CN108939291A - 一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法，属于生命科学技术领域。所述改善帕金森运动障碍的神经刺激方法，包括如下步骤：步骤1：脊髓回路的神经刺激；步骤2：中脑运动区的神经刺激；步骤3：治疗效果评价。本发明通过恒河猴的脊髓和中脑进行神经刺激，能有效减轻非人类灵长类动物帕金森病模型的运动不能和平衡障碍的缺陷，并且规避了现有技术的丘脑底核深部脑刺激导致的步态冻结副作用。

Description

一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法

技术领域

本发明涉及一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法，属于生命科学技术领域。

背景技术

帕金森病(Parkinson's disease，PD)，又称“震颤麻痹”，是一种仅次于阿尔茨海默病的第二大中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为静止性、意向性或姿势性震颤，肌肉强直、运动迟缓和姿势平衡障碍等，并以黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元严重变性缺失和脑内残存的DA能神经元内出现路易小体(lewy body，LB)为病理特点。帕金森病是老年人中第四位最常见的神经变性疾病。

目前，改善帕金森运动障碍的方法主要采用药物治疗丘脑底核深部脑刺激。但是缺乏有效的药物和预防策略，多巴胺替代和丘脑底核深部脑刺激已成为PD临床治疗方案。在疾病发展过程中，PD病人行为学症状为运动障碍或运动迟缓。当病人出现运动障碍，难以使用普通多巴胺替代治疗来缓解震颤发生或姿势调节障碍时，丘脑底核的深部电刺激成为一种有效的治疗选择。但是，靶点在丘脑底核的深部电刺激有可能导致步态冻结等副作用。

鉴于此，有必要提供一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法，以解决现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法。本发明通过恒河猴的脊髓和中脑进行神经刺激，能有效减轻非人类灵长类动物帕金森病模型的运动不能和平衡障碍的缺陷，并且规避了现有技术的丘脑底核深部脑刺激导致的步态冻结副作用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法，包括如下步骤：

步骤1：脊髓回路的神经刺激

选取恒河猴为模型动物，将96通道的微电极阵列植入恒河猴指导腿部运动的左侧运动皮层内，同时记录腿部肌肉的肌电图信号；将双极电极植入横跨右腿每个关节的拮抗肌，同时监测肌电信号；

步骤2：中脑运动区的神经刺激

使用步骤1中的数据分析，在中脑神经调节前后，观察脑活动、肌肉协调作用及进行下肢运动比较；

步骤3：治疗效果评价

通过应用运动模式，分别测试步骤1中对脊髓回路的神经刺激结果，以及步骤2中对中脑神经的刺激结果，评价治疗效果。

本发明的步骤1中，采用恒河猴为本发明的模型动物。恒河猴，别名猕猴、黄猴、恒河猴、广西猴等，猕猴属猕猴种，是亚洲地区最常见的一种猴。恒河猴适应性强，容易驯养繁殖，生理上与人类较接近，也常被用于进行各种医学试验。目前对PD病因学和发病机理的大部分认知，都来源于动物模型研究。经研究发现，相较于大鼠、小鼠、猫、非人灵长类等动物，无论从生理结构、生化特点、病理特征等方面来看，只有非人灵长类动物模型能够真正模拟人类PD发病机制及进程。因此，本发明采用恒河猴为模型动物。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤1中，所述恒河猴为健康雄性恒河猴，年龄为4-9岁，体重为4.3kg-8.4kg，平均为6.5±0.5kg。

进一步，步骤1中，所述腿部肌肉包括臀中肌、髂腰肌、股直肌、半腱肌、腓肠肌、胫前肌、趾长伸肌和长屈肌。

进一步，步骤1中，所述拮抗肌包括髂腰肌、臀中肌、股直肌、半肌腱、腓肠肌、内侧、胫骨前肌、趾长伸肌和拇长屈肌。

上述髂腰肌和臀中肌位于臀部，股直肌和半肌腱位于膝盖，腓肠肌、内侧和胫骨前肌位于踝部，趾长伸肌和拇长屈肌位于趾部。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过恒河猴的脊髓和中脑进行神经刺激，能有效减轻非人类灵长类动物帕金森病模型的运动不能和平衡障碍的缺陷，并且规避了现有技术的丘脑底核深部脑刺激导致的步态冻结副作用。

(2)本发明的方法简单，操作容易，为帕金森病的临床前研究及新药评价提供动物模型与科研平台。

附图说明

图1为本发明的脑脊柱接口的概念和技术设计图。

图2为本发明的脑脊髓接口减轻脊髓损伤后的步态缺陷图。

图3为本发明的MPTP处理后，皮层神经活动保持解码预测肌肉活动的准确性图。

图4为本发明的脑-脊髓电环路缓解了步态后的步态缺陷脊髓损伤图。

图5为本发明的第一个扩展数据图。

图6为本发明的第二个扩展数据图。

图7为本发明的第三个扩展数据图。

图8为本发明的第四个扩展数据图。

图9为本发明的第五个扩展数据图。

图10为本发明的第六个扩展数据图。

图11为本发明的第七个扩展数据图。

图12为本发明的第八个扩展数据图。

图13为本发明的第九个扩展数据图。

图14为本发明的第十个扩展数据图。

具体实施方式

以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

一、实验方法

1、动物饲养

实验由波尔多机构动物护理和使用委员会(CE50，France)批准，许可证号为50120102-A，并根据2010年9月22日欧盟指令(2010/63/EU)在AAALAC(国际实验动物饲养管理评估和认可协会)认可的设施(中国科学院，中国北京)以科学研究为目的对动物进行保护。实验动物包括9只健康雄性恒河猴(中国猕猴，中国)，年龄为4-9岁，体重4.3kg-8.4kg，平均6.5±0.5kg，分别饲养在根据欧洲指南设计的笼子中(2m×1.6m×1.26m)。饲养时给予玩具和舒缓的音乐。9只实验猴中仅有两只恒河猴受到脊髓损伤。

2、外科手术

所有手术均在阿托品(0.04mg/kg)和氯胺酮(10mg/kg，肌内注射)诱导的全麻下进行，插管后1％-3％异氟醚维持。经过认证的功能性神经外科医生(J.B)监督所有手术过程。植入手术时长约8小时。

手术期间，将一个96通道的微电极阵列(Blackrock Microsystems，1.5mm)植入指导腿部运动的左侧运动皮层内(F4)。同时使用无线系统(T33F-4，KonigsbergInstruments，USA)，用于记录下面腿部肌肉的肌电图信号：臀中肌(GLU)、髂腰肌(IPS)、股直肌(RF)、半腱肌(ST)、腓肠肌(GM)、胫前肌(TA)、趾长伸肌(EDL)和长屈肌(FHL)。并根据先前描述的方法，将定制的脊柱植入物插入腰脊髓的硬膜外腔。将植入物插入L4-L5椎骨并拉直至达到T13-L1椎骨。电生理学测试在手术中进行以调整电极的位置。具体来说，本申请的发明人证实了通过最头端和最尾端的电极提供的单脉冲刺激分别在IPS和GM肌肉中引起运动反应。使用钛螺钉(直径1.5mm，长度8mm，Synthes)的钛螺钉(Vis MatrixMIDFACE)将植入物的连接器封入钛制矫形器中，固定到椎骨上。电线经皮下输送到插入肋间肌之间的植入式脉冲发生器。

恒河猴Q2和Q3受到脊髓损伤。在T7/T8胸椎水平进行部分椎板切除术。使用微型刀片切割约2/3背腹部脊髓。在显微镜观察下使用微型剪刀完成病变。恒河猴在受伤后保留肠、膀胱和自主神经功能。手术后立即给予抗生素头孢曲松钠(100mg/kg，肌肉注射)，每天一次，共7天。兽医团队在手术后的第一个小时内持续监测恒河猴，并在随后的7天中每天多次监测恒河猴。在手术干预完成后的几个小时内，恒河猴能够四处移动并自己喂食。临床评分和监测量表用于评估手术后疼痛。Ketophen(2mg/kg，皮下)和Metacam(0.2mg/kg，皮下)每天一次。利多卡因乳膏涂抹手术伤口，每天两次。

3、实验记录

训练恒河猴在跑步机及露天走廊(300cm×35cm×70cm)上行走。有机玻璃外壳用于将恒河猴保持在相机视野内。食物颗粒和水果奖励适当的行为，并提供额外的食物来完成日常的饮食要求。

4、给予使用镇定剂的恒河猴单次脉冲信号

给予氯胺酮(3.5mg/kg)镇静。为了不妨碍腿部运动，给恒河猴穿上夹克悬挂在半空中。通过电极递送负极脉冲、电荷平衡刺激(0.3ms，1Hz)，从而引发腿部肌肉中的复合电位。在本申请中，选择了相应的运动神经元激活空间图显示与热点相关性最高的活动位点。

5、完整恒河猴运动期间的脑控制刺激

通过在跑步机上以舒适速度(Q1,2.0km/h；Q2,1.6km/h)运动的方式来测试脑控制的刺激方案。记录内容如下：首先，在没有刺激的情况下记录行走期间的两到五个区间，每个区间的持续时间为1-2分钟。为了实时检测脚踏地面和向前运动步态，这些基线记录被用于校准解码器。其次，在仅针对伸肌热点的电极、仅针对屈肌热点的电极或针对伸屈肌的两个电极的脑控制刺激方案中分别记录恒河猴状态。本申请的发明人测试了刺激频率和幅度对功能波动(30-80Hz；1.5-3.9V)的影响。

6、受伤恒河猴运动期间的脑控制刺激

损伤后第6天和16天，恒河猴Q2和Q3分别能够在跑步机上维持独立运动。Q3的恢复速度比Q2慢得多，可能是因为接受了更广泛的腹侧和外侧脊髓损伤(扩展数据图9)。所以，损伤2周后，当Q3出现适当的行为和身体状况时开始记录恒河猴的状态。由于实验的总时程(2周)的限制，这只恒河猴仅进行一次完整的远程连接信息。由于在该实验之后，恒河猴迅速恢复，所以无法对脑-脊柱环路功效进行评估。恒河猴在跑步机上以最舒适的速度行走(恒河猴Q2为1.2-1.4km/h，恒河猴Q3为1.0km/h)。记录内容如下。首先，在没有刺激的情况下，记录两到六个区块，每个区块持续1-2分钟。这些记录被用来校准解码器。其次，还测试了与脑控制期间相同的连续刺激的效果。在刺激参数的功能范围内，脑控制的刺激不会引起会削弱运动的干扰性运动或痉挛。

7、数据采集

先前已经详细记录了记录运动学和肌肉活动的程序。使用高速运动捕捉系统SIMI(Simi Reality Motion Systems，Germany)及4个或6个摄像机(100Hz)测量全身运动。将反光白色涂料直接应用于猴右侧以下身体标志上的猴皮肤上：髂嵴、大转子(髋)、外髁(膝)、外踝(脚踝)、第5跖趾骨(mtp)和小拇指(脚趾)的外端。Simi运动跟踪软件用于获取标记的三维空间坐标。相应地计算关节角度。同时记录肌电信号(2kHz，Kronisberg，USA)并通过Blackrock Cerebrus系统(Blackrock Microsystems，USA)同步记录，该系统也记录神经信号。恒河猴头上安装Cereplex无线系统。六条天线和一个接收器用于传输宽带神经信号(0.1Hz至7.8kHz频段，采样频率为22kHz)。对信号进行带通滤波(500Hz至7.5kHz)，并通过阈值交叉提取峰值事件。具体而言，在5秒内如果信号超过计算的其均方根值的3.0-3.5倍，则被定义为在每个通道上的峰值事件(总计96个)。这个程序产生了来自96个多单元的二进制信号，每个单元来源于阵列的96个电极中的一个。这96个多单元的信号被集成在解码器中。

8、神经信号解码运动状态

根据解码器计算出的神经数据的历史记录(病变前病变300ms和病变后病变400ms)，根据观察足部或足部行走运动状态的概率做出决定。为了在神经活动，这些热点被激活的时候给伸肌和屈肌热点传递刺激，在神经活动中解码与步态相关的运动状态，并在适当的时候使用这些检测结果来触发刺激方案。连接到本地网络的控制用计算机不断接收包含神经记录的使用数据报协议(Used Datagram Protocol，UDP)数据包。本申请的发明人设计了一个在控制计算机上运行的定制内部软件应用程序(Visual Studio C++2010)，它可以实时分析神经信号。每20ms，应用程序会决定是否触发其中一个脊髓刺激，而是否触发脊髓刺激取决于解码器根据神经数据的历史记录(病变前病变300ms和病变后病变400ms)计算出的脚踏地面和向前运动步态出现的概率。

伸展和屈曲热点的激活与脚踏地面和向前运动步态是时间锁定的。由于神经活动的发生先于脚踏地面和向前运动步态，本申请的发明人分别用ΔtFO和ΔtFS时间偏移量定义脚踏地面和向前运动步态作为神经活性。这些偏移将步态事件和热点激活之间的延迟以及与设备之间的无线通信相关的延迟整合到解码器的设计中，这可以保证对这些热点的刺激与这些热点的自然激活最大化重叠。

9、运动状态的读取用于解码器的校准

每次会话开始时，对记录的两到七个无刺激块的数据对解码器进行了校准。步态事件由肌电图(Q1)或录像(Q2和Q3)识别。肌电图通过来自髂腰肌的信号对脚踏地面和向前运动步态的识别。髂腰肌在步态开始时被激活，并在运动期间维持激活状态。通过限制调整的肌电信号对脚踏地面和向前运动步态进行评估。视频记录脚踏地面和向前运动步态事件将其可视化。损伤后，当恒河猴只出现肢体同侧损伤时的最小运动时，根据髋关节或膝关节残余的轻微运动来定义脚踏地面和向前运动步态事件，这种轻微的动作与尝试运动相关。

10、校准解释了神经信号内刺激引起的变化

对Q1解码时间精度的分析显示，在脑控制刺激期间脚踏地面和向前运动步态与从脚踏地面和向前运动步态估计的运动状态的时间是不同的(脚踏地面的平均差是68ms，向前运动步态平均差是90ms)。在没有刺激的情况下，本申请的发明人在检测运动状态时没有观察到这种差异(脚踏地面的平均差是11ms，向前运动步态平均差是3ms)。而包括刺激引起的体感反馈的变化，恒河猴尝试改变其步态，稳定性变化等的一系列因素可能会降低解码性能。为了提高解码器的时间精度，本申请的的发明人引入了解码器重新校准系统。最初的在没有刺激的情况下解码数据的解码器在每2-3个区间通过延伸热点或屈曲热点触发刺激。在这些区间收集到的数据与没有刺激的区间相结合用于校准一个新的第二解码器。该解码器成功弥补了刺激引起的运动皮质活动变化(图3和扩展数据图5)。

11、热点刺激的持续时间。

本申请的发明人试图在整个运动过程中的自然激活期间刺激屈曲和伸展热点。通过将持续时间设置为300ms来确定屈伸热点刺激的持续时间。然后，在脑控制刺激过程中记录了几个步骤，并在必要时调整每只恒河猴的刺激方案的持续时间，以获得对腿运动学的清晰调制。这一过程在所有伤前训练阶段只进行一次，并且在伤后训练阶段重复进行。

12、盲实验

除了识别步骤和对视频记录中脚踏地面和向前运动步态的标记外，数据分析均通过自动计算机程序进行。当分析需要研究人员的参与时，研究人员对实验条件是未知的。

13、运动神经元活化的时空图。

为了可视化运动神经元活化的时空图，将肌电信号映射到由组织学分析重建的运动神经的躯体纵轴上。这种方法在节段水平而不是在个体肌肉水平上为运动神经元激活提供了译码。

14、识别伸肌和屈肌热点激活。

分别从每只恒河猴的运动神经元激活的平均时空图中鉴定出伸屈的热点(Q1、P2、P3，n＝3)。将两个连续的脚踏地面事件计算出的图像插入到一个1,000点的图像中，计算出获得平均运动神经元激活的时空图。然后通过对脚踏地面时弯曲热点周围的平均图(步态周期-10％+20％)以及对向前运动步态时伸展热点周围的平均图(步态周期-10％+30％)进行时间平均来确定屈伸热点和延伸热点。

15、肌肉补充曲线分析。

矫正腿部肌肉中的复合电位并与每个肌肉和刺激的振幅整合，复合电位通过运动神经元活化的彩色编码的空间图表现。本申请的发明人忽略了肌肉的特异性，没有测量特定的屈肌和伸肌选择性，而是测定了与屈曲和伸展激活类似的能激发空间图图的电极。计算每只恒河猴在运动过程中记录的结果图和记录的图之间的相关性，以确定相关性最大的电压范围。而这个电压范围在随后的行为实验期间被使用(扩展数据图3c)。

16、量化解码信号

本申请的发明人使用混淆矩阵和规范化的互信息量化了异步解码器的性能。为了对运动进行分析，对走步进行了分类。为了评估脑-脊柱电环路的功能、评估刺激时间对纠正步态缺陷的重要性，本申请的发明人基于解码器的时间准确性对行走进行事后分类，以重现期望的热点激活的时间控制。本申请的发明人根据屈伸热点刺激的启动定义了最优和次优走步。所有仅包含一个正确伸展运动的激活(刺激发生在足部触发±125ms)和一个正确屈曲运动的激活(刺激发生在足部离地--200ms和+50ms之间)的步态循环被定义为最优走步方式(扩展数据图10)。

17、步数分析

脊髓损伤后，恒河猴通常使用其它三个完整肢体行走，脊髓损伤同侧下肢沿步行表面拖动或保持弯曲的姿势。由于行动的缺陷，恒河猴无法在设定好速度的跑步机的正常移动，所以它们偶尔以向前跳行的方式同时移动双腿，从而避免撞到跑步机后方的外壳上。本申请的发明人对这些“跳跃”和“颠簸”的次数以及正常步数进行计数。在分析过程中，实验者对刺激条件是未知的。为了量化由脑-脊柱电环路介导的功能改善，本申请的发明人计算了当日所有记录块上正常步数的比例。为了量化恒河猴维持运动的能力，本申请的发明人提取了所以标记为行走的事件，并估量了由于撞到跑步机后方外壳而未被执行的相对步数。

18、行走质量

根据之前在参考文献8,9和31中描述的方法，每一步包含26个量化运动学参数(补充表3)。本申请的发明人使用主成分分析来显示步态随时间和不同条件的变化(图4和扩展数据图7和8)。为了量化运动性能，本申请的发明人计算了整个26维空间中与相应实验条件和损伤前每个恒河猴记录的平均步数相关的步间的欧几里德距离。

19、组织处理

将恒河猴深度麻醉并用4％多聚甲醛溶液经鼻灌注。取出脊髓硬膜并用冷冻切片机制作40μm厚的切片，4℃、0.1M磷酸盐缓冲盐水叠氮化物(0.03％)中保存。

20、运动皮层投射的顺行追踪。

本申请的发明人使用解剖示踪剂从恒河猴Q2和Q3左侧腿部和躯干区运动皮层顺行追踪皮质脊髓投射。麻醉如上所述。将生物素化葡聚糖胺(BDA；10％水溶液；10,000Da；Molecular Probes，TSA PLUS Biotin KIT PerkinElmer，NEL749A001KT)以300nl/位点注射到跨越左运动皮质的腿和躯干区的40个位点中。将生物素化的葡聚糖胺以每个位点300nl注射到跨越左运动皮质的腿和躯干区的40个位点。

21、量化脊髓损伤

在整个背腹轴上使用均匀间隔的水平切片(1：4)，使用星形胶质细胞标记物(GFAP；1：1000，Dako，USA，Z0334)、NeuN标记物(anti-NeuN；1：300，Millipore，MAB377)和BDA反应性对病变部位相机透明区重建(Neurolucida 11.0,MBF Biosciences,USA)。使用AlexaFluor 488(1:400，Invitrogen，A-11034)和647(1:300，Invitrogen，A-21235)标记的第二抗体显现免疫反应。

22、统计学分析

所有计算的参数在每只恒河猴内进行量化和比较。所有数据均以平均值±平均值的标准误差(s.e.m.)的形式进行表示。使用非参数Wilcoxon秩和检验，自举及Monte Carlo方法用来分析显着性。

二、实验结果

1、脑脊柱接口的概念和技术设计，如图1所示。

实验猴脑内控制腿部运动的左运动皮质被植入一个微电极阵列。在记录期间，无线模块将神经信号传输到控制计算机。(1)在三个连续的步态周期上记录的光栅图。每条线表示从一个电极识别的放电事件，而水平轴表示时间。(2)在控制计算机上运行的解码器从这些神经信号识别运动状态。

(3)解码出用于触发运动的脊髓电刺激模式，为此实验猴脊髓植入了脊髓电刺激器。在三个连续的步态周期中记录的作用于脚踝的伸肌(灰色)和屈肌(黑色)肌肉的肌电信号与在步态的站立(灰色)和摆动(黑色)阶段期间的腿部运动的杆状分解示意图。

2、脑脊髓接口减轻脊髓损伤后的步态缺陷，如图2所示。其中，(a)脑和脊髓方案说明病变的位置和使用BDA从左运动皮层出现的皮质脊髓标记。该图示出了对于猴子Q2和Q3，包含以灰色突出显示的病变的脊髓节段的解剖重建。照片显示损伤脊髓的纵向视图，其中标记了星形胶质细胞(GFAP，灰色)，神经元(NeuN，青色)和皮质脊髓束轴突(BDA，粉红色)。星号表示病变。比例尺-200μm。(b)在运动期间在没有刺激的与伴随脑控刺激实验猴在跑步机上两个完整的步态周期。肢体麻痹用红色表示。(c)视频截图，显示没有刺激和在脑控制刺激期间的腿部运动的代表性序列。(d)柱状图，报告由每只猴子进行的无刺激和在脑控制刺激期间的正常步态的比例。常规步态是猴子没有绊倒或跳跃的所有步态。(e)主成分(PC)分析应用于从所有常规步骤计算的一组26个步态参数。每个步骤显示在由第一和第二PC定义的空间中。条形图显示了在由26个步态参数跨越的欧几里得空间中计算的损伤前和损伤后规则步骤之间的平均欧氏距离。

3、MPTP处理后，皮层神经活动保持解码预测肌肉活动的准确性，如图3所示。其中，(a)用MPTP处理两只猴子，引起黑质(SN)中多巴胺能神经元的死亡。本申请的发明人使用运动皮质神经信号来解码运动期间记录的EMG活动。(b)点显示解码精度，如通过解释的方差(r2)的比率测量的。

4、脑-脊髓电环路缓解了步态后的步态缺陷脊髓损伤，如图4所示。其中，(a)使用生物素化葡聚糖胺(biotinylated dextran amine，BDA)对损伤位置和皮质脊髓束进行标记。右图：猴子Q2和Q3对解剖重建包含病变(灰色)的脊髓节段。图(1)和(2)：脊髓损伤的纵向视图，标记星形胶质细胞(胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP；灰色)，神经元(抗NeuN抗体，NeuN；青色)和皮质脊髓束轴突(BDA，粉红色)。星号表示病变。总览比例尺为500μm，插图比例尺为50μm。(b)猴Q2脊髓损伤6天后，在无刺激运动期间及屈伸热点刺激期间进行的步态周期。图3：肢体瘫痪显示为红色。(c)从视频记录中提取的快照显示了猴Q2脊髓伤后6天在没有刺激的情况下和在脑控制刺激期间的一系列腿部运动。时间线表示视频快照时间。(d)条形图显示无刺激期间(第6天n＝6，第14天n＝39，第6天n＝68)和受控脑刺激期间(第6天n＝12，第2天n＝93，第3天n＝31)受影响腿与未受累腿的步数之间的比率。(P<0.001，自举；误差线：平均数标准误差)(e)主成分分析用于分析猴子Q2的26个步态参数。所有与肢体瘫痪或绊倒相对应的步态周期都不包括在本分析中。每个步态周期都在PC1和PC2定义的空间中显示。条形图显示在整个运动学空间中计算的损伤前和损伤后与行走相关的平均欧几里得距离。(P<0.001，Wilcoxon秩和检验。误差线：平均数标准误差)。

5、空间选择性脊柱植入物的设计和制造

第一个扩展数据，如图5所示。

步骤1：测量椎骨T12-L4及脊椎节段L1-S1的长度。照片显示L3和S1脊柱节段的左半部分的冠状切片，包括硬脑膜，背根和脊髓组织。补充的视图显示相机上对脊神经根、白质和灰质透明区的重建。投射到L1/L2和L6/L7脊神经背根用颜色编码以显示它们各自的位置。

步骤2：整个腰骶脊髓和脊髓背根的三维重建。为了可视化支配包含目标伸展(L6，L7)和屈曲(L1，L2)热点的脊椎节段的背根的空间轨迹，用颜色将其编码。通过背侧视图及沿躯体纵轴向左侧旋转45°的视图进行三维重建。

步骤3：空间选择性脊柱植入物的设计，包括电极相对于背根的位置及植入物相对于椎骨的位置。青色和洋红色分别突显针对屈肌和伸肌热点的电极。

步骤4：空间选择性硬膜外植入术的掩模设计。

步骤5：脊柱植入物的制造。然后通过旋涂施加20um厚的光敏聚酰亚胺覆盖层以均匀地覆盖底部和电极结构。首先，通过旋转涂布的方法将40um厚的聚酰亚胺薄膜覆盖到硅基板上。通过紫外线光刻技术实现组成植入物覆盖区的聚酰亚胺基底层。通过真空蒸发及光刻结构化技术覆盖一层200nm厚的金层，用于形成一个导电的阵列源模式。再覆盖一层6um厚的金层用于形成电极和互联。再通过旋转涂布的技术将20um厚的光感聚酰亚胺层均匀地覆盖底部和电极结构。植入物顶层通过紫外光刻技术在电极和接触垫上形成开口。载体晶片慢慢释放植入物。为了创建一个连接器，将位于植入物末端的接触垫粘贴到由医用级聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)片材制成的小支撑板上。精密研磨的对齐结构支持支撑板与脊柱植入物以及引线末端的微调。带有硅橡胶绝缘层的不锈钢导线通过位于印刷电路板上的接触条直接焊接到植入物的接触垫上。最终的植入物和连接导线在机械和电气方面都非常可靠。医用级钛的三维激光烧结固定结构。

步骤6：包括放大的插图在内的图片显示了制作的脊柱植入物和植入后进行的微型计算机断层扫描。

6、脊髓刺激系统的方案和技术

第二个扩展数据，如图6所示。

步骤1：神经研究程序员界面(屏幕快照)对刺激方案进行编码，这些刺激方案被预编程到上传到一个植入式脉冲发生器的表格中。该表的每一行对应于特定的电极配置(阴极和阳极)和刺激特征(振幅，频率，脉冲宽度和刺激持续时间)。在实验过程中，控制计算机选择要执行的行。该图显示了由解码器和神经研究程序员之间的通信引起的时间延迟的分布(n＝5,000)。

步骤2：将刺激命令传输到植入式脉冲发生器。命令首先通过蓝牙传输到一个模块，该模块将它们转换成传输到刺激编程器设备的红外信号。在实验过程中，蓝牙至红外模块和刺激编程器嵌入猴子穿的夹克中。刺激程序员通过感应遥测技术将刺激命令发送到植入式脉冲发生器。将天线置于护套下面，与皮肤接触并与植入式脉冲发生器对齐。该图显示了将神经研究编程器的刺激命令传输到植入式脉冲发生器所需的延迟分布。

步骤3：植入式脉冲发生器执行选定的刺激方案。在执行刺激命令之后，植入式脉冲发生器切换到空闲模式。插图中显示了单电荷平衡阴极脉冲的形状。该图显示了由植入式脉冲发生器执行单个刺激命令所需的时间延迟分布。

7、解剖、计算机和功能实验允许识别刺激方案以激活屈伸热点

第三个扩展数据，如图7所示。

步骤1：估计运动过程中运动神经元激活的时空图的计算过程。步骤1:为了在运动期间记录肌电信号，跨越腿的每个关节的四对拮抗肌被植入双极电极。

步骤2：使用Butterworth三阶滤波器(30-800Hz，猴子P3)通过带通滤波对在跑步机上运动期间的肌肉活动进行记录。

步骤3：以10Hz的低通滤波纠正信号，标准化在所有步态周期中记录的最大活动，然后投射到记录的每个肌肉在脊髓中相应运动神经元列的位置。用颜色标记对时空图表示运动神经元激活。

步骤2：记录在三只完整猴子(Q1，P2和P3)中的运动神经元活动的时空图。通过平均在跑步机上连续运动期间记录的肌电信号获得时空图(猴子Q1，P2和P3，n＝73,25和24)。通过平均估计运动神经元活动周围的足部活动和足部活动分别提取伸展和屈曲热点激活的时空图。为此，一个窗口被定义为脚踏地面的步态周期持续时间的-10％到+30％，以及向前运动的步态周期持续时间的-10％到+20％。这些时空图可以在猴子间重现。对于Q1-P2，Q1-P3和P2-P3，猴Q1，P2和P3之间屈曲热点的相关分别为0.94,0.90和0.90。对于Q1-P2，Q1-P3和P2-P3，猴子Q1，P2和P3之间伸展热点的相关分别为0.88,0.90和0.60。得到的时空图投影到重建的脊柱节段上(图5)。

步骤3：招募曲线显示由单次脉冲硬膜外电刺激引起后肢肌肉运动诱发电位与三只完整猴子(Q1，Q2和P1)的刺激振幅之间的关系。通过电极定位于屈伸热点的电极对刺激进行传导。对腿部肌肉引起的复合反应进行矫正并整合以计算响应的幅度，然后将其投影到重建的脊柱节段上。空间图显示每只猴子的电极相对于脊柱段的位置、对运动神经元激活的刺激振幅最佳范围。为了计算每个热点的刺激幅度的最佳范围，我们提取刺激幅度，运动神经元激活的空间图显示与目标热点的空间图相关的最高值。青色和洋红色阴影突出显示每个热点和猴子的刺激幅度的功能范围。

8、扩展数据图4：校准解码器以实时检测电机状态的过程。

步骤1：使用摄像机系统记录右腿的运动。同时，从植入主运动皮层腿部区域的微电极阵列记录神经信号。信号进行了带通滤波(0.5-7.5kHz)。阈值是标准偏差的3-3.5倍以获得峰值事件。这两个数据流保存在电脑上。

步骤2：视频帧的视觉检查允许识别脚步踩踏地面和向前运动的事件。我们利用每20ms更新一次的重叠150ms分档的估计了峰值速率。然后使用与标记视频记录开始的神经数据一起保存的触发器，将步态事件与峰值速率估计同步。

步骤3：我们提取起源于脚步踩踏地面和向前运动事件的特征向量，将它们分别标记为脚步踩踏地面和向前运动的动作状态。其他特征向量标记为“均否”。

步骤4：特征向量的运动状态类别被用来校准正则化的线性判别分析解码器。

步骤5：将解码器上传到我们在控制计算机上运行的实时分析应用程序中。实时收集神经数据，处理成峰值速率估计值，并通过解码器计算脚踏地面和向前运动的概率。当其中一个运动状态概率超过0.8的阈值时，触发屈曲或伸展热点刺激方案的命令被发送给神经研究程序员，该程序员将该指令传达给植入的脉冲发生器。由于无线通信的延迟，在检测到运动状态后，执行命令分别需要178ms(Q1)和105ms(Q2和Q3)。

9、实时解码器在未受损的猴子的运动过程及运动启动和终止时准确检测运动状态并触发刺激方案

第四个扩展数据，如图9所示。

例子：在完整猴子Q2病变前期的脑控制屈伸刺激期间连续运动序列(20秒)。与图3中的相同。实时解码器正确检测到在该序列中出现的22个连续的脚步踩踏地面和向前运动事件(垂直虚线)，并且在整个运动过程中适当地触发了相关的刺激方案序列。

步骤1：柱状图显示测试的完整猴子(Q1和Q2)的所有记录中脚踏地面和向前运动事件的实际发生与这些运动状态的解码发生之间的时间差异的分布。虚线表示每个分布的中位数。对于猴Q1，解码器仅使用没有刺激的记录进行校准。对于Q2猴子，我们通过执行两次校准来提高解码器的准确度。首先，使用没有刺激的记录重新校准解码器。这些解码器用于独立收集脑控制屈伸期间的记录。然后使用所有记录块一起校准新的解码器。

步骤2：混淆矩阵显示了实时解码器在没有刺激及在脑控制刺激期间的准确度，容限窗口；±125ms。条形图显示了与随机解码器和机会级别解码器相比，实时解码器计算了归一化互信息。随机解码器也可以使用混洗步态事件进行校准。而机会水平解码器随机分配利用在线编码器校准通过数据估算出来的机会水平概率，其速率与在线解码器的速率相同。***P<0.001，自举。误差：平均数标准误差。

步骤3：收集猴子Q1和Q2在跑步机上开始或终止连续运动的序列。绿色阴影区域表示跑步机关闭期间。在整个记录过程中，脑-脊柱电环路都正常工作。与图3相同。在休息期间，脚踩踏地面和向前状态的概率较低，并在猴子恢复持续运动时重新开始调整运动状态的发生。解码器混淆矩阵是在未损伤猴子在关闭跑步机时脑控制的刺激期间计算的(Q1：n＝345；Q2：n＝127)。假阳性检测很少见。

10、在未损伤猴子的脑控制刺激期间腿部运动的调节

第五个扩展数据，如图10所示。

步骤1：主成分分析应用于没有刺激期间(n＝125和n＝119，Q1和Q2)、脑控制的伸展刺激期间(n＝33和n＝54，Q1和Q2)及脑控制屈曲刺激期间(n＝98和n＝120，Q1和Q2)在跑步机上的个体运动步态周期。与图3和扩展数据图7相同。该分析强调了分别增加伸展和屈曲热点刺激的频率或振幅时步态参数的分级调节作用。

步骤2：图例显示伸肌(洋红色)或屈肌(青色)热点刺激的幅度或频率与右腿伸展或屈曲相关的运动学或肌肉活动参数之间的关系。右上图显示了每个实验条件下的平均脚部轨迹，说明了在受控制的屈曲热点刺激期间屈曲的分级调制。右下图显示了在整个测试刺激参数范围内腿部特定调节的高度程度。在Q1和Q2猴中结果存在可比性。*P<0.05，**P<0.001，Wilcoxon秩和检验。误差：平均数标准误差。

11、脊髓损伤的量化和重建以及脊髓损伤后步态缺陷和自发恢复的量化

第七个扩展数据，如图11所示。

步骤1：图解说明量化皮质脊髓束损伤的解剖实验。将顺行解剖示踪剂BDA注射到支配左侧腿部主运动皮层和躯干区域以标记脊髓中的皮质脊髓束纤维，在图片中以粉红色显示。右上方案显示了背部上行通道和参考文献36、37中确定的所有下行通道。对于猴子Q2和Q3，在横跨整个背腹侧损伤脊髓的等间距的矢状面，通过识别胶质瘢痕的边界在二维上重建最大损伤面积。b-e，对于每只猴子，共焦照片显示在特定背腹水平处损伤的脊髓的纵向切片，如虚线所示。在每张照片中，以下解剖元素被标记：星形胶质细胞(GFAP，灰色)，神经细胞体(NeuN，青色)和皮质脊髓束轴突(BDA，粉红色)。图中显示了同一照片的选定区域(白色方块)的高分辨率照片，该图显示损伤上完整的皮质脊髓束轴突，损伤正上方的轴突回缩球和损伤下方的轴突缺失。猴子Q2在背外侧柱的背侧显示了一小部分备用的皮质脊髓束轴突。星号表示病变的位置。宏观图片比例尺，500μm，嵌入比例尺，50um。f在猴子Q2、Q3脊髓损伤后2周、99天的运动记录中提取步态周期。分析仅适用于分类为行走的步态周期，其中不包括分类为肢体瘫痪或绊倒的步态周期。分析的步态周期数直接记录在图中。条形图显示在给定记录日的所有步数之间的平均欧几里得距离，在26个运动学参数的整个空间中计算无刺激和损伤前记录的步数。其他柱状图报告相关运动学参数的平均值。这一分析说明了运动在逐步但不完全的恢复。***P<0.001，Wilcoxon秩和检验。误差：平均数标准误差。

12、脊髓损伤后地面运动过程中腿部运动的恢复

第八个扩展数据，如图12所示。

步骤1：在猴子Q2的病变后7天和13天记录的无刺激和脑控制刺激期间沿直道走廊行走的代表性运动序列。与图4中的相同。条形图显示摆动期间右侧(损伤的)腿的平均步高。*P<0.05，Wilcoxon秩和检验。误差：平均数标准误差。

步骤2：从视频记录中提取的快照显示猴子Q2脊髓损伤后7天在没有刺激或受脑控制刺激期间在一次步行周期中腿部运动的代表性序列。符号图使用与图a中的相同的配色方案对右侧(病变侧)腿和脚的轨迹的进行颜色编码。如果没有刺激，猴子会沿着地面拖动腿部，而大脑控制的刺激可以恢复脚踏步的负重运动。

13、在脊髓损伤后脑控制刺激期间步态改善和解码准确性的量化。

第九个扩展数据，如图13所示。

步骤1：脊髓损伤后6、14天，猴子Q2在没有刺激、脑控制刺激的作用下在跑步机上的两个连续的步态周期。与图4中的相同。此外，通过记录包括病变前运动、脑控制刺激后明显改善的运动在内的所有记录的步态周期，计算平均脚轨迹。

步骤2：条形图显示猴子Q2和Q3在脊髓损伤前后没有刺激和脑控制刺激期间的运动角度，步高和脚运动轨迹面积的总偏移的平均值。分析仅适用于分类为行走的步态周期(不包括分类为肢体瘫痪或绊倒的步态周期)。(Q2：损伤前n＝294，损伤后第6天无刺激n＝6，脑控制n＝12，第14天无刺激n＝39，脑控制n＝93。Q3：脊髓损伤前n＝185，伤后第16天无刺激n＝98，脑对照n＝31)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，Wilcoxon秩和检验。误差：平均数标准误差。

步骤3：条形图显示猴子在强加的跑步机皮带速度下行走的能力。功能评分是按照猴子能够以跑步机带速行走的常规步数(不会碰到跑步机后面，不包括分类为单足跳跃或绊倒的步态周期)的百分比来计算的。*P<0.05，***P<0.001，自举。误差：平均数标准误差.。

步骤4：脊髓损伤后恢复期间解码精度增加。计算的解码器混淆矩阵显示猴子Q2在第6天(脚踩踏地面n＝76，向前运动n＝74)和受伤后第14天(脚踩踏地面n＝264，向前运动n＝264)猴子Q3在第16天(脚踩踏地面n＝319，向前运动n＝321)在脑控制刺激期间实时解码器和机会水平解码器的准确性。容限窗口设置为±125ms。条形图显示随机解码器和机会级别解码器相比较为实时解码器计算的规范化互信息。***，**P<0.001和P<0.01。自举。误差：平均数标准误差。

步骤5：上图从左至右显示：通过逐步降低猴子Q1至Q3的步态周期阶段的峰值速率引起的平均事件发生率、调制深度及记录获得的神经元峰值信号的优选方向。优选方向定义为拟合调谐函数最大的角度。下图从左到右：平均事件率的平均绝对单电极差异，调制深度及上图中显示的两个连续步数之间的首选方向。分析显示脊髓损伤前后均有实质性变化。尽管如此，损伤前最后一次记录和损伤后的第一次记录之间的变化率大大高于任何两个其他两个记录之间的变化率，因此表明脊髓损伤后可塑性水平增加。**P<0.01，***P<0.001，蒙特卡洛，Wilcoxon秩和检验，Wilcoxon符号秩检验和自举。误差：平均数标准误差。

14、刺激的时间结构和特征决定了步行的数量和质量。

第十个扩展数据，如图14所示。

步骤1：猴子Q2脊髓损伤后6天脑控制刺激下的最优及次优的时间结构及猴子Q2在脊髓损伤后14天在脑连续刺激的最优及次优的时间结构。当刺激超过±125ms容限时，步态周期被分类为次优的时间结构。与图4中的相同。

步骤2：条形图显示在运动期间计算的步数。在脊髓损伤后第6天、14天及16天，在最优及次优的时间结构下以一定范围的刺激频率连续刺激猴子Q2和Q3。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，自举。误差：平均数标准误差。

步骤3：条形图显示与图b相同条件下的步行质量。如图4显示，由26个步态参数定义的运动空间中计算的损伤前后步态周期之间的平均欧几里德距离评价步行质量。这些结果显示与次优时间结构相比，最优时间结构导致步数增加和步进质量提高。

步骤4：此外，最优、次优时间结构下、与连续相同刺激相比，脑控制刺激可显著改善运动表现。这些结果还突出了在调整刺激频率时优化运动性能的能力。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，Wilcoxon秩和检验。误差：平均数标准误差。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：脊髓回路的神经刺激

选取恒河猴为模型动物，将96通道的微电极阵列植入恒河猴指导腿部运动的左侧运动皮层内，同时记录腿部肌肉的肌电图信号；将双极电极植入横跨右腿每个关节的拮抗肌，同时监测肌电信号；

步骤2：中脑运动区的神经刺激

使用步骤1中的数据分析，在中脑神经调节前后，观察脑活动、肌肉协调作用及进行下肢运动比较；

步骤3：治疗效果评价

通过应用运动模式，分别测试步骤1中对脊髓回路的神经刺激结果，以及步骤2中对中脑神经的刺激结果，评价治疗效果。

2.根据权利要求1所述的一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法，其特征在于，步骤1中，所述恒河猴为健康雄性恒河猴，年龄为4-9岁，体重为4.3kg-8.4kg，平均为6.5±0.5kg。

3.根据权利要求1所述的一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法，其特征在于，步骤1中，所述腿部肌肉包括臀中肌、髂腰肌、股直肌、半腱肌、腓肠肌、胫前肌、趾长伸肌和长屈肌。

4.根据权利要求1所述的一种改善帕金森运动障碍的神经刺激方法，其特征在于，步骤1中，所述拮抗肌包括髂腰肌、臀中肌、股直肌、半肌腱、腓肠肌、内侧、胫骨前肌、趾长伸肌和拇长屈肌。