CN109021055A

CN109021055A - Fxr激动剂

Info

Publication number: CN109021055A
Application number: CN201710433046.6A
Authority: CN
Inventors: 袁建栋; 黄仰青; 隋巍峰
Original assignee: Borui Pharmaceutical (suzhou) Ltd By Share Ltd
Current assignee: Borui Pharmaceutical (suzhou) Ltd By Share Ltd; Brightgene Bio Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2037-06-09
Also published as: CN109021055B

Abstract

本发明涉及一种FXR激动剂，本发明公开了一种如下式所示的化合物：本发明化合物OBN‑DJ对FXR有激动作用，EC₅₀值与奥贝胆酸相当。OBN‑DJ能显著降低胆管结扎导致的胆汁淤积性肝硬化模型大鼠血清ALP和TBIL水平，并显著改善肝纤维化评分，治疗PBC的效果与奥贝胆酸相当。OBN‑DJ还能显著降MCD诱导NASH模型大鼠血清ALT和AST水平，并显著改善肝脏病理NASH评分，治疗NASH的效果与奥贝胆酸相当。OBN‑DJ导致的瘙痒不良反应发生率显著低于奥贝胆酸。

Description

FXR激动剂

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种FXR激动剂，具体涉及一种小分子FXR激动剂，及其制备方法和用途。

背景技术

FXR(法尼酯X受体)是一种在肝肠系统等组织器官表达的胆汁酸受体，可被内源性配体胆汁酸激活，在胆汁酸代谢及胆固醇代谢中发挥重要作用，可促进体内脂肪细胞分化，调节体内脂肪细胞功能，其中一条十分重要的通路便是胰岛素通路。初级胆汁酸鹅脱氧胆酸是FXR最有效的配体，次级胆汁酸石胆酸和脱氧胆酸也可以激活FXR。奥贝胆酸是FXR激动剂和胆汁酸调节剂，增加胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗，增强脂细胞脂质贮存，促进脂联素(一种胰岛素增敏激素，有研究发现脂联素可以改善由胆汁酸介导的NASH患者肝脏损伤)以及瘦素(leptin)的分泌，并具有抗纤维化作用。奥贝胆酸最重要的适应症包括原发性胆汁性肝硬化(PBC)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，以及原发性硬化性胆管炎(PSC)、门静脉高压、胆汁酸性腹泻等。

原发性胆汁性肝硬化(PBC)：本病为原因不明、慢性进行性因胆道堵塞而引起胆汁淤积性的肝病，很可能与自身免疫有关。PBC常与其他免疫性疾病如类风湿性关节类、干燥综合征、硬皮病、慢性淋巴细胞性甲状腺炎等并存，多见于中年妇女，起病隐袭，经过缓慢，食欲与体重多无明显下降，约10％的患者可无任何症状。PBC的病情呈进行性，最终导致肝硬化和肝功能衰竭，肝移植是终末期PBC患者惟一有效的治疗方法。

PBC的特征是高度特异性的肝内小胆管毁损。PBC患者特异性的血清标记物是AMA(抗线粒体抗体)，特异性为90～95％。

该病为罕见病，全球发病率约为0.25‰～0.33‰，各地发病率无明显变化，但也有认为在西方国家发病率相对高，在亚洲和非洲比较罕见。发病人群多为女性，女性患者：男性患者的比率约为10：1，发病年龄多为40～60岁。

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)：NAFLD(non-alcoholic fatty liver disease) 是一种与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，其病理学改变与酒精性肝病相似，但患者无过量饮酒史，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌。NAFL定义为有肝脏脂肪变性但无肝细胞受损(肝细胞气球样变)的证据；NASH定义为有肝脏脂肪变性和肝细胞炎症损害伴或不伴有纤维化。

NAFL组织学进展非常缓慢，而NAFLD不仅通过NASH进展至纤维化和肝硬化，10～15年内肝硬化发生率高达15％～25％，可进一步发展为肝衰竭和原发性肝癌，增加了肝病相关的死亡率，更重要的是作为代谢综合征的组分，显著增加了代谢综合征相关恶性肿瘤、动脉粥样硬化和心血管疾病的死亡率以及2 型糖尿病的发病率。这些综合征为影响NASH患者生活质量和预期寿命的重要因素。

NAFLD发病率较高，是欧美等西方发达国家肝功能酶学异常和慢性肝病最常见的原因，普通成人NAFLD患病率为20％～33％，其中NASH和肝硬化分别占10％～20％和2％～3％。肥胖症患者NAFL患病率为60％～90％、NASH为 20％～25％、肝硬化为2％～8％，Ⅱ型糖尿病和高脂血症患者NAFLD患病率分别为28％～55％，和27％～92％。

综合评估，西方国家NASH患病率估计约为3％～5％，NASH相关肝硬化患病率尚不清楚。据估计，美国大约有600万成人发生NASH所致的晚期肝脏纤维化或肝硬化。随着肥胖症和代谢综合征在全球的流行，近20年亚洲国家 NAFLD增长迅速且呈低龄化发病趋势，中国的上海、广州、香港等发达地区患病率在15％左右，NASH患病率约为1.5％～3％。按照当前的发展趋势，预计 NASH将成为未来10年的肝脏移植首要适应症。

但奥贝胆酸的不良反应中，瘙痒是最为常见的，在一项临床试验中，口服10mg治疗组有68％、滴定10mg治疗组有56％的患者出现瘙痒。口服10mg治疗组有12％、滴定10mg治疗组有9％的患者停止使用研究药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种疗效好、不良反应小的FXR激动剂。

本发明一方面提供了以下化合物：

本发明第二方面提供了含有OBN-DJ及药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂等。

本发明第三方面提供了OBN-DJ的制备方法：

(1)OBA(奥贝胆酸)与牛磺酸反应生成OBN(牛磺酸奥贝胆酸)；

(2)OBN与胆碱成盐，得到OBN-DJ。

本发明第四方面提供了OBN-DJ及其药物组合物的用途：在制备作为FXR 激动剂的药物中的用途；在制备用于治疗PBC的药物中的用途；在制备用于治疗NASH的药物中的用途；在制备用于治疗原发性硬化性胆管炎的药物中的用途；在制备用于治疗门静脉高压的药物中的用途；在制备用于治疗胆汁酸性腹泻的药物中的用途。

本发明化合物OBN-DJ对FXR有激动作用，EC₅₀值与奥贝胆酸相当。 OBN-DJ能显著降低胆管结扎导致的胆汁淤积性肝硬化模型大鼠血清ALP和 TBIL水平，并显著改善肝纤维化评分，治疗PBC的效果与奥贝胆酸相当。OBN-DJ 还能显著降MCD诱导NASH模型大鼠血清ALT和AST水平，并显著改善肝脏病理NASH评分，治疗NASH的效果与奥贝胆酸相当。OBN-DJ导致的瘙痒不良反应发生率显著低于奥贝胆酸。

附图说明

图1：H-NMR图

图2：MS图

具体实施例

下面结合具体的实施例对发明内容作进一步的解释和说明，但是，它们并不构成对本发明范围的限制或限定。

实施例1 OBN-DJ的合成

1.OBN的合成

将OBA(40g 0.095mol 1eq)加入3L三口瓶中，再加入丙酮(400ml)，搅拌并将温度控制在0-10℃之间，加入HOBT(21.9g 0.19mol 2.0eq)，再加入DCC (49g 0.24mol 2.5eq)和4-二甲基氨基吡啶(1.16g 0.95mmol 0.01eq)，搅拌0.5-2h，TLC，115消失，生成活性酯。在反应液中加入牛磺酸水溶液(24g 0.192mol 2eq) 和三乙胺(20g 0.2mol 2eq)，继续搅拌溶液2-5h，加入6N HCl调节反应溶液的pH 为1-2，搅拌反应液1-2h，浓缩溶剂，抽滤沉淀，滤液用四氢呋喃萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后，40℃旋干，得OBN(牛磺奥贝胆酸)粗品，将粗品用硅胶拌样，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝20:1。TLC监控，磷钼酸显色。纯品合并旋干得OBN 26g，收率：52％。

2.OBN-DJ的合成(OBN和胆碱成盐)

N₂保护下，室温将OBN(1g 0.0019mol 1eq)和纯化水(10ml)加入100ml 单口瓶中，反应室温，再将50％胆碱水溶液(0.223g 0.0019mol 1eq)滴加到反应液中，冰浴控温，滴毕改为室温搅拌。继续搅拌2-5h，停止反应。反应液直接旋干，用甲醇置换水，得到无定形的OBN-DJ。

实施例2 FXR激动活性测定

FXR配体结合区(第105至472氨基酸)与COOH-末端谷胱甘肽转移酶(GST) 融合，融合GST-FXR蛋白通过大肠杆菌表达，并通过谷胱甘肽玻璃珠纯化。对于FRET测试，将铕标记的抗GST[anti-GST—(Eu)](Wallac,Gaithersburg,MD)标记GST-FXR，类固醇受体辅激活因子-1(SRC-1，氨基酸595至822)用6聚组氨酸标记，并通过大肠杆菌表达，经过离子色谱纯化后进行生物酰化并通过别藻蓝素荧光蛋白(APC)标记并与链霉亲和素共轭结合。当配体介导的FXR构象对SRC-1亲和力发生变化，使得能量从铕(337nm激发波长和620nm发射波长)转移至APC(620nm激发波长和665nm发射波长)，在溶液中会发生荧光共振能量转移，结果通过APC与铕的荧光比例表示。向黑色聚丙烯96孔板中，每孔加入10nM GST-FXR，100nM生物素-SRC1抗GST—(Eu)(0.2mg/ml)，APC- 亲和素(1mg/ml)以及溶于100mL溶液[100mM Hepes(pH7.6),0.125％CHAPS， and 125mM NaF]化合物。将上述反应物混合4℃反应12小时。通过Victor II plate reader(Wallac)读取荧光值。

ELISA实验，1.5mM生物素标记的肽段(氨基酸序列： Ile-LeuArg-Lys-Leu-Leu-Gln-Glu)与100nM GST-FXR及溶于100mL溶液[25mM tris-HCl(pH 7.4)和150mM NaCl]化合物在96孔板中孵育1h。然后清洗96孔板并加入兔抗GST抗体进行孵育。与链霉亲和素结合的GST-FXR通过辣根过氧化物标记的抗兔抗体检测定量。

结果：见表1，OBA和OBN-DJ的EC₅₀值相当。

表1 FXR激动活性

化合物	EC₅₀(μM)
		OBA	0.11
OBN-DJ	0.097

实施例3 PBC模型

32只SPF级6～8周龄SD大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物饲养在SPF动物房内，动物房通风良好，装备空调，温度保持在20～25℃，湿度保持在40％～70％，换气次数10～15次/h，明暗照明各12小时，实验动物自由进食和饮水，每只大鼠均用耳标标记。将大鼠按照体重随机分为2组：胆管结扎组24只，假手术组8只。胆管结扎组大鼠过夜禁食后，腹部剃毛，使用异氟烷吸入麻醉动物，腹部消毒并沿腹中线切开，暴露并游离胆总管，将其远心端三段结扎，于远心端第二、三结扎线之间剪断，缝合腹部。假手术组仅沿腹中线切开腹腔，游离胆总管，缝合腹部。手术后一周，按照体重将胆管结扎组大鼠随机分为三组：模型组，OBA组和OBN-DJ组。模型组和假手术组灌胃给予10mL/kg 0.5％CMC-Na，OBA组灌胃给予5mg/kg OBA，OBN-DJ组灌胃给予OBN-DJ 7.5 mg/kg(与OBA等摩尔剂量)。给药4周后，用2％戊巴比妥钠麻醉动物，下腔静脉取血后分离血清，测定ALP(碱性磷酸酶)和TBIL(总胆红素)。取肝右叶置于10％中性福尔马林中固定，脱水、包埋，切片后制作HE和胶原染色，对肝纤维化程度评分：门管区纤维组织无增生“-”；增生面积占肝小叶1/3以下为“+”；占肝小叶1/3～2/3为“++”；占肝小叶2/3以上为“+++”。每个“+”记1分，每个标本记总分。使用SPSS软件的单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较。

结果：见表2和表3，OBA和OBN-DJ与模型组相比，有显著性差异，均能显著降低胆管结扎导致的胆汁淤积性肝硬化模型大鼠血清ALP和TBIL水平，并显著改善肝纤维化评分，OBA和OBN-DJ相比，没有显著性差异，治疗PBC 的效果相当。

表2 大鼠血清中ALP，ALT，AST和TBIL水平

“**”与模型组相比，p＜0.01，有显著性差异

“#”与OBA相比，p＞0.05，没有显著性差异

表3 肝纤维化评分

组别	剂量(mg/kg)	评分
			假手术组	NA	0
模型组	NA	9.3
			OBA	5	5.5**
OBN-DJ	7.5	5.1**#

“**”与模型组相比，p＜0.01，有显著性差异

“#”与OBA相比，p＞0.05，没有显著性差异

实施例4NASH模型

32只SPF级雄性C57BL/6小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验动物饲养在SPF动物房内，动物房通风良好，装备空调，温度保持在20～25℃，湿度保持在40％～70％，换气次数10～15次/h，明暗照明各12小时，实验动物自由进食和饮水，每只小鼠均用耳标标记。随机取8只作为空白对照组，给予MCS (蛋氨酸-胆碱缺乏对照饲料，购自南通特洛菲饲料科技有限公司)饲料配对饲养，空白对照组小鼠饲料按照模型组前48小时食量给予。其余24只小鼠给予 MCD(蛋氨酸-胆碱缺乏饲料，购自南通特洛菲饲料科技有限公司)饲料复制非酒精性脂肪肝炎模型。模型复制给予第一周适应性饲养，实验开始第1、2天(MCD饲料：MCS饲料＝1:2)，实验开始第3、4天(MCD饲料：MCS饲料＝1:1)，实验开始第5、6天(MCD饲料：MCS饲料＝2:1)，实验开始第7天完全给以MCD 饲料。所有48小时后未食用完实验饲料丢弃处理。造模2周后，将24只动物根据体重采用随机区组方法分成3组：模型组、OBA组和OBN-DJ组。空白对照组和模型组灌胃给予10mL/kg 0.5％CMC-Na，OBA组灌胃给予5mg/kgOBA， OBN-DJ组灌胃给予OBN-DJ 7.5mg/kg(与OBA等摩尔剂量)。给药4周后，用 2％戊巴比妥钠麻醉动物，下腔静脉取血后分离血清，测定AST(谷草转氨酶) 和ALT(谷丙转氨酶)。采集的肝脏组织右叶沿正中线剖开，一部分沿外缘切取 2块约5mm×5mm大小的组织块置于10％中性缓冲福尔马林溶液中固定，将所有组动物的肝脏组织从10％中性缓冲福尔马林溶液固定液中移出，进行取材、脱水、石蜡包埋、切片，HE染色和镜检。另一部分沿外缘切取2块约5mm×5mm 大小的组织块于液氮中固定，将所有组动物的肝脏组织从液氮中取出，进行冰冻切片(10μm厚)，依照常规方法，60％异丙醇漂洗2min、油红O工作液染色10min、 60％异丙醇分化漂洗，水洗、Fluoromount-G水溶性封片剂封片。组织病理学评分标准依据美国国立卫生研究院非酒精性脂肪性肝炎临床研究网病理工作组2005 年所制定的标准，即非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活动度积分(NAFLD activity score，NAS)。具体评分标准：该组织学评分系统包括14项病理改变，其中4项指标进行了半定量评估：肝脂肪变(steatosis)：0～3分、小叶内炎症(hepatocyte ballooning)：0～2分、肝细胞气球样变(lobularinflammation)：0～2分、肝纤维化：0～4分，其余指标“有或无(1/0)”表示。根据前3项计算NAS值。使用 SPSS软件的单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较。

结果：见表4和表5，OBA和OBN-DJ能显著降MCD诱导NASH模型大鼠血清ALT和AST水平，并显著改善肝脏病理NASH评分。

表4 大鼠血清中ALT和AST水平

组别	剂量(mg/kg)	ALT(U/L)	AST(U/L)
				假手术组	NA	38.6	113
模型组	NA	85.4	259
				OBA	5	62.1**	183**
OBN-DJ	7.5	53.8**#	172**#

“**”与模型组相比，p＜0.01，有显著性差异

“#”与OBA相比，p＞0.05，没有显著性差异

表5 NASH评分

“**”与模型组相比，p＜0.01，有显著性差异

“#”与OBA相比，p＞0.05，没有显著性差异

实施例5瘙痒模型

32只SPF级雄性ICR小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验动物饲养在SPF动物房内，动物房通风良好，装备空调，温度保持在20～25℃，湿度保持在40％～70％，换气次数10～15次/h，明暗照明各12小时，实验动物自由进食和饮水，每只小鼠均用耳标标记。按照体重将小鼠随机分为四组：空白组、模型组、OBA组和OBN-DJ组。空白组和模型组动物灌胃给予10mL/kg 0.5％CMC-Na，OBA组灌胃给予150mg/kg OBA，OBN-DJ组灌胃给予OBN-DJ 225mg/kg(与OBA等摩尔剂量)，每天给药1次，连续给药7天。于给药第4 日和第7日给药2h后，模型组、OBA组和OBN-DJ组动物颈背部皮下注射48/80 化合物(刺激肥大细胞脱颗粒)10μg/只，空白对照组颈背部注射同样体积PBS缓冲液。皮下注射48/80化合物后，每只小鼠单笼录像30min，记录搔抓次数，并进行统计分析。注意：录像时注意房间关闭，杜绝任何干扰，以免影响小鼠行为。使用SPSS软件的单因素方差分析(ANOVA)进行组间比较。

结果：见表6，与OBA组相比，OBN-DJ组能显著减少48/80诱导的瘙痒模型小鼠抓挠次数。

表6 抓挠次数

组别	剂量(mg/kg)	抓挠次数(第4天)	抓挠次数(第7天)
				假手术组	NA	12	14
模型组	NA	31	37
				OBA	150	122	143
OBN-DJ	225	52**	64**

“**”与OBA组相比，p＜0.01，有显著性差异。

Claims

1.一种如下所示的化合物：

2.如权利要求1所述的化合物在制备作为FXR激动剂的药物中的用途；在制备治疗PBC的药物中的用途；在制备治疗NASH的药物中的用途；在制备治疗PSC的药物中的用途；在制备治疗门静脉高压的药物中的用途；在制备治疗胆汁酸性腹泻的药物中的用途。

3.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其为：

(1)奥贝胆酸与牛磺酸反应生成OBN；

(2)OBN与胆碱成盐，得到OBN-DJ。

4.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的化合物及任选的药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的组合物在制备作为FXR激动剂的药物中的用途；在制备治疗PBC的药物中的用途；在制备治疗NASH的药物中的用途；在制备治疗PSC的药物中的用途；在制备治疗门静脉高压的药物中的用途；在制备治疗胆汁酸性腹泻的药物中的用途。