CN108871911B - 一种叶酸复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种叶酸复合物及其制备方法与应用，所述叶酸复合物按照重量百分比计包括以下组分：叶酸0.05‑5wt％，亚甲蓝0.05‑5wt％，高分子材料0.5‑20wt％，溶剂75‑99wt％。所述叶酸复合物的制备方法是将叶酸、亚甲蓝与高分子材料溶液在30‑50℃条件下持续搅拌反应2‑6小时而获得。所述叶酸复合物用于制备一种上皮组织病变细胞染色液，所述染色液用于人体上皮组织病理学分析前的初步诊断。本发明提供的叶酸复合物的目的是通过改善叶酸的溶解性和亚甲蓝的生物透过性，从而提高上皮组织中叶酸和亚甲蓝的浓度，使得含有叶酸复合物的上皮组织病变细胞染色液的检测灵敏度和准确度大大提升。
Description
技术领域
本发明涉及一种叶酸复合物及其制备方法与应用。
背景技术
随着生活节奏加快、工作压力增大，肿瘤的患病率和死亡率逐年攀升。肿瘤疾病的防治工作成为广大医药工作者研究的重点。目前，肿瘤细胞筛查包括活体细胞检查、脱落细胞检查和肿瘤组织切片检查是对肿瘤诊断具有最直接的生物学和组织学意义。
亚甲蓝是一种无毒性的生物染色材料，该材料的氧化型呈蓝色，还原型为五色。在肿瘤细胞内的弱酸条件下，还原态的亚甲蓝可以被肿瘤病变细胞中具有强氧化性的自由基氧化为氧化型，呈蓝色，从而可初步判断该部位是否具有肿瘤病变细胞。
叶酸受体(FR)在许多上皮源性和非上皮源性恶性肿瘤细胞显著高表达，其表达水平大大高于正常细胞，具有组织特异性。FR是细胞摄取叶酸的重要途径，其机制为受体介导的内吞效应，这种机制具有亲和力高、特异性强的特点。国内外广大学者利用叶酸受体这一生物学特点，将其用于肿瘤的诊断和治疗。
CN103808551A公开一种肿瘤组织细胞染色剂的组合物，该组合物由显色剂、叶酸、隐色剂和pH调节剂组成。其原理是利用叶酸的靶向作用和显色剂在病变细胞内发生氧化还原反应从而变色的机理进行临床诊断。然而，该发明仅仅是将显色剂和叶酸进行简单的混合，显色剂凭借叶酸受体被吞噬到细胞内的量有限，所以检测限较高。
CN201510743350公开一种上皮组织染色剂及其制备方法，该发明是通过对叶酸的种类进行筛选从而提高与叶酸受体结合的特异性和亲和性以提高染色剂的准确性；其次，辣根过氧化酶的引入可以增强上皮肿瘤细胞内亚甲蓝发生氧化还原的程度和速度，以提高染色剂的灵敏度。
以上发明都是利用叶酸靶向作用结合亚甲蓝染色技术来鉴别肿瘤细胞，但是从发明内容上来看，只是单纯的对叶酸的种类进行筛查，或者是通过手段来加强亚甲蓝的氧化还原过程。然而，即使叶酸的亲和性和靶向性得到很大提升，但是进入肿瘤细胞内的亚甲蓝数量仍有限，那么检测结果的灵敏度仍有待提高。
发明内容
本发明公开的一种叶酸复合物及其制备方法与应用，其原理是利用高分子材料的特性，将小分子的亚甲蓝包裹到高分子材料所形成的空洞中后再与叶酸进行复合从而形成具有叶酸为靶向的高分子复合物。
本发明提供一种叶酸复合物，所述叶酸复合物按照重量百分比计包括以下组分：叶酸0.05-5wt％，亚甲蓝0.05-5wt％，高分子材料0.5-20wt％，溶剂75-99wt％。优选的，叶酸1-3wt％，亚甲蓝1-3wt％，高分子材料5-14wt％，溶剂80-90wt％；再进一步优选的，叶酸2-2.5wt％，亚甲蓝2-2.5wt％，高分子材料8-12wt％，溶剂83-88wt％。
进一步地，所述高分子材料包括壳聚糖、β环糊精、聚乙烯吡咯烷酮以及淀粉中的任意一种或者多种组合。当选择多种组合时，相互之间的质量配比没有限制。
进一步地，所述溶剂包括去离子水、二甲基亚砜、无水乙醇以及乙酸乙酯中的一种或者多种组合。当选择多种组合时，相互之间的质量配比没有限制。
本发明还提供一种叶酸复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将重量百分比为0.5-20wt％的高分子材料混悬于重量百分比为75-98.5wt％的溶剂中，搅拌均匀；
(2)将重量百分比为0.05-5wt％的亚甲蓝加入到步骤(1)制备的含有高分子材料的混悬液中，搅拌2-6小时后再加入重量百分比为0.05-5wt％的叶酸，继续搅拌反应2-4小时后即得。
进一步地，在30-50℃温度条件下将重量百分比为0.05-5.0wt％的亚甲蓝加入到步骤(1)制备的含有高分子材料的混悬液中。
本发明还提供一种叶酸复合物的应用，用于制备一种上皮组织病变细胞染色液，所述染色液用于人体上皮组织病理学分析前的初步诊断。
进一步地，所述染色液按照重量百分比计包括以下组分：叶酸复合物1.0-15wt％，抗氧剂0.5-10wt％，pH值调节剂0.01-2wt％，溶剂73-90wt％。优选为叶酸复合物2.0-15wt％，抗氧剂1-9wt％，pH值调节剂0.05-1.5wt％，溶剂75-88wt％。再进一步优选为叶酸复合物5-13wt％，抗氧剂2-8wt％，pH调节剂0.1-1.3wt％，溶剂80-86wt％；更进一步优选为叶酸复合物8-12wt％，抗氧剂4-6wt％，pH值调节剂1-1.2wt％，溶剂82-85wt％；最优选为叶酸复合物10wt％，抗氧剂5wt％，pH值调节剂1wt％，溶剂84wt％。
进一步地，所述染色液的制备方法包括以下步骤：
将重量百分比为0.5-10wt％的抗氧剂加入到重量百分比为73-90wt％的溶剂中，搅拌溶解后将重量百分比为1.0-15wt％的叶酸复合物缓慢加入其中，搅拌后以pH调节剂调节，使溶液pH值在5-8范围内，即得。
进一步地，所述抗氧剂为抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸氢钠、柠檬酸中的一种或多种，优选抗坏血酸、亚硫酸氢钠或焦亚硫酸氢钠。当选择多种组合时，相互之间的质量配比没有限制。
进一步地，所述pH调节剂为磷酸、盐酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸钠其中的一种或多种，优选醋酸和氢氧化钠；所述溶剂为乙醇、去离子水、二甲基亚砜、乙酸乙酯中的一种或多种。当选择多种组合时，相互之间的质量配比没有限制。当选择多种组合时，相互之间的质量配比没有限制。
本发明具有的优点在于：
本发明提供的叶酸复合物，在叶酸与病变细胞表皮叶酸受体结合被吞噬后，与之复合在一起的亚甲蓝也同时被吞噬，进入到病变细胞内的亚甲蓝浓度增加，从而提高检测灵敏度；其次，受高分子材料的保护作用，即使肿瘤病变细胞内外pH发生显著变化，也不会过多影响亚甲蓝的变色过程，从而保证染色稳定。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明加以说明，以下的实施例不限制对本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书中的内容为基础。
实施例1
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸0.5wt％，亚甲蓝0.5wt％，聚乙烯吡咯烷酮5wt％，乙醇94wt％。
所述叶酸复合物的制备方法包括如下步骤：(1)将处方量聚乙烯吡咯烷酮加入到乙醇中，搅拌均匀后加入处方量的亚甲蓝，30℃条件下反应4小时，待亚甲蓝完全与聚乙烯吡咯烷酮聚合后，加入处方量的叶酸继续反应2小时即得。
本实施例还提供一种含有叶酸复合物的上皮组织病变细胞染色剂，其组成按重量百分比包括以下组分：叶酸复合物9.5wt％、抗坏血酸5wt％、亚硫酸氢钠5wt％、醋酸0.5wt％、去离子水10wt％、二甲基亚砜70wt％。制备方法如下：将处方量去离子水和二甲基亚砜混合形成均一混合溶液后，先后加入抗坏血酸和亚硫酸氢钠，搅拌溶解得均一溶液；将处方量叶酸复合物溶液在搅拌条件下缓慢加入上述含有抗氧剂的溶液中，以醋酸调节pH在5-8范围内即得。
实施例2
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸3wt％，亚甲蓝1wt％，β环糊精10wt％，二甲基亚砜86wt％。制备方法如下：将处方量的β环糊精加入到处方量的二甲基亚砜中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，40℃条件下反应3小时；待亚甲蓝完全与β环糊精聚合后，加入处方量的叶酸继续反应3小时即得。
本实施例还提供一种含有叶酸复合物的上皮组织病变细胞染色剂，其组成按重量百分比包括以下组分：叶酸复合物15wt％、抗坏血酸5wt％、亚硫酸氢钠5wt％、醋酸0.7wt％、去离子水20wt％、二甲基亚砜54.3wt％。制备方法如下：将处方量去离子水和二甲基亚砜混合形成均一混合溶液后，先后加入亚硫酸氢钠和焦亚硫酸氢钠，搅拌溶解得均一溶液；将处方量叶酸复合物溶液在搅拌条件下缓慢加入上述含有抗氧剂的溶液中，以醋酸调节pH在5-8范围内即得。
对比例1
与实施例1中叶酸复合物的组成成分及比重均相同，但仅为各有效成分的物理混合物——叶酸混合物。
与实施例1中上皮组织病变细胞染色液的组成、比重和制备方法均相同，仅将组分中的叶酸复合物替溶液换成叶酸混合物溶液。
对比例2
与实施例2中叶酸复合物的组成成分及比重均相同，但仅为各有效成分的物理混合物——叶酸混合物。
与实施例2中上皮组织病变细胞染色液的组成、比重和制备方法均相同，仅将组分中的叶酸复合物替换成叶酸混合物。
本发明采用灵敏度来表征产品的性能。灵敏度是指对已经确诊的早期上皮组织肿瘤细胞病变患者切片进行染色试验，染色成功的比例即为灵敏度。选取确诊的早期上皮组织肿瘤细胞病变患者切片1000例进行染色试验。
| 实施例1 | 实施例2 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 灵敏度 | 98.9 | 99.1 | 94.3 | 91.2 |
从对比实验结果可以看出，实施例1和2使用本发明提供叶酸复合物制备的上皮组织病变细胞染色液与对比例1和2相比较具有更高的灵敏度，对于早期肿瘤患者的确诊起到关键作用。
实施例3
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸0.05wt％，亚甲蓝0.05wt％，壳聚糖0.9wt％，无水乙醇99wt％。制备方法如下：将处方量的壳聚糖加入到处方量的无水乙醇中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，30℃条件下搅拌反应2小时；待亚甲蓝完全与壳聚糖聚合后，加入处方量的叶酸继续反应3小时即得。
本实施例还提供一种含有叶酸复合物的上皮组织病变细胞染色剂，其组成按重量百分比包括以下组分：叶酸复合物溶液1wt％、抗坏血酸8.99wt％、醋酸0.01wt％、去离子水90wt％。制备方法如下：先后加入抗坏血酸加入到去离子水中，搅拌溶解得均一溶液；将处方量叶酸复合物在搅拌条件下缓慢加入上述含有抗氧剂的溶液中，以醋酸调节pH在5-8范围内即得。
实施例4
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸5wt％，亚甲蓝5wt％，聚乙烯吡咯烷酮0.5wt％，乙酸乙酯89.5wt％。制备方法如下：将处方量的聚乙烯吡咯烷酮加入到处方量的乙酸乙酯中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，40℃条件下搅拌反应6小时；待亚甲蓝完全β环糊精聚合后，加入处方量的叶酸继续反应2小时即得。
实施例5
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸1wt％，亚甲蓝1wt％，淀粉20wt％，乙酸乙酯78wt％。制备方法如下：将处方量的淀粉加入到处方量的乙酸乙酯中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，50℃条件下搅拌反应2小时；待亚甲蓝完全与淀粉聚合后，加入处方量的叶酸继续反应2小时即得。
实施例6
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸2wt％，亚甲蓝2wt％，淀粉8wt％，乙酸乙酯88wt％。制备方法如下：将处方量的淀粉加入到处方量的乙酸乙酯中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，50℃条件下搅拌反应6小时；待亚甲蓝完全与淀粉聚合后，加入处方量的叶酸继续反应4小时即得。
实施例7
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸2.5wt％，亚甲蓝2.5wt％，淀粉12wt％，乙酸乙酯83wt％。制备方法如下：将处方量的淀粉加入到处方量的乙酸乙酯中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，40℃条件下搅拌反应3小时；待亚甲蓝完全与淀粉聚合后，加入处方量的叶酸继续反应4小时即得。
实施例8
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸1wt％，亚甲蓝1wt％，淀粉5wt％，乙酸乙酯93wt％。制备方法如下：将处方量的淀粉加入到处方量的乙酸乙酯中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，40℃条件下搅拌反应3小时；待亚甲蓝完全与淀粉聚合后，加入处方量的叶酸继续反应4小时即得。
实施例9
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸3wt％，亚甲蓝3wt％，淀粉14wt％，乙酸乙酯80wt％。制备方法如下：将处方量的淀粉加入到处方量的乙酸乙酯中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，40℃条件下搅拌反应3小时；待亚甲蓝完全与淀粉聚合后，加入处方量的叶酸继续反应4小时即得。
实施例10
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸5wt％，亚甲蓝5wt％，淀粉15wt％，乙酸乙酯75wt％。制备方法如下：将处方量的淀粉加入到处方量的乙酸乙酯中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，50℃条件下搅拌反应2小时；待亚甲蓝完全与淀粉聚合后，加入处方量的叶酸继续反应4小时即得。
实施例11
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸2.5wt％，亚甲蓝2.5wt％，淀粉12wt％，乙酸乙酯83wt％。制备方法如下：将处方量的淀粉加入到处方量的乙酸乙酯中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，50℃条件下搅拌反应2小时；待亚甲蓝完全与淀粉聚合后，加入处方量的叶酸继续反应4小时即得。
实施例12
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸2.5wt％，亚甲蓝2.5wt％，聚乙烯吡咯烷酮15wt％，二甲基亚砜80wt％。制备方法如下：将处方量的聚乙烯吡咯烷酮加入到处方量的二甲基亚砜中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，30℃条件下搅拌反应6小时；待亚甲蓝完全与聚乙烯吡咯烷酮聚合后，加入处方量的叶酸继续反应3小时即得。
实施例13
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸1.5wt％，亚甲蓝5wt％，聚乙烯吡咯烷酮3.5wt％，二甲基亚砜90wt％。制备方法如下：将处方量的聚乙烯吡咯烷酮加入到处方量的二甲基亚砜中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，30℃条件下搅拌反应6小时；待亚甲蓝完全与聚乙烯吡咯烷酮聚合后，加入处方量的叶酸继续反应3小时即得。
实施例14
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸2wt％，亚甲蓝2wt％，β环糊精10wt％，无水乙醇86wt％。制备方法如下：将处方量的β环糊精加入到处方量的无水乙醇，搅拌均匀后加入亚甲蓝，30℃条件下搅拌反应6小时；待亚甲蓝完全与β环糊精聚合后，加入处方量的叶酸继续反应3小时即得。
实施例15
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸2wt％，亚甲蓝3wt％，β环糊精10wt％，聚乙烯吡咯烷酮10wt％，无水乙醇35wt％，乙酸乙酯40wt％。制备方法如下：将处方量的β环糊精、聚乙烯吡咯烷酮加入到处方量的无水乙醇、乙酸乙酯混合液中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，40℃条件下搅拌反应5小时；待亚甲蓝完全与β环糊精、聚乙烯吡咯烷酮聚合后，加入处方量的叶酸继续反应2.5小时即得。
实施例16
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸0.5wt％，亚甲蓝0.5wt％，2wt％壳聚糖，β环糊精2wt％，聚乙烯吡咯烷酮2wt％，无水乙醇40wt％，二甲基亚砜53wt％。制备方法如下：将处方量的壳聚糖、β环糊精、聚乙烯吡咯烷酮加入到处方量的无水乙醇、二甲基亚砜混合液中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，45℃条件下搅拌反应5小时；待亚甲蓝完全与壳聚糖、β环糊精、聚乙烯吡咯烷酮聚合后，加入处方量的叶酸继续反应3.5小时即得。
实施例17
本实施例提供一种叶酸复合物，其组成按重量百分比计算包括以下组分：叶酸2wt％，亚甲蓝2wt％，2wt％壳聚糖，β环糊精3wt％，无水乙醇40wt％，二甲基亚砜51wt％。制备方法如下：将处方量的壳聚糖、β环糊精、聚乙烯吡咯烷酮加入到处方量的无水乙醇、二甲基亚砜混合液中，搅拌均匀后加入亚甲蓝，45℃条件下搅拌反应5小时；待亚甲蓝完全与壳聚糖、β环糊精、聚乙烯吡咯烷酮聚合后，加入处方量的叶酸继续反应3.5小时即得。
Claims (8)
1.一种叶酸复合物，其特征在于，所述叶酸复合物按照重量百分比计包括以下组分：叶酸0.05-5wt％，亚甲蓝0.05-5wt％，高分子材料0.5-20wt％，溶剂75-99wt％；
所述高分子材料包括壳聚糖、β环糊精、聚乙烯吡咯烷酮以及淀粉中的任意一种或者多种组合；
所述叶酸复合物的制备方法包括以下步骤：
(1)将重量百分比为0.5-20wt％的高分子材料混悬于重量百分比为75-99wt％的溶剂中；
(2)将重量百分比为0.05-5wt％的亚甲蓝加入到步骤(1)制备的含有高分子材料的混悬液中，搅拌2-6小时后再加入重量百分比为0.05-5wt％的叶酸，继续搅拌反应2-4小时后即得。
2.根据权利要求1所述叶酸复合物，其特征在于，所述溶剂包括去离子水、二甲基亚砜、无水乙醇以及乙酸乙酯中的一种或者多种组合。
3.根据权利要求1所述叶酸复合物，其特征在于，在30-50℃温度条件下将重量百分比为0.05-5.0wt％的亚甲蓝加入到步骤(1)制备的含有高分子材料的混悬液中。
4.一种权利要求1至3中任意一项所述叶酸复合物的应用，其特征在于，用于制备一种上皮组织病变细胞染色液。
5.根据权利要求4所述叶酸复合物的应用，其特征在于，所述染色液按照重量百分比计包括以下组分：叶酸复合物1.0-15wt％，抗氧剂0.5-10wt％，pH调节剂0.01-2wt％，溶剂73-90wt％。
6.根据权利要求5所述叶酸复合物的应用，其特征在于，所述染色液的制备方法包括以下步骤：
将重量百分比为0.5-10wt％的抗氧剂加入到重量百分比为73-90wt％的溶剂中，搅拌溶解后将重量百分比为1.0-15wt％的叶酸复合物缓慢加入其中，搅拌后以pH调节剂调节，使溶液pH值在5-8范围内，即得。
7.根据权利要求5或6所述叶酸复合物的应用，其特征在于，所述抗氧剂为抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸氢钠、柠檬酸中的一种或多种。
8.根据权利要求5或6所述叶酸复合物的应用，其特征在于，所述pH调节剂为磷酸、盐酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸钠其中的一种或多种；所述溶剂为乙醇、去离子水、二甲基亚砜、乙酸乙酯中的一种或多种。
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