CN108977408A - 利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法 - Google Patents

利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108977408A
CN108977408A CN201810927109.8A CN201810927109A CN108977408A CN 108977408 A CN108977408 A CN 108977408A CN 201810927109 A CN201810927109 A CN 201810927109A CN 108977408 A CN108977408 A CN 108977408A
Authority
CN
China
Prior art keywords
maturation
dog
vitro
culture
mother cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810927109.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108977408B (zh
Inventor
郑敏
米继东
赵建平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanchang Police Dog Base Of Ministry Of Public Security
Original Assignee
Beijing Snow Valley Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Snow Valley Biological Technology Co Ltd filed Critical Beijing Snow Valley Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201810927109.8A priority Critical patent/CN108977408B/zh
Publication of CN108977408A publication Critical patent/CN108977408A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108977408B publication Critical patent/CN108977408B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A61D19/04—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for embryo transplantation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/31—Pituitary sex hormones, e.g. follicle-stimulating hormone [FSH], luteinising hormone [LH]; Chorionic gonadotropins

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法，所述方法包括：收集犬卵母细胞，用成熟培养液培养收集的犬卵母细胞进行体外成熟培养，其中成熟培养液是添加10～100μg/ml孕酮的TCM199培养液。

Description

利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法
技术领域
本发明涉及利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法，尤其是涉及利用成熟培养液在体外培养卵母细胞获得体外成熟的犬卵母细胞，然后再与获能精子共培养获得体外受精卵，然后移植入受体母犬获得体外受精犬。
背景技术
犬生殖生理较为特殊，不同于牛、羊等哺乳动物，犬排卵时排出的是处于GV期的未成熟卵母细胞，黄体生成激素(LH)达到峰值后，仍需经过2～5天，最终在输卵管中成熟，因此，很难获得体内成熟的卵母细胞。目前，包括人类在内的许多哺乳动物都可以通过一定途径在体外获得胚胎及后代，但犬与其他哺乳动物不同，犬卵母细胞体外成熟(IVM)率一直不高，平均MII(成熟卵子)率为10％～20％，极大限制了犬体外胚胎生产，冷冻保存及细胞核移植等的发展，也限制了犬体外受精(IVF)技术的发展。
为了提高犬卵母细胞的体外成熟率，科研工作者进行了一系列的研究，首先从母犬自身条件出发，考虑不同生殖周期对犬IVM的影响，分别收集处于不同生殖周期的母犬卵巢，根据卵巢状态进行分类后评估母犬卵母细胞体外成熟率。其次，还考虑了不同的培养基对IVM的影响，分别研究尝试了DMEM、TCM199、输卵管合成液(Synthetic Oviduct Fluid，mSOF)、M171等的基础培养基。此外，研究者还尝试通过模拟犬卵母细胞的体内成熟微环境来改善体外成熟(IVM)。
Rodrigues等首次证实犬IVF胚胎可以在体外低氧环境(5％O2)中进行培养。其中，Saikhun等利用切割法收集犬卵母细胞后进行体外培养，在mSOF中培养48h后，与冷冻解冻的精子进行受精，其中，在mSOF中培养的胚胎发育至2cell，3～4cell和5～7cell的卵裂率分别达到33.6±1.2％，24.7±0.5％和15.1±2.2％，然而没有一个胚胎发育超过8～16细胞阶段。Rodrigues等同样使用IVM的卵母细胞进行IVF试验，利用卵裂率来作为判断标准，他们收集来自不同生殖阶段卵巢的卵母细胞，挑选形态学质量较高的卵母细胞在体外成熟48h后与新鲜犬精子共培养进行IVF，其中发育成早期胚胎的卵母细胞所占比例为10.1％(27/267)，但是Rodrigues等并未获得健康的幼犬。Otoi等探索了进行IVF的犬卵母细胞最佳成熟时间，结果发现IVF后犬卵母细胞体外发育的最佳时间为48h，与卵母细胞最佳成熟时间(72h)不一致，但是，同样Otoi等也没有获得健康的幼犬。
Nagashima等报道了犬IVF的第一次活产，共19枚冷冻复苏后胚胎通过胚胎移植入受体母犬输卵管内，最终通过剖腹产术获得7只健康幼犬，但是，Nagashima等是通过体内成熟的卵母细胞经体外受精后获得健康幼犬。
因此，到目前为止，现有技术中成功制备体外受精(IVF)犬的方法都是利用体内成熟的卵母细胞，这样的方法需要对供体母犬进行发情鉴定，判断卵母细胞所处的成熟阶段，因此对发情鉴定技术要求较高，同时存在发情鉴定准确率较低等问题。具体来说，一般情况下，发情鉴定准确率在60％左右，试验成功率较低。而且，由于需要使用自然发情母犬作为卵母细胞供体，因此实验成本大大增加，也极大限制了犬体外受精(IVF)技术的发展和应用。
发明内容
本发明利用体外成熟的犬卵母细胞制备体外受精犬，通过对体外成熟(IVM)技术的优化，提高了犬成熟卵母细胞的获得率，降低了成本，并且操作简单，可以实现体外受精犬技术的广泛应用。
第一方面，本发明提供了制备体外成熟卵母细胞的方法，所述方法包括：收集犬卵母细胞，用成熟培养液培养收集的犬卵母细胞进行体外成熟培养，其中成熟培养液是添加10～100μg/ml孕酮的TCM199培养液。
所述卵母细胞的供体是从动物医院收取的正常绝育犬的卵巢，并且犬卵母细胞为卵丘卵母细胞复合体(COCs)。所述COCs是包裹2层以上的卵丘细胞，并且卵母细胞的直径＞110μm，胞质呈均匀黑色
犬卵母细胞的成熟培养是采用成熟培养液的微滴培养法，微滴大小为100μl，以矿物油覆盖，每滴放置20个COCs。培养时间为48-96小时，每24小时更换培养液，优选地，培养时间为72小时。
优选地，所述成熟培养液配方如下：
9ml的TCM199(货号11150，购自Gibco)+1ml FBS(胎牛血清，购自Gibco)+1mM半胱氨酸+0.2mM丙酮酸钠+8IU促卵泡素+2IU促黄体素+100μL双抗(Penicillin-Streptomycin)+40μg/ml孕酮。
第二方面，本发明提供了制备体外受精犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)收集犬卵母细胞，用成熟培养液培养收集的犬卵母细胞进行体外成熟培养；(2)采集精子以及进行精子的体外获能；(3)将培养至成熟的犬卵母细胞与体外获能的精子共培养受精；(4)将体外成熟的卵母细胞与获能精子共培养获得体外受精的受精卵，并将体外受精的受精卵移植到发情受体母犬未冲卵一侧的输卵管中，从而制备体外受精(IVF)犬，其中成熟培养液是添加10～100μg/ml孕酮的TCM199培养液。
在步骤(1)中，所述卵母细胞的供体是从动物医院收取的正常绝育犬的卵巢，并且犬卵母细胞为卵丘卵母细胞复合体(COCs)。所述COCs是包裹2层以上的卵丘细胞，并且卵母细胞的直径＞110μm，胞质呈均匀黑色。
犬卵母细胞的成熟培养是采用成熟培养液的微滴培养法，微滴大小为100μl，以矿物油覆盖，每滴放置20个COCs。培养时间为48～72小时，每24小时更换培养液，优选地，培养时间为72小时。每次换液前应将新的培养液在培养箱中至少孵育2h，换液时用新的成熟液润洗至少3次。
所述成熟培养液配方如下：
9ml的TCM199(货号11150，购自Gibco)+1ml FBS(胎牛血清，购自Gibco)+1mM半胱氨酸+0.2mM丙酮酸钠+8IU促卵泡素+2IU促黄体素+100μL双抗(Penicillin-Streptomycin)+40μg/ml孕酮。
所述精子的体外获能是用精子获能液清洗精液，并置于37.5℃，5％CO2培养箱中孵育2-4小时进行获能，所述精子获能液为本领域已知的精子获能液。优选地，所述精子获能液的配方如下：
NaCl粉末488.0mg，KCl粉末35.6mg，CaCl2·2H2O粉末25.1mg，MgCl2·6H2O粉末20.3mg，KH2PO4粉末16.2mg，丙酮酸钠2.8mg，葡萄糖50mg，HEPES粉末595.75mg，溶于60mL超纯水中，用磁力搅拌器充分混匀溶解，再加入1mL青霉素钠和硫酸链霉素，0.1mL酚红，调节pH值为7.8，转入100mL容量瓶中进行定容，使渗透压保持在280～320mOsm。
从公犬获得的精液用精子获能液清洗3次后，用精子获能液重悬精子，将精子密度调节到7.5×106/mL，置于37.5℃，5％CO2培养箱中孵育2-4小时进行获能。优选地，孵育2.5小时进行获能。所述公犬为希诺谷基地第6、7和8号公犬。
在卵母细胞体外成熟48～96小时后，优选地72小时后，挑选形态质量较好的体外成熟卵母细胞与1×106/mL获能精子加入微滴中共培养12～16小时进行体外受精(1VF)，所述微滴是以mSOF做100μL微滴，以矿物油覆盖，在温箱预平衡2h制备。优选地，体外成熟卵母细胞与获能精子在微滴中共培养14小时。
将完成体外受精的受精卵转移至信达mSOF微滴中进行培养。
将体外受精卵胚胎移植到孕酮值达到4～7ng/ml后72～120小时的发情受体母犬的未冲卵一侧的输卵管中。
第三方面，本发明提供了用于制备体外成熟卵母细胞的成熟培养液，所述成熟培养液是添加10～100μg/ml孕酮的TCM199培养液。
优选地，所述成熟培养液配方如下：
9ml的TCM199(货号11150，购自Gibco)+1ml FBS(胎牛血清，购自Gibco)+1mM半胱氨酸+0.2mM丙酮酸钠+8IU促卵泡素+2IU促黄体素+100μL双抗(青霉素-链霉素)+40μg/ml孕酮。
本发明相对于现有技术最关键的改进就在于成熟培养液中孕酮含量的提高，本发明的成熟培养液中的孕酮含量相比与现有技术中成熟培养液中的孕酮含量提高了大约1000倍，因此，相比于现有技术中没有获得成活的健康幼犬，本发明获得了成活的健康幼犬(共3只，分别命名为牛奶、小黑仔和阿黄)。而且，利用本发明的方法和成熟培养液获得了体外成熟的卵母细胞为进一步在体细胞核中移植的应用提供了基础。还为拯救濒危犬科动物、优良犬种繁育、犬遗传疾病的治疗及人类疾病的研究提供了新的方法。
本发明利用体外成熟犬卵母细胞制备IVF(体外受精)犬，采用绝育母犬卵巢获得卵母细胞后经体外培养成熟再与获能精子共培养得到受精卵，然后移植入受体母犬体内获得IVF犬，极大的降低了动物生产成本。此外，本发明的卵巢可以获自宠物医院中做绝育手术的母犬，母犬如果不做绝育手术，随着年龄的增长很容易患病，所以获得母犬卵巢的成本很低廉，也使进行卵母细胞的体外成熟和体外受精的成本大大降低。在不能成功进行卵母细胞的体外成熟培养并且成功地经体外受精获得健康幼犬的条件下，即使有低廉的母犬卵巢，也没有应用价值，本发明使得这些成本低廉的母犬卵巢的应用成为可能，尤其是对于濒危的犬、优良犬的繁育提供了新的方案。
缩略语和关键术语定义：
IVM(体外成熟)：在体外将未成熟卵母细胞培养成熟的方法。
IVF(体外受精)：在体外条件下将成熟卵母细胞与获能精子共培养以获得受精卵的方法。
COCs(卵丘卵母细胞复合体)：切割绝育母犬卵巢获得的卵母细胞和卵丘细胞的复合体，包含有完整的遗传物质，用于体外受精。
ICSI(单精子胞浆显微注射)：是使用显微操作技术将精子注射到卵细胞胞浆内，使卵子受精，体外培养到早期胚胎，再放回母体子宫内发育着床。
mSOF(合成输卵管液)：配制方法是：用分析天平称取NaCl粉末0.6g，KCl粉末0.05g，NaHCO3粉末0.2g，KH2PO4粉末0.016g，乳酸钙0.06g，葡萄糖0.027g，CaCl2·2H2O粉末0.025g，MgCl2·6H2O粉末0.01g，丙酮酸钠0.0033g，谷氨酰胺0.015g，胰岛素5μg，转铁蛋白2.75μg，硒2.5ng溶于60mL超纯水中，然后添加1％的非必须氨基酸和2％必须氨基酸。最后定容于100mL容量瓶，然后用0.22μm滤器进行过除菌过滤。使用前按4mg/mL加入BSA，待完全溶解后，再次过滤。按1mL进行分装，于4℃保存备用。
精子获能液的配方如下：
NaCl粉末488.0mg，KCl粉末35.6mg，CaCl2·2H2O粉末25.1mg，MgCl2·6H2O粉末20.3mg，KH2PO4粉末16.2mg，丙酮酸钠2.8mg，葡萄糖50mg，HEPES粉末595.75mg，溶于60mL超纯水中，用磁力搅拌器充分混匀溶解，再加入1mL青霉素钠和硫酸链霉素，0.1mL酚红，调节pH值为7.8，转入100mL容量瓶中进行定容，使渗透压保持在280～320mOsm。
附图说明
图1：是利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精幼犬(从上到下分别为牛奶、阿黄和小黑仔)及代孕母犬(586)的合影。
图2：是利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精幼犬(从左到右依次为阿黄、小黑仔和牛奶)合影。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
实施例：
1.犬卵母细胞的收集及体外成熟
从动物医院收取健康母犬绝育卵巢，置于盛有添加了青霉素钠和硫酸链霉素的37℃无菌生理盐水的保温杯中，在3小时内尽快运送回实验室。收到试验样品后，用无菌剪刀和镊子仔细分离卵巢组织，尽可能将卵巢周围的结缔组织和脂肪清理干净，然后将卵巢转入50mL离心管中，用预先加热至37℃的无菌生理盐水润洗三次。将清洗过的卵巢组织放入置于37℃恒温台上的盛有HM的培养皿中，用无菌刀片切割卵巢，尽量释放卵母细胞。然后在体视显微镜下挑选COC，挑选标准为：包裹2层以上卵丘细胞，卵母细胞直径＞110μm，胞质呈均匀黑色。将COC转入成熟培养液中，润洗至少3次后进行培养。
卵母细胞的成熟培养采用微滴培养法，微滴大小为100μL，成熟培养液为添加40μg/mL浓度孕酮的TCM199培养液，以矿物油覆盖，每滴放置20个COC，培养时间为72h，每24h换液，成熟培养液需现用现配，每次换液前应将新的培养液在培养箱中至少孵育2h，换液时用新的成熟液润洗至少3次。
成熟培养液的具体配方如下：
9ml的TCM199(货号11150，购自Gibco)+1ml FBS(胎牛血清，购自Gibco)+1mM半胱氨酸+0.2mM丙酮酸钠+8IU促卵泡素+2IU促黄体素+100μL双抗(青霉素-链霉素)+40μg/ml孕酮。
实验共收集诱导发情母犬卵巢38对，按照收集标准纳入试验卵母细胞1263枚。用不同浓度孕酮统计试验结果如表1所示。
2.精子采集及精液获能
在采精前用生理盐水和喷洒酒精的湿纱布对公犬进行充分清洁和消毒，保证无菌条件操作，人工采集精液后转移入实验室，取新鲜精液在倒置相差显微镜下观察精子活力，活力＞90％方可进行试验；然后取新鲜精液750rpm离心1min，除去碎屑、杂质，取上清于新的离心管；添加3倍体积精子获能液进行清洗，3000rmp离心5min，沉淀精子；弃掉上清，用精子获能液重悬精子，重复上述步骤，清洗三次；再次用精子获能液重悬精子，在显微镜下对精子密度进行计数；根据计数结果，调整精子密度为7.5×106/mL，置于37.5℃，5％CO2培养箱孵育2.5h进行获能。
所述精子获能液的配方如下：
NaCl粉末488.0mg，KCl粉末35.6mg，CaCl2·2H2O粉末25.1mg，MgCl2·6H2O粉末20.3mg，KH2PO4粉末16.2mg，丙酮酸钠2.8mg，葡萄糖50mg，HEPES粉末595.75mg，溶于60mL超纯水中，用磁力搅拌器充分混匀溶解，再加入1mL青霉素钠和硫酸链霉素，0.1mL酚红，调节pH值为7.8，转入100mL容量瓶中进行定容，使渗透压保持在280～320mOsm。
3.体外受精
体外成熟卵母细胞的IVF(体外受精)：用mSOF做100μL微滴，以矿物油覆盖，在温箱预平衡2小时，挑选体外培养48小时，形态质量较好的卵母细胞和1×106获能精子加入微滴中，共培养14h。将完成IVF(体外受精)的卵母细胞转移至新的mSOF微滴中进行培养。剩余IVM(体外成熟)卵母细胞脱卵丘，体视显微镜下观察是否成熟，记录卵母细胞的卵裂率，卵裂率为75.38±1.99。
4.母犬发情鉴定
本研究共使用受体犬6只，发情鉴定采用阴道涂片及血清孕酮检测。进入发情期的母犬，每天抽取3mL血液，离心分离血清，采用孕酮检测仪器检测孕酮含量，当孕酮值达到4～7ng/mL是认为其处于排卵期，排卵后72～120h进行手术，移植IVF胚胎。在进行孕酮检测的同时进行阴道涂片检测，采用长度为5cm的棉棒用生理盐水浸润后插入阴道，然后将提取物涂至载玻片，用吉姆萨染液染色后，在显微镜下技术阴道上皮细胞角化程度，但角化程度大于80％时认为其处于排卵期。
5.胚胎移植
受体犬麻醉后，选择未冲卵一侧腹壁侧切，暴露未冲卵的卵巢组织，将子宫及卵巢牵出。将克隆胚胎吸入胚胎移植管中，从输卵管伞部插入胚胎移植管，将胚胎植入受体体内。共进行胚胎移植6次，移植受体6只，出生健康幼犬合计12只。
胚胎移植后25天进行B超检测，共有3只受体怀孕，共产下健康幼犬12只(参见下表2)。
表2：IVM～IVF胚胎移植结果
受体犬编号 移植受精卵数 产仔数
233 4 0
295 4 6
285 7 2
440 2 0
546 6 0
586 10 3
合计 33 11
幼犬出生后，分别采集精液供体公犬(6号)、受体母犬(586)、幼犬(牛奶、小黑仔、阿黄)血液进行鉴定。将样品送南昌警犬基地进行微卫星鉴定。
鉴定结果如下表所示：
表3由体外成熟卵母细胞获得的IVF幼犬微卫星鉴定结果
根据孟德尔遗传规律，牛奶、小黑仔和阿黄样品与6好公权基因座数据匹配，99％存在亲子关系。牛奶、小黑仔和阿黄样品与代孕母犬586多个STR位点不符合孟德尔遗传定律，排除亲子关系。

Claims (10)

1.制备体外成熟卵母细胞的方法，所述方法包括：收集犬卵母细胞，用成熟培养液培养收集的犬卵母细胞进行体外成熟培养，其中成熟培养液是添加10～100μg/ml孕酮的TCM199培养液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述卵母细胞的供体是绝育犬的卵巢，并且犬卵母细胞为卵丘卵母细胞复合体(COC)，所述COC是包裹2层以上的卵丘细胞，并且卵母细胞的直径＞110μm，胞质呈均匀黑色。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于犬卵母细胞的成熟培养是采用成熟培养液的微滴培养，微滴大小为100μl，以矿物油覆盖，每滴放置20个COCs，培养时间为48-96小时，每24小时更换培养液，优选地，培养时间为72小时，每次换液前应将新的培养液在培养箱中至少孵育2小时，换液时用新的成熟液润洗至少3次。
4.制备体外受精犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)收集犬卵母细胞，用成熟培养液培养收集的犬卵母细胞进行体外成熟培养；(2)采集精子以及进行精子的体外获能；(3)将培养至成熟的犬卵母细胞与体外获能的精子共培养受精；(4)将体外成熟的卵母细胞与获能精子共培养获得体外受精的受精卵，并将体外受精的受精卵移植到发情受体母犬未冲卵一侧的输卵管中，从而制备体外受精(IVF)犬，其中成熟培养液是添加10～100μg/ml孕酮的TCM199培养液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述卵母细胞的供体是绝育犬的卵巢，并且犬卵母细胞为卵丘卵母细胞复合体(COC)，所述COC是包裹2层以上的卵丘细胞，并且卵母细胞的直径＞110μm，胞质呈均匀黑色。
6.根据权利要求4或5的方法，其特征在于，犬卵母细胞的成熟培养是采用成熟培养液的微滴培养法，微滴大小为100μl，以矿物油覆盖，每滴放置20个COCs，培养时间为48-72小时，每24小时更换培养液，优选地，培养时间为72小时，每次换液前应将新的培养液在培养箱中至少孵育2小时，换液时用新的成熟液润洗至少3次。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于获能精子是通过如下步骤获得的：从公犬获得精液用精子获能液清洗3次后，用精子获能液重悬精子，将精子密度调节到7.5×106/mL，置于37.5℃，5％CO2培养箱中孵育2-4小时进行获能，优选地，孵育2.5小时进行获能。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于步骤(4)是在卵母细胞体外成熟48-96小时后，优选地72小时后，挑选形态质量较好的体外成熟卵母细胞与1×106/mL获能精子加入微滴中共培养12～16小时进行体外受精(IVF)，所述微滴是以mSOF做100μL微滴，以矿物油覆盖，在温箱预平衡2小时制备，优选地，体外成熟卵母细胞与获能精子在微滴中共培养14小时；将完成体外受精的受精卵转移至新的mSOF微滴中进行培养；将体外受精卵胚胎移植到孕酮值达到4～7ng/ml后72～120小时的发情受体母犬的未冲卵一侧的输卵管中。
9.用于体外成熟卵母细胞的成熟培养液，或权利要求1或4的方法中所述的成熟培养液，其是添加10～100μg/ml孕酮的TCM199培养液。
10.根据权利要求9所述的成熟培养液，所述成熟培养液的配方如下：9ml的TCM199；1mlFBS；1mM半胱氨酸；0.2mM丙酮酸钠；8IU促卵泡素；2IU促黄体素；100μL双抗(青霉素-链霉素)；和40μg/ml孕酮。
CN201810927109.8A 2018-08-14 2018-08-14 利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法 Active CN108977408B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810927109.8A CN108977408B (zh) 2018-08-14 2018-08-14 利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810927109.8A CN108977408B (zh) 2018-08-14 2018-08-14 利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108977408A true CN108977408A (zh) 2018-12-11
CN108977408B CN108977408B (zh) 2022-06-14

Family

ID=64553654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810927109.8A Active CN108977408B (zh) 2018-08-14 2018-08-14 利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108977408B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2232985A2 (en) * 2008-01-04 2010-09-29 Seoul National University Industry Foundation Method for producing cloned transgenic canidae
CN107937444A (zh) * 2017-07-25 2018-04-20 北京希诺谷生物科技有限公司 体细胞克隆犬的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2232985A2 (en) * 2008-01-04 2010-09-29 Seoul National University Industry Foundation Method for producing cloned transgenic canidae
CN107937444A (zh) * 2017-07-25 2018-04-20 北京希诺谷生物科技有限公司 体细胞克隆犬的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAMILA INFANTOSI VANNUCCHI,ET AL.: "Effects of gonadotropin-exposed medium with high concentrations of progesterone and estradiol-17βon in vitro maturation of canine oocytes", 《IN VITRO CELL.DEV.BIOL.—ANIMAL》 *
JENNIFER B. NAGASHIMA，ET AL.: "Live Births from Domestic Dog (Canis familiaris) Embryos Produced by In Vitro Fertilizatio", 《PLOS ONE》 *
王伦学等: "犬卵母细胞体外成熟的研究进展", 《黑龙江动物繁殖》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108977408B (zh) 2022-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cognie et al. Current status of embryo technologies in sheep and goat
Seidel et al. Training manual for embryo transfer in cattle
Brown et al. Successful artificial insemination of an Asian elephant at the National Zoological Park
Lonergan Historical and futuristic developments in bovine semen technology
Catt et al. Comparison of pregnancy in cattle when non-vitrified and vitrified in vitro-derived embryos are transferred into recipients
Rodriguez-Dorta et al. Effect of coculture with oviduct epithelial cells on viability after transfer of vitrified in vitro produced goat embryos
JPS60246751A (ja) 胚移植法
Nagashima et al. The domestic dog embryo: in vitro fertilization, culture, and transfer
CN104126004A (zh) 有关胚胎移植延迟和使用外周血单核细胞的体外受精方法
CN110042078B (zh) 卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和应用
Martínez et al. Cryopreservation of in vitro-produced ovine embryos
Hazeleger et al. State of the art in pig embryo transfer
CN107937444A (zh) 体细胞克隆犬的方法
Seidel et al. Embryo transfer in dairy cattle
Hori et al. Intrauterine embryo transfer with canine embryos cryopreserved by the slow freezing and the Cryotop method
Goto et al. Pregnancies after invitro fertilization of cow follicular oocytes, their incubation invitro and their transfer to the cow uterus
CN108977408A (zh) 利用体外成熟犬卵母细胞制备体外受精犬的方法
Lindeberg et al. Surgical recovery and successful surgical transfer of conventionally frozen–thawed embryos in the farmed European polecat (Mustela putorius)
CN113736728A (zh) 一种小鼠体细胞核移植胚胎培养液及胚胎培养方法
KR101046706B1 (ko) 스트로우를 이용한 포유동물의 수정란 이식 방법
Li et al. Factors affecting the efficiency of embryo transfer in the domestic ferret (Mustela putorius furo)
Lindeberg embryo technology in the farmed european polecat (Mustela putorius)
Ismail et al. Production and growth performance of Malayan gaur x cattle hybrid (selembu) in Malaysia
Jindal et al. Biotechnology in animal health and production
Hartmann et al. Biotechnics applied to bovine female

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20191021

Address after: 310, 311, 312, building 16, yard 37, Chaoqian Road, science and Technology Park, Changping District, Beijing 102200

Applicant after: Beijing snow Valley Biological Technology Co. Ltd.

Applicant after: Nanchang Police Dog Base of Ministry of Public Security

Address before: 102200, Changping District Beijing science and Technology Park, super Road, No. 37, building 16, floor 3, 310

Applicant before: Beijing snow Valley Biological Technology Co. Ltd.

CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zheng Min

Inventor after: Mi Jidong

Inventor after: Zhao Jianping

Inventor after: Ye Junhua

Inventor before: Zheng Min

Inventor before: Mi Jidong

Inventor before: Zhao Jianping

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant