CN108841972A - 一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及临床医疗领域，尤其涉及一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒及其应用：第一试剂为基因序列为5’‑AGAGTTTGATCATGGCTC‑3’和5’‑CCGTCAATTCCTTTGAGTTT‑3’的水溶引物；第二试剂为pGEM‑T easy载体质粒，通过对代谢标本的PCR扩增，载体质粒pGEM‑T easy及转入DH5α感受态细胞，通过探索脑梗塞患者肠道菌群结构，可为其诊断提供新依据，并为预防提供可能的指征，具有较大的社会意义和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及临床医疗领域，尤其涉及一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒及其应用。
背景技术
脑梗塞又称急性缺血性脑卒中(Cerebral Ischemia，CI)，是老年人中比较常见的疾病，严重的影响患者的生存质量。近年来，由于个人生活习惯不合理或者个人生活的环境因素使得脑血管首次发病者年龄逐渐年轻化。脑血管病目前已成为中国第一大致残和第二大致死疾病。尽管近年来脑梗死的治疗水平得到了很大提高，但大部分患者的治疗效果仍不理想，死亡率与致残率均较高、预后较差。因此，探索脑梗死发病机制并预防被认为是控制脑梗死最经济有效的方法。
在过去的几年内，复杂的肠道微生物生态系统已经被广泛的研究。我们认为，饮食结构会影响肠道菌群，反之，肠道菌群结构的改变也会影响人体代谢，而代谢的改变已经被认为是脑梗死的潜在原因之一。目前尚未存在一种通过代谢产物诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒及其应用。
1.一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒，其特征在于，包括依次设置的如下试剂：
第一试剂为基因序列为5’-AGAGTTTGATCATGGCTC-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’的水溶引物；
第二试剂为pGEM-T easy载体质粒。
2.一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒应用，其特征在于：
a.将粪便标本的基因组DNA为模板，加入第一试剂为基因序列为5’-AGAGTTTGATCATGGCTC-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’的水溶引物中，以High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR扩增；
b.将PCR产物加入第二试剂载体质粒pGEM-T easy，使其连接，转染；
c.将连接，转染后产物，转入DH5α感受态细胞，并进行测序，测序结果使用GenBank的BLAST和RDP数据库进行比对,得到各微生物相对丰度，进行分析。
本发明的有益效果是：
通过对代谢标本的PCR扩增，载体质粒pGEM-T easy及转入DH5α感受态细胞，分析各微生物相对丰度，并且通过探索脑梗塞患者肠道菌群结构，发现脑梗塞患者与健康志愿者肠道菌群结构相似度较低，脑缺血与健康组肠道菌群结构相似度较高，可能与脑梗塞进程有关，并为脑梗塞患者的诊断与分层以及发病机制提供新的依据。通过寻找脑梗塞患者的特征性肠道菌群，可为其诊断提供新依据，并为预防提供可能的指征，具有较大的社会意义和经济效益。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
所示，本发明一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒，其特征在于，包括依次设置的如下试剂：
第一试剂为基因序列为5’-AGAGTTTGATCATGGCTC-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’的水溶引物；
第二试剂为pGEM-T easy载体质粒。
一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒应用，其特征在于：
a.将粪便标本的基因组DNA为模板，加入第一试剂为基因序列为5’-AGAGTTTGATCATGGCTC-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’的水溶引物中，以High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR扩增；其中将粪便标本通过粪便基因组提取试剂盒按照试剂盒说明书方法提取总RNA。利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl，并以稀释后的基因组DNA作为模板。
b.将PCR产物加入第二试剂载体质粒pGEM-T easy，使其连接，转染；
c.将连接，转染后产物，转入DH5α感受态细胞，并进行测序，测序结果使用GenBank的BLAST和RDP数据库进行比对,得到各微生物相对丰度，进行分析。
结果应用SPSS1.0软件进行数据分析组间分析采用Tukey和wilcox秩和检验分析组间物种Beta多样性差异是否显著，以P<0.05判定差异具有统计学意义。用Qiime软件(Version 1.7.0)计算Unifrac距离、构建UPGMA样品聚类树。使用R软件(Version 2.15.3)绘制PCoA图，PCoA分析使用R软件的WGCNA，stats和ggplot2软件包。使用R软件进行Beta多样性指数组间差异分析。
根据所有健康志愿者、脑缺血和脑梗死患者粪便样品在门、纲、目、科和属的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35位的门、纲、目、科和属的物种进行聚类，可发现聚集较多或含量较低的微生物种类
根据物种注释结果和OTUs的丰度信息，通过主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)对各组菌群结构特征进行分析，从结果中可看出，健康志愿者和脑梗死患者组肠道菌群结构之间存在显著不同，而各组中样品菌群结构相似，脑缺血组和健康组相比未见显著变化。
其中：
纲：gammaproteobacteria相对丰度高于23％；
科：enterobacteriaceae相对丰度高于22％；
目：enterobacteriales相对丰度高于22％；
属：escherichia_shigella:相对丰度高于20％可判断粪便样本与脑梗死患者有较大相关性。
通过对代谢标本的PCR扩增，载体质粒pGEM-T easy及转入DH5α感受态细胞，分析各微生物相对丰度，并且通过探索脑梗塞患者肠道菌群结构，发现脑梗塞患者与健康志愿者肠道菌群结构相似度较低，脑缺血与健康组肠道菌群结构相似度较高，可能与脑梗塞进程有关，并为脑梗塞患者的诊断与分层以及发病机制提供新的依据。通过寻找脑梗塞患者的特征性肠道菌群，可为其诊断提供新依据，并为预防提供可能的指征，具有较大的社会意义和经济效益。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒，其特征在于，包括依次设置的如下试剂：
第一试剂为基因序列为5’-AGAGTTTGATCATGGCTC-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’的水溶引物；
第二试剂为pGEM-T easy载体质粒。
2.一种用于诊断脑梗塞的肠道菌群试剂盒应用，其特征在于：
a.将粪便标本的基因组DNA为模板，加入第一试剂为基因序列为5’-AGAGTTTGATCATGGCTC-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’的水溶引物中，以High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR扩增；
b.将PCR产物加入第二试剂载体质粒pGEM-T easy，使其连接，转染；
c.将连接，转染后产物，转入DH5α感受态细胞，并进行测序，测序结果使用GenBank的BLAST和RDP数据库进行比对,得到各微生物相对丰度，进行分析。
d.纲：gammaproteobacteria相对丰度高于23％；
科：enterobacteriaceae相对丰度高于22％；
目：enterobacteriales相对丰度高于22％；
属：escherichia_shigella:相对丰度高于20％可判断粪便样本与脑梗死患者有相关性。
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