CN109022563B - 血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的相关位点及检测方法和试剂盒 - Google Patents

血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的相关位点及检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的相关位点及检测方法和试剂盒，具体地，本发明首次发现FADS2‑rs66698963与不饱和脂肪酸的合成能力密切相关，并且本发明还首次发现，FADS2基因还与血脂紊乱相关的代谢性疾病以及药物敏感性显著相关。

Description

血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的相关位点及检测方法和 试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，具体地，涉及血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的相关位点及检测方法和试剂盒。
背景技术
血脂紊乱是代谢紊乱疾病(如代谢综合征)、心血管疾病、癌症等风险性因素。随着人们生活水平提高，能量摄入渐增，2012年高胆固醇、高甘油三酯、低高密度脂蛋白的流行率比2002年分别高了近9％，12％，11％。血脂紊乱的控制与治疗逐渐受到重视。
目前，常见的FADS基因簇上的SNP与血脂紊乱相关代谢性疾病存在单一SNP功能有限，检验效能不足，而多重SNP增加成本，增加样本使用量的问题。
因此，本领域迫切需要对不饱和脂肪酸谱(如n-3)和疾病相关的基因型进行研究，并开发新的血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的相关位点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的相关位点。
本发明提供了一种新的血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的相关位点，可以为血脂紊乱危险性性评估做参考，还可以为深海鱼油的补充做个性化的评估。
本发明第一方面提供了一种FADS2基因的基因突变位点和/或其检测试剂的用途,用于制备一试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于：
(i)检测血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性或其患病风险；和/或
(ii)判断被检测对象对不饱和脂肪酸的合成能力；
其中，所述FADS2基因的基因突变位点为FADS2基因的rs66698963。
在另一优选例中，所述FADS2基因的基因突变位点为FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位插入。
在另一优选例中，所述不饱和脂肪酸为n-3不饱和脂肪酸。
在另一优选例中，所述血脂紊乱相关的代谢性疾病为与n-3不饱和脂肪酸相关的血脂紊乱相关的代谢性疾病。
在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还用于判断被检测对象对脂肪酸代谢相关药物的敏感性。
在另一优选例中，所述FADS2基因的登录号为NT_167190.1。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位插入时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为插入型基因型。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位插入22bp的核苷酸序列时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为插入型基因型。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位插入22bp的核苷酸序列(ACTTCTCCCTGCCTCCCCAGGG，SEQ ID NO.:2)时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为插入型基因型。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位没有插入时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为缺失型基因型。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位没有插入22bp的核苷酸序列时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为缺失型基因型。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位没有插入22bp的核苷酸序列(ACTTCTCCCTGCCTCCCCAGGG，SEQ ID NO.:2)时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为缺失型基因型。
在另一优选例中，所述插入型基因型为I/I基因型、I/D基因型。
在另一优选例中，所述缺失型基因型为D/D基因型、I/D基因型。
在另一优选例中，所述FADS2基因的基因突变位点是杂合的或纯合的。
在另一优选例中，所述FADS2基因的基因突变位点选自下组：I/I、D/D、I/D、或其组合。
在另一优选例中，所述血脂紊乱相关的代谢性疾病选自下组：肥胖、高血压、高血脂、高血糖、冠心病、心肌梗死、缺血性卒中、糖尿病、或其组合。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括点样于测试板上的所述检测试剂以及使用说明书。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括检测配套的样品前处理试剂以及使用说明书。
在另一优选例中，所述的说明书记载了检测方法以及根据所述FADS2基因的基因突变位点判断被检测对象对不饱和脂肪酸的合成能力；和/或检测血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的方法。
在另一优选例中，所述说明书注明以下内容：
(1)当检测对象具有I/I基因型时，则提示所述检测对象对不饱和脂肪酸的合成能力高于D/D基因型人群；
(2)当检测对象具有I/I基因型时，则提示所述检测对象对血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性低于D/D基因型人群。
(3)当检测对象具有D/D基因型时，则提示所述检测对象对不饱和脂肪酸的合成能力低于I/I基因型人群；
(4)当检测对象具有D/D基因型时，则提示所述检测对象对血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性高于I/I基因型人群；
在另一优选例中，所述“检测对象对不饱和脂肪酸的合成能力高于D/D基因型人群”指将来自测试对象的样品的某一不饱和脂肪酸含量A1与D/D基因型人群的相应不饱和脂肪酸含量A0相比较，若A1显著高于A0，则提示测试对象对不饱和脂肪酸的合成能力较高。
在另一优选例中，所述“检测对象对血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性低于D/D基因型人群”指将来自测试对象的样品的某一不饱和脂肪酸含量A1与D/D基因型人群的相应不饱和脂肪酸含量A0相比较，若A1显著高于A0，则提示测试对象对血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性较低。
在另一优选例中，所述“显著高于”指A1/A0≥2，较佳地A1/A0≥3，更佳地A1/A0≥4。
在另一优选例中，所述“检测对象对不饱和脂肪酸的合成能力低于I/I基因型人群”指将来自测试对象的样品的某一不饱和脂肪酸含量A1与I/I基因型人群的相应不饱和脂肪酸含量A0相比较，若A1显著低于A0，则提示测试对象对不饱和脂肪酸的合成能力较低。
在另一优选例中，所述“检测对象对血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性高于I/I基因型人群”指将来自测试对象的样品的某一不饱和脂肪酸含量A1与I/I基因型人群的相应不饱和脂肪酸含量A0相比较，若A1显著低于A0，则提示测试对象对血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性较高。
在另一优选例中，所述“显著低于”指A1/A0≤1/2，较佳地，A1/A0≤1/3，更佳地，A1/A0≤1/4。
在另一优选例中，所述的一般人群的数量为至少100人；较佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。
在另一优选例中，所述试剂盒用于检测亚洲人群(尤其是中国人群)对不饱和脂肪酸的合成能力。
在另一优选例中，所述的样品包括血液样品、血浆样品、或血清样品。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括引物、探针、芯片、抗体。
在另一优选例中，所述脂肪酸代谢相关药物选自下组：DHA、EPA、亚麻酸、花生四烯酸、或其组合。
在另一优选例中，如果所述被检测对象中的FADS2基因的基因型为I/I，则说明该对象对脂肪酸代谢相关药物更为敏感。
在另一优选例中，如果所述被检测对象中的FADS2基因的基因型为I/D，则说明该对象对脂肪酸代谢相关药物较为敏感。
在另一优选例中，如果所述被检测对象中的FADS2基因的基因型为D/D，则说明该对象对脂肪酸代谢相关药物一般敏感。
在另一优选例中，被检测对象包括：人或非人哺乳动物(如家畜、家禽、实验动物等)。
在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：
(A)用于基因检测的特异性引物；
(B)用于基因检测的特异性探针；
(C)用于基因检测的芯片；
(D)用于检测突变的基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体。
在另一优选例中，所述试剂或试剂盒用于普通PCR检测。
在另一优选例中，所述普通PCR中，退火温度为60-67℃之间，PCR扩增产物长度为80-500bp。
在另一优选例中，所述检测为辅助性检测和/或早期检测。
本发明第二方面提供了一种检测血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性或其患病风险的试剂盒，所述试剂盒包括FADS2基因的基因突变位点的检测试剂；其中，所述FADS2基因的基因突变位点为FADS2基因的rs66698963。
在另一优选例中，所述的检测试剂为：
(A)用于基因检测的特异性引物；
(B)用于基因检测的特异性探针；
(C)用于基因检测的芯片；
(D)用于检测突变的基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体。
本发明第三方面提供了一种检测血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性或其患病风险的方法，包括步骤：
检测对象的FADS2基因的基因突变位点，并与正常的FADS2基因相比较，
其中，当所述对象的FADS2基因的基因突变位点的基因型为I/I基因型，则表明该对象的血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性低于正常人群；和/或
当所述对象的FADS2基因的基因突变位点的基因型为D/D基因型，则表明该对象的血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性高于正常人群。
在另一优选例中，所述正常人群为携带未突变的FADS2基因的人群。
在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长目动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。
本发明第四方面提供了一种检测血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性或其患病风险的方法，包括步骤：
检测对象的FADS2基因的基因突变位点，其中，当所述对象的FADS2基因的基因突变位点的基因型为I/I，则表明该对象的血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性低于D/D基因型人群；和/或
当所述对象的FADS2基因的基因突变位点的基因型为D/D，则表明该对象的血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性高于I/I基因型人群。
在另一优选例中，所述对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、灵长目动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了对FADS2-rs66698963进行PCR扩增与基因型扩增的结果。
图2显示了三种基因型对脂肪酸的影响。
图3显示了三种基因型与脂肪酸的交互作用对血脂的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次发现FADS2-rs66698963与不饱和脂肪酸的合成能力密切相关，并且本发明还首次发现，FADS2基因还与血脂紊乱相关的代谢性疾病以及药物敏感性显著相关，其中研究结果显示，当检测对象的FADS2-rs66698963基因型为I/I，则表明该对象的不饱和脂肪酸(如n-3)的合成能力较高，血脂紊乱相关的代谢性疾病(如与n-3不饱和脂肪酸相关的血脂紊乱相关的代谢性疾病)的易感性较低；当测对象的FADS2-rs66698963基因型为D/D，则表明该对象的不饱和脂肪酸(如n-3)的合成能力较低，血脂紊乱相关的代谢性疾病(如与n-3不饱和脂肪酸相关的血脂紊乱相关的代谢性疾病)的易感性较高；当检测对象的FADS2-rs66698963基因型为I/D，则表明该对象的不饱和脂肪酸(如n-3)的合成能力和血脂紊乱相关的代谢性疾病(如与n-3不饱和脂肪酸相关的血脂紊乱相关的代谢性疾病)的易感性介于基因型I/I与D/D之间。在此基础上完成了本发明。
不饱和脂肪酸以及不饱和脂肪酸的合成能力
不饱和脂肪酸指含有双键的脂肪酸，含两个及两个以上的双键的脂肪酸为多不饱和脂肪酸。多不饱和脂肪酸分为n-6和n-3多不饱和脂肪酸。多不饱和脂肪酸和多种疾病结局包括心血管疾病，免疫和炎症反应包括过敏等，以及神经心理性疾病相关。多不饱和脂肪酸合成底物为食物来源的18:2和18:3，经过这样两条途径：(1)18：2n6→(FADS2)18:3n6→20:3n6→(FADS1)20:4n6→22:4n6(2)18:3n3→(FADS2)18:4n3→20:4n3→(FADS1)20:5n3→22:5n3→24:5n3→(FADS2)24:6n3→(氧化)22:6n3。其中，FADS1和FADS2作为去饱和酶基因，编码相应的蛋白调控底物生成产物的过程。因为实际操作和伦理原因，人体中的去饱和酶活性仅能通过产物/底物的的间接测量来评定。现在普遍使用18：3n6/18:2n6和20:4n6/20:3n6来衡量FADS2和FADS1活性。
多不饱和脂肪酸依据双键距离甲基端的碳原子的个数分为n-3系、n-6系以及n-9系等。其中，n-3系与n-6系多不饱和脂肪酸是必需脂肪酸，研究较为广泛。n-3和n-6脂肪酸在合成代谢上存在竞争抑制关系。n-6不饱和脂肪酸花生四烯酸可在环氧合酶作用下转化为前列腺、血栓素等促炎症物质。而n-3不饱和脂肪酸摄入或合成不足将使得n-6脂肪酸相对增加，使出现炎症反应。n-3不饱和脂肪酸的增加抑制花生四烯酸的合成降低，从而降低炎症以及相关疾病风险。研究显示，n-6不饱和脂肪酸能导致血小板凝集和血栓形成，n-3则作用相反。一般来说，n-6不饱和脂肪酸可促进肿瘤生长，而n-3能抑制动物肿瘤生长。此外，n-3能调节脂肪分配，刺激脂肪氧化利用，增加膜流动性，降低LDL-C和VLDL-C。n-3不饱和脂肪酸中的DHA在调节视力和脑发育有正向作用。总的来说，n-3不饱和脂肪酸对健康的积极影响主要就是通过抑制n-6系的花生四烯酸和合成，改变炎症反应和相关分子表达及活性。因此，n-3和n-6脂肪酸的作用不同。
血脂紊乱相关的代谢性疾病
近年来，随着居民生活水平的提高以及老龄化人口增加，血脂异常患病率逐渐上升。血脂异常具有危害大，发病率高和控制率低等特点，可引起常见的疾病发生，如高血压、肥胖、冠心病、心肌梗死、缺血性卒中、糖尿病、或其组合等。血脂异常早期无比较明显的症状，常以冠心病及脑中风等严重的心血管疾病为首发表现，导致不良后果。随着血脂异常发病率的降低，其相关的疾病的患病率也随着降低。调整血脂水平是降低心脑血管疾病发病的有效预防措施。了解基因对血脂的调节效应，并调整生活方式，有利于血脂异常与血脂代谢紊乱相关疾病的治疗。
在本发明的一个优选例中，所述血脂紊乱相关的代谢性疾病为与n-3不饱和脂肪酸相关的血脂紊乱相关的代谢性疾病，选自下组：肥胖、高血压、高血脂、高血糖、冠心病、心肌梗死、缺血性卒中、糖尿病、或其组合。
FADS2基因
FADS2基因全称为脂肪酸去饱和酶基因-2，位于第11号染色体上。该基因编码的蛋白质是Δ-6去饱和酶蛋白(D6D)。D6D酶催化18:2n6→18:3n6以及18:3n3→18:4n3,这是n-3和n-6长链不饱和脂肪酸合成的第一个限速步骤。此外，D6D酶还在EPA合成DHA途径发挥作用。
FADS2基因的登录号为NT_167190.1。在本发明中，所述FADS2基因的基因突变位点为FADS2基因的rs66698963：即FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位插入。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位插入时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为插入型基因型(如I/I基因型或I/D基因型)。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位插入22bp的核苷酸序列(ACTTCTCCCTGCCTCCCCAGGG，SEQ ID NO.:2)时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为插入型基因型(如I/I基因型或I/D基因型)。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位插入22bp的核苷酸序列(ACTTCTCCCTGCCTCCCCAGGG，SEQ ID NO.:2)时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为插入型基因型(如I/I基因型或I/D基因型)。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位没有插入时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为缺失型基因型(D/D基因型或I/D基因型)。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位没有插入22bp的核苷酸序列(ACTTCTCCCTGCCTCCCCAGGG，SEQ ID NO.:2)时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为缺失型基因型(D/D基因型或I/D基因型)。
在另一优选例中，所述FADS2基因的7309822-7310132位(SEQ ID NO.:1)中的第169－192位没有插入22bp的核苷酸序列(ACTTCTCCCTGCCTCCCCAGGG，SEQ ID NO.:2)时，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为缺失型基因型(D/D基因型或I/D基因型)。
不饱和脂肪酸去饱和酶5(D5D)和不饱和脂肪酸去饱和酶6(D6D)是不饱和脂肪酸合成通路上关键性酶，能够催化花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)的产生。这两种酶分别由FADS1和FADS2基因编码。
在本发明中，Rs66698963是一个22bp插入缺失的多态性位点，位于FADS2基因内含子1上的SRE位点下游137bp处。本发明首次研究rs66698963插入缺失的基因型与不饱和脂肪酸谱(n-3)和疾病相关结局的人群研究。
检测方法、检测试剂及试剂盒
与FADS2基因相关的多聚核苷酸可用于不饱和脂肪酸的合成能力的预测。另一方面，本发明的检测方法可用于评估个体患血脂紊乱相关的代谢性疾病以及药物敏感性的风险。
本领域的技术人员知道，有大量的分析技术可用于检测基因中所述位点是否存在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于)：DNA测序、杂交测序；酶促错配切割、异源双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技术、分子信标等，变性高效液相色谱法(DHPLC)。
用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”或“核酸芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用FADS2基因特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测相应的转录产物。
检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。FADS2基因的突变的形式包括与正常野生型DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用FADS2基因特异性引物扩增样品的FADS2基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存本发明的单核苷酸多态性。
应理解，在本发明首次揭示了FADS2-rs66698963与不饱和脂肪酸(n-3)的合成能力、与血脂紊乱相关的代谢性疾病(n-3不饱和脂肪酸相关)以及药物敏感性的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在本发明的多核苷酸多态性。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对扩增具有SEQ ID NO:1中第169－192位(优选第170-191位)的序列。虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为50-800bp，较佳地为100-600bp，更佳地为200-500bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO:1中第169－192位(优选第170-191位)。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，FADS2-rs66698963基因型和n-3脂肪酸合成有强烈关联。
(2)本发明首次发现，D/D基因型和TG的升高、HDL-C的降低相关，这些效应还能被18:2n-6，EPA+DHA,运动等因素修饰。
(3)本发明首次发现，FADS2-rs66698963I/I型人群合成多不饱和脂肪酸的能力要比D/D型强，因此多不饱和脂肪酸的补充摄入可能并没有D/D型人群严格，并不需要补充那么多深海鱼油等补充剂。尤其是DHA的市场价格依然较高的情况，对rs66698963差异性人群进行个性化膳食指导很有意义。
(4)本发明首次发现，FADS2-rs66698963与血脂紊乱相关的代谢性疾病(n-3相关)也有显著关系，并且FADS2-rs66698963对于疾病的作用能被外界因子修饰。说明不同基因型的人群对于疾病的程度不一致，对药物的敏感程度也不一致，对于疾病的治疗和药物的种类剂量的个性化有指导作用。
(5)本发明首次发现，对于FADS2-rs66698963的研究和开发应用，如制成试剂盒，将其运用到医疗中产生的作用可能比其他SNP大，作用也更加稳定。
(6)可结合基因型治疗这些疾病，开出不同种类和剂量的药物和食疗。基于以上，生物公司可针对该插入缺失片段研发检测试剂盒，投入医疗和研究应用中。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，否则本发明说明书中所用的材料和试剂均为市售产品。
实施例
在一个2年的追踪实验中，检测了2008个住在北京顺义的居民的基线的脂肪酸，血脂和rs66698963基因型，在排除数据缺失的，排除有心血管疾病，恶性肿瘤，和有其他重大疾病的人，最后利用1504个人来分析rs66698963对于脂肪酸和血脂水平的作用。利用rs66698963的检测，可以指导脂肪酸的膳食摄入。Rs66698963的不同基因型对血脂谱，血脂相关代谢紊乱疾病，如代谢综合征，心血管疾病，及癌症产生不同影响。
1.实验方法：
1.1收集人群血液样本，提取血液DNA，检测血液总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白，空腹血糖等指标。
1.2检测脂肪酸：Folch法提取脂肪酸后甲酯化后采用气相色谱(GC)-氢火焰离子化检测(FID)法测定脂肪酸组成和含量。
1.3基因型鉴定：从中国疾病控制中心申请获得的全血经过1500g/min离心15分钟，分离出白膜层，基因组DNA从白膜层，主要是白细胞中提取出来，设计常规引物，PCR方法将含rs66698963插入缺失位点的DNA扩增。配制3％高浓度琼脂糖，将PCR产物凝胶电泳直到条带分离(如果是纯合子则只有一条条带)；凝胶用EB染色后置于凝胶电泳成像仪下观察，根据胶的大小和条带鉴定基因型。插入型纯合子记为I/I,缺失型纯合子记为D/D,杂合型记为I/D。
1.4血脂异常定义：根据《中国成人血脂异常防治指南2007版》将血脂异常定义为：高胆固醇(TC≥5.18mmol/L)、高甘油三酯(TG≥1.70mmol/L)和低高密度脂蛋白(HDL-C＜1.04mmol/L)。
1.5数据分析：秩和检验和卡方检验分别用来检测三种基因型间的基本变量的差异。采用卡方检验来检测哈迪-温伯格平衡，广义线性回归用来检测rs66698963基因型与不饱和脂肪酸和基线血脂的关系。Logistic回归用来检测基因型对血脂异常的风险比例(OR)。继续追踪基线血脂正常的人群，利用Logistic回归用来检测基因型对追踪2年后血脂的影响。此外，还利用广义线性回归来检测基因与脂肪酸或者与年龄、运动、高血压等风险因素的交互作用对血脂的影响。
2.实验结果
2.1 FADS2-rs66698963PCR扩增与基因型扩增
根据常规引物设计，扩增产物为200bp的单一条带，基因型为I/I(+22bp/+22bp),扩增产物为178bp的单一条带，基因型为D/D(-22bp/-22bp),两种条带都有的为I/D(+22bp/-22bp)(图1)。人群包涵1504个人群，基因型分布为I/I(45.8％),I/D(42.4％),D/D(11.8％)。
2.2三种基因型对脂肪酸的影响
D/D基因型能显著的升高D5D和D6D调控过程的底物和降低产物。如D/D基因型的18:3n-3水平比I/I基因型更高(all P<0.001)，而20:5n-3,22:5n-3,22:6n-3,EPA+DHA水平比I/I基因型更低(all P<0.001)(图2)。2.3三种基因型对血脂的影响
表1三种基因型对血脂的影响
Figure BDA0001318091880000121
Figure BDA0001318091880000131
加性模型：随着D-allele数量增加，把基因当做连续变量。显性模型：(D/D基因型+I/D基因型)VS I/I基因型，把基因当做分类变量。P值来源于广义线性模型。模型1:调整年龄和性别。模型2:调整年龄、性别、BMI、吸烟、干农活、高血压和糖尿病。模型3::调整年龄、性别、BMI、吸烟、干农活、高血压、糖尿病和AA/(EPA+DHA)
结果如表1所示。结果显示，加性模型中，模型1和模型2都显示FADS2-rs66698963缺失位点(D-allele)比插入位点(I-allele)携带者更能显著升高TG和降低HDL-C(P<0.05)。显性模型中，模型1和模型2显示(D/D+I/D)基因型比I/I基因型能显著升高TG和降低HDL-C(p<0.05).以上结果说明D-allele增加血脂异常风险，D/D基因型与血脂异常敏感性最强。
2.4三种基因型与脂肪酸和风险因子的交互作用对血脂的影响
FADS2-rs66698963对升高TG的作用在低水平的18：2n-6和EPA+DHA时更明显(Pinteraction＝0.04和0.004)(图3)。FADS2-rs66698963对降低HDL-C的作用在EPA+DHA水平更低时和没有运动更明显(Pinteraction＝0.004和0.004)(表2)。
表2三种基因型与风险因子的交互作用对血脂的影响
Figure BDA0001318091880000132
P值和P interaction来源于广义线性模型，使用加性模型。
结果如表2所示。结果显示，FADS2-rs66698963基因与运动在降低HDL-C有交互作用(Pinteraction＝0.004),但是在TC,TG没有显著作用。FADS2-rs66698963基因与高血压在降低TC上有显著交互作用(Pinteraction＝0.02),但是在TG和HDL-C上没有显著交互作用。FADS2-rs66698963基因在没有运动和没有高血压的人中对血脂异常的效果更加明显。以上结果说明运动和高血压可以影响到rs66698963基因调控血脂的效应。因此不同rs66698963基因型的人，可以采用不同强度的运动和与预防高血压相关的措施来调整基因产生的影响。
3.实验结论
研究显示，FADS2-rs66698963基因型和脂肪酸合成有强烈关联。D/D基因型和TG的升高，HDL-C的降低相关，这些效应还能被18:2n-6，EPA+DHA,运动等因素修饰。这些结果说明：(1)FADS2-rs66698963基因型可能调控不饱和脂肪酸合成。用多不饱和脂肪酸替代饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸一直被提倡来降低疾病风险。而本发明的研究显示，rs66698963I/I型人群合成多不饱和脂肪酸的能力要比D/D型强，因此多不饱和脂肪酸的补充摄入可能并没有D/D型人群严格，并不需要补充那么多深海鱼油等补充剂。尤其是DHA的市场价格依然较高的情况，对rs66698963差异性人群进行个性化膳食指导很有意义；(2)FADS2-rs66698963与血脂紊乱相关的代谢性疾病也有显著关系，并且FADS2-rs66698963对于疾病的作用能被外界因子修饰。说明不同基因型的人群对于疾病的程度不一致，对药物的敏感程度也不一致，对于疾病的治疗和药物的种类剂量的个性化有指导作用；(3)基因型分布的选择性进化。我们的人群基因型分布为I/I(45.8％),I/D(42.4％),D/D(11.8％)。而一个美国人群的该基因型分布为,I/I(18％),I/D(39％),D/D(43％),说明这个基因型分布在人种、地域、饮食上的选择，这是一种稳定的进化，并不是单个基因点的偶然突变。我们的研究在中国人群，乃至世界人群中都具有指导意义；(4)在人群中，单核苷酸多态性位点(SNP)往往是某个插入缺失位点的标签，FADS2-rs66698963上下游附近的研究较为透彻的SNPs,如rs174570，rs174575很可能就是rs66698963的标签，这些SNP的作用可能体验的就是rs66698963的作用。对于rs66698963的研究和开发应用，如制成试剂盒，将其运用到医疗中产生的作用可能比其他SNP大，作用也更加稳定。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 血脂紊乱相关的代谢性疾病易感性的相关位点及检测方法和试剂盒
<130> P2017-0473
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 311
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcaccccac ccagagccag caaagctggt caccactgca accctgggct cctccctgcc 60
cgcaccctgg gcctcctccc tgcctgcccc cccaccccag ccctcctccc tgcctgcccc 120
cagggcctcc tccctgcctc cccagggact tctccctgcc tccccaggga cttctccctg 180
cctccccagg gccctggaat agcacgtctc ttttccctga aaatactctt gacctgatcc 240
tctgctacca tcccttttcg gctcggctag tgggtcacag gcatttttta agaaaccgtg 300
ggcccagttt t 311
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acttctccct gcctccccag gg 22

Claims (3)

1.一种FADS2基因的基因突变位点的检测试剂的用途，其特征在于，用于制备用于：
（i）检测血脂紊乱相关的代谢性疾病的易感性或其患病风险；和
（ii）判断被检测对象对不饱和脂肪酸的合成能力的试剂或试剂盒；
其中，所述FADS2基因的基因突变位点为FADS2基因的rs66698963；
所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为插入型基因型，其序列如SEQ ID NO:1所示，所述FADS2基因的基因突变位点的基因型为缺失型基因型，其在SEQ ID NO:1中的第169－192位之间有一段22bp的核苷酸序列，即ACTTCTCCCTGCCTCCCCAGGG，SEQ ID NO:2的缺失，所述插入型基因型为I/I基因型、I/D基因型，所述缺失型基因型为D/D基因型、I/D基因型；
所述不饱和脂肪酸为n-3不饱和脂肪酸，所述血脂紊乱相关的代谢性疾病为与n-3不饱和脂肪酸相关的血脂紊乱相关的代谢性疾病。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述FADS2基因的基因突变位点选自下组：I/I、D/D、I/D、或其组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述血脂紊乱相关的代谢性疾病选自下组：肥胖、高血压、高血脂、高血糖、冠心病、心肌梗死、缺血性卒中、糖尿病、或其组合。
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A regulatory insertion-deletion polymorphism in the FADS gene cluster influences PUFA and lipid profiles among Chinese adults: a population-based study;Peiqin Li et al;《Am J Clin Nutr》;20180509;第107卷;第867-875页 *
Positive Selection on a Regulatory Insertion–Deletion Polymorphism in FADS2 Influences Apparent Endogenous Synthesis of Arachidonic Acid;Kumar S. D. Kothapalli et al;《Mol. Biol. Evol.》;20160329;第33卷(第7期);第1726-1739页 *
吃素易致病还是吃肉易致病?;乔梁;《百科知识》;20160515(第10期);第1-7页 *

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