CN108888238A - 一种基于带孔超声反射板的光声显微镜及成像法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于带孔超声反射板的光声显微镜及成像法，利用超声反射板对超声波的全反射特性，实现聚焦超声波的90°转向；同时，激光束可以穿过反射板中心孔洞不受扰动的高质量聚焦；实现高质量的光‑声共聚焦，并获得极高的接收灵敏度和光学焦点质量；最后，利用脉冲激光逐点扫描样品，并检测焦点处的光声信号，实现高灵敏度高分辨率的光声显微成像。本发明中带孔反射板的使用减少了激光照射和超声信号传播过程中的损耗，降低了光声成像对激光强度的要求，使得该光声显微镜系统在生物组织成像中更加安全；同时，本发明克服了透射式光声显微镜仅适用于薄样品的缺点，使得光声显微镜系统有了更广泛的应用，如对厚的生物组织的皮下层成像。

Description

一种基于带孔超声反射板的光声显微镜及成像法

技术领域

本发明涉及一种利用带孔超声反射板实现高灵敏度高分辨率的光声显微镜及成像的方法，属于光声显微成像技术。

背景技术

光声显微镜作为一种非侵入性的生物医学成像技术，近几年得到了飞速地发展。光声显微镜既具有声学方法对深层组织分辨率高的优点，又具有光学方法在功能成像、分子成像和成像对比度等方面的优势。这些优点使得光声显微镜被广泛地应用生物医学的诸多领域。

探测灵敏度和成像分辨率是评价光声显微镜系统性能优劣的两个重要指标。高探测灵敏度意味着检测到的光声信号具有更高的信噪比，获得的光声图像具有更小的背景噪声和斑点噪声；同时还意味着成像所需的激光能量更低，生物成像具有更高的安全性。高成像分辨率意味着能够获得样品更精细的细节信息。人们通过适当的光路和声路设计，使得光声显微镜的光学焦点与声学焦点重合，从而实现高探测灵敏度和高成像分辨率。因此，光-声共聚焦性能对于提升光声显微镜系统性能至关重要。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种利用带孔超声反射板实现光-声共焦，从而实现高灵敏度高分辨率光声显微镜及其成像方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于带孔超声反射板的高灵敏度高分辨率光声显微镜，包括单模光纤SMF、准直镜CL、分光镜BS、光电探测器PD、数据采集仪DAQ、显微物镜OL、超声反射板和点聚焦超声换能器UT，在超声反射板上设置有小孔；所述单模光纤SMF出射的激光束经过准直镜CL准直后，经过分光镜BS分为两路，一路经光电探测器PD触发数据采集仪DAQ，另一路通过显微物镜OL形成聚焦光束，照射在成像样品表面上；由于光声效应，照射在成像样品表面的聚焦光束在成像样品表面激发出光声信号，该光声信号经超声反射板全反射，实现90°转向，该90°转向后的光声信号入射至点聚焦超声换能器UT；所述数据采集仪DAQ触发后，对点聚焦超声换能器UT输出的光声信号进行数模转换和高速采样。

优选的，所述点聚焦超声换能器UT的输出端连接有前置信号放大器，所述数据采集仪DAQ触发后，对经前置信号放大器放大后的点聚焦超声换能器UT输出的光声信号进行数模转换和高速采样。

优选的，还包括纳秒脉冲激光器和光纤耦合器耦合FC，秒脉冲激光器产生的激光脉冲，经过空间滤波后，通过光纤耦合器FC耦合进入单模光纤SMF，单模光纤SMF出射的激光脉冲作为准直镜CL的入射激光。

一种基于带孔超声反射板的高灵敏度高分辨率光声显微镜成像法，包括如下步骤：

(1)入射激光经过准直镜CL准直后，入射至分光镜BS并分成两束，其中一束入射到显微物镜OL，另一束入射到光电探测器PD；

(2)入射到显微物镜OL的激光光束，形成聚焦光束照射在成像样品表面，超声反射板中心的小孔设置在聚焦光路上，并不对聚焦光束产生光学影响；记聚焦光束的光学聚焦点在x-y平面上的坐标为(x,y)；由于聚焦光束经过超声反射板中心的小孔时未受到任何干扰，因此聚焦光束可以高质量地照射在成像样品表面，从而保证了成像的分辨率；

(3)由于光声效应，照射在成像样品表面的聚焦光束在成像样品表面激发出光声信号，该光声信号经超声反射板全反射，实现90°转向，该90°转向后的光声信号入射至点聚焦超声换能器UT；调整点聚焦超声换能器UT的位置和焦长，使得该90°转向后的光声信号的声学焦点与光学焦点重合；

(4)通过前置信号放大器对超声换能器UT接收到的光声信号进行放大；同时，入射至光电探测器PD的激光光束，触发数据采集仪DAQ对前置信号放大器射出的光声信号进行数模转换和高速采样；

(5)记(x,y)位置处接收到的光声信号为p(x,y,t)，t为时间，时间零点为数据采集仪DAQ的触发时刻；耦合媒质和成像样品的平均声速为C，计算(x,y)处声轴上的一维光声图像S(x,y,z)为：

S(x,y,z)＝||Hilbert[p(z/C)]||

其中：Hilbert[·]表示Hilbert变换，||·||表示复数的模，z轴与声轴平行，且z轴与x-y平面垂直；

(6)逐点移动成像样品或者移动光声信号的激发与接收装置(包括准直镜CL、分光镜BS、光电探测器PD、显微物镜OL、超声反射板和点聚焦超声换能器UT)，重复步骤(1)～(5)，实现对成像样品的逐点扫描和逐点成像，最终获得成像样品的高灵敏度高分辨率的光声显微镜成像。

优选的，所述超声反射板为不锈钢材质，其与声轴的夹角设置有45°。水和不锈钢超声反射镜的声阻抗分别为1.48×10⁶牛顿·秒/米³、45.4×10⁶牛顿·秒/米³，由此可得当声信号由水入射到不锈钢界面时第二临界角为27.3°，当超声波入射角大于第二临界角时，声波发生全反射，入射声波的全部能量均被反射，而无透射。本案中的不锈钢反射镜与声轴成45°放置，超声入射角度为45°，远大于第二临界角，声信号在水-钢界面发生全反射，因此可在最大限度保留超声波能量的情况下实现超声波的90°转向，从而最终实现光学焦点和声学焦点的共聚焦。

可以从理论模拟和实验两个方面对本发明的灵敏度进行测量。

(1)通过数值计算，可获得带孔超声反射板具有不同中心孔径的条件下，超声换能器焦点附近局域声压分布情况，同时，还可计算获得该聚焦超声换能器直接聚焦时，焦点处的声压分布情况，通过计算结果的对比可以证明反射板孔径大小对聚焦位置准确性没有影响；同时，可以通过计算获得焦点处声压随着反射板孔径大小而变化的曲线，将该声压曲线与直接聚焦时焦点声压进行比较，结果表明，带孔反射板中心孔径大小仅仅影响了焦点处声压大小，且当孔直径为4.0mm时，焦点处声压值仅仅下降15.7％。

(2)检测光声显微镜系统的探测灵敏度的实验方法为：采用脉冲激光照射黑胶带，在保持光照强度不变的前提下，上下移动超声探头，直至探测到的超声信号达到最强，即为探测焦点处的最优检测灵敏度。采用该实验步骤依次测量聚焦探头直接接收的检测灵敏度和同一聚焦探头采用不同孔径的带孔反射板的探测灵敏度，实验结果对探头直接检测结果进行归一化。

有益效果：本发明提供的利用带孔超声反射板实现高灵敏度高分辨率的光声显微镜及其成像的方法具有以下优点：

1、本发明利用带孔超声反射板实现的光声显微镜成像系统具有高探测灵敏度和高分辨率，即该光声显微镜系统的成像信噪比较高，可在较低能量的激光强度下获得高分辨率的光声图像；

2、本发明中带孔反射板的使用减少了激光照射和超声信号传播过程中的损耗，降低了光声成像对激光强度的要求，使得该光声显微镜系统在生物组织成像中更加安全；

3、本发明中光声显微镜系统为反射模式的成像系统，克服了透射式光声显微镜仅适用于薄样品的缺点，使得光声显微镜系统有了更广泛的应用，如对厚的生物组织(皮肤、手部)的皮下层成像；

4、本发明的光-声共聚焦实现方法简便，无需定制特殊的显微物镜或者超声换能器，仅采用常规的商业化生产的显微物镜和超声换能器即可实现高质量的光-声共聚焦。

附图说明

图1为本发明提供的基于带孔超声反射板的光声显微镜结构示意图；

图2为图1所示光声显微镜的探测灵敏度的数值模拟结果和实验结果图；2(a)、2(b)和2(c)为超声反射板的小孔直径为0mm、2mm和4mm时声场分布图；2(d)为聚焦区域声压轴线上声压分布，即为轴线上探测灵敏度的分布；2(e)为不同孔径下焦点处相对声压值，也就是系统的最佳探测灵敏度，其中实线是数值模拟的结果、实心点是实验测量的结果；

图3为图1所示光声显微镜的分辨率测量结果图；3(a)为碳纤维的最大投影光声图像；3(b)为3(a)中局部位置归一化的剖面轮廓；

图4为图1所示光声显微镜的两个应用实例，4(a)为基于带孔超声反射板的光声显微镜对小鼠耳朵的成像应用；(b)为基于带孔超声反射板的光声显微镜对手部皮肤的成像应用。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

如图1所示为一种基于带孔超声反射板的高灵敏度高分辨率光声显微镜，包括光纤耦合器FC、单模光纤SMF、准直镜CL、分光镜BS、光电探测器PD、数据采集仪DAQ、显微物镜OL、超声反射板和点聚焦超声换能器UT，在超声反射板上设置有小孔；纳秒脉冲激光器产生的激光脉冲，经过空间率波后，通过光纤耦合器耦合FC进入单模光纤SMF，单模光纤SMF出射的激光脉冲作为准直镜CL的入射激光；所述准直镜CL出射的激光束，经过分光镜BS后分为两路，一路经光电探测器PD触发数据采集仪DAQ，另一路通过显微物镜OL形成聚焦光束，照射在成像样品表面上；由于光声效应，照射在成像样品表面的聚焦光束在成像样品表面激发出光声信号，该光声信号经超声反射板全反射，实现90°转向，该90°转向后的光声信号入射至点聚焦超声换能器UT，点聚焦超声换能器UT的输出端连接有前置信号放大器，所述数据采集仪DAQ触发后，对经前置信号放大器放大后的点聚焦超声换能器UT输出的光声信号进行数模转换和高速采样。

一种基于带孔超声反射板的高灵敏度高分辨率光声显微镜成像法，包括如下步骤：

(1)Nd:YAG激光器工作波长为532nm，脉冲宽度约为15ns，脉冲重复率为10kHz；Nd:YAG激光器产生的激光脉冲，经过空间滤波后，通过光纤耦合器耦合FC进入单模光纤SMF；由单模光纤SMF出射的激光脉冲，经过准直镜CL准直后，入射至分光镜BS并分成两束，其中一束入射到数值孔径为0.25的显微物镜OL，另一束入射到光电探测器PD；

(2)入射到显微物镜OL的激光光束，形成聚焦光束照射在成像样品表面，超声反射板中心的小孔设置在聚焦光路上，并不对聚焦光束产生光学影响；记聚焦点在x-y平面上的坐标为(x,y)；由于聚焦光束经过超声反射板中心的小孔时未受到任何干扰，因此聚焦光束可以高质量地照射在成像样品表面，从而保证了成像的分辨率；超声反射板的厚度为2mm、倾斜度为45°的不锈钢反射板；

(3)由于光声效应，照射在成像样品表面的聚焦光束在成像样品表面激发出光声信号，该光声信号经超声反射板全反射，实现90°转向，该90°转向后的光声信号入射至点聚焦超声换能器UT；点聚焦超声换能器UT的焦距为20mm，中心频率为15MHz，-6dB相对带宽为60％；调整点聚焦超声换能器UT的位置，使得该90°转向后的光声信号的声学焦点与光学焦点重合，以保证最优的探测灵敏度；

(4)通过增益为46dB的前置信号放大器对超声换能器UT接收到的光声信号进行放大；同时，入射至光电探测器PD的激光光束，触发数据采集仪DAQ对前置信号放大器放大后的光声信号进行数模转换和高速采样，采样频率为250MHz，数字化后的光声信号被存储于计算机；

(5)记(x,y)位置处接收到的光声信号为p(x,y,t)，t为时间，时间零点为数据采集仪DAQ的触发时刻；耦合媒质为水，成像样品为软组织，水和软组织的平均声速C≈1500m/s，计算(x,y)处声轴上的一维光声图像S(x,y,z)为：

S(x,y,z)＝||Hilbert[p(z/C)]||

其中：Hilbert[·]表示Hilbert变换，||·||表示复数的模，z轴与声轴平行，且z轴与x-y平面垂直；

(6)逐点移动成像样品，重复步骤(1)～(5)，实现对成像样品的逐点扫描和逐点成像，最终获得成像样品的高灵敏度高分辨率的光声显微镜成像。

图2为图1装置的探测灵敏度的数值模拟和实验结果。

通过数值模拟，可获得带孔反射板孔径大小不同时超声换能器焦点附近声压分布，该模拟采用半径6mm，焦距为20mm，中心频率为15MHz的超声换能器探测信号。2(a)、2(b)和2(c)为超声反射板中间孔直径为0mm、2mm、4mm时声场分布图，对比证明反射板孔径对聚焦位置准确性没有影响；2(d)显示了聚焦区域轴向的声压分布，它也代表了轴线上探测灵敏度分布；2(e)为焦点处声压随着反射板孔径大小不同而变化的曲线，该声压曲线对无反射板时焦点声压进行归一化，它也表示了系统的最佳探测灵敏度，其中实线是数值模拟的结果、实心点是实验测量的结果，结果表明，带孔反射板中心孔径大小仅仅影响了焦点处声压大小，且孔直径为4.0mm时，焦点处声压值仅仅下降15.7％。

通过实验检测光声显微镜系统的探测灵敏度，具体方法为：采用脉冲激光照射黑胶带，在保持光照强度不变的前提下，上下移动超声探头，直至探测到的超声信号达到最强，即为探测焦点处的最优检测灵敏度。2(e)中的实心点给出了该光声显微镜系统的探测灵敏度，其探测灵敏度与采用超声探头直接接收灵敏度相当。

图3所示为基于带孔超声反射板的光声显微镜系统分辨率测量结果图；实验所用样品为随机散落的碳纤维，这些碳纤维的单根直径约为7微米。3(a)是碳纤维样品的光声最大投影图像，它清晰地反映了碳纤维的几何形状、尺寸和位置等；3(b)为3(a)中碳纤维图像局部位置(绿线处)x剖面的归一化强度分布曲线。图中空心圆点为3(a)中实验测得的光声信号强度剖面数据，虚线是对空心圆点进行高斯拟合得到的曲线，图中两峰值之间的距离约为8.9微米，由于碳纤维的直径约为7微米，则根据瑞利判据，该系统的横向分辨率优于1.9微米。

实施例一

图4(a)所示为该光声显微镜系统在生物成像上的应用。实验样品为六周大小、20g左右的裸鼠，对小鼠耳朵的血管和毛细血管进行光声成像。成像范围为5.0mm×5.0mm，逐点扫描步长为5微米。如图4(a)所示，小鼠耳朵的血管和毛细血管清晰可见。在中间区域，直径小于10.0μm的毛细血管十分密集。图像出色地展示了毛细血管在血管周围卷曲、环绕的形态。

实施例二

图4(b)所示为该光声显微镜系统在人体组织(手部皮肤)的应用。激光的能量和裸鼠实验采用的激光能量一样低以确保实验的安全性。志愿者的手被固定在容器下方。实验中采用超声耦合凝胶来实现手部皮肤和系统的耦合，自动平移台步长增大为20μm以加快扫描速度。图4(b)展示了手部皮肤和痣的高对比度光声图像，痣的形成是由于黑色素产生的光声信号。有趣的是，我们也能清晰观察到交错的皮肤皱纹，甚至在痣区域也能观察到皱纹，由此可以推测皱纹产生的光声信号是由不同的角质层结构产生的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于带孔超声反射板的高灵敏度高分辨率光声显微镜，其特征在于：包括单模光纤SMF、准直镜CL、分光镜BS、光电探测器PD、数据采集仪DAQ、显微物镜OL、超声反射板和点聚焦超声换能器UT，在超声反射板上设置有小孔；

所述单模光纤SMF出射的激光束经过准直镜CL准直后，经过分光镜BS分为两路，一路经光电探测器PD触发数据采集仪DAQ，另一路通过显微物镜OL形成聚焦光束，照射在成像样品表面上；由于光声效应，照射在成像样品表面的聚焦光束在成像样品表面激发出光声信号，该光声信号经超声反射板全反射，实现90°转向，该90°转向后的光声信号入射至点聚焦超声换能器UT；所述数据采集仪DAQ触发后，对点聚焦超声换能器UT输出的光声信号进行数模转换和高速采样。

2.根据权利要求1所述的基于带孔超声反射板的高灵敏度高分辨率光声显微镜，其特征在于：所述点聚焦超声换能器UT的输出端连接有前置信号放大器，所述数据采集仪DAQ触发后，对经前置信号放大器放大后的点聚焦超声换能器UT输出的光声信号进行数模转换和高速采样。

3.根据权利要求1所述的基于带孔超声反射板的高灵敏度高分辨率光声显微镜，其特征在于：还包括纳秒脉冲激光器和光纤耦合器耦合FC，秒脉冲激光器产生的激光脉冲，经过空间滤波后，通过光纤耦合器FC耦合进入单模光纤SMF，单模光纤SMF出射的激光脉冲作为准直镜CL的入射激光。

4.一种基于带孔超声反射板的高灵敏度高分辨率光声显微镜成像法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)入射激光经过准直镜CL准直后，入射至分光镜BS并分成两束，其中一束入射到显微物镜OL，另一束入射到光电探测器PD；

(2)入射到显微物镜OL的激光光束，形成聚焦光束照射在成像样品表面，超声反射板中心的小孔设置在聚焦光路上，并不对聚焦光束产生光学影响；记聚焦光束的光学聚焦点在x-y平面上的坐标为(x,y)；

(3)由于光声效应，照射在成像样品表面的聚焦光束在成像样品表面激发出光声信号，该光声信号经超声反射板全反射，实现90°转向，该90°转向后的光声信号入射至点聚焦超声换能器UT；调整点聚焦超声换能器UT的焦长和位置，使得该90°转向后的光声信号的声学焦点与光学焦点重合；

(4)通过前置信号放大器对超声换能器UT接收到的光声信号进行放大；同时，入射至光电探测器PD的激光光束，触发数据采集仪DAQ对前置信号放大器射出的光声信号进行数模转换和高速采样；

(5)记(x,y)位置处接收到的光声信号为p(x,y,t)，t为时间，时间零点为数据采集仪DAQ的触发时刻；耦合媒质和成像样品的平均声速为C，计算(x,y)处声轴上的一维光声图像S(x,y,z)为：

S(x,y,z)＝||Hilbert[p(z/C)]||

其中：Hilbert[·]表示Hilbert变换，||·||表示复数的模，z轴与声轴平行，且z轴与x-y平面垂直；

(6)逐点移动成像样品或者移动光声信号的激发与接收装置，重复步骤(1)～(5)，实现对成像样品的逐点扫描和逐点成像，最终获得成像样品的高灵敏度高分辨率的光声显微镜成像。

5.根据权利要求4所述的基于带孔超声反射板的高灵敏度高分辨率光声显微镜成像法，其特征在于：所述光声信号的激发与接收装置包括准直镜CL、分光镜BS、光电探测器PD、显微物镜OL、带孔超声反射板和点聚焦超声换能器UT。