CN108801994B - 一种组织焦亡的荧光检测方法及基于该方法的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种组织焦亡的荧光检测方法及基于该方法的检测试剂盒。本发明的荧光检测方法包括：组织冰冻切片制备，滴加内源性亲和素封闭A液和B液封闭，每个样本按2：3的比例滴加TdT酶反应液和Streptavidin‑FITC标记工作液，5％BSA封闭，每个样本按2：3的比例孵育Caspase‑1一抗和二抗，染核，封片，荧光检测。全程都在避光下操作。在荧光显微镜下，可见TUNEL(绿光)和Caspase‑1(红光)共表达现象，共表达细胞为焦亡细胞，呈斑块状荧光。本发明同时公开一种适用于该检测方法的试剂盒，操作方便，快速灵敏，对焦亡类疾病的检测具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织焦亡的荧光检测方法，及基于该方法的检测试剂盒。
背景技术
2001年，Brennan和Cookson首次用Pyroptosis来描述这种独特的程序性炎性细胞死亡方式，pyro是指促炎介质的释放，ptosis表示下降,Pyroptosis称为细胞焦亡。细胞焦亡时，质膜出现破裂形成直径1-2nm的小孔，细胞渗透性肿胀，胞内物质流出，通过膜的通透性可检测细胞焦亡，但组织焦亡在电镜下无法观察到细微膜孔的形成。
荧光检测技术具有背景干扰低，灵敏度高，精准，成本相对低廉等特点，可快速检测细胞死亡。焦亡在形态学上同时具有坏死和凋亡的特征，与凋亡相似的是，发生焦亡的细胞同样会出现细胞核浓缩、染色质DNA断裂。染色质DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜进行检测，这就是传统检测凋亡的TUNEL法，凋亡和焦亡发生时TUNEL检测均阳性，但与凋亡不同的是，焦亡并不由传统的凋亡分子Caspase-3介导，而是由炎性半胱氨酸蛋白酶Caspase-1介导。而单一的TUNEL核酸检测或Caspase-1蛋白检测均并不能反映焦亡的发生，同一细胞Caspase-1和TUNEL荧光表达双阳性则可判断为焦亡。如何使核酸检测和蛋白检测在同一个组织中实现共表达是本发明主要突破点，本发明不断摸索实验条件，优化实验参数，成功建立一种组织焦亡的检测方法，在此基础上，开发一种组织焦亡检测试剂盒，操作方便，快速灵敏，对焦亡类疾病的检测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织焦亡的荧光检测方法，该方法可用于焦亡类疾病的临床和科研诊断。
本发明的目的之二是提供一种组织焦亡的荧光检测试剂盒可用于焦亡类疾病的检测。
本发明提供的一种组织焦亡的荧光检测方法，包括以下步骤：
(1)制备样品组织冰冻切片；
(2)样品组织冰冻切片先后滴加内源性亲和素封闭液A和B，孵育；
(3)第一次封闭后按2:3的比例滴加TdT酶反应液和Streptavidin-FITC标记工作液；
(4)第二次封闭后滴加一抗Caspase-1和荧光标记二抗IgG孵育，染核，封片，荧光检测；步骤(1)-(4)全程避光。
本发明的荧光检测方法中，步骤(1)的样品组织冰冻切片室湿复温后，浸入2-4℃预冷的丙酮固定。
步骤(2)所述内源性亲和素封闭液A为链酶亲和素，内源性亲和素封闭液B为生物素。
步骤(2)每个样本加内源性亲和素封闭A液，室温孵育10-30min，冲洗；之后每个样本加内源性亲和素封闭B液，室温孵育10-30min，冲洗。优选地，室温孵育20min。
步骤(3)的第一次封闭是用上述封闭液A和B进行封闭。
步骤(4)的第二次封闭是指在添加了TdT酶之后采用2-8％BSA封闭样品50-70min。优选地，采用5％的BSA封闭样品60min。
所述TdT酶反应液20μL配方为15μLEquilibration Buffer，1.0μL Biotin-11-dUTP，4.0μLTdT Enzyme，所述Streptavidin-FITC标记工作液30μL配方为为25μL Labelingbuffer、5μLStreptavidin-FITC标记液。
步骤(3)中，每个样本上滴加TdT酶反应液，30-40℃避光反应40-80min，冲洗；之后，每个样本上滴加Streptavidin-FITC标记工作液，30-40℃避光反应20-40min，PBS冲洗；然后滴加多聚甲醛，30-40℃避光反应8-20min，冲洗。
优选地，步骤(3)中，按TdT酶反应液：Streptavidin-FITC标记工作液(2：3)量的体积比例滴加每个样本上滴加TdT酶反应液20ul，37℃避光反应60min，冲洗；之后，每个样本上滴加Streptavidin-FITC标记工作液30ul，37℃避光反应30min，PBS冲洗；然后滴加多聚甲醛，37℃避光反应10min，冲洗。
步骤(4)滴加稀释的一抗Caspase-1，2-6℃避光孵育8-16小时，冲洗后，滴加荧光标记二抗IgG 30-40℃避光孵育70-120min，冲洗，DAPI工作液染核，5-20min，冲洗，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。
优选地，步骤(4)按一抗Caspase-1：荧光标记二抗IgG(2：3)量的体积比例滴加稀释的一抗Caspase-120ul，4℃避光孵育12小时，冲洗后，滴加荧光标记二抗IgG30ul，37℃避光孵育90min，冲洗，DAPI工作液染核，10min，冲洗，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。本发明的实施例中采用的荧光标记二抗IgG为荧光标记兔抗IgG。
在荧光显微镜下，焦亡的细胞可见TUNEL(绿光)和Caspase-1(红光)共表达现象，共表达细胞为焦亡细胞，呈斑块状荧光。
本发明还提供一种检测组织焦亡的试剂盒，含有内源性亲和素封闭液A、内源性亲和素封闭液B、TdT酶反应液、Streptavidin-FITC标记工作液、5％BSA、一抗Caspase-1、荧光标记二抗IgG；内源性亲和素封闭液A为链酶亲和素，内源性亲和素封闭液B为生物素。
本发明提供了所述试剂盒在检测组织焦亡中的应用。
本发明的有益效果在于，(1)现有的TUNEL核酸检测和Caspase-1蛋白检测都是单独的检测方法，而单一的TUNEL阳性或Caspase-1阳性并不能反映焦亡的发生，TUNEL和Caspase-1双阳性则可表明焦亡，如何使同一细胞的核酸和蛋白表达在同一个组织中实现共表达是本发明相对于现有技术的关键改进点，本发明不断摸索实验条件，优化荧光技术参数，采用双重封闭、溶液的比例滴加及避光操作等技术成功建立一种组织焦亡的检测方法，在荧光显微镜下可见TUNEL和Caspase-1的共表达，本发明建立一种TUNEL和Caspase-1荧光双染的检测方法，能更准确的反映组织焦亡，为焦亡类疾病的检测提供一种方法，对于焦亡类疾病的检测具有重要意义。(2)本发明在检测技术基础上衍生的试剂盒，具有操作方便，反应灵敏等优点，同时避免了人为因素造成结果的误差。
附图说明
图1为TUNEL和Caspase-1荧光双染检测在大鼠海马区焦亡的表达现象。A:Caspase-1的表达(激光共聚焦下荧光显示为红色，白色箭头所指之处)；B:TUNEL的表达(激光共聚焦下荧光显示为绿色，白色箭头所指之处)；C：DAPI核的定位(激光共聚焦下荧光显示为蓝色，白色箭头所指之处)；D:Merge为三者共表达，箭头所指为焦亡细胞(激光共聚焦下荧光显示为黄青色，白色箭头所指之处)。
图2为TUNEL和Caspase-1荧光双染检测在大鼠皮质区焦亡的表达现象。A:Caspase-1的表达(激光共聚焦下荧光显示为红色，白色箭头所指之处)；B:TUNEL的表达(激光共聚焦下荧光显示为绿色，白色箭头所指之处)；C：DAPI核的定位(激光共聚焦下荧光显示为蓝色，白色箭头所指之处)；D:三者共表达，箭头所指为焦亡细胞(激光共聚焦下荧光显示为黄青色，白色箭头所指之处)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用生化试剂均为市售商品。
实施例1
1、组配组织焦亡荧光检测试剂盒，包括以下试剂：
(1)内源性亲和素封闭A液(50uL)、内源性亲和素封闭B液(50uL)
内源性亲和素封闭液A为链酶亲和素(市售)，内源性亲和素封闭液A为生物素(市售)。
(2)5％BSA 50ul。
(3)TdT酶反应液20uL：15uL Equilibration Buffer+1.0uL Biotin-11-dUTP+4.0uL TdT Enzyme
(4)Streptavidin-FITC标记工作液30uL：25uL Labeling buffer+5ulStreptavidin-FITC标记液
(5)Caspase-1一抗：按1：50浓度稀释液20uL
(6)抗rabbit-IgG标记荧光抗体(30uL)
2、以脑组织为样品，检测脑组织焦亡方法，包括以下步骤：
(1)大鼠麻醉后开胸暴露心脏，经左心室先快速灌注生理盐水(50ml左右)至流出液变清亮，然后换4％多聚甲醛继续灌注大约100ml直至肝脏变硬。
(2)取脑：小心剥离脑组织，4％多聚甲醛固定。
(3)脱水：将标本依次移入20％蔗糖至30％蔗糖溶液梯度脱水，4℃放置至组织块沉底。
(4)切片：将脑组织用OCT包埋，模底部接触液氮，待周边变白，置于冰冻切片机中切片，切片厚度8-10μm。
(5)切片经丙酮处理后PBS冲洗3次，每次10min。
(6)每个样本加50uL内源性亲和素封闭A液，室温孵育20min，PBS冲洗5min，冲洗3次。
(7)每个样本加50uL内源性亲和素封闭B液，室温孵育20min，PBS冲洗5min×3次。
(8)配制TdT酶反应液：计算好样本数集中配制，每样本用量：15μLEquilibrationBuffer加1.0μL Biotin-11-dUTP和4.0μLTdTEnzyme，即用即配，注意避光；
(9)样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加20μLTdT酶反应液，放入温盒中，37℃避光反应60min，PBS冲洗5min×3次，注意避光。
(10)配制Streptavidin-FITC标记工作液：计算好样本数集中配置，阴性对照片同样计入，每个样本用量为：25μL Labeling buffer加入5μL Streptavidin-FITC标记液，即用即配，注意避光。
(11)样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加30μL配好的标记工作液，放入温盒中，37℃避光反应30min，PBS冲洗5min x 3次，注意避光。
(12)滴加多聚甲醛，37℃10min，PBS冲洗5min×3次，注意避光。
(13)每个样本的滴加30μL 5％BSA进行封闭。
(14)孵育一抗：滴加稀释的一抗(caspase-1)20μL，4℃过夜。PBS冲洗5min×3次，注意避光。
(15)孵育二抗：滴加l抗rabbit-IgG标记荧光抗体30μL，37℃孵育90min，PBS冲洗5min×3次，注意避光。
(16)DAPI工作液37℃染核10min，PBS冲洗5min×3次，注意避光。
(17)缓冲甘油封片。
(18)荧光显微镜下观察。结果见图1和图2。
由图1可以看到，TUNEL和Caspase-1荧光双染检测在大鼠海马区焦亡的表达现象。A:Caspase-1的表达(激光共聚焦下荧光显示为红色，白色箭头所指之处)；B:TUNEL的表达(激光共聚焦下荧光显示为绿色，白色箭头所指之处)；C：DAPI核的定位(激光共聚焦下荧光显示为蓝色，白色箭头所指之处)；D:Merge为三者共表达，箭头所指为焦亡细胞(激光共聚焦下荧光显示为黄青色，白色箭头所指之处)。
由图2可以看到，TUNEL和Caspase-1荧光双染检测在大鼠皮质区焦亡的表达现象。A:Caspase-1的表达(激光共聚焦下荧光显示为红色，白色箭头所指之处)；B:TUNEL的表达(激光共聚焦下荧光显示为绿色，白色箭头所指之处)；C：DAPI核的定位(激光共聚焦下荧光显示为蓝色，白色箭头所指之处)；D:三者共表达，箭头所指为焦亡细胞(激光共聚焦下荧光显示为黄青色，白色箭头所指之处)。可见采用本发明的试剂盒进行TUNEL和Caspase-1荧光双染，能更准确的反映组织焦亡。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种组织焦亡的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备样品组织冰冻切片；
（2）每个样本加内源性亲和素封闭液A，室温孵育10-30 min，冲洗；之后每个样本加内源性亲和素封闭液B，室温孵育10-30 min，冲洗；所述内源性亲和素封闭液A为链酶亲和素，内源性亲和素封闭液B为生物素；
（3）按TdT酶反应液：Streptavidin-FITC标记工作液2：3的体积比例滴加，每个样本上滴加TdT酶反应液20ul，30-40℃避光反应40-80min，冲洗；之后，每个样本上滴加Streptavidin-FITC标记工作液30ul，30-40℃避光反应20-40min，PBS冲洗；然后滴加多聚甲醛，30-40℃避光反应8-20min，冲洗；
（4）采用2%-8%的BSA进行封闭后按一抗Caspase-1：荧光标记二抗IgG为2：3的体积比例滴加稀释的一抗Caspase-120ul，2-6℃避光孵育8-16小时，冲洗后，滴加荧光标记二抗IgG30ul，30-40℃避光孵育70-120min，冲洗，DAPI工作液染核，5-20min，冲洗，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察；步骤（1）-（4）全程避光。
2.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，步骤（1）的样品组织冰冻切片室湿复温后，浸入2-4℃预冷的丙酮固定。
3.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述TdT 酶反应液20µL配方为15µLEquilibration Buffer，1.0µL Biotin-11-dUTP，4.0µLTdT Enzyme，所述Streptavidin-FITC标记工作液30µL配方为25µL Labeling buffer、5µLStreptavidin-FITC标记液。
4.一种基于权利要求1-3任一项所述荧光检测方法检测组织焦亡的试剂盒，其特征在于，含有内源性亲和素封闭液A、内源性亲和素封闭液B、TdT 酶反应液、Streptavidin-FITC标记工作液、5%BSA，一抗Caspase-1、荧光标记二抗IgG；所述内源性亲和素封闭液A为链酶亲和素，内源性亲和素封闭液B为生物素。
5.权利要求4所述的试剂盒在检测组织焦亡中的应用。
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