CN109010524A - 紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位作为预防免疫性肝损伤药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位作为预防免疫性肝损伤药物的应用，属于中药医药应用技术领域。实验证明，紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位在作为预防免疫性肝损伤药物，尤其是作为减少TNF‑α或IFN‑γ的对肝损伤的药物中有着广阔的应用前景。本发明为紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位提供了一种新的用途，也为预防免疫性肝损伤提供了一种新的药用来源。通过对紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位对免疫肝损伤的保护作用研究，得出紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位用于保护免疫肝损伤的依据，进一步合理利用紫花地丁药用资源，为紫花地丁作为药品的研发提供数据支撑。

Description

紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位作为预防免疫性肝损伤药 物的应用

技术领域

本发明属于中药医药应用技术领域，具体涉及一种紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位作为预防免疫性肝损伤药物的应用。

背景技术

紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino.的干燥全草，具有清热解毒，凉血消肿之效。用于疔疮肿毒，痈疽发背，丹毒，毒蛇咬伤 。临床上主要用于治疗各种炎症，包括扁慢性前列腺炎、急性或慢性咽炎、盆腔炎、附件炎、阴道炎、皮肤急性化脓性炎症等。紫花地丁的化学成分复杂，主要有黄酮及其苷类、有机酸、酚性、糖类、氨基酸、生物碱、多肽及蛋白质、皂苷、植物多醇、鞣质以及微量元素等多种成分。

现代药理学研究表明其具有抗氧化、抗炎、调节免疫、抗内毒素、抑菌及人类免疫缺陷病毒（HIV）等作用。紫花地丁水煎剂和乙醇提取物乙酸乙酯部位具有明显的抗炎作用。研究表明紫花地丁总碱对鸡新城疫病毒有一定的抗病毒活性。

紫花地丁化学成分研究较多，但少有对紫花地丁临床疗效与成分的种类、药理作用的报道，这些均制约了紫花地丁药用价值的发挥。

发明内容

有鉴于此，有必要提供一种紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位作为预防免疫性肝损伤药物的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术手段是：

一种紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位作为预防免疫性肝损伤的药物的应用。

优选地，紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位作为预防乙型肝炎或丙型肝炎药物的应用。

优选地，所述预防免疫性肝损伤的药物为降低TNF-α或IFN-γ对肝损伤的药物。

优选地，所述药物中，紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位的给药量为3g/kg～12g/kg。

最优地，所述药物中，紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位的给药量为6g/kg。

优选地，所述紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位的制备方法包括以下步骤：

提取：紫花地丁药材以质量浓度为60%乙醇水溶液，紫花地丁与乙醇水溶液的料液比1:20，超声提取，时间为40min，制备紫花地丁药材的乙醇提取物干浸膏；

萃取：得到的干浸膏经正丁醇萃取，取萃取相，即得到紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位。

本发明采用上述技术方案，其有益效果在于：本发明为紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位提供了一种新的用途，也为降低TNF-α或IFN-γ的水平以及预防免疫性肝损伤提供了一种新的药用来源。通过对紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位对免疫肝损伤的保护作用研究，得出紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位用于保护免疫肝损伤的依据，进一步合理利用紫花地丁药用资源，为紫花地丁作为药品的研发提供数据支撑。

紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位能够降低免疫性肝损伤发病过程中起到重要作用的TNF-α、IFN-γ，紫花地丁乙醇提取物的正定醇部位可降低免疫性肝损伤小鼠肝脏组织中TNF-α和IFN-γ含量，通过影响TNF-α和IFN-γ水平有效调节免疫应答，有效改善免疫肝损伤。

附图说明

图1是紫花地丁正丁醇部位对ALT的影响柱状图。

图2是紫花地丁正丁醇部位对AST的影响柱状图。

图3是紫花地丁正丁醇部位对免疫肝损伤小鼠肝组织肝均浆GSH-px的影响柱状图。

图4是紫花地丁正丁醇部位对免疫肝损伤小鼠肝组织肝均浆SOD的影响柱状图。

图5是紫花地丁正丁醇部位对免疫肝损伤小鼠肝组织肝均浆MDA的影响柱状图。

图6是TNF-α 标准品含量曲线图。

图7是IFN-γ 标准品含量曲线图。

图8是紫花地丁正丁醇部位对免疫肝损伤小鼠肝组织TNF-α影响柱状图。

图9是紫花地丁正丁醇部位对免疫肝损伤小鼠肝组织IFN-γ影响柱状图。

图10是紫花地丁正丁醇部位对肝组织病理学的影响显微切片图（其中：A为正常对照组、B为模型组、C为甘利欣组、D为紫花地丁低剂量组、E为紫花地丁中剂量组、F为紫花地丁高剂量组）。

具体实施方式

免疫性肝损伤通常由生物性因素等引起,常见的原因为病毒感染,如临床上乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等病毒的感染,其重要的特征是肝组织内大量的炎症细胞浸润,产生免疫炎症应答,导致免疫反应为基础的肝损伤。病毒性乙型肝炎由HBV感染所致，我国有过亿人携带HBV，其中1/3出现肝损伤的临床表现，HBV已然成为临床上长久以来难以治愈的病毒传染性疾病。

刀豆球蛋白（Con-A）肝损伤模型是由T淋巴细胞介导的免疫肝损伤，是方便并适合深入研究病毒性和免疫性肝损伤的病理机制以及进行治疗药物筛选的理想实验动物模型。该实验模型具有操作简单快速，损伤明显，且具有一定的器官靶向性。

膜脂过氧化反应可以引起细胞代谢和功能障碍甚至死亡，且该反应能通过过氧化引起细胞损伤，过氧化物的分解产物也能引起细胞损伤，丙二醛（MDA）作为膜脂过氧化反应最重要产物之一，其含量常常反应机体内脂过氧化的程度，即细胞损伤的程度。超氧化物歧化酶（SOD）生物体内重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物质，抑制氧自由基反应，保护细胞不受损伤，对抗脂质过氧化反应的启动。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）是机体内重要的催化过氧化氢分解酶，其催化的还原反应可保护细胞膜结构和功能的完整性。以上三种物质是肝组织抗氧化功能的体现，对肝损伤的预防和保护有着中重要的作用。

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是体内导致Con-A肝损伤的最重要的因素，γ-干扰素（IFN-γ）也在其中发挥了重要作用。TNF-α是T细胞活化后刺激巨噬细胞释放的强促炎细胞因子，可通过促进炎症的发生及通过死亡受体途径激活Caspase启动凋亡程序来损伤肝细胞、诱发肝细胞凋亡。它还能促使炎性基因表达，诱生其他炎性因子，其水平与肝组织损伤的严重程度呈正相关。γ-干扰素（IFN-γ）主要由T细胞及自然杀伤细胞分泌，是激活巨噬细胞增强吞噬能力及杀死自然杀伤细胞内病原的活化剂，同时诱生可溶性细胞间粘附分子增加相关功能抗原结合，从而加重肝损伤。

下面结合紫花地丁正丁醇部位对刀豆蛋白（Con A）所致肝损伤小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）及天冬氨酸氨基转移酶（AST）的测定，对肝损伤小鼠肝脏组织病理学变化的观察，对免疫性肝损伤中肝均浆MDA产生和SOD、GSH-px水平及TNF-α、IFN-γ水平的测定，对本发明做进一步的详细说明，所诉是对本发明的解释而不是限定。

1.Con-A所致免疫肝损伤小鼠模型的建立

1.1 实验动物

SPF级雄性小鼠体重18-22 g由宁夏医科大学实验动物中心提供。于保持通风、干燥、室温22-25℃，湿度50%-70%的动物房自由饮水，鼠料定量饲养。

1.2 试剂和药物

紫花地丁正丁醇部位提取自紫花地丁；甘利欣（正大天晴制药，批号：160517202）；Con-A（sigma公司）；苏木精、伊红等试剂（实验室自备）；ALT、AST试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20170704）；GSH-px、SOD、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20170705）；TNF-α和IFN-γ ELISA试剂盒（伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：AK0018JAN26025，AK0018JAN26026）。

1.3 仪器

酶标仪（Labsystems Multiskan MS ）；DP20-5倒置显微镜（日本 OLYMPUS公司）；离心机（Thermo）；电子计重称（厦门佰伦斯电子科技有限公司）。

1.4 溶剂的配制

紫花地丁正丁醇部位的制备：紫花地丁药材以质量浓度为60%乙醇水溶液，紫花地丁与乙醇水溶液的料液比1:20，超声提取，时间为40min，得到的干浸膏经正丁醇萃取，取萃取相，即得到紫花地丁正丁醇部位。

甘利欣溶液（100 mg/kg）：将适量的甘利欣与0.5%的CMC-Na溶液配制成5 mg/ml的甘利欣溶液。

紫花地丁正丁醇部位高剂量（12.00 g/kg）、中剂量（6.00 g/kg）、低剂量（3.00 g/kg）溶液：将适量的的紫花地丁正丁醇部位干浸膏与0.5%CMC-Na溶液分别配制成浓度为0.6g/ml、0.3 g/ml、0.15 g/ml的紫花地丁正丁醇部位溶液。

1.5 模型分组与建立

SPF级ICR雄性小鼠，适应性喂养三天后，随机分为正常对照组、模型组、甘利欣治疗组（GLX）、紫花地丁正丁醇部位高、中、低剂量给药组（12.00g/kg、6.00g/kg、3.00 g/kg），共计6组，每组10只。正常对照组和免疫肝损伤模型组每日灌胃适量体积CMC-Na溶液，甘利欣治疗组每日灌胃甘利欣100 mg/kg，紫花地丁高剂量组每日灌胃给药紫花地丁正丁醇部位提取物溶液12.00g/kg，紫花地丁中剂量组每日灌胃给药紫花地丁正丁醇部位提取物溶液6.00g/kg，紫花地丁低剂量组每日灌胃给药紫花地丁正丁醇部位提取物溶液3.00 g/kg，每日一次，连续7d。第7d，除正常组外，其他组于灌胃半小时后尾静脉注射Con-A 25.00 mg/kg以造成免疫肝损伤模型。

2.对照组及紫花地丁正丁醇部位剂量组的免疫性肝损伤小鼠模型相关检测

2.1 血清AST和ALT的测定

Con-A注射4h后，观察小鼠精神状态及活动情况，8h后摘小鼠眼球取血，血液4000 r/min离心10 min分离血清，按照AST、ALT试剂盒说明书进行实验，最后于510 nm波长酶标仪测各孔OD值，

其中，绝对OD值=测定孔OD值-对照孔OD值，以绝对OD值查标准曲线求得相应的AST、AST活力单位。

2.2肝均浆谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、的测定

取各个组小鼠同一部位肝组织及表皮组织各0.50 g，分别以重量：体积（g/ml）=1：9比例加入生理盐水于冰上研磨成10%肝组织匀浆及10%表皮组织均浆，4000 r/min离心10分钟后取上清液于超低温冰箱冻存，制备肝组织匀浆及表皮组织均浆，备用。根据GSH-px、SOD测试盒测定肝组织上清液GSH-px和SOD活力，用MDA测试盒测定肝组织上清液MDA含量，测定时按试剂盒操作说明分别进行。

2.3 肝组织均浆及表皮组织均浆肿瘤坏死因子（TNF-α）和γ-干扰素（IFN-γ）的测定

根据TNF-α和IFN-γ酶联免疫吸附测定测试盒说明书制定标准曲线并测定1%肝组织上清液及1%表皮组织上清液的TNF-α和IFN-γ含量，于波长450 nm酶标仪测定各孔吸光度值。

2.4 肝组织病理学检测

取各个组内小鼠肝右叶同一部位，取约1cm×1cm×0.5cm的肝组织，于4%的多聚甲醛中固定，HE染色，光镜下观察肝组织病理损伤情况。

2.5 统计方法

实验数据用统计软件SPSS17.0的one-way ANOVA进行分析，方差不齐时，可采用DunnettT3方法或非参数检验中的2 Independent Samples Tests进行数据处理。

3.紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位对免疫性肝损伤小鼠模型的影响

3.1 紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位对免疫肝损伤小鼠血浆转氨酶水平的影响

请参看图1、图2所示，血浆中的ALT和AST测定结果，其中，Control表示正常对照组、Model表示模型组、GLX表示甘利欣治疗组、BE-L表示紫花地丁低剂量组、BE-M表示紫花地丁中剂量组、BE-H表示紫花地丁高剂量组（下同）。与正常对照组相比#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型组相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

与正常组相比较，模型组血清中ALT，AST的水平显著升高（P<0.01），表明Con-A诱导免疫肝损伤模型建立成功。与模型组比较，紫花地丁正丁醇部位低剂量（P<0.05）、中剂量（P<0.05）、高剂量组（P<0.01）及甘利欣组（P<0.05），均可降低AST水平，紫花地丁正丁醇部位低剂量对于小鼠需求的ALT水平影响没有显著性，而中剂量（P<0.05）、高剂量组（P<0.01）、甘利欣组（P<0.05）均可降低ALT水平。紫花地丁正丁醇提取物高剂量组的AST、ALT水平最低。

3.2 紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位对免疫肝损伤小鼠肝均浆GSH-px、SOD、MDA的影响

请参看图3、图4及图5所示，GSH-px、SOD和MDA的测定结果，模型组小鼠肝组织的GSH-px，SOD活力明显降低，MDA含量则明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01），说明肝损伤动物模型造模成功。与模型组比较，紫花地丁正丁醇提取物低剂量（P<0.05）、中剂量（P<0.01）、高剂量（P<0.05）及甘利欣组（P<0.01）可以提高肝脏SOD活力及肝脏GSH-px活力，各给药组均可以降低肝脏MDA含量（P<0.01）。紫花地丁正丁醇提取物中中剂量在提高肝脏SOD活力、肝脏GSH-px活力及降低肝脏MDA含量中较其他剂量影响大。

3.3 紫花地丁正丁醇部位对免疫性肝损伤小鼠肝组织TNF-α和IFN-γ的影响

请参看图6、图7所示，六个标准品浓度下，小鼠肝组织TNF-α和IFN-γ标准品的含量曲线。

请参看图6，TNF-α标准品浓度为2000.00，1000.00，500.00，250.00，125.00，62.50pg/ml，得到标准品的含量曲线：

y = -6×10^-7x² +0.002x + 0.1474，其中，方差R² = 0.9988。

请参看图7，IFN-γ 标准品浓度为1000.00，500.00，250.00，125.00，62.50，31.25pg/ml，得到标准品的含量曲线：

y = -2×10^-6x² + 0.0038x + 0.0652，其中，方差R² = 0.9985。

请一并参看图8、图9，TNF-α和IFN-γ的测定结果，模型组小鼠肝组织的TNF-α和IFN-γ含量明显升高，差异均有统计学意义（P<0.001）。与模型组比较，在对肝组织中TNF-α的影响中紫花地丁正丁醇提取物低剂量、中剂量、高剂量（P<0.001）能显著降低其含量，甘利欣组的TNF-α显著降低（P<0.001），而在对肝组织中IFN-γ含量的影响中紫花地丁正丁醇提取物低剂量、中剂量（P<0.01）能减低其含量，而高剂量及甘利欣组（P<0.001）均可以显著降低肝脏IFN-γ的含量。其中紫花地丁正丁醇提取物高剂量效果最佳。

同理，紫花地丁正丁醇部位对小鼠表皮组织TNF-α和IFN-γ的降低也具有显著影响。

3.4 肝组织病理学检测结果

肝组织病理学检查表现为，肉眼下免疫肝损伤模型组肝组织肿胀增大，颜色显暗红色，部分小鼠肝组织出现大小不等的坏死斑点，正常组肝脏色泽光滑，显淡粉色，其他组肝组织也稍显肿大，颜色偏暗，但均较模型组轻。

光镜下，请参看图10，如图中A所示，正常组小鼠肝细胞排列规则，肝小叶清晰可见。然而，如图中B所示，Con-A诱导免疫肝损伤小鼠肝小叶结构被破坏，肝细胞体积增大，静脉其及周围肝血窦扩张充血，炎性因子浸润严重，肝细胞出现严重脂肪变性。如图中C～F所示，阳性药物组即甘利欣组和紫花地丁正丁醇部位治疗组肝小叶结构紊乱，出现炎性因子浸润与脂肪变性较模型组减轻。

综合以上反映肝损伤灵敏指标ALT和AST的测定、抗脂质过氧化环节相关的GSH-px、SOD和MDA的测定、在免疫性肝损伤发病过程起到重要作用的TNF-α和IFN-γ含量测定结果，与模型组比较，紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位可降低AST、ALT水平，表明紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位能缓解小鼠的肝功能损伤情况，减轻Con A所致肝损伤的炎症反应；紫花地丁正丁醇部位可升高免疫性肝损伤中肝组织的GSH-px及SOD的活力，降低MDA 含量，证明紫花地丁正丁醇部位具有保护肝氧化性损伤，改善机体抗氧化能力的作用；紫花地丁正丁醇部位提取物各剂量组均可降低肝脏TNF-α和IFN-γ含量，通过影响TNF-α和IFN-γ水平有效调节免疫应答，这表明紫花地丁正丁醇部位能够有效改善免疫肝损伤，其保护作用与氧化应激和免疫应答等反应有关。进而说明紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位可用于抗免疫性肝损伤药物的制备，进一步地，可应用于预防乙型肝炎或丙型肝炎药物的制备。

以上对免疫性肝损伤各检测指标测定，发现中剂量（6g/kg）在提高肝脏GSH-px、SOD活力及降低肝脏MDA含量中较低剂量（3g/kg）和高剂量（12g/kg）影响大；从降低免疫性肝损伤发病过程中起到重要作用的TNF-α和IFN-γ含量来看，高剂量组的预防效果最佳；从降低免疫性肝损伤血清转氨酶水平来看，高剂量组的预防效果要好于作为对照的甘利欣组（100mg/kg）。

以上所诉，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何人员在本发明披露的技术范围内得到的技术方案的简单变化或等效替换均在本发明的保护范围内。本发明还会有各种发明和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (6)

1.一种紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位作为预防免疫性肝损伤的药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位作为预防乙型肝炎或丙型肝炎药物的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述预防免疫性肝损伤的药物为降低TNF-α或IFN-γ对肝损伤的药物。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物中，紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位的给药量为3g/kg～12g/kg。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物中，紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位的给药量为6g/kg。

6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位的制备方法包括以下步骤：

提取：紫花地丁药材以质量浓度为60%乙醇水溶液，紫花地丁与乙醇水溶液的料液比1:20，超声提取，时间为40min，制备紫花地丁药材的乙醇提取物干浸膏；

萃取：得到的干浸膏经正丁醇萃取，取萃取相，即得到紫花地丁乙醇提取物的正丁醇部位。