CN108938639B - 化合物nsc305780在制备治疗或预防流感病毒的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化合物NSC305780在制备治疗或预防流感病毒的药物中的应用。本发明保护化合物(a)或化合物(b)的应用，为如下(1)或(2)：(1)制备抑制流感病毒的药物；(2)抑制流感病毒；化合物(a)为式(I)所示化合物；化合物(b)为式(I)所示化合物的溶剂合物。本发明对于流感病毒的防治具有重大价值。

Description

化合物NSC305780在制备治疗或预防流感病毒的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及一种化合物NSC305780在制备治疗或预防流感病毒的药物中的应用。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属。根据病毒粒子核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段1至节段8命名。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可进一步分为17个H(H1-H17)和10个N(N1-N10)亚型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型。而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7和H9亚型，其中以H5N1亚型致死率最高。

流感病毒的整个生活周期需要在细胞质和细胞核内完成。感染的起始是病毒颗粒表面的刺突HA识别和结合宿主细胞表面的唾液酸受体，与受体结合后病毒粒子以内吞体的形式进入到宿主细胞。在内吞体的酸性pH条件下病毒HA蛋白的构象发生变化，位于轻链N端的融合肽暴露，病毒囊膜与细胞膜融合。低pH环境也致使大量H⁺经由M2离子通道进入病毒粒子内部，导致M1蛋白与vRNP的解离。两者的共同结果致使病毒粒子的vRNP释放到被感染细胞的胞浆。vRNP随后转到细胞核内进行基因组的复制和转录，复制时病毒首先以自身RNA为模板合成互补RNA(cRNA)，然后以cRNA为模板再合成vRNA。转录生成的mRNA由核内转移到胞浆，翻译出病毒的结构蛋白和非结构蛋白。一部分合成蛋白(如NP)需要重新转移到核内与新生成的vRNA组成vRNP，vRNP出核后与其余的病毒蛋白开始组装成新的病毒粒子，新生成的子代病毒通过神经氨酸酶(NA)水解细胞表面的糖蛋白，释放N-乙酰神经氨酸，促使病毒粒子从出芽位点释放出来。

防治流感的基本手段分为疫苗注射以及药物治疗两种。疫苗的有效性建立在制备疫苗的毒株与环境中存在的或者是将要造成流行的流感病毒毒株的相似性，而由于流感病毒极易发生变异，给预测的准确性增加了困难，进而使疫苗防治的效果受到极大的影响。在疫苗有效性难以把握的情况下，抗流感病毒的药物研究就显得尤为重要。而目前FDA批准上市的抗流感药物只有四种：金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦、扎那米韦。前两种属于M2离子通道抑制剂，通过抑制病毒RNA释放到胞质抑制病毒的复制。后两种属于NA活性抑制剂，通过抑制病毒粒子的释放和扩散抑制病毒的复制。然而，随着病毒对这些药物抗药性的产生以及这些药物引起的副反应等问题使得新型抗流感病毒药物的研发迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种化合物NSC305780在制备治疗或预防流感病毒的药物中的应用。

本发明首先要求化合物(a)或化合物(b)的应用，为如下(1)或(2)：

(1)制备抑制流感病毒的药物；

(2)抑制流感病毒。

所述抑制流感病毒可体现为抑制流感病毒复制。所述流感病毒可为A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒，具体可为A型流感病毒，更具体可为A型流感病毒H1N1亚型，进一步具体可为A/WSN/33毒株。

本发明还保护一种抑制流感病毒的药物，其活性成分为化合物(a)或化合物(b)。所述抑制流感病毒体现为抑制流感病毒复制。所述流感病毒可为A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒，具体可为A型流感病毒，更具体可为A型流感病毒H1N1亚型，进一步具体可为A/WSN/33毒株。

本发明还保护化合物(a)或化合物(b)在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下((c1)和/或(c2)和/或(c3)：(c1)抗流感病毒；(c2)治疗流感；(c3)预防流感。所述(c1)中，所述流感病毒可为A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒，具体可为A型流感病毒，更具体可为A型流感病毒H1N1亚型，进一步具体可为A/WSN/33毒株。所述(c2)和/或(c3)中，所述流感可为A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒引起的流感，具体可为A型流感病毒引起的流感，更具体可为A型流感病毒H1N1亚型引起的流感，进一步具体可为A/WSN/33毒株引起的流感。

本发明还保护一种药物，其活性成分为化合物(a)或化合物(b)；所述药物的功能为如下((c1)和/或(c2)和/或(c3)：(c1)抗流感病毒；(c2)治疗流感；(c3)预防流感。所述(c1)中，所述流感病毒可为A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒，具体可为A型流感病毒，更具体可为A型流感病毒H1N1亚型，进一步具体可为A/WSN/33毒株。所述(c2)和/或(c3)中，所述流感可为A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒引起的流感，具体可为A型流感病毒引起的流感，更具体可为A型流感病毒H1N1亚型引起的流感，进一步具体可为A/WSN/33毒株引起的流感。

以上任一所述化合物(a)为式(I)所示化合物。

以上任一所述化合物(b)为式(I)所示化合物的溶剂合物。

所述式(I)所示化合物的溶剂合物为式(I)所示化合物的乙醇合物。

所述化合物(b)为式(II)所示化合物。

所述式(II)所示化合物为化合物NSC305780。

本发明通过实验发现，化合物NSC305780对于治疗或预防流感病毒有重要作用。本发明对于流感病毒的防治具有重大价值。

附图说明

图1为实施例2的结果。

图2为实施例3的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

化合物NSC305780：来自NCI Diversity Set II library化合物库(https：//dtp.cancer.gov/organization/dscb/obtaining/available_plates.htm、https：//dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/ChemData？outputformat＝html&searchtype＝NSC&searchlist＝305780)；化合物NSC305780的分子式为C₁₈H₁₄N₄S·1/2C₂H₆O，分子量为341.0，化合物编号为：NSC 305780，结构式如下：

PBS缓冲液(pH7.0-7.2)：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g、KH₂PO₄0.27g，超纯水定容至1L。

293T细胞(人肾上皮细胞)：ATCC，编号为CRL-11268。

DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)：Gibco公司。

转染试剂PEI(按说明书操作)：Polyscience公司。

荧光素酶活性测量试剂盒：Promega公司。

三氮唑核苷病毒唑(利巴韦林)：Sigma公司。

蛋白酶抑制剂：购自Roche公司。

A/WSN/33流感病毒毒株(简称A/WSN/33毒株)：为A型流感病毒H1N1亚型毒株，该毒株记载于“Neumann G1，Watanabe T，Ito H，et al.Generation of influenza A virusesentirely from cloned cDNAs.PNAS，1999(16)：9345-9350”一文，在文献中的名称为“Influenza viruses AyWSNy33(H1N1)”，公众可从浙江立恩生物科技有限公司获得。

pREP4载体：记载于“李云芳，张幼怡，侯嵘等.质粒转染对HEK293和DDT1-MF2细胞天然β2-肾上腺素受体表达的影响.北京大学学报：医学版，2001年底5期”一文，公众可从浙江立恩生物科技有限公司获得。

pHH21载体：记载于“Neumann G1，Watanabe T，Ito H，et al.Generation ofinfluenza A viruses entirely from cloned cDNAs.PNAS，1999(16)：9345-9350”一文，公众可从浙江立恩生物科技有限公司获得。

pNLLucE-R-HIV-Luc质粒、pEWSN-HA质粒和pCAGGS-NA质粒：参考文献：JunjieZhang，Ting Liu，Xiaomei Tong，Jinghua Yan，Xin Ye，et al.Identification of novelvirus inhibitors by influenza A virus specific reporter cellscreening.Antivirus Research.2011；93：48-54.，公众可从浙江立恩生物科技有限公司获得。

实施例1、293T-IAV-Luc细胞的制备

一、pREP4-IAV-Luc质粒的构建

1、人工合成序列表中序列1所示DNA片段。序列1共由1748个核苷酸组成，第14-58位记为片段1，第59-1711位为萤火虫荧光素酶编码基因(报告基因)，第1712-1734位记为片段2，两端为BsmB I的识别位点序列。其中，片段1和片段2均为流感病毒NP蛋白的启动子，在流感病毒存在的情况下，位于该融合质粒上的该启动子可被启动，萤火虫荧光素酶才能够表达。

2、用限制性内切酶BsmBI酶切序列表中序列1所示的DNA片段，回收酶切片段后与经过同样酶切的pHH21载体的骨架大片段正向相连，将测序验证正确的中间质粒命名为pHH21-IAV-Luc质粒。将pHH21-IAV-Luc质粒以NheI和PciI内切酶(Takara)酶切，回收酶切片段，以Klenow酶(购自Takara公司)补平末端后连入PvuII内切酶消化的pREP4载体，将测序验证正确的重组质粒命名为pREP4-IAV-Luc。

二、293T-IAV-Luc细胞的制备

将重组质粒pREP4-IAV-Luc导入293T细胞，得到重组细胞，命名为293T-IAV-Luc细胞。

实施例2、化合物NSC305780抑制H1N1亚型流感病毒的复制

1、将A/WSN/33毒株、DMEM培养基和化合物NSC305780混合，得到混合液。混合液中含有0.5MOI病毒和50μmol/L化合物NSC305780。

2、将实施例1制备的293T-IAV-Luc细胞均匀的铺于96孔板上(每孔20000个细胞)，37℃静置培养12小时，弃上清，用PBS缓冲液清洗孔中的细胞。

3、完成步骤2后，取所述96孔板，加入步骤1得到的混合液，37℃静置孵育1小时，弃上清。

4、完成步骤3后，取所述96孔板，加入含10％(体积比)胎牛血清和50μmol/L化合物NSC305780的DMEM培养基，37℃静置培养12小时，弃上清，用PBS缓冲液清洗孔中的细胞。

5、完成步骤4后，取所述96孔板，加入荧光素酶活性测量试剂盒中的裂解液，37℃静置孵育30分钟，取上清。

6、取步骤5得到的上清，采用荧光素酶活性测量试剂盒检测荧光素酶报告基因的表达水平。

设置采用DMSO替代化合物NSC305780的阴性对照。

进行三次重复试验，结果取平均值。

结果见图1(图1中，DV代表阴性对照)。结果表明，化合物NSC305780可以抑制流感病毒的复制。

实施例3、化合物NSC305780抑制HA假病毒的活性

一、制备HA假病毒

将293T细胞接种至细胞培养皿，达到80％密度后借助转染试剂PEI共转染6μgpNLLucE-R-HIV-Luc质粒、6μg pEWSN-HA质粒和6μg pCAGGS-NA质粒，6小时后更换为含10％(体积分数)胎牛血清的DMEM完全培养基，48小时后将整个培养体系转移15ml离心管中，吹散细胞，冻融一次后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为HA假病毒的病毒液，-80℃保存。

二、化合物NSC305780抑制HA假病毒的活性

1、将293T细胞均匀铺于24孔板上(每孔16万个细胞)，37℃静置培养15小时，弃上清。

2、完成步骤1后，取所述24孔板，每孔加入100μL步骤一制备的HA假病毒的病毒液(病毒含量为0.5MOI)和400μl含化合物NSC305780的DMEM培养基(使得化合物NSC305780在体系中的浓度为50μM)，37℃静置孵育18小时，用PBS缓冲液清洗孔中的细胞。

3、完成步骤2后，取所述24孔板，加入荧光素酶活性测量试剂盒中的裂解液，37℃静置孵育30分钟，取上清。

4、取步骤3得到的上清，采用荧光素酶活性测量试剂盒检测荧光素酶报告基因的表达水平。

设置采用DMSO替代化合物NSC305780的阴性对照。

进行三次重复试验，结果取平均值。

结果见图2(图2中，DV代表阴性对照)。化合物NSC305780具有抑制HA假病毒复制的活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江立恩生物科技有限公司

<120> 化合物NSC305780在制备治疗或预防流感病毒的药物中的应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1748

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atacgtctcg gggagtagaa acagggtaga taatcactca ctgagtgaca tcggtaaaat 60

ggaagacgcc aaaaacataa agaaaggccc ggcgccattc tatccgctgg aagatggaac 120

cgctggagag caactgcata aggctatgaa gagatacgcc ctggttcctg gaacaattgc 180

ttttacagat gcacatatcg aggtggacat cacttacgct gagtacttcg aaatgtccgt 240

tcggttggca gaagctatga aacgatatgg gctgaataca aatcacagaa tcgtcgtatg 300

cagtgaaaac tctcttcaat tctttatgcc ggtgttgggc gcgttattta tcggagttgc 360

agttgcgccc gcgaacgaca tttataatga acgtgaattg ctcaacagta tgggcatttc 420

gcagcctacc gtggtgttcg tttccaaaaa ggggttgcaa aaaattttga acgtgcaaaa 480

aaagctccca atcatccaaa aaattattat catggattct aaaacggatt accagggatt 540

tcagtcgatg tacacgttcg tcacatctca tctacctccc ggttttaatg aatacgattt 600

tgtgccagag tccttcgata gggacaagac aattgcactg atcatgaact cctctggatc 660

tactggtctg cctaaaggtg tcgctctgcc tcatagaact gcctgcgtga gattctcgca 720

tgccagagat cctatttttg gcaatcaaat cattccggat actgcgattt taagtgttgt 780

tccattccat cacggttttg gaatgtttac tacactcgga tatttgatat gtggatttcg 840

agtcgtctta atgtatagat ttgaagaaga gctgtttctg aggagccttc aggattacaa 900

gattcaaagt gcgctgctgg tgccaaccct attctccttc ttcgccaaaa gcactctgat 960

tgacaaatac gatttatcta atttacacga aattgcttct ggtggcgctc ccctctctaa 1020

ggaagtcggg gaagcggttg ccaagaggtt ccatctgcca ggtatcaggc aaggatatgg 1080

gctcactgag actacatcag ctattctgat tacacccgag ggggatgata aaccgggcgc 1140

ggtcggtaaa gttgttccat tttttgaagc gaaggttgtg gatctggata ccgggaaaac 1200

gctgggcgtt aatcaaagag gcgaactgtg tgtgagaggt cctatgatta tgtccggtta 1260

tgtaaacaat ccggaagcga ccaacgcctt gattgacaag gatggatggc tacattctgg 1320

agacatagct tactgggacg aagacgaaca cttcttcatc gttgaccgcc tgaagtctct 1380

gattaagtac aaaggctatc aggtggctcc cgctgaattg gaatccatct tgctccaaca 1440

ccccaacatc ttcgacgcag gtgtcgcagg tcttcccgac gatgacgccg gtgaacttcc 1500

cgccgccgtt gttgttttgg agcacggaaa gacgatgacg gaaaaagaga tcgtggatta 1560

cgtcgccagt caagtaacaa ccgcgaaaaa gttgcgcgga ggagttgtgt ttgtggacga 1620

agtaccgaaa ggtcttaccg gaaaactcga cgcaagaaaa atcagagaga tcctcataaa 1680

ggccaagaag ggcggaaaga tcgccgtgta aagaaaaata cccttgtttc tactaatatg 1740

agacgtat 1748

Claims (3)

1.化合物（a）在制备抑制流感病毒的药物中的应用；所述流感病毒为A型流感病毒H1N1亚型；

化合物（a）为式（Ⅰ）所示化合物；

式（Ⅰ）。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制流感病毒体现为抑制流感病毒复制。

3.化合物（a）在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下（c1）和/或（c2）：（c1）治疗流感；（c2）预防流感；所述流感由A型流感病毒H1N1亚型导致；

化合物（a）为式（Ⅰ）所示化合物；

式（Ⅰ）。

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