CN108956398B - 基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法，利用普鲁士蓝染色细胞图通过图像分析处理的方式定量细胞内的铁含量，首先对细胞染色样品进行图像采集，通过对数字图片每个像素RGB色彩空间的运算，提取蓝色特征信息。将大量样品的蓝色特征信息与其由ICP等元素分析仪器得到的细胞铁含量建立回归关系，回归关系确定后就能够实现由定性的染色图片得到准确的细胞内铁含量，避免了繁琐昂贵的铁含量测量过程，实现了操作更加简单，成本大大降低的效果。
Description
技术领域
本发明涉及纳米技术领域，尤其涉及一种基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法。
背景技术
铁基磁性纳米颗粒近年来在生物医学领域非常多的关注和研究，相比较其他金属纳米颗粒如：金纳米颗粒、银纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒等，铁基纳米颗粒具有更好的生物相容性以及独特的磁学性质。在肿瘤治疗的应用中，通常将铁基颗粒作为载药平台靶向特定肿瘤组织，并且通常利用铁基纳米颗粒的磁响应特性，在外部磁场引导下使载药体能够更高效地到达肿瘤部位。如果将铁基磁性纳米粒子暴露在交变磁场下，由于奈尔弛豫效应，纳米颗粒会发生产热效应，载药体在到达肿瘤局部时同时能够通过升温使得肿瘤消融。另外，在组织重建工程当中，通常使细胞内吞或标记上铁基纳米颗粒，通过外部磁场的调控使细胞在体外构建形成特定的形状。铁基纳米颗粒同时能够充当磁共振造影剂，随着干细胞在疾病治疗中表现出的广阔前景，将干细胞标记上纳米颗粒就能够通过磁共振观察细胞的运动和变化，对医学的发展具有重大意义。其中重要的是，无论是治疗还是诊断亦或是组织工程建设，为了达到预期的效果，首先要明确的是细胞内铁基纳米颗粒的含量。
目前测定细胞内铁纳米颗粒的方法主要分为两大类，其中一类是通过染色的方式利用试剂盒对固定后的细胞进行染色，染色的原理是基于3K4[Fe(CN)6]与Fe3+后能够产生Fe4[Fe(CN)6]3(普鲁士蓝粒子)，普鲁士蓝是一种呈现蓝色的物质，当细胞中含有Fe3+时，细胞内会呈现出蓝色，随着Fe3+量越多，染色后的蓝色的色度也就越深，呈现蓝色的像素点数也越多。此方法的优势在于简便、直观、易操作且成本低，能够比较出两个样品间的差距，但是此方法的缺点在于无法定量，无法明确此时细胞内具体的铁含量。另一种测量细胞内铁含量的方法是通过破碎细胞，释放出细胞内的铁离子和未被溶酶体代谢的铁纳米颗粒，对收集到的溶液用硝酸全部反应成铁离子后利用金属离子检测器检测溶液中的铁含量，之后根据结果换算成未破碎前每个细胞内的铁含量，由于细胞内的铁含量较少，通常每个细胞内仅有几皮克到几十皮克之间，因此用于测量的仪器需要很高的灵敏度，如：ICP-OES(指电感耦合等离子体发射光谱仪)、ICP-MS(电感耦合等离子体质谱仪)、电化学等方法，优点在于灵敏度高、能够定量细胞内的铁含量，缺点在于细胞处理过程复杂、ICP仪器价格昂贵不具有普遍性。
发明内容
发明目的：针对以上问题，本发明提出一种基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法。
技术方案：为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法，包括步骤：
(1)将细胞样品进行清洗、固定和染色，染色样品拍摄多张照片；
(2)基于大量的图片样本得到图片信息值与仪器实际测得的铁含量建立回归方程Y＝AX+B，X为图片提取的特征值，Y为测得的细胞内铁含量，并确定A与B的值；
(3)基于图像分析得到蓝色表征值，基于两者回归关系从而定量细胞内铁含量。
所述步骤(2)具体包括：
(2.1)统计图片中细胞的总个数；
(2.2)通过对RGB色彩空间的运算提取蓝色特征信息，并计算表征值TN；
(2.3)通过样本染色图片的TN值和仪器对应测得的细胞内铁含量，建立线性回归曲线，拟合得到回归方程Y＝AX+B。
所述步骤(2.1)包括：
a、读取目标格式图片。
b、将彩色图片转为灰度图，底帽变换去除颜色不均一。
c、灰度图像二值化，全局阈值分割。
d、孔洞填充，利用形态学开运算，去除影响计数的干扰颗粒。
e、统计连通域个数，并在图片上自动标注目标位置。
f、对(e)中的结果进行人工干预检测是否与原图的细胞位置相一致，如有偏差，回到(d)调整算法参数。
所述步骤(2.2)包括：
a、读取目标格式图片；
b、提取彩色图片每个像素的RGB分量；
c、用T对每个像素的蓝色色度赋予对应的值，T值表示为：
d、设置阈值u，将T值大于u的像素点的加权求和，用TN值表示平均每个细胞内蓝色信息的特征值，表征值TN为：
所述步骤(1)中，染色的样品由一台连接电脑的显微镜拍摄，拍摄由NIS ElementsF照相软件完成。
所述步骤(1)中，细胞样品利用普鲁士蓝试剂盒染色。
有益效果：本发明利用对细胞染色结果拍摄得到的数字图像进行处理对细胞内的铁含量进行定量分析，这种方式能够利用简单的染色、拍摄步骤对细胞内的铁含量进行较准确的定量，省去了大型仪器的检测、节省了实验成本和操作流程，并且能够很快得出结果。本发明将染色法和铁含量测定法结合起来，具有结果直观明显且能够定量的优势，是目前的表征方法所不能达到的。
附图说明
图1为本发明计算细胞内铁含量流程图；
图2为本发明中提取细胞总个数算法流程图；
图3为本发明中分割提取图像中的蓝色特征信息算法实现流程图；
图4为本发明中分割提取图像中的蓝色特征信息原理图；
图5为普鲁士蓝溶液颜色梯度图对应的T值变化图；
图6为本发明中用一批样本的图像TN值与细胞内铁含量建立的回归关系图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
如图1所示，本发明所述的基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法，包括步骤：
(1)将细胞样品按照步骤进行清洗、4％多聚甲醛固定和普鲁士蓝试剂盒染色，染色的样品由一台连接电脑的显微镜拍摄，拍摄由NIS Elements F照相软件完成，每个样品多点采样，拍摄多张照片(不少于8张)；
本发明所需装置包括透明的细胞培养皿、细胞染色样品、光学成像显微镜、用于数字图像处理的电脑。细胞染色样品是贴壁状态固定在透明培养皿中，培养皿中加磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)保持细胞样品在拍摄过程中不脱水。拍摄图片放大倍数为200倍，每个细胞染色样品多点采样照片，以消除一个细胞培养皿中染色情况的差异。
对于拍摄的需要，细胞的密度需要控制在60％融合度以下，以防细胞融合度过高，细胞跟细胞粘粘紧密不易提取特征信息。对于细胞培养皿，使用普通的透明培养板或培养皿，6孔、12孔或24孔等。
(2)利用MATLAB软件进行处理分析，基于大量的图片样本得到图片信息特征值，与仪器实际测得的铁含量建立回归方程Y＝AX+B，X为图片信息值，Y为细胞内铁含量，并确定A与B的值；
(2.1)如图2所示，统计图片中的细胞总个数N；
a、读取目标格式图片。
b、将彩色图片转为灰度图，底帽变换去除颜色不均一。
c、灰度图像二值化，全局阈值分割。
d、孔洞填充，利用形态学开运算，去除影响计数的干扰颗粒。
e、统计连通域个数，并在图片上自动标注目标位置。
f、对(e)中的结果比对是否与原图的细胞位置相一致，如有偏差，回到(d)调整算法参数。
(2.2)如图3所示，蓝色是一个模糊的概念，通过对RGB色彩空间的运算对蓝色从浅到深赋予连续变化的权重作为提取到的蓝色特征信息因子，并由此计算表征值TN；
a、读取目标格式图片；
b、提取彩色图片每个像素的R、G、B三个分量；
如图4所示，对于彩色图片中每个像素而言都有一个对应的颜色，而这个颜色通常利用RGB色彩模型来表示，RGB色彩模型可以看成一个三维空间，每个颜色都是一个由R(红)、G(绿)、B(蓝)三个向量构成的空间向量。
c、针对普鲁士蓝的颜色特征，利用T值表示蓝色像素的深浅，T值越小表明蓝色越浅，反之表明蓝色越深，T值表示为：
对12个液面高度一定浓度等梯度变化的普鲁士蓝溶液提取平均T值进行表征，如图5所示，直线表明T值能够很敏感的区分普鲁士蓝颜色的深浅，且具有高的线性度。
d、设置阈值T，分割出阈值以上的所有蓝色像素点，将这些像素点的值加权求和，考虑到细胞面积大小不统一会引起的误差，因此用TN值作为最终代表图片蓝色信息的特征值，定义表征值TN：
(2.3)由于细胞内的铁含量与染色后的蓝色深浅和蓝色面积大小成正相关关系，因此利用ICP等元素分析仪器测量来自同一样本的实际铁含量值，样本量越大越得到的回归关系越可靠，通过对较样本的染色图片的TN值和对应测得的细胞内铁含量，拟合得到如图6的线性回归曲线，得到回归方程Y＝AX+B；
(3)基于回归关系，后续样品可以由软件进行图像分析得到图片信息值，直接定量细胞内铁含量。
这种方式能够利用简单的染色、拍摄步骤对细胞内的铁含量进行较准确的定量，省去了大型仪器的检测、节省了实验成本和操作流程，并且能够在很短时间内得到结果。本发明将染色法和铁含量测定法结合起来，具有结果直观且能够定量的优势，是目前的表征方法所不能达到的。
Claims (4)
1.一种基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法，其特征在于：包括步骤：
(1)将细胞样品进行清洗、固定和染色，染色样品拍摄多张照片；
(2)基于大量的图片样本得到图片信息值与仪器实际测得的铁含量建立回归方程Y＝AX+B，X为图片信息值，Y为细胞内铁含量，并确定A与B的值；
所述步骤(2)具体包括：
(2.1)统计图片中的细胞总个数N；
(2.2)通过对RGB色彩空间的运算提取蓝色特征信息，并计算表征值TN；
所述步骤(2.2)包括：
a、读取目标格式图片；
b、提取彩色图片每个像素的R、G、B三个分量；
c、用T对每个像素的蓝色色度赋予对应的值，T值表示为：
d、设置阈值u，将T值大于u的像素点的加权求和，用TN值表示平均每个细胞内蓝色信息的特征值，表征值TN为：
(2.3)通过样本染色图片的TN值和仪器对应测得的细胞内铁含量，建立线性回归曲线，拟合得到回归方程Y＝AX+B；
(3)根据图像分析得到特定表征值，基于最后建立的回归关系定量细胞内铁含量。
2.根据权利要求1所述的基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法，其特征在于：所述步骤(2.1)包括：
a、读取目标格式图片；
b、将彩色图片转为灰度图，底帽变换去除颜色不均一；
c、灰度图像二值化，全局阈值分割；
d、孔洞填充，利用形态学开运算，去除影响计数的干扰颗粒；
e、统计连通域个数，并在图片上自动标注目标位置；
f、对(e)中的结果比对是否与原图的细胞位置相一致，如有偏差，回到(d)调整算法参数。
3.根据权利要求1所述的基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，染色的样品由一台连接电脑的显微镜拍摄，拍摄由NIS Elements F照相软件完成。
4.根据权利要求1所述的基于图像分析定量细胞内铁纳米颗粒含量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，细胞样品利用普鲁士蓝试剂盒染色。
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