CN108815191A - Rig-i通路介导对hcmv细胞抗病毒作用 - Google Patents

Rig-i通路介导对hcmv细胞抗病毒作用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了RIG‑I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用，星形胶质细胞的模式识别受体RIG‑I识别病毒蛋白和核酸的病原相关分子模式，导致细胞信号转导通路活化，启动I型干扰素的表达。I型干扰素促进干扰素刺激基因的表达，通过多种机制抑制病毒的复制。本发明的有益效果是对胚胎发育期的抗HCMV感染具有重要的临床应用价值。

Description

RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用
技术领域
本发明属于医学技术领域，涉及RIG-I通路介导HCMV感染的神经星形胶质细胞抗病毒作用。
背景技术
人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)属于庖疹病毒β亚科，在大部分免疫系统正常的成人中潜伏感染、无临床症状，在免疫缺陷性疾病中病毒重新激活、导致高发病率和高死亡率。HCMV感染所致的神经系统发育异常是出生缺陷的常见原因之一。HCMV对发育中的脑组织有特殊亲嗜性，在神经发育的重要时期孕早期感染容易导致严重的胎儿神经系统损伤。由于CMV感染具有严格的细胞嗜性和种属特异性，至今HCMV感染与胚胎发育时期神经组织的相互作用机制不明，也不了解中枢神经组织对抗病毒感染的免疫相关机制。
星形胶质细胞在神经发育的过程中始终伴着神经元的整个发育过程，在正常生理、神经系统发育、抗感染免疫过程中发挥重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用，本发明的有益效果是对胚胎发育期的抗HCMV感染具有重要的临床应用价值。
本发明所采用的技术方案是RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用。
进一步，RIG-I通路介导HCMV感染的神经星形胶质细胞抗病毒作用。
附图说明
图1是本发明实验路线示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
1.关于HCMVAD169感染的人孕早期星形胶质细胞全基因组表达谱分析中首次发现，与未感染组比较，HCMV感染6h，模式识别受体RIG-I通路分子表达变化明显RIG-I、IPS-1、IRF3/7表达上调，变化有统计学意义(p<0.05)，而已经证实的HCMV模式识别受体TLR2、TLR4的表达变化没有统计学意义(p>0.05)。实验方法如图1所示，基于以上前期实验结果，本项目拟高表达和低表达RIG-I分子及接头蛋白IPS-1，转导HCMV AD169感染的人孕早期星形胶质细胞，通过检测实验组和对照组细胞的HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达，验证RIG-I识别通路介导的HCMV感染的人孕早期星形胶质细胞的抗病毒作用。
2.2.1.1RIG-I分子介导抗病毒作用
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理后，高表达RIG-I/ShRNA RIG-I慢病毒载体转导细胞，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达以及测定细胞内外病毒滴度。
2.2.1.2接头蛋白IPS-1介导抗病毒作用
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理后，高表达及ShRNA IPS-1(RIG-I下游的必须接头蛋白)慢病毒载体转导细胞，RT-qPCR、Westernblotting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达以及测定细胞内外病毒滴度，通过研究IPS-1，进一步证实RIG-I通路介导的HCMV感染星形胶质细胞的抗病毒作用。
2.2.1.3共培养检测RIG-I介导抗病毒作用通过共培养方法或者收集人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理细胞上清(SN)加入HCMV感染的星形胶质细胞或神经元，检测病毒复制，进一步证实RIG-I介导的抗病毒作用。
2.2.2RIG-I通路参与合成抗病毒分子I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG已经证实，模式识别受体识别病原体的病原相关分子模式，活化细胞并传递信号给下游分子诱导IFN、ISG的合成以抑制病毒的复制和扩散，本项目拟通过HCMV感染活化RIG-I通路，检测抗病毒分子I型和III型IFN和ISG的表达和分泌，进一步证实RIG-I通路介导HCMV感染的人孕早期星形胶质细胞抗病毒作用。
2.2.2.1HCMV感染细胞I型、III型IFN和ISG表达的检测
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)与细胞RIG-I作用后，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting检测和ISG的表达。
2.2.2.2检测I型和III型IFN是否参与ISG的表达
通过IFNAR2中和抗体和IFNλ胞外段抗体IL-10Rβ处理HCMV感染细胞，检测I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG表达，证明I型IFNα/β和III型IFNλ是否参与ISG的表达
2.3.1RIG-I通路介导HCMV感染神经星形胶质细胞抗病毒作用
2.3.1.1RIG-I分子介导抗病毒作用
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理后，高表达RIG-I/ShRNA RIG-I慢病毒载体转导细胞，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting、免疫组化方法检测HCMV病毒物IE1/2、pp65的表达以及测定细胞内外病毒滴度。
①RT-qPCR检测：接种细胞，次日更换为维持生长培养基，设定感染组和未感染组，病毒感染3h、6h、12h后，收集感染和未感染组细胞，TRIzol抽提总RNA，以Oligo(dt)作为引物，将RNA逆转录为cDNA，qPCR检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达。
②Western blotting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达：蛋白标准曲线的制作及蛋白浓度的测定，蛋白提取。Western blotting：i.从不同样品中取出等量蛋白(100μg)与蛋白上样缓冲液混合，并于100℃变性3min；ii.电泳；iii.转膜；iv.5％的脱脂奶粉PBST溶液封闭；用封闭液稀释的一抗(包括RIG-I、IRF3、IRF7、ISGs、Actin、GAPDH 4℃孵育过夜；vi.洗涤；vii.二抗室温孵育1h；viii.洗涤；ix.加底物和显色剂，暗室中进行曝光显色。
③免疫组化检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达：i.接种细胞；ii.甲醛固定：弃掉培养基4％的多聚甲醛4℃固定细胞30min，0.01M PBS洗3次；iii.透化：0.2％的Tritonx-100室温透化30min，0.01M PBS洗3次；iv.封闭：10％的山羊血清室温封闭30min，不洗；v.孵育1抗：4℃孵育过夜；0.01M PBS洗3次；vi.孵育二抗：加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1:100)37℃闭光孵育30min；0.01M PBS洗3次；vii.DAPI复染细胞核，激光共聚焦显微镜下观察，拍照。
④病毒滴度的测定：收集细胞，经10％甲醛固定和0.5％结晶紫染色，倒置显微镜下进行空斑计数。空斑定量检测细胞内、外病毒滴度变化，病毒负荷量按下列公式计算：感染性病毒量(PFU/mL)＝(蚀斑均数×病毒稀释倍数)/病毒接种量(mL)，再取log值。
2.3.1.2接头蛋白IPS-1介导抗病毒作用
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNApoly(dAT:dAT)处理后，高表达及ShRNA IPS-1(RIG-I下游的必须接头蛋白)慢病毒载体转导细胞，RT-qPCR、Westernblottingting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp 65的表达以及测定细胞内外病毒滴度，通过研究IPS-1，进一步证实RIG-I通路介导的HCMV感染星形胶质细胞的抗病毒作用。
①RT-qPCR检测：接种细胞，次日更换为2％FBS维持生长培养基，设定感染组和未感染组，病毒感染3h、6h、12h后，收集感染和未感染组细胞，TRIzol抽提总RNA，以Oligo(dt)作为引物，将RNA逆转录为cDNA，qPCR检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达。
②Western blotting检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达：蛋白标准曲线的制作及蛋白浓度的测定，蛋白提取。Western blotting：i.从不同样品中取出等量蛋白(100μg)与2×SDS蛋白上样缓冲液混合，并于100℃变性5min；ii.电泳；iii.转膜；iv.5％牛奶的PBST溶液封闭；用封闭液稀释的一抗(包括RIG-I、IRF3、IRF7、ISGs、、Actin、GAPDH v4℃孵育过夜；vi.洗涤；vii.二抗室温孵育1h；viii.洗涤；ix.加底物显色剂，暗室中进行曝光显色。
③免疫组化检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达：i.细胞接种；ii.固定：弃掉培养基4％的多聚甲醛4℃固定细胞30min，0.01M PBS洗3次；iii.透化：0.2％的Tritonx-100室温透化30min，0.01M PBS洗3次；iv.封闭：10％的山羊血清室温封闭30min，不洗；v.孵育一抗：4℃孵育过夜；0.01M PBS洗3次；vi.孵育二抗：加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1:100)37℃闭光孵育30min；0.01M PBS洗3次；vii.DAPI复染细胞核，激光共聚焦显微镜下观察，拍照。
④病毒滴度的测定：收集细胞，经10％甲醛固定和0.5％结晶紫染色，倒置显微镜下进行空斑计数。空斑定量检测细胞内、外病毒滴度变化，病毒负荷量按下列公式计算：感染性病毒量(PFU/mL)＝(蚀斑均数×病毒稀释倍数)/病毒接种量(mL)，再取log值。
2.3.1.3共培养检测RIG-I分子介导抗病毒作用
使用人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理细胞16h，然后和HCMV感染的星形胶质细胞或神经元共培养，处理细胞在transwell共培养小室的下面，未处理的星形胶质细胞或神经元在transwell共培养小室的上面，共培养48h后，检测共培养小室上面的HCMV感染的病毒复制，进一步证实RIG-I介导的抗病毒作用；另外，收集人工合成dsDNA poly(dAT:dAT)处理细胞上清(SN)加到HCMV感染的星形胶质细胞或神经元的培养基中，检测病毒复制，进一步证实RIG-I介导的抗病毒作用。将dsDNA poly(dAT:dAT)刺激的培养上清(SD)，dsDNApoly(dAT:dAT)5％，10％，20％vol/vol)加入到HCMV感染的星形胶质细胞或神经元中，48h后检测病毒复制，更充分地证实RIG-I介导的抗病毒作用。
2.3.2RIG-I参与合成抗病毒分子I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG
2.3.2.1HCMV感染细胞I型、III型IFN和ISG表达的检测
接种人胚胎星形胶质细胞，HCMV、人工合成dsDNApoly(dAT:dAT)与人胚胎星形胶质细胞RIG-I作用后，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting、免疫组化、ELISA方法检测I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG的表达。RT-qPCR、Western blotting、免疫组化操作方法同前。ELISA方法如下：
接种人星形胶质细胞于96孔板，HCMV(MOI＝(1.0～5.0)感染人星形胶质细胞，同时设立阴性对照组，感染不同时间后，取细胞培养上清液，每孔取50uL，每个时间点取20孔，然后用0.45nm的微孔滤膜过滤，无菌EP管收集，-86℃保存，备用。采用ELISA法检测培养上清液中星形胶质细胞分泌的I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG的含量。每个检测重复3次。实验步骤依据说明书(Quantikine R&D systems Europe Ltd,UK)操作定量化。
2.3.2.2检测I型和III型是否参与ISG的表达
通过IFNAR2中和抗体和IFNλ胞外段抗体IL-10Rβ处理HCMV感染细胞，检测HCMV病毒标志物IE1/2、pp65的表达、I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG表达。
i.接种人胚胎星形胶质细胞于6孔板，5×105/孔，同时设定对照组。
ii.第二天，IFNAR2中和抗体或IL-10Rβ处理细胞后，HCMV感染细胞，裂解细胞，RT-qPCR、Western blotting、免疫组化(操作方法同前)检测I型IFNα/β、III型IFNλ和ISG的表达。
本发明具有如下优点：
(1)HCMV对发育中的脑组织有特殊亲噬性，神经发育的重要时期在孕早期，这一时期感染HCMV容易导致神经损伤，由于HCMV的种属特异性，目前国内外无动物模型用于试验。本项目采用HCMV感染的原代人孕早期星形胶质细胞为模型进行研究，人孕早期星形胶质细胞比其他细胞株更接近体内细胞的特性，实验结果更具说服力；
(2)本发明首次发现HCMV感染星形胶质细胞RIG-I通路分子表达上调的现象，国内外首次研究模式识别受体RIG-I介导的HCMV感染星形胶质细胞的抗病毒效应，揭示RIG-I通路在HCMV感染的神经星形胶质细胞固有免疫抗病毒作用的重要意义，具有重要的临床应用价值。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用。
2.按照权利要求1所述RIG-I通路介导对HCMV细胞抗病毒作用，其特征在于：所述RIG-I通路介导HCMV感染的神经星形胶质细胞抗病毒作用。
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