CN108929683A - 食源性纳米粒子的制备方法 - Google Patents

食源性纳米粒子的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食源性纳米粒子的制备方法，本方法以烤制猪五花肉为原料，经乙醇提取、三氯甲烷萃取及D101大孔吸附树脂柱纯化步骤制备食源性纳米粒子，本发明制备的纳米粒子具有良好的荧光性能，并且光稳定性好，生物相容性好等优点，可作为荧光染料用于模式生物秀丽隐杆线虫的活体成像，在荧光标记和基于秀丽隐杆线虫的安全性评价方面具有良好的应用前景。

Description

食源性纳米粒子的制备方法
技术领域
本发明涉及一种食源性纳米粒子的制备方法。
背景技术
纳米技术包含开发、表征和尺寸较广的纳米材料的应用，控制材料在1-100 nm长度范围内的结构和性能，可以产生新的对商业应用有利的属性，与块状材料相比，纳米材料尺寸更小，因此会表现出许多常规材料不具备的特性，产生的纳米效应使得材料本身在许多方面都提高了性能，有着显著的优势，比如在食品工业中，纳米材料可以提高食品质量、延长保质期、降低成本、提高营养等，也可用于改变食品的质地、外观或稳定性，其中功能性纳米材料受到人们广泛关注，如碳、半导体和磁性纳米材料等。
纳米粒子（nanoparticles），指微粒尺寸处在原子簇与宏观物体相交的过渡区域，又称超细微粒，纳米粒子在激发光谱、发射光谱、激发与发射波长、光稳定性等方面表现出特别的光电性质，拥有良好的荧光效应，可应用于生物、医药、食品、电子器械、化妆品以及材料等各个领域，纳米粒子在食品中很常见，如牛奶中的酪蛋白胶束或者动植物器官中的某些细胞均能发现纳米粒子，研究表明环境中的纳米粒子可以通过呼吸系统、皮肤接触、饮食等途径进入人或动物体内，在体内积累、转移，对细胞或各器官产生潜在损伤。
发明内容
本发明的目的是针对现有提取的纳米粒子进行生物安全性评价提供一种食源性纳米粒子的制备方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种食源性纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
A、制备纳米粒子，以猪五花肉为原料进行烤制，将烤制后的猪五花肉浸泡在无水乙醇中并均匀搅拌，浸提完成后除去不溶性残渣，使用旋转蒸发仪除去乙醇，再利用有机溶剂复溶、将分液漏斗静置分层除去有机溶剂层，然后再加入有机溶剂，反复萃取脱脂直至水相澄清透明，将水溶性提取物过层析柱，收集荧光部分冷冻干燥，得到纳米粒子；
B、分析纳米粒子性质，分析纳米粒子的形貌，元素与官能团组成，光学性质以及荧光寿命；
C、将食源性纳米粒子用于模式生物秀丽隐杆线虫的毒理学评价和活体成像。
所述步骤A中烤制猪五花肉的温度为180-280℃，烤制时间为30min。
所述步骤A中猪五花肉的样品和乙醇质量与体积比为1:1-1:3，浸提时间为2-48h。
所述步骤A中水与有机溶剂的体积比为1:1-1:3。
所述步骤A中层析柱的填料为凝胶、D101大孔树脂。
所述步骤B中纳米粒子的形貌采用透射电镜观察，光学性质采用荧光光谱仪，荧光寿命采用稳态或瞬态荧光分光光度计测定，元素与观能团组成采用X射线光电子能谱以及傅里叶红外光谱仪分析。
所述步骤C中纳米粒子浓度使用0 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL，秀丽隐杆线虫的培养温度为20℃。
本发明一种食源性纳米粒子的制备方法，原料来源于食品、制备过程简单、在激发光谱、发射光谱、激发与发射波长、光稳定性等方面表现出特别的光电性质，可作为荧光染料用于模式生物秀丽隐杆线虫的活体成像，在荧光标记和基于秀丽隐杆线虫的安全性评价方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例2中制备的纳米粒子的透射电子显微镜示意图。
图2是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例2中制备的纳米粒子的XRD的图谱。
图3是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例2中制备的纳米粒子的紫外荧光光谱。
图4 是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例2中制备的纳米粒子的荧光寿命图谱。
图5 是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例2中制备的纳米粒子的FT-IR图谱。
图6 是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例2中制备的纳米粒子的XPS图谱。
图7 是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例2中制备的纳米粒子的pH稳定性的图谱。
图8是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例2中制备的纳米粒子的光稳定性的图谱。
图9是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例3中制备的纳米粒子对于秀丽隐杆线虫致死率图。
图10是本发明一种食源性纳米粒子的制备方法实施例4中制备的纳米粒子在秀丽隐杆线虫的体内分布成像图。
具体实施方式
实施例1：烤肉纳米粒子的制备，500g猪五花，均匀切分小块，经过280 ℃烤制30min，将烤制后的猪五花肉浸泡在1.5L无水乙醇中并均匀搅拌12h，浸提完成后除去不溶性残渣，使用旋转蒸发仪除去乙醇，采用水:三氯甲烷=1:3的混合溶液复溶、然后去除三氯甲烷，反复加入三氯甲烷萃取脱脂，直至水相澄清透明，将水溶性提取物过经过D101大孔吸附树脂柱层析，收集荧光部分冷冻干燥，得到纳米粒子。
实施例2：烤肉纳米粒子性质的表征，S1、烤肉纳米粒子的形态及大小尺寸，如图1是烤肉中纳米粒子的透射电子显微镜照片及粒径统计图，结果显示，经过分离提纯的纳米粒子形态似球型，分布均匀，统计得到烤肉纳米粒子粒径尺寸大小集中分布在4-7nm；S2、烤肉纳米粒子的X射线光电子衍射(XRD)实验，如图2是烤肉纳米粒子的XRD图谱，显示在2θ=23.66°处有一个很宽的中心衍射峰，在其他位置未发现波峰，这显示的是纳米粒子无定形态的特征峰，S3、烤肉纳米粒子的紫外光谱和荧光光谱特征，如图3是烤肉纳米粒子的紫外光谱和荧光光谱，紫外光谱具有两个峰，分别在270nm和325nm，在270nm处推测为n→π*跃迁的特征吸收峰，由烤肉纳米粒子的荧光光谱可见随着波长增加出现了明显的红移现象，纳米粒子的最大激发波长出现在380nm处；S4、烤肉纳米粒子的荧光寿命，图4是烤肉纳米粒子的荧光寿命图谱，配置1mg/mL的烤肉纳米粒子水溶液，在380nm的激发光下激发，最大发射峰在460nm处发射，测得荧光寿命，经拟合计算烤肉纳米粒子的荧光寿命是9.53ns，S5、烤肉纳米粒子的傅立叶变换红外光谱表征，图5是烤肉纳米粒子的红外图谱，图中结果表明经过纯化后的纳米粒子表面含有C-C、C-O、C-N、C-H等官能团组成，S6、烤肉纳米粒子的X射线光电子能谱(XPS)表征，图6是烤肉纳米粒子XPS的图谱。图中结果表明纳米粒子中主要含有C和O两种元素并且含有少量的N元素，S7、烤肉纳米粒子的pH稳定性实验，图7是烤肉纳米粒子的pH稳定性图谱。配置不同pH(2—11)的B-R缓冲溶液，取碳纳米粒子溶液分别加入不同的pH溶液中(1mg/mL)，用荧光分光光度计测荧光强度，取三次平均值，图中可以看出烤肉纳米粒子在强酸性条件下荧光较稳定，在pH＝11处荧光强度有所下降，S8、烤肉纳米粒子的光稳定性实验，图8是烤肉纳米粒子的光稳定性图谱。纳米粒子的荧光强度正常情况为1.0，在荧光照射60 min之内下降至0.8，下降趋势呈阶梯性平稳下降，这表明纳米粒子的稳定性随着荧光照射时间的增加而降低，但总体来说较为稳定。
实施例3：烤肉中的纳米粒子对秀丽隐杆线虫的毒性实验，将野生型N2线虫暴露于不同浓度纳米粒子24h，每个浓度大约20条线虫，暴露结束后，将线虫转移至涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上，在显微镜下观察，每24h对其活性进行评估，如果线虫对小金属丝刺激无反应，则线虫被判断为死亡，通过所剩余存活线虫数量的百分比评估致死率，进行三次平行试验，图9是烤肉纳米粒子对于秀丽隐杆线虫致死率图，当纳米粒子浓度为2.5 mg/mL时，前十一天对线虫的影响较小，存活率与空白组相差不大；但从第十二天开始，线虫存活率明显下降了20%，浓度越升高，线虫受影响越大，当纳米粒子浓度为5mg/mL时，前八天线虫的存活率一直呈大幅度阶梯式递减，线虫全部死亡的总天数也较对照组减少，而10mg/mL的纳米粒子对线虫存活率影响较大，在较短的天数内就可大大降低线虫的存活率，缩短寿命，这说明随着纳米粒子暴露剂量的提高，线虫的存活率呈逐渐下降的趋势，由于所用剂量较大，推测纳米粒子具有较低毒性。
实施例4：烤肉中纳米粒子在秀丽隐杆线虫体内分布成像实验，将野生型N2线虫暴露于5mg/mL纳米粒子24 h，暴露结束后，然后利用激光共聚焦显微镜对线虫体内分布进行成像，激光共聚焦显微镜样品的制备如下：将2%琼脂糖固体进行加热，待融化后取适量琼脂糖滴加到载玻片上，并立即用新的载玻片盖上从而使琼脂糖的厚度较薄，然后水平拿掉其中一片载玻片，将线虫从培养皿转移至1.5 mL 的离心管中，并用M9 溶液清洗几遍以去除虫体表面附着的大肠杆菌，然后收集到有琼脂的载玻片上，加少量的盐酸左旋咪唑使线虫瘫痪，盖上盖玻片并用透明胶带将两边进行固定即可，将培养皿置于激光共聚焦显微镜下，分别在405nm，488nm，543nm波段下激发，观察纳米粒子的线虫标记情况，图10是烤肉纳米粒子在秀丽隐杆线虫的体内分布成像图，如图所示，与对照组相比，经纳米粒子标记的秀丽线虫都能发出明显的荧光，与空白组相对比，样品组中可清楚发现纳米粒子可被线虫吸收，并且荧光强度显著增高，表明纳米粒子在线虫体内的荧光强度积累情况与线虫的进食作用密切相关，由此说明烤肉中纳米粒子可以作为良好的荧光染料应用于模式生物秀丽隐杆线虫荧光成像。

Claims (7)

1.一种食源性纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备纳米粒子，以猪五花肉为原料进行烤制，将烤制后的猪五花肉浸泡在无水乙醇中并均匀搅拌，浸提完成后除去不溶性残渣，使用旋转蒸发仪除去乙醇，再利用有机溶剂复溶、将分液漏斗静置分层除去有机溶剂层，然后再加入有机溶剂，反复萃取脱脂直至水相澄清透明，将水溶性提取物过层析柱，收集荧光部分冷冻干燥，得到纳米粒子；
B、分析纳米粒子性质，分析纳米粒子的形貌，元素与官能团组成，光学性质以及荧光寿命；
C、将食源性纳米粒子用于模式生物秀丽隐杆线虫的毒理学评价和活体成像。
2.根据权利要求1所述的一种食源性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中烤制猪五花肉的温度为180-280℃，烤制时间为30min。
3.根据权利要求1所述的一种食源性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中猪五花肉的样品和乙醇质量与体积比为1:1-1:3，浸提时间为2-48h。
4.根据权利要求1所述的一种食源性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中水与有机溶剂的体积比为1:1-1:3 。
5.根据权利要求1所述的一种食源性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中层析柱的填料为凝胶、D101大孔树脂。
6.根据权利要求1所述的一种食源性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤B中纳米粒子的形貌采用透射电镜观察，光学性质采用荧光光谱仪，荧光寿命采用稳态或瞬态荧光分光光度计测定，元素与观能团组成采用X射线光电子能谱以及傅里叶红外光谱仪分析。
7.根据权利要求1所述的一种食源性纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述步骤C中纳米粒子浓度使用0 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL，秀丽隐杆线虫的培养温度为20℃。
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