CN108904779B

CN108904779B - 曲普瑞林的新应用

Info

Publication number: CN108904779B
Application number: CN201811144736.0A
Authority: CN
Inventors: 曹文宇; 万炜; 王贞; 徐杨; 牛磊; 钟小林; 刘政海
Original assignee: University of South China
Current assignee: University of South China
Priority date: 2018-09-29
Filing date: 2018-09-29
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2038-09-29
Also published as: CN108904779A

Abstract

本申请属于医药领域，公开了曲普瑞林的新应用，尤其是曲普瑞林在制备抑制神经炎症的药物中的应用。实验表明曲普瑞林可以抑制小胶质细胞激活，显著抑制LPS诱导的小鼠海马炎症介质TNF‑α和iNOS的释放。曲普瑞林还能够使LPS诱导的学习记忆损伤小鼠的新旧事物分辨率明显增加，Y迷宫中的自发性交替率明显增加，表明曲普瑞林对LPS诱导的小鼠学习记忆损伤具有明显的保护作用。因此曲普瑞林具有显著的抑制神经炎症活性，可用于制备预防和/或治疗神经炎症以及急慢性神经退行性疾病等其相关疾病的药物，具有较高的临床应用价值和开发前景。

Description

曲普瑞林的新应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及曲普瑞林的新应用，特别涉及曲普瑞林在制备抑制神经炎症的药物中的应用。

背景技术

免疫系统在维护组织稳态以及应对感染和伤害中起着重要的作用。小胶质细胞是中枢神经系统常驻免疫细胞，是单核巨噬细胞家族的成员之一，参与脑内的固免疫反应(Thompson,K K,Tsirka,S E.The Diverse Roles of Microglia in theNeurodegenerative Aspects of Central Nervous System(CNS)Autoimmunity.Int JMol Sci,2017,18:3)。正常情况下小胶质细胞起免疫监视作用，通过简单的吞饮起到清除代谢产物，维护组织稳定的净化作用。在正常的生理条件下，大脑被认为是免疫豁免的。实际上，抗原呈递被主动抑制，小胶质细胞维持在静息状态，而免疫组分被血脑屏障排除在大脑之外。然而，神经损伤或有毒物质的存在，会刺激免疫细胞促炎症介质的释放，这些促炎性介质诱发了神经炎症反应。当神经炎症在适当的时机以适当的程度出现时，它可以解除诱发刺激，并恢复大脑的稳态和功能。有益的急性神经炎症反应可修复已有的损害，并将进一步损伤降至最低。然而如果小胶质细胞发生了持续的过度激活，其过度活化后能产生促炎酶类(iNOS和COX-2)和促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)。此类物质的产生在短期内会引起免疫反应，但是所述物质过量或者持续的产生会引起相邻神经细胞的死亡，从而导致神经退化。而且，因为由死亡的神经细胞所释放的物质会诱导小神经胶质细胞再次活化，所以神经退化会陷入持续的恶性循环(Da,Fonseca AC,Matias,D,Garcia,C,Amaral,R,Geraldo,L H,Freitas,C,Lima,F R,The impact of microglial activation on blood-brain barrier in brain diseases.Front Cell Neurosci,2014,8:362)。

大量临床研究和动物实验证据表明，脑内神经炎症与多种急慢性神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症和亨廷顿氏舞蹈症等的发生和发展密切相关。有研究发现，抑制神经炎症反应能减弱受损脑区的神经元病变或者推迟神经退行性疾病的进程。因此，寻找和研究脑内神经炎症抑制剂，对于开发具有治疗多种急慢性神经退行性疾病的新型药物具有重要的意义。

曲普瑞林属于GnRH激动剂，其化学结构如下，分子式为C₆₄H₈₂N₁₈O₁₃；分子量为1311.45；CAS号为57773-63-4，为白色粉末。其化学式为：

曲普瑞林一般用于治疗需要把类固醇激素如雄性激素和雌性激素降低到低水平的患者。目前文献中还未见报道曲普瑞林可以抑制神经炎症，并据此对中枢神经系统疾病治疗方面的相关研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了GnRH激动剂曲普瑞林的新应用，即曲普瑞林制备抑制神经炎症的药物中的应用。

神经炎症主要以脑内小胶质细胞激活，炎症因子大量释放，并伴随学习记忆障碍为特征的。

在一个实施方案中，本发明以曲普瑞林作为研究对象，首先采用实时荧光定量PCR法考察曲普瑞林对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠小胶质细胞活化标记物CD68和CD11b以及相应炎症相关因子IL-1β和iNOS的影响。结果显示曲普瑞林可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞激活以及炎症因子IL-1β和iNOS的释放。因此本发明提供了曲普瑞林在制备小胶质细胞激活抑制剂和炎症相关因子的释放的抑制剂中的应用。

其中，所述炎症相关因子为IL-1β和iNOS。

在一些实施方案中，本发明采用新物体辨别(NovelObject Recognition，NOR)实验考察曲普瑞林对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠新物体辨别能力的影响，结果显示在NOR实验中，腹腔注射LPS能够使小鼠对新事物的偏爱指数明显降低。曲普瑞林(0.2mg/kg)预处理能够明显增加小鼠对新事物的偏爱。表明曲普瑞林能够明显增加LPS诱导的学习记忆损伤小鼠新物体辨别能力。

进一步的，在一些实施方案中，本发明采用Y迷宫实验考察曲普瑞林对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠工作记忆能力的影响。结果显示在Y迷宫实验中，LPS模型组小鼠的自发交替反应率明显低于正常对照组，说明腹腔注射LPS能够明显损伤小鼠的学习记忆能力。曲普瑞林(0.2mg/kg)预处理能够明显增加小鼠在Y迷宫中的自发交替反应率。实验结果表明，曲普瑞林能够明显增加LPS诱导的学习记忆损伤小鼠的工作记忆能力。

综上所述，曲普瑞林对LPS诱导脑内小胶质细胞激活及炎症因子的释放具有抑制作用，对LPS诱导的小鼠学习记忆损伤具有明显的保护作用。因此本发明提供了曲普瑞林在制备抑制神经炎症的药物中的应用。

其中，所述神经炎症是脂多糖(LPS)诱导的神经胶质细胞炎症。

进一步，本发明还提供了曲普瑞林在治疗急慢性神经退行性疾病的药物中的应用。

其中，所述急慢性神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症或亨廷顿氏舞蹈症。

优选的，本发明所述药物包括有效剂量的曲普瑞林和药学上可接受的辅料。

本领域技术人员可将所述曲普瑞林直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，以常规药物制剂方法，制成常用注射制剂。

优选的，所述注射制剂为注射液或粉针剂。

由上述技术方案可知，本发明提供了曲普瑞林的新应用，尤其是曲普瑞林在制备抑制神经炎症的药物中的应用。实验表明曲普瑞林可以抑制小胶质细胞激活，显著抑制LPS诱导的小鼠海马炎症介质TNF-α和iNOS的释放。曲普瑞林还能够使LPS诱导的学习记忆损伤小鼠的新旧事物分辨率明显增加，Y迷宫中的自发性交替率明显增加，表明曲普瑞林对LPS诱导的小鼠学习记忆损伤具有明显的保护作用。因此曲普瑞林具有显著的抑制神经炎症活性，可用于制备预防和/或治疗神经炎症以及急慢性神经退行性疾病等其相关疾病的药物，具有较高的临床应用价值和开发前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1曲普瑞林对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠海马小胶质细胞激活的影响的统计结果图；

图2示实施例1曲普瑞林对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠海马IL-1β和iNOS表达的影响的统计结果图；

图3示实施例3曲普瑞林对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠新物体辨别能力的影响的统计结果图，与LPS组比较**P＜0.01；

图4示实施例4Y迷宫实验考察曲普瑞林对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠工作记忆能力的影响的统计结果图，与LPS组比较*P＜0.05。

具体实施方式

本发明公开了曲普瑞林的新应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：曲普瑞林对LPS诱导的小鼠小胶质细胞活化标记物CD68和CD11b以及相应炎症相关因子IL-1β和iNOS的影响

1、实验动物：

24只雄性C57BL/6小鼠，3月龄，体重25g左右。动物饲养在室温(22±2)℃，湿度(45％～65％)和明暗交替(12h:12h)的环境中，自由摄食和饮水。动物分组与处理小鼠按随机数字表法分为3组：正常对照组(NS，n＝8)、神经炎症模型组(LPS，n＝8)、曲普瑞林(LPS+TRIP，n＝8)，每日1次腹腔注射(i.p)，共治疗1周。

2、实验药物：脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)；曲普瑞林。

3、实验方法：

(1)小鼠神经炎症模型的建立：腹腔注射0.83mg/kg LPS。

(2)CD68、CD11b、IL-1β和iNOS的测定

小鼠在LPS注射后24h，给予4％水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉完全后取海马组织，用于RNA抽提。提取组织总RNA，反转录，实时荧光定量PCR法检测曲普瑞林对LPS诱导的小鼠小胶质细胞活化标记物CD68和CD11b以及相应炎症相关因子IL-1β和iNOS的表达量的影响。

其中，RNA抽提及反转录的方法具体如下：

(a)Trizol抽提mRNA及反转录成cDNA：加入0.8mlTrizol充分匀浆组织，EP管中静置10min；12,000g离心15min，弃沉淀；加入300μl氯仿，充分混匀，室温放置15min；4℃，12,000g，离心15min，吸取上层水相到另一离心管中，不要吸取中间层；加入等体积的异丙醇混匀，室温静置5-10min；4℃，12,000g，离心10min，弃上清，RNA沉于管底；加入1ml的75％乙醇，悬浮RNA沉淀；4℃，8000g离心5min，弃上清；室温晾干或真空干燥5-10min；加入20μlDEPC水，60℃水浴溶解；按照ReverAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成cDNA。

(b)RT-PCR：反应体系：SYBRGreen Mix 10μl；上下游引物(2μM)各2μl；cDNA 1μl；ddH₂O 5μl(总体系20μl)

反应程序：步骤1:95℃5min；步骤2：95℃15s，60℃15s，72℃45s，40个循环；步骤3：溶解曲线分析

以内参GAPDH对目的基因的扩增进行标化，目的基因的相对表达量通过2-ddct方法计算获得。

所采用Q-PCR引物如表1所示。

表1：Q-PCR引物

4、实验结果：

实时荧光定量PCR法检测曲普瑞林对LPS诱导的小鼠小胶质细胞活化标记物CD68和CD11b以及相应炎症相关因子IL-1β和iNOS的表达量结果见图1和图2。

结果显示，曲普瑞林可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞激活标记物CD68和CD11b的表达，曲普瑞林可显著抑制LPS诱导的IL-1β和iNOS释放。

实施例2：曲普瑞林对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠新物体辨别能力的影响

实验动物：36只雄性C57BL/6小鼠，3月龄，体重25g左右。动物饲养在室温(22±2)℃，湿度(45％～65％)和明暗交替(12h:12h)的环境中，自由摄食和饮水。

动物分组与处理小鼠按随机数字表法分为3组：正常对照组(NS，n＝12)、神经炎症模型组(LPS，n＝12)、曲普瑞林(LPS+TRIP，n＝12)，每日1次腹腔注射(i.p)，共治疗1周，在最后一次药物注射后1h，LPS组及LPS+TRIP组腹腔注射0.83mg/kg LPS，第8天开始进行新事物辨别实验。

实验原理：小鼠对之前从未见过的事物表现出更强的好奇心。预实验时，在旷场(40cm×40cm×40cm)对称部位放置形状及材质相同的两个物体A和B，将小鼠由旷场正中放入，熟悉物体5min后取出小鼠，间隔1h后进行实验期检测，将物体A更换为形状及材质不同的物体C，再次将小鼠放入场内自由探索，相机记录小鼠5min内对物体C的探索时间(Timeexploring novel obeject,TN)和物体A的探索时间(Time exploring familiar obeject,TF)。旷场及其内物体用70％的乙醇去除小鼠残留气味。测定每只小鼠的偏爱指数。结果如图3所示。

其中偏爱指数的计算公式为：偏爱指数＝(TN-TF)/(TN+TF)×100％。

结果显示，在NOR实验中，腹腔注射LPS能够使小鼠对新事物的偏爱指数明显降低。曲普瑞林(0.2mg/kg)预处理能够明显增加小鼠对新事物的偏爱。表明曲普瑞林能够明显增加LPS诱导的学习记忆损伤小鼠新物体辨别能力。

实施例3：曲普瑞林对LPS诱导的学习记忆损伤小鼠工作记忆能力的影响

实验方法：

动物：36只雄性C57BL/6小鼠，3月龄，体重25g左右。动物饲养在室温(22±2)℃，湿度(45％～65％)和明暗交替(12h:12h)的环境中，自由摄食和饮水。

动物分组与处理小鼠按随机数字表法分为3组：正常对照组(NS，n＝12)、神经炎症模型组(LPS，n＝12)、曲普瑞林(LPS+TRIP，n＝12)，每日1次腹腔注射(i.p)，共治疗1周，在最后一次药物注射后1h，LPS组及LPS+TRIP组腹腔注射0.83mg/kg LPS，第8天开始进行Y迷宫实验。测定每只小鼠的自发交替反应率，结果如图4所示。

实验原理：Y迷装置由三个完全相同的臂组成，分别为A,B,C臂，各臂夹角为120度，每一臂尺寸为(30cm×8cm×15cm)，在迷宫各个臂的尽头贴上不同颜色的卡纸，作为辨别标记。由于动物每次转换探索臂时都会记住前一次探索过的臂，实验动物若保留了对前一次探索臂的记忆，就不会重复进入相同臂(A，B，A或A，B，B)，即连续进入三个不同的臂的次数的比率就会越多(A，B，C或A，C，B)。实验将小鼠置于一个臂的末端，摄像机记录8min内动物在各臂内的探索顺序，记录小鼠自发交替反应率。

其中自发交替反应率的计算公式为：

自发交替反应率＝正确探索次数/(总进臂次数-2)×100％，该指标越高说明小鼠空间记忆越好。

结果显示：在Y迷宫实验中，LPS模型组小鼠的自发交替反应率明显低于正常对照组，说明腹腔注射LPS能够明显损伤小鼠的学习记忆能力。曲普瑞林(0.2mg/kg)预处理能够明显增加小鼠在Y迷宫中的自发交替反应率。实验结果表明，曲普瑞林能够明显增加LPS诱导的学习记忆损伤小鼠的工作记忆能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.曲普瑞林在制备小胶质细胞激活的抑制剂中的应用。

2.曲普瑞林在制备炎症相关因子的释放的抑制剂中的应用；所述炎症相关因子为IL-1β和iNOS。

3.曲普瑞林在制备抑制神经炎症的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述神经炎症为脂多糖诱导的神经胶质细胞炎症。

5.曲普瑞林在制备治疗急慢性神经退行性疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述急慢性神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症或亨廷顿氏舞蹈症。

7.根据权利要求3-6任意一项所述应用，其特征在于，所述药物包括有效剂量的曲普瑞林和药学上可接受的辅料。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述药物为注射制剂。