CN108811877A - 一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂及测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于园艺；蔬菜的栽培技术领域，公开了一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂及测定方法，所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂为葡萄糖。本发明通过外源葡萄糖喷施处理富士苹果‘长富2号’品种，研究其对花芽孕育的影响，基于RNA‑seq测序手段，全面解析外源葡萄糖调控苹果花芽孕育过程中糖代谢以及成花相关基因表达模式；利用重测序技术鉴定比较不同成花特性芽变品种成花相关基因DNA多态性变异差异，发掘差异基因。葡萄糖处理促使短枝顶芽中可溶性糖及淀粉含量的上升，有利于短枝顶芽在花芽生理分化期的生长，富士成花率显著提升。

Description

一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂及测定方法
技术领域
本发明属于园艺；蔬菜的栽培技术领域，尤其涉及一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂及测定方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：据FAO(2016)统计数据显示，全球苹果栽培面积达到529.33万公顷，总产量8932.92万吨，单产168758百克/公顷。苹果作为栽培作物由来已久，在漫长发展过程中种类逐增，是全球最重要的农业经济作物之一。同时，苹果作为我国第一大商品性水果品种，FAO(2016)统计数据显示我国苹果栽培面积238.39万公顷，产量4444.86万吨。有数据统计以来，从1993年开始，我国的苹果在栽培面积和产量上就已经位居世界的首位。‘富士’苹果，起源于日本农林水产省，1939年本省果树试验场以国光为母本，元帅为父本进行杂交，经过数十年的品种选育，专家发现芽变品种在生产中利用愈加广泛。红富士是从普通富士的芽(枝)变中选育出的着色系富士的统称。‘长富1号’是第一个富士片红芽变品种。至今，大概有100个芽变品种被运用到栽培中，根据表型的变化大致将其分为三类：着色型芽变，短枝型芽变和早熟型芽变(束怀瑞1999)。‘富士’在我国种植面积占比达到70％，产量占比达到65％，是我国最主要的栽培品种。但是在实际栽培中，还存在诸多问题，比如普通富士难成花、童期较长、大小年现象严重，使其产量及其不稳定。在实际生产中，现多采用修剪，拉枝，环割等手段缓解这一现象。虽然一定程度上缓解了‘富士’苹果的产业难题，但技术繁琐、成本巨大、难于统一化的劣势也显而易见。研究富士苹果花芽分化的生理与分子机制，寻求解决富士苹果难成花的技术是急待解决的产业问题。众所周知，植物开花的时间是内外因素共同调控，外在环境因素有光照时间、光质、水分、营养物质等，内在因素有发育阶段、营养状态、激素水平等。苹果等果树花芽分化主要包括两个重要时期：生理分化期与形态分化期。苹果等多年生木本植物，在经过一定阶段营养生长之后，树体进入生殖生长发育阶段。此过程中，完成营养物质的积累后的茎尖分生组织在一定的条件诱导下，属性逐渐改变，成为花序分生组织，而这个过程被称为芽生理分化期。这一时期是花芽诱导和花芽发端的关键时期，其包括成花诱导(Floral Induction)和成花起始(Floral Initiation)两个阶段。成花诱导指在成花基因诱导下，茎尖分生组织内部结构改变，其生长状态由营养生长逐渐过渡至生殖生长，并有花芽分化的趋势。花芽发端指完成花芽孕育的过程，此时的茎尖分生组织逐渐分化，不可逆转的形成花器官原基。研究发现，苹果当年生枝条的停长的时期就是花芽孕育的起始点，一般在花后40-50d左右。之后进入花芽的形态分化期，其特点为分生组织呈扁平状，顶芽生长点增大变圆，芽的形态结构发生由花原基发育为成熟的花器官，常见于盛花期后100d左右。花芽分化这一复杂但重要的过程，直接影响到苹果开花的数量、质量以及坐果率等。由于关系到产业现实问题，所以苹果花芽分化的生理与分子机制长久以来都是果树科学研究的重点。为了揭示植物成花转变的机制，在模式植株拟南芥中，科学家进行了大量的报道与研究。在现有报道中，众多调控植物开花的相关基因在拟南芥中已被鉴定出来，并且明确6条植物开花信号调控途径：即光周期途径(photoperiod pathway)、自主途径(autonomous pathway)、春化途径(vemalizationpathway)、赤霉素途径(gibberellin pathway)、温敏途径(ambient temperaturepathway)、年龄途径(aging pathway)，这几个途径组成一个复杂的基因网络共同调控植物开花时间。光周期对植物形态建成具有重要作用，也是调节成花诱导的关键外源因子。植物通过对外界昼夜相对长短的变化来调控成花。拟南芥是长日照植物，长日照下促花，短日照下开花受到抑制，其光感受部位部位为叶片。光周期诱导下，光受体(光敏素，隐花素和紫外线B类受体)在昼夜节律(circadian rhythm)发生改变时，植物体内光周期平衡被打破，会直接影响一些基因的表达，从而调控开花过程。CONSTANS(CO)是光周期途径下游的关键基因，在整个通路中具有桥梁作用。一方面它受到上游的昼夜节律基因的调控，GIGANTEA(GI)可通过F-box泛素连接酶家族之间的相互作用来促进一些CO转录抑制因子的降解，例如FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX1(FKF1)蛋白可以降解CYCLING DOF FACTOR(CDF)，从而正向调控CO表达(Ayre et al.2004)。此外，在缺少光照的条件下，CONSTITUTIVEPHOTOMORPHOGENIC1(COP1)泛素连接酶可以降解CO调控其表达。另一方面，CO能直接正向调控下游开花时间调节基因SUPPRESSOR OF OVEREX-PRESSION OF CONSTANS1(SOC1)、FLOWERING LOCUST(FT)和LEAFY(LFY)的表达。在苹果中已克隆出光周期相关的同源基因：PHYTOCHROME、CO、FT等。苹果中存在CONSTANS-like(COL)与NUCLEAR FACTOR Y(NF-Y)的互作，且二者共同调控FT1的表达。春化作用是指在低温诱导(4℃)条件下，且低温持续一定时长(7-56d)，植物表现出开花表型的过程。该途径中发挥主要作用的基因是MADS-box成花抑制因子FLOWERINGLOCUS C(FLC)。春化过程中，低温促使FLC反义转录产生反义长链非编码RNA COOLAIR，引发FLC转录沉默，从而保持其低水平表达状态。即使植物恢复到较高温度，FLC抑制的维持也需要染色质上的组蛋白修饰，其中起到主要作用的便是PHD-fingerprotein VERNALIZATION-INSENSITIVE 1，2，3(VIN 1，2，3)。FRIGIDA(FRI)突变体可以恢复晚花表型，且正向调控FLC的表达，同样也是春化途径中的关键基因，两者都可以抑制SOC1、LFY、FT等下游成花基因的表达。只受植物内源信号的调控，不管环境因素，生长到一定阶段后都会开花的途径统称为自主途径。拟南芥作为兼性长日照植物，在短日照下呈现晚花表型。现已被鉴定的自主途径相关基因主要有FLOWERING CONTROL LOCUSA(FCA)、FLOWERINGLOCUS PA(FPA)、FLOWERING LOCUS K(FLK)、FLOWERING LOCUS D(FLD)、FLOWERING LOCUSVE(FVE)等，拟南芥突变体fca、fld、fpa、flk均表现出晚花，且这些突变体中FLC表达量较野生型明显升高，最终导致FT和SOC1表达受到抑制而表现出晚花(Chou and Yang.1998)。但是这些基因间并不是单一的直线调控关系，它们通过各种方式独立调控FLC。但总的来说，主要通过编码两类蛋白来实现调控作用，一类是染色质加工修饰蛋白，另一类是影响RNA加工的蛋白。FVE和FKD属于前者为染色质重塑蛋白，修饰FLC染色质，造成FLC失活，同时FLD促进LFY表达，从而促进成花。而FCA、FPA和FLK基因所编码的蛋白质属于后者，抑制FLC表达属于转录后调节。不同于另外几种众所周知的途径，除了知晓细微的温度变化会对开花时间产生巨大影响外，关于温敏途径的首次分子机制研究出现的相对较晚。拟南芥在23℃的生长条件下，比16℃表现出早花表型。在对拟南芥的突变体与地理生态型研究过程中，大多数生态型在温度升高后出现早花表型，但是突变体中的SHORT VEGETATIVEPHASE(SVP)与生态型中的FLOWERINGLOCUSMFLM(FLM)缺失型都失去了温度敏感性。最近结果表明，温敏途径中的关键MADS-box家族基因SVP，它能结合成花调控整合基因FT和SOC1以及miR172启动子序列上CArG box，从而抑制成花或直接调控miR172的转录。此外，SVP还能与FLC和AP1互作，介导GA途径(抑制GA合成)来调控植物开花。FLM是FLC的高度同源基因，也同属温敏途径关键基因，外界温度会改变营养生长阶段的FLM mRNA前体的可变剪切位点，从而改变FLM表达量，调控开花。在年龄途径中，Jang et al的结果显示，最广泛的作用主体是miRNA156和miRNA172。miR156在植物童期的表达量达到顶峰，之后表达量随着植株变老而逐渐下降；而miR172的表达模式与miR156相反，随着植株变老而表达量上升，两者通过相反的平行表达模式共同调控植物成花。在植物中鉴定得到6个miR156高度保守的成员，其靶基因为SBP-box家族成员，对于拟南芥中的11个SBPs具有调控位点，可使其降解或失活。Squamosapromoter-binding-like protein(SPL)多位成员可调控植物成花，如SPL3，4，5，其上调表达可促使植物早花。而miR156可以抑制SPLs的表达，通过调控SPLs的表达而间接调控FRUITFULL(FUL)、SOC 1、LFY和APETALA1(AP1)等MADS-box基因的表达。拟南芥中miR172家族经鉴定得到5个家族成员，植株进入生殖生长的过程中，miR172调控AP2转录因子TARGETOFEAT(TOE1、2)、SCHNARCHZAPFEN(SNZ)与SCHLAFMUTZE(SMZ)，参与植物成花诱导。完全进入生殖生长后，miR172的靶基因TOE表达水平逐渐降低，这是拟南芥成花起始完成的标志，而SMZ和SNZ的过表达植株导致晚花的表型。同时miR172与miR156还具互作效应，miR172的启动子上具有可供miR156的靶基因SPL9和SPL15结合的特异区域，实现miR156对miR172的调控。而miR172则通过抑制其靶基因TOE1、2的表达反过来参与对miR156的调控。众所周知，成花诱导与许多激素相关，而GA是其中研究的较为透彻的植物内源激素，模式植物中赤霉素途径也已被确定。叶片中的赤霉素合成氧化酶Gibberellin 20 oxidase(GA20ox)上调表达导致植株GA积累，上调FT基因表达，调控植株成花。GA感受器GIBBERELLICINSENSITIVEDWARF 1GID1(GID1)通过E3泛素化修饰，由26S蛋白进行降解DELLA蛋白，从而解除对转录因子SPL的抑制作用，而激活MADS box基因如SOC1、LFY和AP1，还有miR172，从而调控开花时间。GA具有多效效应。拟南芥成花过程中，GA作用呈现出阶段性差别，开始时GA有助于抑制营养生长，启动花芽孕育，之后GA又会抑制花器官的形成(李合生2012)。而且对不同植物的成花诱导的实际作用，会因GA的种类而异。如GA4能够促进苹果成花，而GA3却抑制苹果成花。在成花诱导途径中，有一些重要基因，它们接收并整合各个通路的信号，将各个成花途径相互联系，相互串联起来，然后继续传递给下游基因，使其整体成为一个复杂精密的网络，从而行使多种功能。FLC整合春化途径和自主途径信号；光周期途径通过CO来调控FT基因的转录水平；温敏途径中通过SVP转录水平的变化调控下游成花基因；赤霉素途径直接向下将信号传递给SOC1。功能与SOC1相似的SVP同源基因---AGL24，可以与SOC1互作，互相提高彼此的表达水平，同时激活下游LFY的表达。LFY直接受到赤霉素途径信号调节，光周期途径CO作用于下游的FT，LFY与FT互作共同调控AP1。花分生组织决定基因LFY和AP1，一经诱导大量表达，便在茎尖不可逆转地进行花器官形态建成。糖作为植物体内重要的碳源和能源物质(Rolland et al.2005)，在成熟叶片(源器官)中经由光合作用合成，之后输送到根、茎、幼叶、花和果实等库器官中生物合成或利用。研究表明，糖分解代谢酶的较高活性可能增强芽的吸收同化物的能力，从而加速芽生长。但同时，当碳水化合物供应受到严重限制时，糖浓度应该是芽生长的限制因素。此外，富士苹果的成花诱导期间，叶片和短枝顶芽中可溶性糖水平发生显著变化，也说明糖可能作为能源物质参与调控其花芽分化过程。即使处于黑暗条件下，在地上部外施蔗糖、葡萄糖植株仍能开花，说明糖也可以参与调控花芽的生长发育。葡萄糖作为可溶性糖，对植物成花调控也十分关键。黑暗条件下的烟草组织培养，外源施加葡萄糖，植株仍能正常开花并形成正常花器官，而当外部葡萄糖浓度下降时，不形成花器官或花器官发育异常。且葡萄糖对植物成花的调控具有“两重性”，将拟南芥幼苗分别培养在浓度为2％和6％葡萄糖的条件下，不管光照条件如何改变，无论是与2％葡萄糖条件还是正常生长条件下相比，6％葡萄糖条件中的植株都延迟抽苔开花。近年来，糖信号与植物成花间的研究越来越多，其多集中于蔗糖与海藻糖。短日照条件下的拟南芥淀粉缺乏突变体pgm，未分化前外部施加蔗糖于分生组织，该突变体成花率提高2.4倍，这证明蔗糖调控植物成花的过程中除了作为能源物质还可能发挥信号作用。表明，拟南芥中蔗糖可能是信号物质，其通过T6P信号途径，实现对叶片中成花基因(主要是FT)与茎尖分生组织成花基因(主要是miR156和SPLs)的调控，从而参与成花诱导。通过对拟南芥童期转变的研究发现，随光合作用糖分的积累，葡萄糖能抑制miR156的表达，从而降低miR156对SPLs的降解作用，间接上调下游MADS-box基因的表达，促进植株脱离童期。与葡萄糖具类似作用的还有海藻糖-6-磷酸(trehalose-6-phosphate，T6P)，也能抑制miR156的表达从而促进成花转变。
综上所述，现有技术存在的问题是：富士苹果作为我国栽培面积最大，产量最高的品种在生产过程存在难成花、果实产量低。
解决上述技术问题的难度和意义：‘富士’是我国苹果产业中主要栽培品种，占全国苹果总种植面积的70％以上，但生产上普遍存在难成花问题，限制了中国北部地区苹果产业的发展。实际生产管理中，多采用刻芽、环剥、环切等措施，在一定程度上缓解了上述问题，但对树体本身会造成不可扭转的影响且实施过程中人工，时间成本较大。因此，富士苹果成花诱导的分子机制，发掘简易富士促花技术，对于解决生产中富士品种成花率低、成花质量差以及产量不稳定等问题具有一定的现实指导意义。近年来，对于糖类与植物成花间的研究愈发广泛，但在苹果中潜在的分子机制尚不十分清楚。
本发明通过在外源葡萄糖处理花芽生理分化期‘长富2号’苹果植株，比较农艺及生理性状，基于转录组(RNA-seq)技术以及qRT-PCR研究葡萄糖对相关糖代谢和成花基因表达模式的影响，以期揭示葡萄糖影响苹果花芽孕育的生理与分子机制。同时，选取了难成花芽变品种‘长富2号’和易成花芽变品种‘烟富6号’，比较成花相关形态生理指标，基于重测序(Whole Genome Resequencing)技术，从DNA水平上揭示糖类对富士苹果花芽孕育的影响，为改善富士苹果成花人工调控技术提供理论依据。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂及测定方法。
本发明是这样实现的，一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂，所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂为葡萄糖。葡萄糖为生产于天津市科密欧化学试剂有限公司的葡萄糖(D-Glucose)。为分析纯试验用，含量99％以上；分子式为C6H12O6.H2O，分子量为198.17。葡萄糖处理时间点为两次，选用的浓度为1.5％和3％，其中盛花后25天用1.5％，盛花后30天用3％，用葡萄糖溶于水即可。用手动喷雾器整树喷施，喷施的湿润程度为叶片和茎表面充分湿润但无液滴凝聚下落。
本发明的另一目的在于提供一种所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂的测定方法，所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂的测定方法包括以下步骤：
步骤一，分别于盛花期后30、40、50、60、70d，随机采取‘长富2号’处理组，对照组以及‘烟富6号’的当年生短枝顶芽及毗邻叶，用锡纸包裹并标记，液氮封存带回，–80℃保存；
步骤二，取‘长富2号’处理组盛花期后30、50、70d的短枝顶芽样品命名为G1、G2、G3，对照组盛花期后30、50、70d的短枝顶芽样品命名为C1、C2、C3用于转录组送测；取‘长富2号’和‘烟富6号’叶片用于重测序送测；
步骤三，测定树体生长发育及成花相关指标、糖代谢相关酶活性、山梨醇脱氢酶与山梨醇氧化酶活性、可溶性糖及淀粉的提取和测定、RNA提取、反转录及荧光定量PCR；
步骤四，数据统计分析使用Statistical Program for Social Science 19进行，相关图表制作使用Excel 2016，Origin 8.0与MultiExperiment Viewer。
进一步，所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂的测定方法在苹果‘长富2号’和‘烟富6号’品种中分别得到SNPs为5,409,757和5,149,354个；SVs分别为266,513和230,483个；INDELs分别为1,554,595和1,491,351个；‘长富2号’特有的SNPs为2,381,987，而‘烟富6号’中的数量为2,121,584，两者相同的SNPs为3,027,770；基于两个品种独特SNPs，采用Fst，Pi，Tajimi’sD三种算法进行基因滑窗，筛选出正向选择的区域。通过不同数据库的注释，共得到1963个差异基因。
本发明的另一目的在于提供一种由所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂得到的基因调控网络假设模型。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：富士苹果作为我国栽培面积最大，产量最高的品种，在生产过程中，普遍具有难成花的问题，严重影响果实产量。本发明通过外源葡萄糖喷施处理富士苹果‘长富2号’品种，研究其对花芽孕育的影响，基于RNA-seq测序手段，全面解析外源葡萄糖调控苹果花芽孕育过程中糖代谢以及成花相关基因表达模式；利用重测序技术鉴定比较不同成花特性芽变品种成花相关基因DNA多态性变异差异，发掘差异基因。
1、葡萄糖处理促使短枝顶芽中可溶性糖及淀粉含量的上升，有利于短枝顶芽在花芽生理分化期的生长，富士成花率显著提升。
2、基于RNA-seq技术，较之对照处理，外源葡萄糖处理显著影响糖代谢及成花相关基因的表达模式。在花芽生理分化期三个关键时间点比较获得差异表达基因数分别为9045、1959、6829个，其中三个时期都表达上调的基因数为186，三个时期都下调的基因数为426。鉴定筛选响应葡萄糖处理在富士苹果成花诱导中扮演重要作用的糖代谢及成花相关的差异表达基因数量分别为34、27个。
3、通过对‘长富2号’和‘烟富6号’的全基因组重测序手段，分析比较了两者全基因组DNA多态性遗传变异信息。(1)在苹果‘长富2号’和‘烟富6号’品种中分别得到SNPs为5，409，757和5，149，354个；SVs分别为266，513和230，483个；INDELs分别为1，554，595和1，491，351个。(2)‘长富2号’特有的SNPs为2，381，987，而‘烟富6号’中的数量为2，121，584，两者相同的SNPs为3，027，770。基于两个品种独特SNPs，采用Fst，Pi，Tajimi’sD三种算法进行基因滑窗，筛选出正向选择的区域。通过不同数据库的注释，共得到1963个差异基因。
4、通过qRT-PCR定量验证发现，在调控成花的T6P信号途经中，不管是葡萄糖处理后的转录水平，还是不同成花特性品种间的DNA水平，其差异都十分显著，另外，通路中的MdTPS在易成花表型中都显著上调。此外，成花关键基因MdFLC、MdFT1、MdSOC1、MdAP1和MdLFY响应外源葡萄糖处理上调表达。基于以上结果，提出了外源葡萄糖介导苹果花芽孕育的基因调控网络假设模型。
附图说明
图1是本发明实施例提供的提高富士苹果花芽孕育率的药剂的测定方法流程图。
图2是本发明实施例提供的外源葡萄糖对芽体发育及成花率的影响示意图；
图中：(a)芽宽；(b)芽长；(c)芽鲜重；(d)成花率。
图3是本发明实施例提供的外援葡萄糖对短枝顶芽及叶片可溶性糖含量的影响示意图；
图中：(a)顶芽；(b)叶片。
图4是本发明实施例提供的外源葡萄糖对短枝顶芽及叶片糖代谢相关酶活示意图；
图中：(a)顶芽；(b)叶片。
图5是本发明实施例提供的葡萄糖处理后‘长富2号’苹果顶芽不同时期差异表达基因Venn图；
图中：(a)上调差异基因；(b)下调差异基因。
图6是本发明实施例提供的外源葡萄糖处理‘长富2号’苹果顶芽糖代谢相关基因聚类热图及定量验证示意图；
图中：(a)q RT-PCR定量表达情况；(b)FPKM值聚类分析热图。
图7是本发明实施例提供的外源葡萄糖处理‘长富2号’苹果顶芽成花相关基因聚类热图及定量验证示意图。
图中：(a)q RT-PCR定量表达情况；(b)FPKM值聚类分析热图。
图8是本发明实施例提供的‘长富2号’与‘烟富6号’当年生枝条生长量示意图。
图9是本发明实施例提供的长富2号’与‘烟富6号’枝类组成及成花率示意图；
图中：(a)枝类组成；(b)成花率。
图10是本发明实施例提供的‘长富2号’与‘烟富6号’芽体生理指标示意图。
图11是本发明实施例提供的‘长富2号’与‘烟富6号’短枝顶芽可溶性糖与淀粉含量示意图。
图12是本发明实施例提供的‘长富2号’与‘烟富6号’苹果SNPs维恩分析图。
图13是本发明实施例提供的基于SNPs的基因滑窗示意图；
图中：(a)Fst；(b)Pi；(c)Tajimi's D。
图14是本发明实施例提供的长富2号’和‘烟富6号’短枝顶芽中基因表达水平分析示意图；
图中：(a)糖相关基因；(b)成花基因。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明通过在外源葡萄糖处理花芽生理分化期‘长富2号’苹果植株，比较农艺及生理性状，基于转录组(RNA-seq)技术以及qRT-PCR研究葡萄糖对相关糖代谢和成花基因表达模式的影响，以期揭示葡萄糖影响苹果花芽孕育的生理与分子机制。
本发明实施例提供的提高富士苹果花芽孕育率的药剂为葡萄糖。葡萄糖为生产于天津市科密欧化学试剂有限公司的葡萄糖(D-Glucose)。为分析纯试验用，含量99％以上；分子式为C6H12O6.H2O，分子量为198.17。葡萄糖处理时间点为两次，选用的浓度为1.5％和3％，其中盛花后25天用1.5％，盛花后30天用3％，用葡萄糖溶于水即可。用手动喷雾器整树喷施，喷施的湿润程度为叶片和茎表面充分湿润但无液滴凝聚下落。
如图1所示，本发明实施例提供的提高富士苹果花芽孕育率的药剂的测定方法包括以下步骤：
S101：分别于盛花期后30、40、50、60、70d，随机采取‘长富2号’处理组，对照组以及‘烟富6号’的当年生短枝顶芽及毗邻叶，用锡纸包裹并标记，液氮封存带回，–80℃保存；
S102：取‘长富2号’处理组盛花期后30、50、70d的短枝顶芽样品命名为G1、G2、G3，对照组盛花期后30、50、70d的短枝顶芽样品命名为C1、C2、C3用于转录组送测。取‘长富2号’和‘烟富6号’叶片用于重测序送测；
S103：测定树体生长发育及成花相关指标、糖代谢相关酶活性、山梨醇脱氢酶与山梨醇氧化酶活性、可溶性糖及淀粉的提取和测定、RNA提取、反转录及荧光定量PCR(qRT-PCR)；
S104：数据统计分析使用Statistical Program for Social Science 19(SPSS，Chicago，IL，USA)进行，相关图表制作使用Excel 2016，Origin 8.0(Microcal SoftwareInc.，Northampton，MA，USA)与MultiExperimentViewer(MeV)。
下面结合试验对本发明的应用效果作详细的描述。
1材料与方法
1.1植物材料和处理
1.1.1植物材料
试验于2017年5-6月在陕西省杨凌现代农业创新园国家苹果产业技术体系试验示范果园(108°04′E，34°16′N)进行。试验苹果材料为8年生长富2号/M26/八棱海棠与烟富6号/M26/八棱海棠，栽植株行距为1.5m×3.5m，密度为1905株/hm-2，树形为改良高纺锤形，树势中庸，树体差异小。选取生长势和负载量较为一致的植株60株，每个区组10株树，1个小区作为1个重复。随机分为6个区组，3个区组作为处理，另外3个区组为对照。
1.1.2处理
于生理分化期前，盛花期后25d(2017年5月10日)与盛花期后30d(2017年5月15日)对‘长富2号’处理组，用手动喷雾器分别喷施浓度为1.5％和3％的葡萄糖，喷施的湿润程度为叶片和茎表面充分湿润但无液滴凝聚下落。对照组喷施清水。
1.2方法
1.2.1采样及样品送测
分别于盛花期后30、40、50、60、70d，随机采取‘长富2号’处理组，对照组以及‘烟富6号’的当年生短枝顶芽及毗邻叶，用锡纸包裹并标记，液氮封存带回，–80℃保存。
取‘长富2号’处理组盛花期后30、50、70d的短枝顶芽样品命名为G1、G2、G3，对照组盛花期后30、50、70d的短枝顶芽样品命名为C1、C2、C3用于转录组送测。取‘长富2号’和‘烟富6号’叶片用于重测序送测。
1.2.2树体生长发育及成花相关指标测定
于头年盛花期(2016年4月12日)在每个区组树体上随机选取20个当年生枝条并标记，至此每隔7d统计一次枝条生长量直至花后42d。另外，从花后30d开始，每隔10天从每个品种的3个区组里混合采集60个短枝顶芽，直至花后70d，用于测量芽体的大小与重量。
次年3月盛花期之前，统计一年生枝条枝类组成时，可被分成三类：短枝(<5cm)，中枝(≥5cm and≤15)与长枝(>15cm)。盛花期(2016年4月15日)对短枝(<5cm)进行成花率统计，方法如下：在头年落叶期后，每个区组随机标记短枝上的100个芽，次年盛花期统计花的数量，计算并以每个品种3个区组的平均结果作为最终开花率。中枝(≥5cm and≤15)与长枝(>15cm)开花率统计方法同上。
1.2.3糖代谢相关酶活性测定
(1)蔗糖合酶(Sucrose synthase，SS)与蔗糖磷酸合成酶(Sucrose-phosphatesynthase，SPS)活性的测定现代植物生理学试验指导的方法。
粗酶液的提取：
研钵预冷取0.3克左右的材料放入，全程置于冰上操作。加入3ml提取缓冲液，快速研磨成均匀糊状，用2ml提取介质，4℃12000prm离心10min后抽提上清液两次后定容至5ml，粗酶液制备完成。
提取缓冲液的成分包括：100mmol/LpH＝7.2的Tris-HCL、10mmol/LMgcl2、1mmol/LEDTA-Na2、2％乙二醇、10mmol/Lβ-巯基乙醇、1％(W/V)吡咯烷酮(pvp)。
酶活性的测定:
SS分解方向的活性测定：三只试管作为重复，处理组各加入0.1ml粗酶液。对照组加入0.1ml 2N NaOH。每一试管加入0.4ml分解反应介质(100mmol/LpH＝7.2Tris-HCL、10mmol/L Mgcl2、5mmol/LUDP、50mmol/L蔗糖)。30℃水浴中30分钟后，沸水浴5分钟。样品管加0.1ml 2NNaOH混匀。每一试管加入0.5ml 5mM DNS后再进行沸水浴5分钟，冷却。全部试管各加入4ml蒸馏水，540nm比色。以单位酶蛋白在单位时间内生成果糖的量作为酶活性。酶活性用μmol果糖/mg·Pr·min表示。
SS合成方向的活性测定：三只试管作为重复，处理组各加入0.1ml粗酶液。对照组加0.1ml 2NNaOH。每一试管加入0.4ml合成反应介质(100mmol/LpH＝7.2Tris-HCL、10mmol/L Mgcl2、5mmol/LUDPG、5mmol/L D-果糖)。30℃水浴中30分钟后，沸水浴5分钟。样品管加0.1ml 2N NaOH混匀。沸水中10分钟，冷却。每一试管加入1ml 0.1％间苯二酚和3.5ml 30％HCL摇匀。80℃水浴10分钟，冷却，480nm比色。以单位酶蛋白在单位时间内生成蔗糖的量作为酶活性。酶活性用μmol蔗糖/mg·Pr·min表示。
SPS活性的测定：三只试管作为重复，处理组各加入0.1ml粗酶液。对照加入0.1ml2N NaOH。每一试管加入0.4ml合成反应介质(100mmol/LPH＝7.2Tris-HCL、10mmol/LMgcl2、5mmol/LUDPG、5mmol/L Fru-6-P)。30℃水浴中30分钟后，沸水浴5分钟。样品管加0.1ml 2NNaOH混匀。沸水中10分钟，冷却。每一试管加入1ml 0.1％间苯二酚和3.5ml30％HCL摇匀。80℃水浴10分钟，冷却，480nm处比色。以单位酶蛋白在单位时间内生成蔗糖的量作为酶活性。酶活性用μmol蔗糖/mg·Pr·min表示。
(2)酸性蔗糖转化酶(Acid invertase，AI)与中性蔗糖转化酶(Neutralinvertase，NI)活性的测定
粗酶液的提取：
取材料0.3g左右于研钵中，加入3ml提取液，冰上快速研磨至均匀糊状，再用2ml提取液清洗研钵并转移至离心管中，20000rpm，4℃下离心15min，上清液即为粗酶液。
提取液为0.05mol/LpH＝7.5磷酸缓冲液(0.l mmol/LEDTA，l mmol/L半胱氨酸及10m mol/LNaS03)。
酶活性的测定:
NI蔗糖酶的测定：各取粗酶液0.2ml装于洁净试管中，加1.2ml 0.2M pH＝7.5磷酸缓冲液，0.2ml 0.3M蔗糖，对照加入1NNaOH 2m1，35℃水浴30分钟，对照与处理再立即加入1N NaOH 2m1，加5m M DNS 2m1，沸水浴5min，540nm比色。按标准曲线计算酶活力，单位以μmol Suc/mg Pr·h表示。
AI蔗糖酶的测定：用0.2M pH＝5.5醋酸缓冲液代替0.2M pH＝7.5磷酸缓冲液，其余同上。
(3)山梨醇脱氢酶(Sorbitol dehydrogenase，SDH)与山梨醇氧化酶(Sorbitoloxidase，SOX)活性的测定。
粗酶液的提取：
取材料0.3g左右于研钵中，全程置于冰上操作。加入5ml 50MmpH＝7.5的HEPES-NaOH缓冲液，研磨匀浆。倒入20ml离心管中，12000rpm，4℃离心20min。上清液用稀释10倍的提取缓冲液透析15h后，取出待测。
缓冲液的组成：10mM MgCl2，1mM EDTA，2.5MmDTT，10mM抗坏血酸和5％不溶性PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)。
酶活性的测定:
SDH的测定：加入400μl反应缓冲液(30mM PH＝9.6Tris-HCL)，200μl NAD，200μl山梨醇溶液与200μl酶粗提取液。等体积水代替山梨醇溶液作为对照。30℃水浴30分钟。用10％HCL终止反应，沸水浴5分钟后冷却，340nm下比色。单位用μmol NAD/mg Pr·h表示。
SOX的测定：加入600μl反应缓冲液(0.1mM PH＝4.0柠檬酸-柠檬酸钠)，200μl山梨醇溶液与400μl酶粗提取液。等体积水代替山梨醇溶液作为对照。30℃水浴30分钟。用1ml3，5-二硝基水杨酸终止反应，冷却。520nm下比色。用葡萄糖标曲，以单位酶蛋白在单位时间内生成葡萄糖的量作为酶活性。酶活性用μmol Glu/mg·Pr·min表示。
1.2.4可溶性糖及淀粉的提取和测定
可溶性糖的测定方法的高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)法。
1.称样：样品50-60℃烘干，0.3g左右，加到10ml离心管中。
2.在加好样品的离心管中各加入7.5ml的80％乙醇。
3.70℃水浴振荡30min，8000r/min离心10min。
4.取上清液于25ml玻璃试管中。
5.将倒掉上清的离心管重复步骤2-4，重复三次。
6.将提取三次上清的试管用80％乙醇定容至25ml摇匀。
7.置于10ml至50ml离心管中，55℃烘干。
8.在烘干的糖样中加10ml dd水溶解。
9.溶解后可全部导入10ml离心管，8000r/min离心10min。
10.取上清用0.45μ滤头过滤，每个重复分装到2个1.5ml离心管中，-20℃保存待测。
1.2.5RNA提取、反转录及荧光定量PCR(qRT-PCR)
花芽生理分化期(花后30～70d)短枝顶芽总RNA的提取按照FOREGENE PlantTotal RNA Isolation Kit试剂盒方法进行。用DNaseⅠ去除样品总RNA中的DNA污染。按照TaKaRa Prime ScriptTM RTReagent Kit所提供步骤合成cDNA第一链。用NCBI Primer-BLAST在线工具设计特异性引物(表1)。
相关基因及成花相关基因的表达情况利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术进行分析。qRT-PCR反应按照TaKaRaPrime EX TaqTMⅡ的试剂盒说明书进行。反应体系(10μL)为：1μL cDNA，1μL前引物，1μL后引物，5μL2×SYBRPremix Ex TaqⅡ(TaKaRa Bio)，2μLddH2O。在Bio-RAD IQ5荧光定量PCR仪上完成反应，条件为：95℃预变性3min；94℃15s，60℃20s，72℃20s，40个循环。以苹果Actin(序列号GQ339778)作为内参，用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量(Livak&Schmittgen，2001)。设置3次重复。
1.2.6数据处理及图标制作
本试验数据统计分析使用Statistical Program for Social Science 19(SPSS，Chicago，IL，USA)进行，相关图表制作使用Excel 2016，Origin 8.0(Microcal SoftwareInc.，Northampton，MA，USA)与MultiExperimentViewer(MeV)。
表1定量引物序列
2结果与分析
2.1外源葡萄糖处理对富士苹果成花及生理特性比较分析
2.1.1葡萄糖处理对富士苹果树体生长发育及成花相关指标的影响
从图2可知，葡萄糖处理后，短枝顶芽的长度，宽度和鲜重都有一定的增加。其中，顶芽长度在花后50d至70d显著大于对照，宽度在花后60d差异显著，单芽鲜重在花后60d至70d显著高于对照。而且，葡萄糖处理后成花率(67.29％)显著高于对照组(45.48％)。
2.1.2葡萄糖处理对富士苹果短枝顶芽及其毗邻叶可溶性糖及淀粉含量的影响通过花芽生理分化过程中六个时间点的短枝顶芽及邻近叶片的可溶性糖含量检测结果，本发明可以看到，富士苹果短枝顶芽中(图3a)，蔗糖与果糖在花后30至40d有一个累积过程，先上升。进入生理分化中后期，迅速下降。而葡萄糖在整个花芽生理分化时期一直呈下降趋势。山梨醇在花后30至60d持续下降，70d小幅回升。淀粉含量在花后30d迅速下降，而后逐渐上升。经过葡萄糖处理后，可溶性糖与淀粉含量都有不同程度的变化。葡萄糖与山梨醇含量在30d与40d，蔗糖在30d、40d和70d，淀粉含量在花后40d、60d与70d都显著高于对照。而蔗糖在花后60d，果糖在40至60d显著低于对照。
而在短枝顶芽毗邻叶中(图3b)，四种可溶性糖与淀粉都表现出类似的变化过程，总体呈现下降趋势。经过葡萄糖处理后，蔗糖含量在花后50至70d，葡萄糖含量在花后30d、40d与70d，果糖在30d与40d，山梨醇在30d、50d和60d，淀粉含量在在30d与50d都显著高于对照。
2.2.3葡萄糖处理对富士苹果短枝顶芽及其毗邻叶糖代谢相关酶活性的影响
由图4可知，葡萄糖处理后对糖代谢酶活性具有不同影响。在短枝顶芽中，山梨醇脱氢酶(SDH)与山梨醇氧化酶(SOX)活性整体呈现相同的下降趋势，处理组酶活性在花后30d-40d显著高于对照，随后迅速下降。对于酸性蔗糖转化酶(AI)与中性蔗糖转化酶(NI)活性，葡萄糖处理后酶活性表现较为显著的降低。蔗糖合酶合成方向(SS synthesis)与蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性，在整个花芽生理分化期均为先升高后降低，且葡萄糖处理后，酶活性显著升高。蔗糖合酶分解方向(SS catabolism)酶活性总体呈下降趋势，处理组极其显著低于对照组(图4a)。
而在顶芽毗邻叶中，SDH与SOX活性在花芽生理分化期间逐渐积累。但葡萄糖处理后，SDH活性在花后30d、40d与70d显著升高，而SOX活性在花后30d、50d、60d显著降低。AI与NI活性在整个时期逐渐降低。葡萄糖处理后，AI在花后60d、70d，NI在花后30d、50d、70d活性显著降低。蔗糖合酶分解方向酶活性在花后30d极其显著低于对照组。而SPS在花芽生理分化初期30-50d逐渐升高，之后活性锐减。葡萄糖处理组在花后30d、40d、70d活性显著高于对照组(图4b)。
2.2基于RNA-seq，响应外源葡萄糖处理，富士苹果花芽孕育基因表达模式分析
2.2.1芽样本RNA-Seq测序数据质量分析
花芽生理分化阶段，葡萄糖处理(G1、G2、G3)与对照(C1、C2、C3)共6个样本，用于RNA-Seq建库与测序，每个样品三次重复，共获得18个样品测序结果。其中，处理组花芽孕育三个阶段G1、G2、G3，获得平均总Reads数分别为25，107，978.3、22，390，682.3、24，204，590.7，而对照组三个阶段的平均总Reads数分别为23，637，058.3、23，922，973.7、21，292，839，每个样品重复具体总Reads数见表2。18个样品GC含量均保持在46-48％，较为一致。Q20百分比(平均质量值大于20的cycle所占的比例)≥97％(表2)，说明测序数据质量符合后续分析要求。
通过与苹果参考基因组GDDH13Version 1.1(https://iris.angers.inra.fr/gddh13/)的比对，处理组(G1、G2、G3)与对照组(C1、C2、C3)共18个测序数据分别匹配的Reads数量情况如下，见表3。
表2样本测序数据质量评估
表3测序匹配数据统计
2.2.2差异表达基因分类及功能注释
通过对不同时间点样本间差异基因比对分析，G1vs C1、G2vs C2、G3vs C3之间的差异基因数分别为9045、1959、6829，其中上调的差异基因数量为5239、909、3297，下调的差异基因数量为3816、1050、3532(表5)。利用Nr、nt、Swiss Prot、GO、KEGG、TrEMBL和COG数据库对以上差异基因进行功能注释。其中G1vs C1、G2vs C2、G3vs C3之间GO功能注释的差异基因数为4577、967、3357，KEGG功能注释的差异基因数为1835、377、1222，其他数据库注释情况见表4。
通过韦恩分析，还可以得知G1vs C1、G2vs C2、G3vs C3三个阶段之间表达量变化趋势相同的基因数。三个阶段都上调表达的基因中，只在G1vs C1与G2vs C2，G2vs C2与G3vs C3，G1vs C1与G3vs C3相同的基因数分别为202、41、2174，在G1vs C1与G2vs C2与G3vs C3都上调表达的相同基因数为186。三个阶段都下调表达的基因中，他们的数量分别是54、195、1884、426，详细情况见图5。
表4不同数据库基因注释情况
表5样品间差异表达基因数量统计
2.2.3糖代谢相关基因筛选及其表达模式分析
苹果花芽生理分化过程，糖相关基因在葡萄糖处理和对照间有显著差异。其中有糖合成与分解的关键基因如TREHALOSE-PHOSPHATE SYNTHASE(MdTPS1、5、7)，SUCROSESYNTHASE(MdSUSY1、2、3)，SUCROSE-PHOSPHATE SYNTHASE(MdSPS1、4)，FRUCTOKINASE(MdFK4)等；一些与淀粉合成与分解的关键基因如BETA-AMYLASE(MdBAM1)，ALPHA-AMYLASE(MdAMY)，STARCH SYNTHASE(MdSS1、4)，STARCH BRANCHING ENZYME(MdSBE)等；一些糖代谢过程中关键的酶基因如PHOSPHOGLUCOMUTASE(MdPGM)，6-PHOSPHOFRUCTO-2-KINASE(MdPFK)，GLUCOSE-1-PHOSPHATE ADENYLYLTRANSFERASE(MdGPA1、3)，HEXOKINASE(MdHXK1)，FRUCTOSE-BISPHOSPHATASE(MdFBP)，SORBITOL DEHYDROGENASE(MdSDH1，SDHL)等；还有一些糖运输蛋白基因如SUCROSE TRANSPORT PROTEIN(MdSUT1)，SORBITOL TRANSPORTER(MdSOT1)(表6)。
其中海藻糖磷酸合酶基因MdTPS1与MdTPS7，蔗糖合酶基因MdSuSy1、MdSuSy3，蔗糖磷酸合酶基因MdSPS1响应葡萄糖处理表达显著上调，且MdTPS1与MdTPS7在葡萄糖处理后在成花诱导初期就可以大量表达。关键的糖代谢酶基因，山梨醇脱氢酶基因MdSDH1与己糖激酶基因MdHXK1在成花诱导呈现先上升后降低的特点，果糖激酶基因MdFK4表达量持续上升，三者都响应葡萄糖处理，表达显著上调。淀粉分解酶基因MdAMY2和MdBAM7经过葡萄糖处理后，都发现了显著下调时期，而淀粉合成限速酶基因MdPGM显著上调。而糖类运输蛋白相关基因，蔗糖转运蛋白MdSUT4与山梨醇转运蛋白MdSOT1分别在花芽生理分化末期与早期下调表达(表6；图6)。
表6外源葡萄糖处理‘长富2号’苹果顶芽糖相关差异表达基因及功能注释
2.2.4成花相关基因筛选及其表达模式分析
在植物成花六条途径中，相关基因在葡萄糖处理和对照间有显著差异。春化途径中FRIGIDA-LIKE PROTEIN(MdFRL4a、MdFRL4b)两个类似基因，MdFRL4a在成花诱导后期表达量下降，而MdFRL4b在整个过程中表达逐渐积累。葡萄糖处理后，两者也呈现相反的表达模式(图7a)。自主成花途径中，MdFCA与MdFLD两个基因在成花诱导过程中表达模式类似，都逐渐降低。而且都响应葡萄糖处理表达下调。赤霉素途径的MdGA20ox2表达量逐渐升高且处理后上调。年龄途径中的SQUAMOSA PROMOTER-BINDING-LIKE PROTEIN(MdSPL5)在花芽分化初期逐渐积累，之后逐渐降低，葡萄糖处理后整个时期都显著上调。光周期途径中CONSTANS-LIKE(MdCOL1、MdCOL5)表达量逐渐积累，响应处理在成花诱导初期就开始显著上调表达。CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1(MdCOP1)与GIGANTEA-LIKE(MdGI)整体表达量逐渐降低，葡萄糖处理后，MdCOP1显著下调，而MdGI显著上调。
成花途径整合因子MdFT1、MdSOC1以及SOC1-LIKE PROTEIN(MdAGL42)，和他们下游的花器官组织特征基因MdAP1与MdLFY都能响应葡萄糖处理上调表达。而成花抑制因子MdFLC经过葡萄萄糖处理后，在成花诱导末期表达显著上调(表7；图7)。
表7外源葡萄糖处理‘长富2号’苹果顶芽成花相关差异表达基因及功能注释
2.3‘长富2号’及短枝型芽变‘烟富6号’基于全基因组重测序的差异突变位点分析
2.3.1‘长富2号’及短枝型芽变‘烟富6号’形态指标差异
2.3.1.1枝条生长动态
Kotoda(2000)研究结果表明，花芽生理分化的起点与当年生枝条的停长时间点紧密相连。为了确定花芽生理分化期的起始时间，本发明测定了‘长富2号’与‘烟富6号’当年生枝条在花后0d到42d的平均生长量(图8)。可以看出，在盛花期后0到28d，两个品种的枝条生长量大幅度上升，而28到42d生长放缓。所以，杨凌本地富士苹果花芽生理分化期的起点应该在盛花期后28d左右。
而‘烟富6号’的枝条平均生长量始终低于‘长富2号’。以上结果说明，花后28天大多数枝条停长，‘烟富6号’枝条生长与‘长富2号’相比较慢。
2.3.1.2枝条组成及成花率
由图9a可知长枝LS(>15cm)，中枝MS(>＝5and<＝15cm)和短枝SS(<5cm)在‘长富2号’与‘烟富6号’之间差异显著。‘烟富6号’的短枝明显较多达到72％，‘长富2号’长枝比例更高。
第二年盛花期，统计了不同类型枝条上的成花率。由图3-8b得知，富士不同类型枝条的成花率表现为短枝＞中枝＞长枝。‘烟富6号’短枝上成花率明显集中，能达到90％，且不同类型枝条成花率都比‘长富二号’更高。结果与‘烟富6号’易成花性状相一致。
2.3.1.3‘长富2号’与‘烟富6号’顶芽在成花诱导过程中的生长差异
芽的生长发育情况由成花诱导阶段决定。两个品种芽的长度，宽度与鲜重(图10)都在成花诱导过程逐渐上升，尤其是在发育早期阶段。此外，‘烟富6号’在整个发育过程中，不管是鲜重，芽长和芽宽几乎在花后40d开始，上升幅度显著高于‘长富2号’，芽体发育情况更好。
2.3.2‘长富2号’及短枝型芽变‘烟富6号’可溶性糖及淀粉含量的差异
通过对‘长富2号’和‘烟富6号’花芽生理分化过程中六个时间点的短枝顶芽的可溶性糖含量分析，本发明可以看到，富士苹果短枝顶芽中(图11)，葡萄糖与山梨醇在花芽孕育期间含量逐渐降低，但在‘烟富6号’中花后30至50d葡萄糖含量显著高于‘长富2号’的，而山梨醇差异较葡萄糖更小。蔗糖含量在两个品种中，花芽生理分化前期升高，花后50d达到顶峰，中后期逐渐降低，且‘烟富6号’中的含量显著高于‘长富2号’。果糖含量变化最为复杂，花后30d-40d升高，花后40d-60d又逐渐降低，花后60-70d又回升。与其他可溶性糖不同的是‘烟富6号’中的果糖含量在花后40d、60d与70d是显著低于‘长富2号’的。而‘烟富6号’中的淀粉含量在整个花芽生理分化过程中都几乎高于‘长富2号’，说明‘烟富6号’短枝顶芽中的碳水化合物水平明显优于‘长富2号’。表8
3.3.4‘长富2号’及短枝型芽变‘烟富6号’重测序原始数据质控及变异位点检测通过WGR全基因组重测序，本发明分别在‘长富2号’中获得342，237，814readas，‘烟富6号’中获得311，437，215reads，为避免其影响后续分析，需要先对原始数据(Raw Data)进行过滤，去除影响数据质量和后续分析的低质量区域。对原始数据进行过滤，处理后得到期望的高质量数据，称为有效数据(Clean Data)。本发明在‘长富2号’和‘烟富6号’获得有效数据分别为271，842，871reads，258，353，815reads。其数据Q30均达到95％以上，测序平均深度分别为31.2-fold，29.7-fold为数据质量可靠，可用于后续分析(表8)。注：Q20：质量得分不低于20(单碱基错误率0.01)的碱基数及比例；Q30：质量得分不低于30(单碱基错误率0.001)的碱基数及比例。
苹果‘长富2号’和‘烟富6号’在全基因组水平上与苹果参考基因组，获得变异位点类型及数量如下，见图9，单核苷酸的变异(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)的数量分别为5，409，757和5，149，354，插入缺失(Insertion-Deletion，INDEL)的数量分别为1，554，595和1，491，351，染色体结构变异(Structure Variation，SV)的数量分别为266，513和230，483，基因拷贝数变异(Copy Number Variations，CNV)的数量分别为5，878和5，107。
表9变异类型及数量统计
3.3.4‘长富2号’及短枝型芽变‘烟富6号’差异基因挖掘及注释
为了缩小范围，更方便找到差异基因，本发明实行了基于SNPs的滑窗(SlidingWindows)。首先排除掉‘长富2号’与‘烟富6号’相同的遗传背景噪音，即相同的SNPs。通过Venn分析(图12)，可以看出‘长富2号’独有的SNPs数量为2，381，987，而‘烟富6号’中的数量为2，121，584，两者相同的SNPs为3，027，770。
本发明将全基因组划分成2500bp的窗口，基于两个品种所有的独特SNPs，通过VCFtools利用三种算法：Fst，Pi，Tajimi’s D来挖掘差异基因(图13)。其中Fst是固定指数(Fixation Index)的参数之一，用来说明种群间的遗传距离，描述亚群间的遗传分化程度。Fst值越大，说明遗传距离越远，值越低，说明大多数的遗传变异是发生在同一个种群内部的。Pi主要用来衡量每个窗口的核苷酸多样度(Nucleotide Divergency)。Tajimi's D是一种统计检验，主要用来区分一个DNA序列是否为随机进化的，进化过程中是不是发生了定向选择。通过对一些参数的设置，本发明可以筛选出正向选择(Positive Selection)的区域，从而进行关联分析，找到可能的差异基因。最后，得到的差异基因注释结果。
2.3.5‘长富2号’及短枝型芽变‘烟富6号’差异基因表达特性分析，通过对所有注释基因的筛选，本发明得到了与糖合成相关的关键基因有TREHALOSE-PHOSPHATE SYNTHASE(MdTPS1、5、7)，SUCROSE SYNTHASE(MdSUSY1)，SUCROSE-PHOSPHATE SYNTHASE(MdSPS1、2)；一些与淀粉合成与分解的关键基因如STARCHSYNTHASE(MdSS1)；一些糖代谢过程中关键的酶基因如HEXOKINASE(MdHXK1)；还有一些糖运输蛋白基因如POLYOL TRANSPORTER(MdPLT5)，SUCROSE TRANSPORTPROTEIN(MdSUC4)，SUGAR TRANSPORTER ERD6-LIKE(MdERL6)。
在植物成花六条途径中的差异基因有年龄途径中的SQUAMOSA PROMOTER-BINDING-LIKE PROTEIN(MdSPL1、5、8)；光周期途径中CONSTANS-LIKE(MdCOL1)；成花途径整合因子MdFT1、MdSOC1以及SOC1-LIKE PROTEIN(MdAGL24)，以及他们下游的花器官组织特征基因MdAP1与MdLFY，和成花抑制因子MdFLC。这些基因虽然在成花诱导过程中表达模式不同，但是在短枝型芽变‘烟富6号’品种中的表达量，与‘长富2号’相比都有不同程度地上调(图14)。
本发明首先通过枝条停长时期来确定杨凌本地富士苹果的花芽生理分化的起始阶段，结果表明在花后28d至42d枝条逐渐停长，即花芽生理分化期开始。为了葡萄糖对富士苹果花芽生理分化的影响，在进入花芽生理分化期前，即盛花期后25d对难成花品种‘长富2号’喷施浓度为1.5％的葡萄糖。盛花期后30d二次喷施浓度为3％的葡萄糖，增强处理效应。本发明结果表明，葡萄糖处理明显促进了富士苹果芽体的发育(芽长、芽宽、单芽重)，显著提高‘长富2号’成花率。从碳水化合物的水平来看，葡萄糖处理后，短枝顶芽中，蔗糖合酶SS与蔗糖磷酸合成酶SPS的活性增强促使蔗糖得到积累。苹果MdS6PDH转基因株系发现，山梨醇脱氢酶SDH与山梨醇氧化酶SOX酶活性都变高，同时伴随着山梨醇和蔗糖含量的升高，与本发明结果较为一致，短枝顶芽可以响应葡萄糖处理，山梨醇脱氢酶SDH与山梨醇氧化酶SOX酶活性都增强，山梨醇含量也有所增加。前人研究表明，α-淀粉酶基因在栽培水稻悬浮培养细胞中，出现糖抑制现象，而α-淀粉酶基因MdAMY与β-淀粉酶基因MdBAM1经过葡萄糖处理后表达被抑制，可能是引起淀粉在短枝顶芽中积累的主要原因，而表明短枝顶芽淀粉含量与花芽数量显著相关。值得注意的是果糖含量响应葡萄糖处理表现下调，之前在对龙眼反季节花芽生理分化期碳水化合物与相关酶的关系的研究中，经过分析发现，蔗糖磷酸合成酶SPS与果糖含量呈显著负相关，酸性蔗糖转化酶AI与果糖有显著正相关。本发明中，SPS从花后30d开始活性显著上调，而AI在花后50d显著下调，所以处理后短枝顶芽中的果糖含量在整个花芽分化期间几乎都显著低于对照。类似结果还出现在难成花品种‘长富2号’与易成花芽变品种‘烟富6号’中，‘烟富6号’的短枝顶芽在碳水化合物水平整体优于‘长富2号’的情况下，果糖含量在花后40d与70d显著低于‘长富2号’，说明富士短枝顶芽中糖的种类及其比例会可能对其花芽分化产生一定影响。而在叶片中，葡萄糖处理后，所有碳水化合物积累明显，同化物库源间运输效应增强。总的来说，葡萄糖处理后短枝顶芽和叶片内碳水化合物积累明显，大部分可溶性糖与淀粉含量增多，进而C/N比值增加，导致短枝顶芽大小及鲜样质量也有明显增幅，更有利于花芽形成。
本发明通过对富士短枝顶芽葡萄糖处理与对照花芽生理分化期三个时间点六个样本的转录组数据分析，不同时期间共得到差异基因9045、1959、6829个，经过不同数据库注释筛选出响应葡萄糖处理的三个时期都上调的基因数为186，三个时期都下调的基因数为426。其中本发明筛选出糖代谢相关(表6，图6)以及成花相关(表7，图7)的差异表达基因数量分别为34、27个。其中，蔗糖合酶基因SuSy，其反义转化胡萝卜植株，导致蔗糖合成酶活性下降，植株发育受到一定的抑制，说明该基因对植株生长发育具有调控作用。获得蔗糖磷酸合酶基因SPS转基因烟草研究结果表明，SPS可促进早花，且开花数量增多。本发明中的MdSuSy1、MdSuSy3与MdSPS1响应葡萄糖处理表达显著上调。而葡萄糖处理后下调的蔗糖转运蛋白基因MdSUT4，其相对表达量与蔗糖含量呈显著负相关，可能参与了蔗糖从液泡膜向细胞质的外排，他的一个马铃薯同源基因StSUT4反义转基因植株可表现出早花性状，说明该基因的表达可能抑制成花。本发明的研究结果表明，葡萄糖处理可以调控这些基因的表达，调节蔗糖的代谢与转运，影响富士苹果的生长发育。
在植物成花的六条途径中，转录组数据与实时荧光定量PCR的结果显示，春化途径中成花抑制基因MdFLC以及FLC的正向调控基因MdFRL4a响应葡萄糖处理表达上调，而MdFRL4b虽然与MdFRL4a属于同源基因，却呈现相反的的表达模式可能是因为该基因具有不同的功能。自主途径中，有研究表明，拟南芥突变体fca、fld在所有光照条件下都表现出延迟抽薹开花，且突变体中FLC的表达水平明显升高。而MdFCA、MdFLD都响应葡萄糖处理显著下调。赤霉素途径的MdGA20ox2调控赤霉素GA合成，而GA可通过解除DELLA蛋白对植物开花的抑制作用从而促进成花，其表达在处理后显著上调。年龄途径中SPL5可以诱导SOC1、LFY和FT等成花基因的表达，是一个成花促进因子，本发明中，MdSPL5葡萄糖处理后整个时期都显著上调。结果表明，苹果成花光周期途径中6个MdCOL蛋白可以与MdNF-YB3相互作用，从而间接调控MdFT1转录，影响其成花。本发明中的MdCOL1、MdCOL5皆能响应葡萄糖处理表达上调。拟南芥中GI与FKF1互作可以抑制CDF1的表达，而CDF1可直接结合到CO上，抑制其表达。而FT只在cop1单突变体中表达上调，区别于cop1，co双突变体，说明COP1是CO的一个负向调控因子，可能通过26S蛋白酶体依赖性途径指导CO降解。本发明结果中，葡萄糖处理后，MdCOP1显著下调，而MdGI显著上调。春化途径与自主途径中都表现出MdFLC在葡萄糖处理后表达上调，而成花途径整合因子在其他成花途径的作用下，MdFT1、MdSOC1以及MdAGL42，以及下游的花器官组织特征基因MdAP1与MdLFY都能响应葡萄糖处理也都上调表达。发现外施蔗糖能够避免FRI、FLC基因对开花的抑制作用，加速fve、fpa、fca、co、gi等突变体的开花。本发明中，经过葡萄糖处理后，蔗糖含量与对照相比有显著提升，因此在MdFLC表达上调的情况下，也可能绕过其抑制作用，正向调控成花基因的表达，促进富士苹果成花。
本发明还进行了难成花品种‘长富2号’与易成花芽变品种‘烟富6号’的全基因组重测序工作，通过与参考基因组‘金冠’的比对，获得全基因组水平DNA多态性差异。结果显示，‘长富2号’和‘烟富6号’获得SNP数量分别为5，409，757和5，149，354，其中‘长富2号’独有的SNPs数量为2，381，987，而‘烟富6号’中的数量为2，121，584，两者相同的SNPs为3，027，770。为了找到差异基因，利用基于两个品种独特SNPs的三种算法的基因滑窗。通过数据库注释总共得到1963个基因。其中，TPS家族多个成员被筛选出来。海藻糖-6-磷酸合酶TPS的催化产物是T6P，T6P是一个植物体内的碳水化合物状态的指示剂(Lunn et al.2006)，通过增加或降低T6P的水平可以影响拟南芥对糖的响应，从而调节植物生长。但同时拟南芥中T6P也可以响应蔗糖信号，调控下游相关成花基因诱导植物开花(Wahl et al.2013)。而MdTPS1基因可能与AtTPS1功能相同，通过响应糖信号来调控SPLs和FT的表达。本发明中不同品种间与葡萄糖处理的MdTPS的表达结果类似，在更易成花的条件中，MdTPS均上调表达，其下游受调控的成花基因表达也上调。说明TPS基因在DNA与RNA水平上的差异，都会对下游的受其调控的SPL及FT产生影响。
本发明探索不同成花特性品种间基因DNA多态性变异，深入探讨外源葡萄糖促花的生理与分子机理；通过对葡萄糖处理后可溶性糖及淀粉含量和相关酶活的分析，揭示了芽中糖的种类及其比例对富士苹果花芽分化具有一定影响。基于葡萄糖处理‘长富2号’花芽孕育期间短枝顶芽转录组数据分析，筛选并鉴定了响应葡萄糖处理与糖代谢及成花相关的差异表达基因。基于重测序技术，鉴定了‘长富2号’和‘烟富6号’品种全基因组DNA多态性变异；并分析比较‘长富2号’、‘烟富6号’品种中的独特SNPs，筛选出与糖代谢及成花相关的差异基因。解析以上所有差异基因表达模式，初步形成了葡萄糖信号介导苹果花芽孕育的基因调控网络假设模型。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种提高富士苹果花芽孕育率的药剂，其特征在于，所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂为葡萄糖；葡萄糖分子式为C6H12O6.H2O，分子量为198.17。
2.一种如权利要求1所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂的喷施方法，其特征在于，所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂的喷施方法为两次，选用的葡萄糖浓度为1.5％和3％；盛花后25天用1.5％，盛花后30天用3％葡萄糖，用葡萄糖溶于水；手动喷雾器整树喷施，喷施的湿润程度为叶片和茎表面湿润但无液滴凝聚下落。
3.一种如权利要求1所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂的测定方法，其特征在于，所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂的测定方法包括以下步骤：
步骤一，分别于盛花期后30、40、50、60、70d，随机采取‘长富2号’处理组，对照组以及‘烟富6号’的当年生短枝顶芽及毗邻叶，用锡纸包裹并标记，液氮封存带回，–80℃保存；
步骤二，取‘长富2号’处理组盛花期后30、50、70d的短枝顶芽样品命名为G1、G2、G3，对照组盛花期后30、50、70d的短枝顶芽样品命名为C1、C2、C3用于转录组送测；取‘长富2号’和‘烟富6号’叶片用于重测序送测；
步骤三，测定树体生长发育及成花相关指标、糖代谢相关酶活性、山梨醇脱氢酶与山梨醇氧化酶活性、可溶性糖及淀粉的提取和测定、RNA提取、反转录及荧光定量PCR；
步骤四，数据统计分析使用Statistical Program for Social Science 19进行，相关图表制作使用Excel 2016，Origin8.0与MultiExperiment Viewer。
4.如权利要求3所述的提高富士苹果花芽孕育率的药剂的测定方法，其特征在于，所述提高富士苹果花芽孕育率的药剂的测定方法在苹果‘长富2号’和‘烟富6号’品种中分别得到SNPs为5,409,757和5,149,354个；SVs分别为266,513和230,483个；INDELs分别为1,554,595和1,491,351个；‘长富2号’特有的SNPs为2,381,987，而‘烟富6号’中的数量为2,121,584，两者相同的SNPs为3,027,770；基于两个品种独特SNPs，采用Fst，Pi，Tajimi’sD三种算法进行基因滑窗，筛选出正向选择的区域；通过不同数据库的注释，共得到1963个差异基因。
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