基；

或其可药用的盐。

42.权利要求41所述的药物组合物，其中所述第一聚合物是：

或其可药用的盐。

43.权利要求39至41中任一项所述的药物组合物，其中所述第二聚合物包含净阳离子电荷。

44.权利要求39或43所述的药物组合物，其中所述第二聚合物由以下结构进一步限定：

其中：

m是5至40；

n是10至40；

p是5至30；

X₁和X₂各自独立地是一价阴离子；

或其药用盐。

45.权利要求44所述的药物组合物，其中所述第二聚合物由下式进一步限定：

或其可药用的盐。

46.权利要求39至45中任一项所述的药物组合物，其中所述第一聚合物具有以下结构：

并且其中所述第二聚合物具有以下结构：

或其可药用的盐。

47.权利要求39至46中任一项所述的药物组合物，其中所述第一聚合物与所述第二聚合物的比例为约100∶1w/w至约1∶10w/w。

48.权利要求47所述的药物组合物，其中所述比例为约100∶1w/w至约1∶1w/w。

49.权利要求48所述的药物组合物，其中所述比例为约5∶1w/w。

50.权利要求48所述的药物组合物，其中所述比例为约50∶1w/w。

51.权利要求35至50中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含两种治疗剂，所述两种治疗剂各自独立地治疗或者选择性地靶向或结合肿瘤细胞和/或肿瘤基质细胞。

52.权利要求35至51中任一项所述的药物组合物，其中所述治疗剂是化学治疗剂。

53.权利要求52所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂是紫杉醇或环杷明。

54.权利要求53所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含紫杉醇和环杷明。

55.权利要求52所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂是GANT58或GANT61。

56.权利要求52所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂是维生素D。

57.权利要求35至56中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：(i)GANT58和紫杉醇、(ii)GANT61和紫杉醇、或(iii)维生素D和紫杉醇。

58.权利要求52所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂是17-N-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素(17-AAG)。

59.权利要求3至525中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：(iv)GANT58和17-AAG、(v)GANT61和17-AAG、或(vi)维生素D和17-AAG。

60.权利要求1至55中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制成用于静脉内、动脉内、腹膜内、肠胃外、皮下或肿瘤内施用。

61.在哺乳动物对象中治疗疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求35至60中任一项所述的药物组合物。

62.权利要求61所述的方法，其中所述疾病是癌症。

63.权利要求62所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。

64.权利要求63所述的方法，其中所述胰腺癌是胰腺导管腺癌(PDAC)。

65.权利要求63所述的方法，其中所述胰腺癌是其中音猬因子信号转导途径中的一种或更多种蛋白质有缺陷的胰腺癌。

66.权利要求65所述的方法，其中所述胰腺癌是其中所述音猬因子信号转导途径上调的胰腺癌。

67.权利要求65所述的方法，其中所述胰腺癌是其中平滑受体(SMO)失调的胰腺癌。

68.权利要求67所述的方法，其中所述平滑受体上调。

69.权利要求62所述的方法，其中所述癌症是肝癌。

70.权利要求69所述的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌。

71.权利要求62所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。

72.权利要求71所述的方法，其中所述卵巢癌是高等级浆液性癌。

73.权利要求62所述的方法，其中所述癌症是基底细胞癌。

74.权利要求62所述的方法，其中所述癌症是髓母细胞瘤。

75.权利要求63所述的方法，其中所述药物组合物包含紫杉醇或环杷明。

76.权利要求75所述的方法，其中所述药物组合物包含紫杉醇和环杷明。

77.权利要求61至76中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物对象是人。

78.权利要求61至77中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述对象施用检查点抑制剂、免疫治疗或放射治疗。

79.权利要求78所述的方法，其中所述方法还包括向所述对象施用放射治疗。