CN108902153B - 一种广谱植物源杀菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种广谱植物源杀菌剂及其制备方法和应用，其中，本发明提供的广谱植物源杀菌剂，包括：蛇婆子茎的提取物。蛇婆子茎提取物，尤其是二氯甲烷粗提物和分离纯化得到的化合物antidesmone和waltherione C具有高效、低毒、低残留、无公害、成本低、杀菌活性强、抗菌谱广、分离过程简单等优势，其杀菌活性和广谱性要远高于商品化植物源杀菌剂蛇床子素、香芹酚和丁香酚，并且不与其它杀菌剂产生交互抗性，并对多菌灵高抗油菜菌核具有特效，与多菌灵存在一定的负交互抗性的关系，可作为农田植物真菌性病害潜在的杀菌剂。

Description

一种广谱植物源杀菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及杀菌剂技术领域，尤其涉及一种广谱植物源杀菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
几十年来，植物病原真菌对作物生产造成严重危害。有超过8000种已知的真菌种类可以引起植物疾病。我国是农业大国，植物病原真菌引起的病害是制约我国农业生产的重要因素，这些病害常常大规模发生，对我国农业生产造成巨大损失。现在农业上使用的主要是化学合成农药，我国每年需生产和使用化学杀菌剂农药达80万吨以上，这些农药的使用很大程度上减少了病害造成的损失，但是化学农药的大量使用也引起了一系列的问题和隐患，如：农药残留，环境污染，生态平衡破坏以及抗药性的产生等。在农业病害的防治过程中，人们已经发现了许多对一些常用农药，如：多菌灵、甲基硫菌灵、噻菌灵、苯菌灵、甲霜灵、恶霜灵、嘧菌酯、醚菌酯、吡唑嘧菌酯、肟菌酯、恶唑菌酮等产生抗性或交互抗性的植物菌株，其抗性高达几百倍。这些抗药性的产生对农药生产和农业病害的防治产生了巨大的阻碍，因此，急需开发综合防治植物病害的方法来解决这些问题，比如使用环境友好的杀菌剂包括生物防治剂(木霉)和植物杀菌剂(蛇床子素、香芹酚和丁香酚)。
随着人们环保意识的提高，崇尚自然、保护环境、关注食品安全的呼声日渐高涨，无公害生物农药和生物防治技术和理念逐渐引起人们的高度关注。从植物中分离的天然杀菌剂已经被成功用来治理植物病害，并且具备化学合成农药所不具备的优势，如：含有已知植物病原真菌尚不能抵抗的新化合物；毒性远远低于化学合成杀菌剂；生物降解相对较快，残留少；材料来源廉价且可再生等。目前，许多植物提取物已经被证明对植物病原真菌具有杀菌活性，如，百里香、大蒜、蛇床子、蒲公英、虎杖等，但这些已知的天然产物中，有些天然产物杀菌活性较低或针对的靶标较为狭窄，不具有广谱杀菌活性，分离程序复杂，成本相对较高。因此，市场上急需发现和开发一系列廉价、环保、杀菌活性高、杀菌范围广、可再生的天然产物及其制备方法。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种广谱植物源杀菌剂及其制备方法和应用，提供的杀菌剂从植物中分离得到，具有较高的杀菌活性和广谱性。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种广谱植物源杀菌剂，包括：蛇婆子茎的提取物。
优选的，所述蛇婆子茎的提取物为蛇婆子茎的甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或水的提取物。
在本发明的一些具体实施例中，所述蛇婆子茎的提取物为蛇婆子茎的二氯甲烷提取物。
实验结果表明，蛇婆子茎的二氯甲烷提取物具有较高的杀菌活性。
本发明对蛇婆子茎的二氯甲烷提取物进行进一步提取，得到具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构：
Figure BDA0001761785700000021
实验结果表明，式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物具有非常优异的杀菌活性。
本发明提供了广谱植物源杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：
蛇婆子茎干燥，粉碎，采用溶剂提取；所述溶剂选自甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或水。
提取后，旋干即可得到提取物。所述旋干的温度优选为40～60℃。
在本发明的一些具体实施例中，所述制备方法包括以下步骤：
S1)蛇婆子茎干燥、粉碎后，用二氯甲烷提取，得到二氯甲烷粗提物；
S2)用石油醚/乙酸溶剂体系对二氯甲烷粗提物进行柱色谱分离，所述石油醚/乙酸的体积比为100:0，95:5，90:10，50:50，0:100，分别得到馏分F1、F2、F3、F4、F5。
优选的，柱色谱分离后还包括以下步骤：
S3)取馏分F5，用Sephadex LH-20凝胶柱，以甲醇作为洗脱剂等度洗脱，得到11个馏分，记为Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Fr10、Fr11；
S4)取馏分Fr4，以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为80:20，进行柱色谱分离，得到式Ⅰ所示化合物；
取馏分Fr7，以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为60:40，进行柱色谱分离，得到式Ⅱ所示化合物；
Figure BDA0001761785700000031
本发明提供了上述广谱植物源杀菌剂或上述制备方法制备的广谱植物源杀菌剂作为杀菌剂的应用。
本发明提供了蛇婆子茎植物病原真菌粗提物的提取方法和活性成分的分离方法，对分离到的两种活性化合物进行了鉴定，并通过菌丝生长速率法，用粗提物和活性化合物对16种常见的植物病原真菌进行体外活性测试，对两种植物病原真菌，通过将病原真菌移接到药物处理过的植物叶片上测定保护效果的方法，测定了其活体保护效应。
上述16种常见的植物病原真菌具体包括：
火龙果溃疡(Neoscytalidium dimidiatum)；
苹果轮纹(Botryosphaeria dothidea)；
香蕉枯萎(Fusarium oxysporum Schl)；
小麦纹枯(Rhizoctonia cerealis)；
香蕉炭疽(Colletotrichum musae)；
橡胶胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；
玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)；
茶褐斑拟盘多毛孢(Pestalotipsis guepinii)；
冬瓜炭疽(Colletotrichum orbiculare)；
串珠镰孢(Fusarium moniliforme)；
烟草疫霉(Phylophthora nicotianae)；
茄链格孢(Alternaria solan)；
灰葡萄孢(Botrytis cinerea)；
长刚毛拟盘多毛孢(Pestalotiopsis longiseta)；
多菌灵敏感油菜菌核(carbendazim-sensitive Sclerotinia sclerotiorum)；
多菌灵高抗油菜菌核(carbendazim-resistant Sclerotinia sclerotiorum)；
多菌灵敏感芒果蒂腐(carbendazim-sensitive Botryodiplodia theobromae)；
多菌灵高抗芒果蒂腐(carbendazim-resistant Botryodiplodia theobromae)。
实验结果表明，蛇婆子茎提取物，尤其是二氯甲烷粗提物和分离纯化得到的化合物antidesmone和waltherione C具有高效、低毒、低残留、无公害、成本低、杀菌活性强、抗菌谱广、分离过程简单等优势，其杀菌活性和广谱性要远高于商品化植物源杀菌剂蛇床子素、香芹酚和丁香酚，并且不与其它杀菌剂产生交互抗性，并对多菌灵高抗油菜菌核具有特效，与多菌灵存在一定的负交互抗性的关系，可作为农田植物真菌性病害潜在的杀菌剂。
目前已知的与多菌灵存在负交互抗性的药物只有乙霉威，并且田间已经出现对多菌灵和乙霉威表现出双重抗性的菌株。植物粗提物和化合物antidesmone对多菌灵抗性油菜菌核的EC50值分别为为49.47μg/mL和0.598μg/mL，其中化合物antidesmone对抗性油菜菌核的抑制效果要远远高于多菌灵。
在活体实验中，通过将病原真菌移接到药物处理过的植物叶片上测定保护效果的方法，证明蛇婆子茎粗提物和化合物antidesmone对油菜菌核病原菌引起的甘蓝菌核病和由拟盘多毛孢引起的牛油果梢枯病也具有很好的防效，其中，化合物antidesmone对甘蓝菌核病的抑制效果要高于多菌灵。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的广谱植物源杀菌剂及其制备方法和应用进行详细描述。
实施例1蛇婆子茎粗提物的活性研究
1)制备
称取适当重量的蛇婆子茎，用鼓风干燥箱50℃烘干，磨成粉末，分别用甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷和水进行提取，每100g粉末与1L溶剂混合浸泡，浸渍24小时后，将提取液收集并用滤纸过滤，用旋转蒸发仪50℃蒸干，得到五种具有杀菌活性的蛇婆子茎粗提物。
2)体外抗真菌活性测试
采用菌丝生长速率法，对以上5相粗提物进行杀菌活性检测。
将一定重量的五种提取相分别溶于DMF(0.1mL)中，然后与马铃薯葡萄糖琼脂混合(PDA；9.9mL)，最终配成所需要的浓度。粗提物在500μg/mL浓度下进行活性测试。所有的菌种均在27±1℃的PDA上培养4-7天，保证菌丝体具有较强的活力，用于鉴定抗真菌活性。试验在无菌操作台上进行，从长满菌丝的培养基中切下直径约5毫米的菌饼，用无菌接种针将菌饼接种于药物处理过的PDA板中部，27±1培养4-7天。在无菌蒸馏水中加入等体积的DMF作为阴性对照，每个处理条件三个重复。测量真菌菌落直径长度。用以下公式计算抑制率：
I(％)＝〔(C－T)/(C－0.5)〕×100
C：对照组PDA上真菌生长的直径；
T：处理过的PDA上真菌的直径；
I：抑制率。
结果如下表1所示。
表1蛇婆子茎粗提物对16种植物病原真菌抑菌活性(500μg/mL)
Figure BDA0001761785700000051
Figure BDA0001761785700000061
N.D：火龙果溃疡；B.D:苹果轮纹；F.O：尖孢镰刀菌；R.C:小麦纹枯；C.M:香蕉炭疽菌；C.G:橡胶胶孢炭疽菌；G.Z:玉蜀黍赤霉；P.G:茶褐斑拟盘多毛孢；C.O：冬瓜炭疽；F.M：串珠镰孢菌；P.N：烟草疫霉；A.S：茄链格孢；B.C：葡萄灰霉菌；P.L:长刚毛拟盘多毛孢；S.SS：多菌灵敏感性油菜菌核；S.SHR:多菌灵高抗油菜菌核；B.TS：多菌灵敏感性芒果蒂腐菌；B.THR:多菌灵高抗芒果蒂腐
由表1可以看出，蛇婆子茎的甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或水的提取物均对菌丝具有抑制作用，其中，二氯甲烷提取物显示出最高的杀菌活性。
3)保护性试验
将二氯甲烷粗提物溶解于0.1mLDMF，并与吐温80水(0.1％v/v)混合，配置成不同浓度的溶液，具体浓度见表2所示，用于测定对由长刚毛拟盘多毛孢引起的牛油果梢枯病和由高抗油菜菌核引起的甘蓝菌核病的抑制效果。将10mL不同浓度的二氯甲烷粗提物溶液均匀涂抹在牛油果叶片和甘蓝叶片上并晾干，处理24h后进行接种。所有的菌种均在27±1℃的PDA上培养4-7天，保证菌丝体具有较强的活力，用于保护性试验。从长满菌丝的培养基中切下直径约5毫米的菌饼，用无菌接种针将菌饼接种于药物处理过的叶片上，接种的叶片在25℃，16h光照，相对湿度80％的条件下培养。7天后，侵染程度通过测量叶片上病斑直径来确定，用于计算的病斑直径为最长直径和最短直径长度平均值。保护效果计算法：保护效果(％)＝(阴性对照处理叶片病变直径－药物处理叶片病变直径)/阴性对照处理叶片病变直径×100。等体积DMF溶于无菌蒸馏水中作为阴性对照，98％多菌灵作为阳性对照，重复三次。
实验结果如下表2所示。
表2蛇婆子茎二氯甲烷粗提物对2种植物病原真菌体外保护效应
Figure BDA0001761785700000071
a：多菌灵高抗油菜菌核.b：无数据
蛇婆子茎二氯甲烷粗提物对植物病原真菌的EC50值如表3所示。
表3蛇婆子茎二氯甲烷粗提物对7种植物病原真菌的EC50值
Figure BDA0001761785700000072
B.D：苹果轮纹；C.M:香蕉炭疽菌；P.G:茶褐斑拟盘多毛孢；C.O：冬瓜炭疽；P.N:烟草疫霉；P.L：长刚毛拟盘多毛孢；S.SS：多菌灵敏感性油菜菌核；S.SHR：多菌灵高抗油菜菌核
以上检测可以看出，蛇婆子茎的二氯甲烷提取物具有较高的杀菌活性。
实施例2具有杀菌活性化合物的分离及活性测定
1)制备
取实施例1制备得到的蛇婆子茎的二氯甲烷粗提物，用200-300目硅胶的硅胶柱进行初次分离，选用石油醚/乙酸溶剂体系，分别用不同体积比例的洗脱剂(100/0，95/5，90/10，50/50，0/100)对粗提物进行分离，获得5个馏分，记为F1，F2，F3，F4，F5。通过活性筛选，测得F5馏分显示最高的杀菌活性。
取F5，用Sephadex LH-20凝胶柱，以甲醇作为洗脱剂等度洗脱，对F5进行进一步分离，每10mL为一个馏分，通过薄层色谱TLC监测，最终合并得到11个馏分，记为Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Fr10、Fr11。其中，Fr4和Fr7显示最高杀菌活性。
取馏分Fr4，通过硅胶柱色谱法，用石油醚/乙酸乙酯(V:V＝80/20)作为洗脱剂等度洗脱，进一步分离得到具有杀菌活性化合物antidesmone，为黄色油状物。。
取馏分Fr7，通过硅胶柱色谱法，用石油醚/乙酸乙酯(V:V＝60:40)作为洗脱剂等度洗脱，进一步分离得到具有杀菌活性化合物waltherione C，为白色粉末。
2)结构鉴定
采用核磁共振氢谱和碳谱对制备得到的antidesmone和waltherione C进行结构检测，结果见表4。
表4 Antidesmone和Waltherione C的1H NMR(500MHz)和13C NMR(125MHz)数据
Figure BDA0001761785700000081
Figure BDA0001761785700000091
a选用CDCl3溶解；b选用CD3OD溶解。
通过对核磁数据进行分析，确定化合物antidesmone结构如以下式Ⅰ所示，其为四氢喹啉类化合物，化学式为：C19H29NO3。
化合物waltherione C结构如以下式Ⅱ所示，其为4-喹诺酮类化合物，化学式为：C22H21NO3。
Figure BDA0001761785700000092
3)体外抗真菌活性测试
采用菌丝生长速率法，对以上化合物进行杀菌活性检测。
将一定重量的两种化合物分别溶于DMF(0.1mL)中，然后与马铃薯葡萄糖琼脂混合(PDA；9.9mL)，最终配成所需要的浓度，在50μg/mL浓度下进行活性测试。所有的菌种均在27±1℃的PDA上培养4-7天，保证菌丝体具有较强的活力，用于鉴定抗真菌活性。试验在无菌操作台上进行，从长满菌丝的培养基中切下直径约5毫米的菌饼，用无菌接种针将菌饼接种于药物处理过的PDA板中部，27±1培养4-7天。在无菌蒸馏水中加入等体积的DMF作为阴性对照，蛇床子素、香芹酚和丁香酚作为阳性对照，每个处理条件三个重复。测量真菌菌落直径长度。用以下公式计算抑制率：
I(％)＝〔(C－T)/(C－0.5)〕×100
C：对照组PDA上真菌生长的直径；
T：处理过的PDA上真菌的直径；
I：抑制率。
结果如下表5所示。
表5化合物Antidesmone和Waltherione C对16种植物病原真菌抑菌活性(50μg/mL)
Figure BDA0001761785700000101
Figure BDA0001761785700000111
N.D:火龙果溃疡；B.D:苹果轮纹；B.T:芒果蒂腐；R.C:小麦纹枯；C.M:香蕉炭疽菌；C.G:橡胶胶孢炭疽菌；G.Z:玉蜀黍赤霉；P.G:茶褐斑拟盘多毛孢；C.O：冬瓜炭疽；F.M：串珠镰孢菌；P.N：烟草疫霉；A.S：茄链格孢；B.C：葡萄灰霉菌；P.L：长刚毛拟盘多毛孢；F.O：尖孢镰刀菌；S.SS：多菌灵敏感性油菜菌核；S.SHR：多菌灵高抗油菜菌核
由表5可以看出，上述化合物antidesmone和waltherione C对菌丝具有较高的抑制作用。
4)保护性试验
将化合物antidesmone溶解于0.1mL DMF，并与吐温80水(0.1％v/v)混合，配置成不同浓度的溶液，具体浓度见表6所示，用于测定对由长刚毛拟盘多毛孢引起的牛油果梢枯病和由高抗油菜菌核引起的甘蓝菌核病的抑制效果。将10mL不同浓度的antidesmone溶液均匀涂抹在牛油果叶片和甘蓝叶片上并晾干，处理24h后进行接种。所有的菌种均在27±1℃的PDA上培养4-7天，保证菌丝体具有较强的活力，用于保护性试验。从长满菌丝的培养基中切下直径约5毫米的菌饼，用无菌接种针将菌饼接种于药物处理过的叶片上，接种的叶片在25℃，16h光照，相对湿度80％的条件下培养。7天后，侵染程度通过测量叶片上病斑直径来确定，用于计算的病斑直径为最长直径和最短直径长度平均值。保护效果计算法：保护效果(％)＝(阴性对照处理叶片病变直径－药物处理叶片病变直径)/阴性对照处理叶片病变直径×100。等体积DMF溶于无菌蒸馏水中作为阴性对照，98％多菌灵作为阳性对照，重复三次。
实验结果如下表6所示。
表6 antidesmone对2种植物病原真菌体外保护效应
Figure BDA0001761785700000121
a：多菌灵高抗油菜菌核.b：无数据
化合物antidesmone和waltherione C对植物病原真菌的EC50值如表7所示。
表7化合物antidesmone和waltherione C对7种植物病原真菌的EC50值
Figure BDA0001761785700000122
B.D：苹果轮纹；C.M:香蕉炭疽菌；P.G:茶褐斑拟盘多毛孢；C.O：冬瓜炭疽；P.N：烟草疫霉；P.L：长刚毛拟盘多毛孢；S.SS：多菌灵敏感性油菜菌核；S.SHR:多菌灵高抗油菜菌核
a：无数据
以上检测可以看出，化合物antidesmone和waltherione C具有较高的杀菌活性。
由上述实施例可知，本发明所得到的植物提取物和分离的化合物在离体条件下对常见的16种植物病原真菌均具有较高的杀菌活性(表1和表5)，化合物antidesmone与3种商品化天然产物(蛇床子素、香芹酚、丁香酚)相比，其杀菌效果相近甚至高于商品化品种且更具广谱性，其中，对多菌灵抗性油菜菌核具有极强的抑制活性，并与多菌灵存在负交互抗性关系。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.蛇婆子茎的提取物作为植物病原真菌杀菌剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛇婆子茎的提取物为蛇婆子茎的甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或水的提取物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛇婆子茎的提取物为蛇婆子茎的二氯甲烷提取物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蛇婆子茎的二氯甲烷提取物具有式Ⅰ或式Ⅱ所示结构：
Figure FDA0002400734120000011
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛇婆子茎的提取物按照以下方法制备：
蛇婆子茎干燥，粉碎，采用溶剂提取；所述溶剂选自甲醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷或水。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1)蛇婆子茎干燥、粉碎后，用二氯甲烷提取，得到二氯甲烷粗提物；
S2)用石油醚/乙酸溶剂体系对二氯甲烷粗提物进行柱色谱分离，所述石油醚/乙酸的体积比为100:0，95:5，90:10，50:50，0:100，分别得到馏分F1、F2、F3、F4、F5。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，还包括以下步骤：
S3)取馏分F5，用Sephadex LH-20凝胶柱，以甲醇作为洗脱剂等度洗脱，得到11个馏分，记为Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、Fr10、Fr11；
S4)取馏分Fr4，以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为80:20，进行柱色谱分离，得到式Ⅰ所示化合物；
取馏分Fr7，以石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为60:40，进行柱色谱分离，得到式Ⅱ所示化合物；
Figure FDA0002400734120000021
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