CN108888624A - 雷公藤甲素及其衍生物作为人孕烷x受体天然激动剂的应用 - Google Patents

雷公藤甲素及其衍生物作为人孕烷x受体天然激动剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次验证了中药雷公藤中的主要活性成分雷公藤甲素及其衍生物能高效激动人孕烷X受体，并促进其下游参与代谢的重要靶基因CYP3A4和MDR1等的表达。本发明公开了雷公藤甲素及其衍生物可以作为hPXR高效激动剂，应用于PXR激动机制研究和外源物质代谢研究的基础，并为其在临床治疗包括代谢性疾病在内的多种疾病的治疗提供了可能。

Description

雷公藤甲素及其衍生物作为人孕烷X受体天然激动剂的应用
技术领域
本发明涉及雷公藤甲素及其衍生物，具体地，本发明涉及雷公藤甲素及其衍生物作为人孕烷X受体天然激动剂的应用，以及雷公藤甲素及其衍生物在治疗以PXR为靶点的许多代谢和炎症相关疾病中的用途。
背景技术
作为核受体超家族的一员，孕烷X受体(Pregnane X Receptor，PXR)是诱导药物代谢酶(Drug Metabolizing Enzymes,DMEs)发挥其功能的重要调节因子。PXR具有典型的核受体结构，即包括一个NH2末端非配体依赖性活化功能区、一个高度保守的DNA结合域(DBD)、一个较不保守的铰链区、一个C末端配体结合域(LBD)和一个活化功能2区。
通常PXR存在于肝脏细胞的细胞质中，在与其配体结合后，转移入核与维甲酸X受体α(Retinoid X Receptor alpha，RXRα)形成异源二聚体，并结合到其下游靶基因启动子DNA特异性反应原件上启动基因表达。
PXR发挥功能时会招募许多共激活蛋白因子，如类固醇受体共激活因子1(Sterioid Receptor Coactivator1，SRC-1)，从而促进许多DMEs的转录，如CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9和UGT1A1等。另外，PXR的激活会抑制NF-κB通路和许多糖脂新生相关基因的表达。因此，PXR作为治疗许多代谢和炎症相关疾病的分子靶点具有重要的研究意义。
PXR的配体结合域口袋与其他核受体相比较大，能被广泛的外源物质激动，但激动浓度都较大，一般为微摩级别，且不具有特异性，可同时激动多种其它核受体。目前，科学研究中常用的人孕烷X受体的激动剂为利福平(Rifampicin)，工作浓度在10-100μM之间，特异性不高。
因此，开发新的、更高效的PXR特异性激动剂对研究PXR在外源物质和药物代谢中的功能非常重要，也可能显著增加其临床应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是找到一种新颖的、更高效的PXR特异性激动剂。
具体地，本发明的目的是在前期构建的中药天然产物文库中筛选全新的hPXR高效激动剂，具体方案为在人肝肿瘤细胞株HepG2中进行哺乳动物单杂交系统检测和双荧光素报告基因检测，以及在细胞水平验证其激动效果。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明了提供雷公藤甲素及其衍生物作为孕烷X受体天然激动剂的应用，其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的结构式如下所述
在一个实施方式中，所述应用用于科学研究。
在又一个实施方式中，所述应用用于临床治疗。
进一步地，所述临床治疗为治疗代谢和炎症相关疾病的治疗。
进一步地，雷公藤甲素及其衍生物的使用浓度为1nM-20μM
优选地，雷公藤甲素及其衍生物的使用浓度为1.869nM。
在另一个方面，本发明提供了雷公藤甲素及其衍生物在制备用于治疗通过激动PXR得以治疗的疾病的制剂中的用途，其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的结构式如下所述
进一步地，所述疾病为代谢和炎症相关疾病。
在又一个方面，本发明提供雷公藤甲素及其衍生物在制备用于治疗以PXR为靶点的疾病的制剂中的用途，其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的结构式如下所述
进一步地，所述疾病为代谢和炎症相关疾病。
在再一个方面，本发明提供了雷公藤甲素及其衍生物在调控PXR下游基因的用途其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的结构式如下所述
定义：
雷公藤(Tripterygiumwilfordii Hook.f.)属于卫矛科雷公藤属植物，是一种传统中药，具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒等功效。现代药理研究表明，其包含的多种化学成分，具有抗炎、免疫抑制、抗菌、抗生育、抗肿瘤等多种药理作用。
雷公藤甲素(Triptolide)，又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇，是从雷公藤中分离出的环氧化二萜内酯化合物，也是中药雷公藤的主要活性成分之一。已有的研究及临床试验证明，雷公藤甲素具有潜在的免疫抑制作用、抗炎及抗生育的功效，被用作治疗类风湿性关节炎及一些其他的自身免疫病。此外，近期的研究已经证实雷公藤甲素是一种有效的抗肿瘤药物，体内及体外实验均证明其能够抑制胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肾上腺癌，及神经母细胞瘤的生长。是临床广泛关注的一个中药单体。
本发明具有如下有益效果：
本发明首次验证了中药雷公藤中的主要活性成分雷公藤甲素及其衍生物能高效激动人孕烷X受体，并促进其下游参与代谢的重要靶基因CYP3A4和MDR1等的表达。
本发明验证了雷公藤甲素对hPXR激动的半最大效应浓度(EC50)为纳摩尔级别(1.869nM)，在该浓度下雷公藤甲素的细胞毒性反应极低(细胞活性为99.849％)。雷公藤甲素两种衍生物对hPXR激动的半最大效应浓度(EC50)分别为10纳摩尔级别和100纳摩尔级别。
本发明提供了雷公藤甲素及其衍生物作为hPXR高效激动剂的应用，应用于PXR激动机制研究和外源物质代谢研究的基础，并为其在临床治疗包括代谢性疾病在内的多种疾病提供了可能。
附图说明
图1为部分中药天然产物对hPXR的激动效果。
图2为不同浓度雷公藤甲素对hPXR的激动效果。
图3为雷公藤甲素hPXR激动曲线。
图4为雷公藤甲素及其类似物结构式。
图5为两种雷公藤甲素类似物对hPXR的激动效果。
图6为雷公藤甲素对多种肝脏高表达核受体的激动效果。
图7为雷公藤甲素对PXR下游重要基因mRNA表达水平的影响。
图8为雷公藤甲素对PXR下游重要基因蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细描述。实施例中所用原料(包括雷公藤甲素及其衍生物)和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或合成。
为达到上述目的，本发明采用的具体技术手段如下：
1.实验中涉及到的工具质粒准备：hPXR全长cDNA、GAL4/hPXR、GAL4/LXR、GAL4/FXR、GAL4/PPARα、GAL4/PPARγ、GAL4/PPARδ质粒、hPXR反应原件(PXRE)荧光素酶报告质粒、pG5-luc和pGL4.74等。
2.工具细胞系的培养：人肝肿瘤细胞株HepG2细胞使用含有10％胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养液，在37摄氏度含有5％二氧化碳的潮湿细胞培养箱内培养。
3.哺乳动物单杂交实验：使用Jet PEI转染试剂向HepG2细胞中转染入pG5-luc报告基因质粒、内参pGL4.74质粒，GAL4/NR(某种核受体)，孵育过夜后，使用药物单体进行24小时处理。荧光素酶活性使用双荧光素报告基因检测试剂盒(Promega公司)测定，不同测量数据间使用海肾荧光素酶信号作为内参标准化后进行比较。
4.荧光素酶报告基因检测：使用Jet PEI转染试剂，将适当比例混合的全长hPXR表达质粒、PXRE报告基因质粒和内参PGL4.74质粒转染至HepG2细胞中，孵育过夜后，细胞使用药物单体处理24小时。荧光素酶活性使用双荧光素报告基因检测试剂盒(Promega公司)测定，不同测量数据间使用海肾荧光素酶信号作为内参标准化后进行比较。
5.实时定量PXR：使用Trizol法提取药物处理后的细胞总RNA，反转录获得cDNA后，根据生产方提供的说明，使用Applied Biosystems 7500 fast系统和全式金TransStartTip Green qPCR SuperMix试剂盒进行qPCR反应。
针对CYP3A4基因的特异性引物为(5'-CCAAGCTATGCTCTTCACCG-3'(SEQ ID NO.1)和5'-TCAGGCTCCACTTACGGTGC-3'(SEQ IDNO.2))。
针对MDR1基因的特异性引物为(5'-GCCGCAGCTCGTCAGATAC-3'(SEQ IDNO.3)和5'-GAATTGCAGTCAAACCACCCT AT-3'(SEQ IDNO.4)。
针对β-actin的特异性引物为(5'-TCCT CCTGAGCGCAAGTACTC-3'(SEQ IDNO.5)和5'-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3'(SEQ IDNO.6))。
6.蛋白免疫印迹：HepG2细胞使用加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶异质结的RIPA细胞裂解液裂解后，获得细胞总蛋白提取液。使用SDS-PAGE胶进行免疫印迹实验，检测CYP3A4和MDR1蛋白的表达水平。
实施例：
1.hPXR激动剂筛选：
使用Jet PEI转染试剂，将适当比例混合的GAL-4/PXR质粒、pG5luc报告基因质粒和内参PGL4.74质粒转染至HepG2细胞中。孵育过夜，使用10μM药物单体细胞处理。24小时后，进行荧光素酶报告基因检测。结果提示，与阳性对照利福平(标记为红色)相比，雷公藤甲素(8号药物单体)对hPXR具有潜在高效激动能力(参见图1)。
2.雷公藤甲素及其类似物对hPXR的激动效果：
为明确雷公藤甲素激活的hPXR对其下游靶基因转录调控的影响，使用Jet PEI转染试剂，将适当比例混合的hPXR全长表达质粒、PXRE报告基因质粒和内参PGL4.74质粒转染至HepG2细胞中，孵育过夜后，用不同浓度梯度的雷公藤甲素(1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、1μM、10μM和20μM)处理HepG2细胞后检测荧光素酶报告基因活性。如图2所示，随着浓度的增加雷公藤甲素显著增加hPXR下游基因的转录水平，与阳性对照利福平(10uM)相比效果更高效。模拟雷公藤甲素对hPXR激动曲线(图3)，计算hPXR激动半最大效应浓度(EC50)为1.869nM。
3.雷公藤甲素对hPXR的激动具有结构相关性
雷公藤甲素(LA)及其类似物(LB、LC、LE、LF、LH、LK)结构如图4所示。为明确雷公藤甲素对hPXR的激动是否具有结构-活性相关性，对雷公藤甲素两种结构类似物进行hPXR激动检测。选取雷公藤甲素两种类似物(LB和LC)检测其对hPXR的激动效果，结果如图5所示。LB单体对hPXR的激动EC50也可达到10nM级别，LC单体对hPXR的激动相对较差，但对hPXR的激动EC50也在500nM。
4.雷公藤甲素是hPXR的特异性激动剂：
为检测雷公藤甲素对hPXR的特异性激动作用，使用10μM雷公藤甲素处理分别转染了其它多种肝脏高表达核受体(NR)的GAL4-NR载体，包括LXR，FXR和PPARs。结果显示，雷公藤甲素对这些核受体不具有激动效应(参见图6)，提示雷公藤甲素是hPXR的选择性激动剂。
5.雷公藤甲素能够诱导PXR下游重要基因的表达：
培养HepG2细胞并使用不同浓度雷公藤甲素处理后，检测PXR下游重要代谢酶CYP3A4和MDR1的mRNA和蛋白水平表达变化。如图7所示，雷公藤甲素对CYP3A4和MDR1的mRNA表达水平均具有显著上调作用。如图8所示，雷公藤甲素对CYP3A4和MDR1的蛋白表达水平均具有显著上调作用。
最后有必要在此指出的是：以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 大连医科大学
<120> 雷公藤甲素及其衍生物作为人孕烷X受体天然激动剂的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaagctatg ctcttcaccg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tcaggctcca cttacggtgc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gccgcagctc gtcagatac 19
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gaattgcagt caaaccaccc tat 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tcctcctgag cgcaagtact c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ctgcttgctg atccacatct g 21

Claims (10)

1.雷公藤甲素及其衍生物作为孕烷X受体天然激动剂的应用，其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的结构式如下所述
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用用于科学研究。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用用于临床治疗。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述临床治疗为治疗代谢和炎症相关疾病。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，雷公藤甲素及其衍生物的使用浓度为1nM-20μM，优选地为1.869nM。
6.雷公藤甲素及其衍生物在制备用于治疗通过激动PXR得以治疗的疾病的制剂中的用途，其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的结构式如下所述
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述疾病为代谢和炎症相关疾病。
8.雷公藤甲素及其衍生物在制备用于治疗以PXR为靶点的疾病的制剂中的用途，其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的结构式如下所述
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病为代谢和炎症相关疾病。
10.雷公藤甲素及其衍生物在调控PXR下游基因中的用途，其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的结构式如下所述
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