CN109009236A - 一种人体呼出气体采集装置及采集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人体呼出气体采集装置及采集方法。该装置在保温套包裹的采集管前端连接吹嘴,靠近前端处设有连接合成空气容器的进气旁路,合成空气经活性炭过滤管和气体流量控制器后导入采集管;靠近采集管末端处设有压力调节旁路;采集管的末端通过管路连接检测仪器或储气袋。本发明采用潮式无创采集方法,保证了采样过程中受试者的非受迫性,也保证了采集气体和实际呼出气体较高的一致性,避免了外界空气的干扰;相比于面罩压迫式的采集方法,成本较低,受试者接受程度高,适用于大人群采样。该呼出气采集装置可以配套PTR‑TOF‑MS使用,实现对低浓度和低m/z VOCs的快速分析。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械领域,特别涉及一种呼出气体采集装置和方法,属于卫生学中的样品采集领域。
背景技术
人体呼出气体中挥发性有机物(Volatile Organic Compounds,简称VOCs)的组成与水平能够反映机体的代谢状况,并在过去的二十多年间广泛用于多种肺部疾病,例如肺癌、哮喘、囊性纤维化的辅助诊断研究,也于近些年取得了多项国内外专利。识别中国地区慢性阻塞性肺病(COPD)患者呼出气体中特殊的VOCs成分以辅助疾病诊断的工作越来越受到关注,其原因是:(1)虽然COPD是一种死亡风险排名非常高的肺部慢性疾病,但针对COPD患者呼出气VOCs开展分析的研究非常稀少,特别是在中国地区;(2)临床上所采用的COPD诊断方法存在有创性、灵敏度低、主观因素强、成本高等缺点,为了降低COPD诊断失误率并对疾病实现连续的监控,呼出气VOCs的使用很可能成为一种无创低成本快速的辅助诊断方法。
目前已有的用于COPD特征呼出气VOCs采集的装置大致有两种:第一种是使用特氟龙(Tedlar)气袋直接进行被采集者的呼出气收集,但这样处理无法排除外界VOCs吸入对于呼出气VOCs的影响,这种影响在环境VOCs浓度暴露水平较高的中国地区显得尤为显著。第二种是使用面罩法进行被采集者的呼出气收集,但这种方法成本较高,操作耗时、复杂,并不适用于大人群的疾病诊断及呼出气VOCs研究工作。另外,质子转移反应-飞行时间质谱(PTR-TOF-MS)应用于COPD人群呼出气VOCs的分析具有独特的优势:分析时间周期短,VOCs物种损失比例小,对与疾病相关性较强的低浓度和低荷质比(m/z)的VOCs分析能力非常强等。但该仪器用于人群呼出气的检测也存在一些问题,包括呼出气中水蒸气含量过高,影响仪器检测的准确性;呼出气中部分VOCs浓度水平过高,超过了仪器的检测能力;呼吸过程中不稳定的气压干扰仪器的运行等。上述的气袋式和面罩式呼出气采集方法均无法解决这些问题,限制了PTR-TOF-MS用于COPD人群特征VOCs分析的能力。
当前需要能够配套PTR-TOF-MS,适用于中国地区大人群的低成本、快速、准确、无创、不受环境空气影响的呼出气采集方法和装置,以满足以上要求及其它需要。
已有的呼出气VOCs采集与分析的代表性技术如下:
Van Berkel等人(Van Berkel,J.J.B.N.et al.A profile of volatile organiccompounds in breath discriminates COPD patients from controls.RespiratoryMedicine 104,557-563,doi:10.1016/j.rmed.2009.10.018(2010).)开发的呼出气采集与检测方法操作流程如下:(A)样品采集。使用氮气吹洗过2次的5L特氟龙气袋收集受试者憋气5秒后全力呼出的气体,并将该气体随后转移至气体吸附管中(Marks International,Llantrisant,Wales,UK)。(B)样品检测。将(A)过程得到的吸附管转移至热脱附单元(MarksUnity desorption unit,Marks International Limited,Llantrisant,Wales,UK)并快速升温至270℃,热脱附所得部分气体进入气相色谱(GC)(column:RTX-5ms,30m×0.25mm 5%diphenyl,95%dimethylsiloxane,film thickness 1μm,Thermo Electron Trace GCUltra,Thermo Electron Corporation,Waltham,USA)分离,随后进入时间飞行质谱(TOF-MS)(Thermo Electron Tempus Plus time-of-flight mass spectrometer,ThermoElectron Corporation,Waltham,USA)检测m/z为35-350的VOCs。(C)质谱峰识别。基于GC-TOF-MS导出的原始数据进行自动峰识别和基线校正,随后进行峰匹配及峰面积计算。(D)统计模型构建。该方法采用支持向量机(SVM)进行辅助诊断模型的构建,并最终选取6种COPD患者呼出气中的特征VOCs。
上述方法仍存在以下问题:首先,在该法中受试者需憋气5秒并用力呼出气体,这种有创性的操作降低了该方法的人群适应性和可重复性,并且和受试者正常呼吸产生的呼出气相比,该法得到的呼出气VOCs可能存在较大差异(Sukul,P.,Trefz,P.,Kamysek,S.,Schubert,J.K.&Miekisch,W.Instant effects of changing body positions oncompositions of exhaled breath.Journal of breath research 9,047105(2015);Sukul,P.,Trefz,P.,Schubert,J.K.&Miekisch,W.Immediate effects of breathholding maneuvers onto composition of exhaled breath.Journal of breathresearch 8,037102(2014).)。其次,该法只能配套GC-TOF-MS方法检测呼出气VOCs,其中的热脱附和气相色谱分离步骤均可能导致目标物损失,对低m/z的物种检测能力也较差。最后,该方法时间周期较长,不适合大人群的采样。其他已有的方法同样存在上述之一或多个问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于不同地区大人群的,可耦合质子转移反应-飞行时间质谱(PTR-TOF-MS)进行COPD患者特征VOCs检测的,低成本、快速、无创的呼出气采集方法。
本发明的技术方案如下:
一种呼出气采集装置,包括采集管和吹嘴,吹嘴连接在采集管前端,其特征在于,所述采集管被保温套包裹,在靠近采集管前端的位置设有进气旁路,靠近采集管末端的位置设有压力调节旁路;所述进气旁路连通采集管和合成空气容器,将合成空气导入采集管,在进气旁路上设有气体流量控制器和活性炭过滤管;所述压力调节旁路上设有只允许气体流出的单向阀,用于排出采集管内过多的气体,维持内外压力平衡;所述采集管的末端通过管路连接检测仪器或储气袋,该管路上设有只允许气体流出的单向阀。
上述呼出气采集装置中,优选的,所述采集管长度为300~350mm,外径30~50mm,内径10~15mm。采集管的材料选择抗酸抗碱、抗各种有机溶剂、易清洁的材料,可以是特氟龙、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等,优选特氟龙。
包裹采集管的保温套可以是电加热套,厚度20~40mm,通常由无碱玻璃纤维和金属加热丝编制而成,可控温度范围为25-100℃。
所述吹嘴优选为一次性吹嘴,通常是聚丙烯材料制作的,通过连接螺母等方式固定在采集管前端。
优选的,所述进气旁路距离采集管前端10~30mm,所述压力调节旁路距离采集管末端20~40mm。进气旁路和压力调节旁路的管道外径优选为8~12mm,内径优选为2~4mm,材料可以是特氟龙、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等抗酸抗碱、抗各种有机溶剂、易清洁的材料,优选特氟龙。
所述采集管的末端可以连接储气袋,所述储气袋优选为特氟龙气袋,将采集的呼出气保存,最终进入PTR-TOF-MS等检测仪器进行呼出气的离线检测;所述采集管的末端也可以直接连接PTR-TOF-MS等检测仪器进行呼出气在线检测。
进一步的,在采集管末端连接储气袋和检测仪器管路上设有单向阀,气体只能从采集管流出(反向则不能),进入储气袋或检测仪器。
本发明的呼出气采集装置在使用时,用鼻夹夹住受试者鼻子,受试者采集全程保持稳定的潮式呼吸。吸气时,经过活性炭过滤的合成空气部分被受试者吸入,部分经过压力调节旁路进入大气;呼气时,受试者呼出的气体在采样管内和合成空气进行混合,部分经由单向阀进入储存袋或者检测仪器,其余经压力调节旁路排入大气中,以保持管内压力平衡。
在本发明的一个应用实例中,提供了使用该呼出气采集装置离线采集人体呼出气,并配合PTR-TOF-MS进行呼出气VOCs检测,以及筛选COPD患者特征性VOCs的具体方法,其中包含:使用呼出气采集装置将呼出气采集入特氟龙气袋中保存,随后使用PTR-TOF-MS检测其中的VOCs成分与水平。在另一个应用实例中,本发明提供在线采集人体呼出气,并使用PTR-TOF-MS检测其中VOCs成分与水平的具体方法。
本发明提供的呼出气采集装置有如下优点:(1)适用于不同地区大人群的呼出气VOCs采样。呼出气采集装置成本较低,可重复使用,在采样过程中能有效隔绝外界空气,保证了采集气体和实际呼出气体较高的一致性,避免了外界空气的干扰。(2)在采集过程中将呼出气体进行稀释,产生的低湿度混合气体有利于PTR-TOF-MS检测的准确性,通过与PTR-TOF-MS直接耦合实现对呼出气VOCs快速、准确的测量。(3)实现采样过程无创化。相比通过“呼吸面罩”采样和直接采样方法,使用本发明的呼出气采集装置采样可最大限度使受试者保持正常呼吸方式,因此在采样过程中受试者不会有受迫感,受试者接受程度高。
本发明的呼出气采集装置耦合PTR-TOF-MS之后有多方面用途:一方面,上述系统可以低成本、快速、无创地实现对低浓度和低m/z VOCs的快速分析,从而实现对COPD等疾病的辅助诊断、严重程度的连续监测及疾病早期筛查;另一方面,在某些情况下上述系统可用于检验药物治疗的成效。
本发明涉及的部分术语如下表所示:
附图说明
图1是本发明实施例的呼出气采集与检测系统示意图,包括呼出气采集装置和VOCs检测仪器PTR-TOF-MS,其中:
1.一次性吹嘴;2.采集管;3.电加热套;4.压力调节旁路;5.进气旁路;6-1.第一单向阀(出);6-2.第二单向阀(出);7.气体流量控制器;8.活性炭过滤管;9.可吸入合成空气容器;10.特氟龙气袋;11.质子转移反应-飞行时间质谱仪;12.连接螺母。
图2显示了本发明应用实例一中质谱峰识别的一个例子。
图3显示了本发明应用实例一中清洗次数对于特氟龙气袋内残留气体的影响。
图4显示了本发明应用实例一中储存时间对于特氟龙气袋内残留气体水平的影响。
图5是本发明应用实例一中离线采集、检测某受试者呼出气的结果。
图6是本发明应用实例一中离线检测不同受试者三次呼出气VOCs的结果。
图7是本发明应用实例一中用ROC曲线评价使用VOCs识别COPD的结果。
图8是本发明应用实例二中某受试者呼出气VOCs在线检测结果。
图9是本发明应用实例二中在线检测不同受试者两次呼出气VOCs的结果。
具体实施方式
下面结合附图,通过实施例进一步详细描述本发明,但不以任何方式限制本发明的范围。
如图1所述,该呼出气采集装置包括一次性吹嘴1、采集管2、电加热套3、压力调节旁路4和进气旁路5。聚丙烯制作的一次性吹嘴1通过连接螺母12固定在采集管2的前端,采集管2的末端连接特氟龙气袋10和质子转移反应-飞行时间质谱仪11,在采集管2末端与储气袋10和质子转移反应-飞行时间质谱仪11的连接管路上设有只允许气体流出的第二单向阀6-2。采集管2长320mm,外径40mm,内径13mm,材料为特氟龙。电加热套3包裹采集管2,电加热套3厚度30mm,由无碱玻璃纤维和金属加热丝编制而成,可控温度范围为25~100℃。压力调节旁路2由特氟龙材料制成,外径10mm,内径3mm,距离采集管2末端30mm,在压力调节旁路2上设有只允许气体流出的第一单向阀6-1。进气旁路5也由特氟龙材料制成,外径10mm,内径3mm,距离采集管2前端20mm。进气旁路5连接可吸入合成空气容器9,合成空气通过进气旁路5上的活性过滤管8和气体流量控制器7后进入采集管2。
采集管2表面被电加热套3包裹,以防止采样期间VOCs液化;采集管2由特氟龙材料制备以最大化降低VOCs在管壁的吸附;进气旁路5连接经活性炭过滤的合成空气;压力调节旁路2保证采样期间采集管2内外压力平衡;呼出气在采集管2内混合均匀进入检测设备。
受试者全程吸入经活性炭过滤的合成空气以防呼出气受外界空气干扰,随后将呼出气经采集管2采集进入特氟龙气袋10保存,最终进入PTR-TOF-MS进行离线检测,或者直接进入PTR-TOF-MS进行在线检测。
应用实例一:呼出气VOCs的离线采集与检测用于COPD的辅助诊断
仪器:PTR-TOF-MS(Ionicon Analytik Ges.m.b.H.,Austria),肺功能仪(MicroLab,MEIKO Inc.,UK),特氟龙气袋(Sigma-Aldrich LLC.,USA)。
本实例共招募102人(COPD患者44人,健康对照58人),具体实施方案为:对受试者呼出气中VOCs进行离线采集和检测,通过统计模型探索得到COPD患者特征呼出气VOCs。样品采集与检测时间间隔为2小时。具体实施步骤为:
A.采集受试者的呼出气。实现方法为:
A1.首先检查采样设备是否正常工作,其中包括:电加热套温控系统,采样管路的密闭性,转子流量计,特氟龙气袋等。定期更换颗粒活性炭(保证受试者吸入合成空气中VOCs浓度较低,以降低吸入气体对呼出气体的干扰)。
A2.启动采集管电加热套升温程序,具体操作为:打开电源,将系统温度设置为70℃,加热5分钟采集管内温度可达30℃,随后将系统温度设为45℃,再经10分钟管内温度稳定至40-45℃;
A3.打开合成空气气阀,对采样管路进行吹洗。建议将吹洗气流量调至0.2-0.4m3/h(合成空气气阀在样品采集过程中会处于常开状态,目的是对呼出气体,尤其是水蒸气等进行稀释,以避免影响仪器的检测灵敏度。稀释比可通过合成空气流量(Q)与潮气量(TV)和呼吸频率(FR)计算得到)。
A4.采样前首先询问受试者有无禁食(进食后人体代谢发生较大变化)。随后指导受试者进行潮式呼吸练习。具体操作为:将合成空气流量调至0.6m3/h,并指导受试者直立就坐,用清水漱口。在采样中要求受试者放松,平稳呼吸。由于呼吸方式对于呼出气中VOCs水平和组成影响较大,因此要在气体采集期间不断提示受试者。随后为受试者佩戴鼻夹和一次性吹嘴(采样过程中受试者全程吸入过滤后的合成空气),指导受试者预先向采集管内呼吸两三口气,排空管内残余气体。
A5.正式采样。具体操作为:检查合成空气流量是否保持在0.6m3/h(在该流量下受试者呼吸较为自然,不会有压迫感)。在采样前告知受试者,若在采样过程中出现不适可举手示意。随后开始正式采样。在采样过程中密切关注合成空气流量变化,并针对此对患者呼吸方式进行指导(理想状况下流量值应比较稳定,若该示数跳动幅度较大,则反映出受试者呼吸不稳定)。受试者的呼出气体会经过呼出气采集管接入一个容积为5L的被黑色遮光材料所严密包裹的特氟龙气袋,以防止VOCs的光解。若有多于1个受试者参与,则后面受试者的采样方式与之前一致。在采完所有受试者样品后,采集当天的空白样品。
A6.完成采样后,需将采集的样本进行测量。在运输过程中应保证该气袋避光、避X射线等。完成每天采样后特氟龙气袋需至少清洗7次(参见图3)。通过实验发现,清洗5次后继续清洗气袋对残留气体水平影响较小,清洗5次、7次、9次后残留气体水平下降缓慢,故确定7次为实验期间气袋清洗的最小次数。样品采集与分析的时间间隔应尽量保证在两小时内(参见图4)。实验发现,相比于直接检测,将呼出气储存在袋中2小时后VOCs水平衰减比例在25%以内。基于储存时间对VOCs衰减的影响和实验期间的实际情况,确定2小时为离线法样品采集与检测的时间间隔。由图5可知,离线采集、检测过程中VOCs水平相对稳定,没有趋势性变化,说明呼出气VOCs离线检测方法可靠。由图6可知,不同受试者的呼出气VOCs水平差异较大,且同一受试者的重复样本中VOCs水平差异较小,这也表明了呼出气VOCs离线检测方法的可靠性。
B.肺功能测量
在本方法中肺功能测量的目的是测得受试者在潮式呼吸状态下的TV和FR以用于上述A过程中呼出气稀释比的计算,因此只需测量受试者的平静肺功能。B过程要求与A过程连续进行。当受试者完成呼出气采集后,指导受试者进行肺功能测量,实现方法为:
B1.指导受试者挺胸坐直,不靠背,不翘腿,头部保持正直,佩戴鼻夹,双手握住吹嘴,保持全程用嘴呼吸。
B2.指导受试者进行6-8次潮式呼吸,并开始正式测量。要求受试者放松、平稳地呼吸,与步骤A中呼吸方式保持一致。
B3.稀释比(r)计算
式中:Q为合成空气流量,即步骤A4中的0.6m3/h;TV为潮气量;FR为呼吸频率。步骤C中测得的不同m/z信号强度乘以稀释比可以指代受试者的真正呼出气体中不同m/z信号强度。
C.PTR-TOF-MS检测分析
由于气袋采样结束时压力具有不确定性(高于或低于大气压),为了保护仪器,将系统改成Manual模式,并将PC设置为450mbar;进样流量设置为100sccm;缓慢揉搓特氟龙气袋,混合均匀后连接气袋;缓慢打开阀门直至PC读数为450mbar,此时P Drift维持3.80mbar以达到较高的灵敏度;设置E/N比值为120Td减少碎片化反应,以简化质谱图;设置样品文件名称;检查仪器运行各参数是否正常;开始进样并记录谱图(每1s记录一张谱图,一个样品共检测3min);停止采样。
D.数据分析
D1.质谱峰识别。具体操作为:实际获取的人体呼出气谱图含有数以千计的质谱峰,在同一质荷比出现的峰也往往是由不同质荷比接近的物种共同贡献形成的,实验通过高分辨率(m/Δm>6000)的飞行时间质谱对目标物种进行定性。通过对质谱图的高分辨拟合,仪器能够分离质荷比接近的物种(见图2)。通过该图可知,同一m/z出现的峰往往由不同质荷比接近的物种共同贡献形成,实验通过高分辨率(m/Δm>6000)的飞行时间质谱对目标物种能够实现准确定性。通过对质谱图的高分辨拟合,仪器能够分离质荷比接近的物种。
D2.辅助诊断模型的构建及结果。通过Logistic模型分析得到16种COPD患者呼出气中的特征VOCs。经过ROC曲线的分析,以该16种VOCs为基础构建的新的信号对于COPD的识别正确率为92.3%,敏感度为84.1%,特异性为91.4%(见图7),模型识别性能优良。
应用实例二:呼出气VOCs的在线采集与检测
本实例共招募2人,重复进行多次测量,以比较测量结果的可重复性、个体差异性,论证使用呼出气采集装置在线采集呼出气耦合PTR-TOF-MS测量系统的可靠性。
具体步骤及所用仪器同应用实例一,唯一不同的是流经采集管的呼出气体直接进入PTR-TOF-MS检测。由图8可知,在线检测过程中VOCs水平相对稳定,没有趋势性变化,故在线检测方法可靠。由图9可知,不同受试者的呼出气VOCs水平差异较大,且同一受试者的重复样本中VOCs水平差异较小,表明在线测量人体呼出气的可靠性。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不应用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种呼出气采集装置,包括采集管和吹嘴,吹嘴连接在采集管前端,其特征在于,所述采集管被保温套包裹,在靠近采集管前端的位置设有进气旁路,靠近采集管末端的位置设有压力调节旁路;所述进气旁路连通采集管和合成空气容器,将合成空气导入采集管,在进气旁路上设有气体流量控制器和活性炭过滤管;所述压力调节旁路上设有只允许气体流出的单向阀;所述采集管的末端通过管路连接检测仪器或储气袋,该管路上设有只允许气体流出的单向阀。
2.如权利要求1所述的呼出气采集装置,其特征在于,所述采集管长300~350mm,外径为30~50mm,内径为10~15mm。
3.如权利要求1所述的呼出气采集装置,其特征在于,包裹采集管的保温套是电加热套,厚度为20~40mm,可控温度范围为25-100℃。
4.如权利要求1所述的呼出气采集装置,其特征在于,所述吹嘴为一次性吹嘴。
5.如权利要求1所述的呼出气采集装置,其特征在于,所述进气旁路距离采集管前端10~30mm,管道外径为8~12mm,内径为2~4mm。
6.如权利要求1所述的呼出气采集装置,其特征在于,所述压力调节旁路距离采集管末端20~40mm,管道外径为8~12mm,内径为2~4mm。
7.如权利要求1所述的呼出气采集装置,其特征在于,所述采集管、进气旁路和压力调节旁路的材料是特氟龙、聚乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯。
8.如权利要求1所述的呼出气采集装置,其特征在于,所述储气袋为特氟龙气袋。
9.如权利要求1所述的呼出气采集装置,其特征在于,所述检测仪器为质子转移反应-飞行时间质谱仪。
10.利用权利要求1~9任一所述呼出气采集装置进行呼出气采集的方法,用鼻夹夹住受试者鼻子,受试者采集全程保持稳定的潮式呼吸;吸气时,经过活性炭过滤的合成空气部分被受试者吸入,部分经过压力调节旁路进入大气;呼气时,受试者呼出的气体在采样管内和合成空气进行混合,部分经由单向阀进入储存袋或者检测仪器,其余经压力调节旁路排入大气中,以保持管内压力平衡。
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