CN108760707B - 一种探针试剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三[2,2’‑二[3‑(4‑硝基苯偶氮)‑6‑羟基]苯甲氨基乙基‑2”‑罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用。在不同溶剂中，利用波长分辨、吸收增强、荧光增强方法，选择性检测很宽范围的pH以及F‑、AcO‑，H2PO4 ‑，Hg2+多种质子、阴及重金属离子。不仅能用紫外‑可见吸收和荧光光谱两种方式高选择性、高灵敏度检测，而且还能用目视比色法，简便、快速、定性、定量检测多种目标离子。检测时波长均在可见光范围，可视性强，便于快速检测。

Description

一种探针试剂的应用
技术领域
本发明涉及一种探针试剂的应用，特别是一种三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针的应用。
背景技术
荧光探针技术作为一种化学传感器能够对环境、生物等特殊环境中的离子实现快速、实时、在线检测，具备检测灵敏度高、选择性好、速度快、样品处理方便及成本低廉等有点，有别于其他如色谱、光谱等离子检测的方法。探针能够以高灵敏、高选择的方式，直观、快速地检测环境和生物样品中微量离子的浓度及其变化。同时，探针还能够以其特征的吸收或发射波长的不同，在适当的条件下实现同一探针对多种离子的选择性检测，更是其有别于其他检测技术的优势所在。探针检测以颜色和光谱视觉变化的形式反馈离子的信息，既可作为比色染色剂方便和灵巧的检测，能够可视化地描绘出离子的分布，提供定位动态信息及分子水平的定性、定量检测。目前大多数的单探针只能用于1～2种离子的同时检测，能同时检测金属离子、酸根阴离子等3种及其以上多种离子的单探针技术，不仅能有效提高检测效率、降低成本、且有利于对复杂微观系统的分析。但对于能同时检测金属离子、酸根阴离子等3种及其以上多种离子的单探针技术，目前尚未有相关文献进行报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，本发明将三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂用于检测pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+；实现了单一探针对金属离子、酸根阴离子等多种离子的检测，能有效提高检测效率、降低成本、且有利于对复杂微观系统的分析。
本发明的技术方案：三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，将探针用于检测pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+；所述探针的结构式为
Figure GDA0002824572630000021
前述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用中，所述的将探针用于检测pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+是：
(1)以探针为试剂，用紫外-可见吸收光谱法对pH、F-、AcO-和/或H2PO4 -的检测；
(2)以探针为试剂，用紫外-可见吸收光谱法对Hg2+的检测；
(3)以探针为试剂，用荧光光谱法对Hg2+的检测；
(4)以探针为试剂，用目视比色法对pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+离子的检测；
(5)以探针为试剂，用探针测试滤纸法对pH的检测。
前述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用中，所述的以探针为试剂，用紫外-可见吸收光谱法对pH、F-、AcO-和/或H2PO4 -的检测是；
用紫外-可见吸收光谱法对pH的检测是：在体积比为95/5的二甲基亚砜/三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液中，在pH 2～10的范围，探针在500nm～550nm范围的最大吸收波长处的吸光度与pH值呈线性关系，pKa为6.685，用校正曲线法检测pH；在体积比为95/5的二甲基亚砜/N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙磺酸(HEPES)-NaOH缓冲溶液中，在pH 10～13的范围，探针在550nm～595nm范围的最大吸收波长处的吸光度与pH值呈线性关系，pKa为11.50，用校正曲线法检测pH，检测的最低pH值为2，最高pH值为13；
用紫外-可见吸收光谱法对F-的检测是：在乙腈溶液中，探针在575nm处的吸光度与F-浓度呈线性关系，用校正曲线法检测F-，检测的浓度线性范围为1.0～20μM，检出限为0.47μM，其他共存阴离子包括AcO-、HSO4 -、H2PO4 -、PF6 -、Cl-、Br-、I-、NO3 -之一，在浓度与F-浓度相同时，对F-的测定无干扰；
用紫外-可见吸收光谱法对AcO-的检测是：在乙腈溶液中，探针在530nm处的吸光度与AcO-浓度呈线性关系，用校正曲线法检测AcO-，检测的浓度线性范围为1.0～20μM，检出限为0.98μM，其他共存阴离子包括F-、HSO4 -、H2PO4 -、PF6 -、Cl-、Br-、I-、NO3 -之一，在浓度与AcO-浓度相同时，其他共存阴离子对AcO-的测定无干扰；
用紫外-可见吸收光谱法对H2PO4 -的检测是；在乙腈溶液中，探针在505nm处的吸光度与H2PO4 -浓度呈线性关系，用校正曲线法检测H2PO4 -，检测的浓度线性范围为1.0～20μM，检出限为0.83μM，其他共存阴离子包括：F-、AcO-、HSO4 -、PF6 -、Cl-、Br-、I-、NO3 -之一，在浓度与H2PO4 -浓度相同时，对H2PO4 -的测定无干扰。
前述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用中，所述的以探针为试剂，用紫外-可见吸收光谱法对Hg2+的检测是；在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，探针在560nm处的吸光度与Hg2+浓度呈线性关系，用校正曲线法检测Hg2+，检测的浓度线性范围为10～20μM，检出限为5.5μM，其他共存金属离子包括：Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Sr2+、Fe3+、Sr2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Pb2+、Cr3+、Al3+、Ag+、Cu2+或Mn2+，在浓度与Hg2+浓度相同时，对Hg2+的测定无干扰。
前述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用中，所述的以探针为试剂，用荧光光谱法对Hg2+的检测是；在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，以500nm为激发波长，探针在583nm处的荧光强度与Hg2+浓度呈线性关系，用校正曲线法检测Hg2+，检测的浓度线性范围为5.0～10μM，检出限为0.017μM，其他共存金属离子包括：Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Sr2+、Fe3+、Sr2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Pb2+、Cr3+、Al3+、Ag+、Cu2+或Mn2+，在浓度与Hg2+浓度相同时，对Hg2+的测定无干扰。
前述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用中，所述的以探针为试剂，用目视比色法对pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+离子的检测是；
用目视比色法对pH是；日光下，在体积比为95/5的二甲基亚砜/三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液中，在pH 2～10范围，探针溶液颜色随pH值增大由淡黄色、粉色、粉红色、紫红色、紫色到蓝色的变化过程；在体积比为95/5的二甲基亚砜/N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙磺酸(HEPES)-NaOH缓冲溶液中，在pH 10～13范围，探针溶液颜色随pH值增大由紫色、蓝紫色到蓝色的变化过程；
用目视比色法对F-的检测是；是日光下，在乙腈溶液中，F-的加入使探针溶液颜色明显变化，F-浓度在0～200μM范围，探针从橙黄色逐渐变化粉红色最后变化到紫蓝色，可目视检测浓度在0～200μM的F-；
用目视比色法对AcO-的检测是；日光下，在乙腈溶液中，AcO-的加入使探针溶液颜色明显变化，AcO-浓度在0～200μM范围，探针从橙黄色逐渐变化到暗红色，可目视检测浓度在0～200μM的AcO-；
用目视比色法对H2PO4 -的检测是；日光下，在乙腈溶液中，H2PO4 -的加入使探针溶液颜色明显变化，H2PO4 -浓度在0～200μM范围，探针从橙黄色逐渐变化到暗红色，可目视检测浓度在0～200μM的H2PO4 -；
用目视比色法对Hg2+离子的检测是；日光下，在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，Hg2+的加入使探针溶液颜色明显变化，Hg2+浓度在0～200μM范围，探针从橙黄色逐渐变化到玫红色，可目视检测浓度在0～200μM的Hg2+。
前述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用中，所述的以探针为试剂，用探针测试滤纸法对pH的检测是；日光下，负载有探针的二甲基亚砜溶液的测试滤纸条，对pH 2～12范围的缓冲溶液，测试滤纸条颜色从淡黄色、橙色、粉红色、桃红色至紫色的变化过程，可目视检测范围在2～12的pH。
前述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用中，所述的探针试剂是以三(2-氨乙基)胺、罗丹明B和2-羟基-5-[(4-硝基苯基)二氮烯基]苯甲醛为主要原料，以乙醇为溶剂，首先合成中间体，再由中间体和2-羟基-5-[(4-硝基苯基)二氮烯基]苯甲醛在二氯甲烷和甲醇溶剂中反应得到。
前述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用中，所述的探针试剂的合成路线为：
Figure GDA0002824572630000051
前述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用中，所述的探针试剂是这样制备的：100ml的三口瓶中，加入三(2-氨乙基)胺27.36mmol、罗丹明B3.42mmol和60ml的无水乙醇，氮气保护下回流36小时，减压蒸去乙醇，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，经硅胶柱层析分离，得到中间体；反应时间：36h，反应溶剂：无水乙醇，洗脱剂：体积比为甲醇/三氯甲烷/三乙胺＝9/1/1的混合液；
10ml的三口烧瓶中加入中间体1mmol、2-羟基-5-[(4-硝基苯基)二氮烯基]苯甲醛2mmol和50ml二氯甲烷，氮气保护下常温反应12h，加入10ml的甲醇，分批加入硼氢化钠8.6mol，继续反应5h，减压蒸去溶剂，用三氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂得深红色的油状液体，硅胶柱层析分离和洗脱，得探针化合物，反应时间：17h，反应溶剂：二氯甲烷和甲醇，洗脱剂：体积比为二氯甲烷/甲醇/三乙胺＝100/2/1的混合液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明所采用的探针检测性能优越。在不同溶剂中，利用波长分辨、吸收增强、荧光增强方法，选择性检测很宽范围的pH以及F-、AcO-，H2PO4 -，Hg2+多种质子、阴及重金属离子。不仅能用紫外-可见吸收和荧光光谱两种方式高选择性、高灵敏度检测，而且还能用目视比色法，简便、快速、定性、定量检测多种目标离子。检测时波长均在可见光范围，可视性强，便于快速检测。
2、在体积比为95/5的二甲基亚砜/缓冲溶液中，在pH 2～10，探针在500nm～550nm的最大波长处的吸光度与pH值呈线性关系；在pH 10～13，探针在550nm～595nm的最大波长处的吸光度与pH值呈线性关系；计算得pKa分别为6.685和11.50，利用紫外-可见吸收光谱，探针可在极酸、中性及极碱的宽范围内检测溶液的pH。这种探针检测pH的技术有别于电极检测技术，不受检测对象的体积或状态等环境因素的影响。
3、在乙腈溶液中，用紫外-可见吸收光谱法，探针在不同波长下对不同阴离子的选择性吸收，用吸收增强方式，分别测量575nm处的吸光度检测溶液中微量F-、测量530nm处的吸光度检测溶液中微量AcO-、测量505nm处的吸光度检测溶液中微量H2PO4 -。
4、在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，用紫外-可见吸收光谱法，探针对Hg2+有选择性吸收，测量560nm处的吸光度检测溶液中微量Hg2+；
5、在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，用荧光光谱法，探针对Hg2+有选择性荧光发射，测量583nm处的荧光强度检测溶液中微量Hg2+；
6、在二甲基亚砜/缓冲溶液中，探针作为试剂在可见光下可目视比色检测pH 2～10及pH 10～13范围的缓冲溶液，颜色变化敏锐；
7、在乙腈溶液中，探针作为试剂在可见光下可目视比色检测0～200μM的F-、AcO-、H2PO4 -，颜色变化敏锐；
8、在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，探针作为试剂在可见光下可目视比色检测0～200μM的Hg2+，颜色变化敏锐；
9、用负载有探针的二甲基亚砜溶液的滤纸条，作为测试纸在可见光下可目视检测pH 2～12范围的溶液pH值，测试滤纸颜色变化敏锐。
单探针多目标识别技术主要体现在所选用的探针结构独特、制备成本低廉、识别方式多样、检测性能优越、操作条件易于控制，应用前景好等方面。
综上所述，本发明将三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂用于检测pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+；实现了单一探针对金属离子、酸根阴离子等多种离子的检测，能有效提高检测效率、降低成本、且有利于对复杂微观系统的分析。
附图说明：
图1是探针检测pH(pH在2～10范围)的紫外-可见吸收光谱图；
图2是探针检测pH(pH在2～10范围)在550nm～595nm范围的最大波长处的吸光度与pH的关系曲线；
图3是探针检测pH(pH在10～13范围)的紫外-可见吸收光谱图；
图4是探针检测pH(pH在10～13范围)在550nm～595nm范围的最大波长处的吸光度与pH的关系曲线；
图5是探针检测F-，AcO-，H2PO4 -的紫外-可见吸收光谱；
图6是探针检测不同浓度的F-的紫外-可见吸收光谱滴定图；
图7是探针检测F-的校正曲线；
图8是共存阴离子对探针检测F-的吸光度影响；
图9是探针检测不同浓度的AcO-的紫外-可见吸收光谱滴定图；
图10是探针检测AcO-的校正曲线；
图11是共存阴离子对探针检测AcO-的吸光度影响；
图12是探针检测不同浓度的H2PO4 -的紫外-可见吸收光谱滴定图；
图13是探针检测H2PO4 -的校正曲线；
图14是共存阴离子对探针检测H2PO4 -的吸光度影响；
图15是探针检测Hg2+的紫外-可见吸收光谱；
图16是探针检测不同浓度的Hg2+的紫外-可见吸收光谱滴定图；
图17是探针检测Hg2+的吸光度校正曲线；
图18是共存金属离子对探针检测Hg2+的吸光度影响；
图19是探针检测Hg2+的荧光光谱；
图20是不同浓度的Hg2+与探针的荧光光谱滴定图；
图21是探针检测Hg2+的荧光校正曲线；
图22是共存金属离子对探针检测Hg2+的荧光强度影响；
图23是日光下探针在不同pH缓冲溶液中颜色变化图；
图24是日光下探针在不同浓度的F-溶液中的颜色变化图；
图25是日光下探针在不同浓度的AcO-溶液中的颜色变化图；
图26是日光下探针在不同浓度的H2PO4 -溶液中的颜色变化图；
图27是日光下不同浓度的Hg2+在探针溶液中的颜色变化图；
图28是日光下负载探针的测试滤纸对不同pH缓冲溶液的颜色变化图。
具体实施方式
实施例1：
1、三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的化学结构式为：
Figure GDA0002824572630000081
其合成路线如下：
Figure GDA0002824572630000083
其具体制备方法为：
(1)中间体的制备：
100ml的三口瓶中，加入三(2-氨乙基)胺(4.0g，27.36mmol)、罗丹明B(1.638g，3.42mmol)和60ml的无水乙醇，氮气保护下回流36小时，减压蒸去乙醇，用二氯甲烷(3×100ml)萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，经硅胶柱层析分离，得到中间体1.71g，产率87.3％。；反应时间：36h，反应溶剂：无水乙醇，洗脱剂：体积比为甲醇/三氯甲烷/三乙胺＝9/1/1的混合液。中间体结构表征数据：1H NMR(500MHz,CDCl3,ppm)δ:7.877(s,1H,ArH)，7.437(s,2H,ArH),7.087(bs,1H,ArH)，6.406(d,J＝10Hz,4H,ArH)，6.272(d,J＝9.0Hz,2H,ArH)，3.355～3.313(m,8H,-CH2CH3)，3.144(t,J＝8.0Hz,2H,OCNCH2-)，2.547(t,J＝6.0Hz,4H,-CH2NH2)，2.347(t,J＝5.5Hz,4H,NCH2CH2)，2.272(t,J＝7.5Hz,2H,NCH2CH2),1.837(bs,4H,CH2NH2)，1.159(t,J＝7.0Hz,12H,-CH2CH3)。
(2)探针的制备：
10ml的三口烧瓶中加入中间体(570mg，1mmol)，2-羟基-5-[(4-硝基苯基)二氮烯基]苯甲醛(540mg，2mmol)，50ml二氯甲烷，氮气保护下常温反应12h，加入10ml的甲醇，分批加入硼氢化钠(320mg，8.6mol)，继续反应5h，减压蒸去溶剂，用CHCl3(3×60ml)萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂得深红色的油状液体，硅胶柱层析分离和洗脱，得深红色固体探针化合物470mg，产率43.4％，反应时间：17h，反应溶剂：二氯甲烷和甲醇，洗脱剂：体积比为二氯甲烷/甲醇/三乙胺＝100/2/1的混合液。探针结构表征数据：m.p.147.3-148.5℃，IR(KBr,νcm-1):3440(O-H,N-H)，1611(C＝C)，1543(-NO2)，1470(C＝C)，1379(-NO2)，854(Ar-H)，756(Ar-H)。1H NMR(500MHz,CDCl3,ppm)δ:8.353(d,J＝9.0,4H,ArH)，7.950(d,J＝9.0,4H,ArH)，7.840～7.811(m,3H,ArH)，7.697(s,2H,ArH)，7.511～7.438(m,2H,ArH)，7.148(d,J＝7.5,1H,ArH)，6.867(d,J＝8.5,2H,ArH)，6.405(t,J＝9.0Hz,4H,ArH)，6.306(s,2H,ArH)，4.078(s,4H,ArCH2NH×2)，3.342～3.314(m,8H,CH2CH3×4)，3.151(t,J＝6.5,2H,NCH2CH2)，2.613(s,4H,NCH2CH2-)，2.516(t,J＝4.5,4H,NCH2CH2×2)，2.225(t,J＝6.5,2H,NCH2CH2)，1.138(t,J＝7.0,12H,-CH2CH3×4)。MS(MALDI-TOF)Calcd for[C60H62N12O8]:m/z 1081.50，Found:m/z 1081.663[M+H]+。
实施例2.试剂配制
(1)探针溶液的配制：称取10.80mg探针(按实施例1进行制备)，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，并配制成浓度为1mM的探针储备液10mL；或用乙腈(CH3CN)溶解，并配制成浓度为1mM的探针储备液10mL；
(2)Hg2+储备液配制：：称取453.54mg高氯酸汞，用超纯水溶解，配制成浓度为20mM的溶液50mL；
(3)其他金属离子(Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Sr2+，Fe3+，Sr2+，Zn2+，Co2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+，Cr3+，Al3+，Ag+，Cu2+，Mn2+)储备液的配制：分别取相应金属离子的高氯酸盐，其他金属离子均用超纯水配成20mM的各金属离子储备液；
(4)F-储备液配制：称取0.1847g四丁基氟化胺，用乙腈溶解，配制成浓度为20mM的F-离子溶液；
(5)AcO-储备液配制：称取0.1507g四丁基醋酸铵，用乙腈溶解，配制成浓度为20mM的AcO-离子溶液；
(6)H2PO4 -储备液配制：称取四丁基醋酸铵0.1697g，用乙腈溶解，配制成浓度为20mM的H2PO4 -离子溶液；
(7)其他阴离子(HSO4 -，PF6 -，ClO4 -，Cl-，Br-，I-，NO3 -)储备液的配制：分别取相应的阴离子四丁基铵盐，用乙腈溶解，配制成20mM的阴离子乙腈储备液；
(8)Tris-HCl缓冲液：用浓度为0.2M的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和0.2M HCl配制，调节pH 2～10，用pH计测试，调节至所需；
(9)HEPES-NaOH缓冲液：用浓度为0.2M的N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙磺酸(HEPES)和0.2M NaOH配制，调节pH 10～13，用pH测试，计调节至所需。
所用试剂为分析纯试剂，试验用水为超纯水。
所用紫外-可见分光光度计型号为UV-1800，日本岛津公司生产；荧光分光光度计型号为Cary Eclipse荧光分光光度计，美国VARIAN公司生产；酸度计型号为奥立龙818，美国奥立龙(Orion)公司生产；手提式紫外灯WFH-204B上海光学仪器厂。
实施例3.荧光光谱法对pH的检测
在10mL容量瓶中加入探针的二甲基亚砜储备液(1mM，0.1mL)后，用二甲基亚砜/缓冲液稀释至刻度，使探针测试溶液中二甲基亚砜/缓冲液体积比为95/5，摇匀，取约3ml移入1cm的石英比色皿进行紫外-可见吸收光谱测定。
在1cm的比色皿中，加入浓度为10μM的探针溶液，再分别加入pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液或pH为11、12、13的N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙磺酸(HEPES)-NaOH缓冲液，使测试溶液的溶剂比为(二甲基亚砜/Tris-HCl或二甲基亚砜/HEPES-NaOH，v/v，3/2)。将溶液进行紫外-可见吸收光谱测定，当pH值不断增大时，385nm处的吸收峰不断下降，500nm处出现一个新的紫外-可见吸收峰也随着pH值不断增大，吸收峰不断增强并且红移，如图1所示。由滴定在500nm～550nm处的最大吸收波长处的吸光度，通过Henderson-Hasselbach质量作用方程log[(Amax-A)(A-Amin)]＝pH-pKa，式中Amax为最大吸光度，A为任意pH条件下的吸光度，Amin为最小吸光度，计算出pKa为6.685。如图2所示。
在pH为10～13探针溶液中，pH为11～12探针变化迅速，pH大于12以后紫外吸收几乎没有改变，探针的吸收峰从550nm变化到595nm如图3，由滴定在550nm～595nm处的最大吸收波长处的吸光度，按上述同样的方法，计算出pKa为11.50，如图4所示。
实施例4.探针对F-、AcO-、H2PO4 -光谱测定
1、紫外-可见吸收光谱法对F-的检测
在10mL容量瓶中加入探针乙腈储备液(1mM，0.1mL)，用乙腈稀释至刻度，制成探针测试溶液，取溶液约3mL于1cm的比色皿中进行紫外-可见光谱测定。
探针的乙腈溶液中分别加入相当于探针20倍的ACO-、F-、HSO4 -、H2PO4 -、PF6 -、Cl-、Br-、I-、NO3 -等阴离子稀释至刻度摇匀，取溶液约3mL于1cm的比色皿中进行紫外-可见吸收光谱测定。
浓度为10μM的探针的乙腈溶液在400nm处有吸收峰；分别加入(20mM，0.1mL)的F-，AcO-，HSO4 -，H2PO4 -，PF6 -，ClO4 -，Cl-，Br-，I-，NO3 -，随着F-的加入，探针溶液在575nm处出现一个新的强的吸收峰如图5，表明在此条件下探针溶液对F-有识别检测作用。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中，加入不同浓度的F-，测定紫外-可见吸收光谱滴定曲线(具体见图6)。测定F-浓度变化时探针溶液在575nm处的吸光度，获得紫外-可见吸收校正曲线(见图7)。由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针检测F-的浓度线性范围和检出限列于表1。
探针溶液检测F-时，在AcO-，HSO4 -，H2PO4 -，PF6 -，ClO4 -，Cl-，Br-，I-，NO3 -分别作为共存阴离子存在于探针-F-混合溶液中，当加入的共存阴离子浓度与F-浓度相同时，上述其他阴离子对探针检测F-的吸光度影响的相对偏差在5％以内，不干扰测定(见图8)。
2、紫外-可见吸收光谱法对AcO-的检测
在10mL容量瓶中加入探针乙腈储备液(1mM，0.1mL)，用乙腈稀释至刻度，制成探针测试溶液，取溶液约3mL于1cm的比色皿中进行紫外-可见光谱测定。
探针的乙腈溶液中分别加入相当于探针20倍的ACO-、F-、HSO4 -、H2PO4 -、PF6 -、Cl-、Br-、I-、NO3 -等阴离子稀释至刻度摇匀，取溶液约3mL于1cm的比色皿中进行紫外-可见吸收光谱测定。
浓度为10μM的探针乙腈溶液在400nm处有吸收峰；分别加入(20mM，0.1mL)的F-，AcO-，HSO4 -，H2PO4 -，PF6 -，ClO4 -，Cl-，Br-，I-，NO3 -，随着AcO-的加入，探针溶液在540nm处出现一个新的强的吸收峰如图5，表明在此条件下探针溶液对AcO-有识别检测作用。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中，加入不同浓度的AcO-，测定紫外-可见吸收光谱滴定曲线(具体见图9)。测定AcO-浓度变化时探针溶液在530nm处的吸光度，获得紫外-可见吸收校正曲线(见图10)。由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针检测AcO-的浓度线性范围和检出限列于表1。
探针溶液检测AcO-时，在F-，HSO4 -，H2PO4 -，PF6 -，ClO4 -，Cl-，Br-，I-，NO3 -分别作为共存阴离子存在于探针-AcO-混合溶液中，当加入的共存阴离子浓度与AcO-浓度相同时，除F-略有影响外，上述其他阴离子对探针检测AcO-的吸光度影响的相对偏差在5％以内，不干扰测定(见图11)。
3、紫外-可见吸收光谱法对H2PO4 -的检测。
在10mL容量瓶中加入探针乙腈储备液(1mM，0.1mL)，用乙腈稀释至刻度，制成探针测试溶液，取溶液约3mL于1cm的比色皿中进行紫外-可见光谱测定。
探针的乙腈溶液中分别加入相当于探针20倍的ACO-、F-、HSO4 -、H2PO4 -、PF6 -、Cl-、Br-、I-、NO3 -等阴离子稀释至刻度摇匀，取溶液约3mL于1cm的比色皿中进行紫外-可见吸收光谱测定。
浓度为10μM的探针乙腈溶液在400nm处有吸收峰；分别加入(20mM，0.1mL)的F-，AcO-，HSO4 -，H2PO4 -，PF6 -，ClO4 -，Cl-，Br-，I-，NO3 -后，随着H2PO4 -的加入，探针溶液在510nm处出现一个新的强的吸收峰如图5，表明在此条件下探针溶液对H2PO4 -有识别检测作用。
在浓度为10μM的探针的乙腈溶液中，加入不同浓度的H2PO4 -，测定紫外-可见吸收光谱滴定曲线(见图12)。测定H2PO4 -浓度变化时探针溶液在505nm处的吸光度，获得紫外-可见吸收校正曲线(见图13)。由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针检测H2PO4 -的浓度线性范围和检出限列于表1。
探针溶液检测H2PO4 -时，在F-，HSO4 -，AcO-，PF6 -，ClO4 -，Cl-，Br-，I-，NO3 -分别作为共存阴离子存在于探针-H2PO4 -混合溶液中，当加入的共存阴离子浓度与H2PO4 -浓度同相当时，上述其他阴离子对探针检测H2PO4 -的吸光度影响的相对偏差在5％以内，不干扰测定(见图14)。
表1探针检测F-、AcO-、H2PO4 -的分析参数
Figure GDA0002824572630000131
实施例5对Hg2+光谱测定
1、探针对Hg2+紫外-可见吸收光谱的测定。
在浓度为5μM的探针在体积比为95/5的乙腈/水溶液中，分别加入20倍量金属离子Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Sr2+，Fe3+，Sr2+，Zn2+，Co2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+，Cr3+，Al3+，Ag+，Cu2+，Mn2 +时，探针在390nm处产生吸收峰，Hg2+(200μM)加入后，探针在560nm处出现一个新的吸收峰，而其他上述实验金属离子对光谱的影响很小(见图15)。
在浓度为5μM的探针在体积比为95/5的乙腈/水溶液中，加入不同浓度的Hg2+，测定紫外-可见吸收光谱滴定曲线(具体见图16)。测定探针在560nm处荧光光谱随Hg2+浓度变化，获得紫外-可见吸收校正曲线(见图17)。由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针检测Hg2+的浓度线性范围和检出限列于表2。
探针溶液检测Hg2+时，在Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Sr2+，Fe3+，Sr2+，Zn2+，Co2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+，Cr3+，Al3+，Ag+，Cu2+，Mn2+，分别作为共存金属离子存在于探针-Hg2+混合溶液中，当加入的共存离子浓度与Hg2+浓度相当时，上述其他金属离子对探针检测Hg2+的吸光度影响的相对偏差在5％以内，不干扰测定(见图18)。
2、探针对Hg2+-荧光光谱的测定。
在浓度为5μM的探针在体积比为95/5的乙腈/水溶液中，以500nm为激发波长，分别加入20倍量的金属离子Hg2+，Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Sr2+，Fe3+，Sr2+，Zn2+，Co2+，Ni2+，Cd2 +，Pb2+，Cr3+，Al3+，Ag+，Cu2+，Mn2+离子，只有Hg2+的加入使探针溶液在583nm处出现了一个强的荧光发射峰(见图19)。
在浓度为5μM的探针在体积比为95/5的乙腈/水溶液中，加入不同浓度的Hg2+，测定荧光光谱滴定曲线(具体见图20)。测定探针在583nm处荧光光谱随Hg2+浓度变化，获得荧光光谱校正曲线(见图21)。由校正曲线的斜率和测定10次空白值的标准偏差，测定并计算得到探针检测Hg2+的浓度线性范围和检出限列于表2。
探针溶液检测Hg2+时，在Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Sr2+，Fe3+，Sr2+，Zn2+，Co2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+，Cr3+，Al3+，Ag+，Cu2+，Mn2+分别作为共存金属离子存在于探针—Hg2+混合溶液中，当加入的共存金属离子浓度与Hg2+浓度相同时，上述其他金属离子对探针检测Hg2+的荧光强度影响的相对偏差在5％以内，不干扰测定(见图22)。
表2探针检测Hg2+的分析参数
Figure GDA0002824572630000141
实施例6：探针目视比色法检测pH，F-，AcO-，H2PO4 -，Hg2+。
1、检测pH
日光下，在体积比为95/5的二甲基亚砜/缓冲液中，浓度为10μM探针在pH2～10(Tris-HCl)缓冲液中，探针溶液颜色随pH值增大由淡黄色、粉色、粉红色、紫红色、紫色到蓝色的变化过程；在pH 11～13(HEPES-NaOH)缓冲液中，探针溶液颜色随pH值增大由紫色、蓝紫色到蓝色的变化过程；探针可以通过目视检测溶液pH为2～13范围的极酸、中性至极碱性溶液的pH(见图23)。
在日光下，将剪裁好的测试滤纸条浸入探针浓度为1mM的二甲基亚砜溶液中，5秒后取出测试滤纸条；再将测试的滤纸条分别浸入浓度为0.2M的pH为2、4、6、8、10、11.5、12的缓冲液中，发现测试滤纸条立即变色，2秒后取出测试滤纸条颜色从淡黄色、橙色、粉红色、桃红色至紫色的变化过程(见图28)
2、检测F-
日光下，在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，在浓度为10μM的探针中分别加入浓度为0，10，20，40，60，100，200μM的F-。日光下，随着F-的浓度增加，探针从橙黄色逐渐变化粉红色最后变化到紫蓝色。通过目视比色，最低能检测10μM的F-，最高能检测200μM的F-(见图24)。
3、检测AcO-
日光下，在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，在浓度为10μM的探针中分别加入浓度为0，10，20，200μM的AcO-。日光下，随AcO-浓度的增大，探针从橙黄色逐渐变化到暗红色后颜色。通过目视比色，最低能检测10μM的AcO-，最高能检测200μM的AcO-(见图25)。
4、检测H2PO4 -
日光下，在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，在浓度为10μM的探针中分别加入浓度为0，10，20，100，200μM的H2PO4 -。日光下，随H2PO4 -浓度的增大，探针从橙黄色逐渐变化到暗红色。通过目视比色，最低能检测10μM的H2PO4 -，最高能检测200μM的H2PO4 -(见图26)。
5、检测Hg2+
在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，在浓度为10μM的探针中分别加入浓度为0，10，20，60，100，200μM的。日光下，随Hg2+浓度的增大，探针从橙黄色逐渐变化到玫红色。通过目视比色，最低能检测10μM的Hg2+，最高能检测200μM的H2PO4 -(见图27)。

Claims (9)

1.三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，其特征在于：将探针用于检测pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+；所述探针的结构式为
Figure FDA0002824572620000011
所述的将探针用于检测pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+是：
(1)以探针为试剂，用紫外-可见吸收光谱法对pH、F-、AcO-和/或H2PO4 -的检测；
(2)以探针为试剂，用紫外-可见吸收光谱法对Hg2+的检测；
(3)以探针为试剂，用荧光光谱法对Hg2+的检测；
(4)以探针为试剂，用目视比色法对pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+离子的检测；
(5)以探针为试剂，用探针测试滤纸法对pH的检测；
用紫外-可见吸收光谱法对pH的检测是：在二甲基亚砜/三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液中，检测波长为500nm～550nm；在二甲基亚砜/N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙磺酸(HEPES)-NaOH缓冲溶液中，检测波长为550nm～595nm；
用紫外-可见吸收光谱法对F-的检测是：在乙腈溶液中，检测波长为575nm；
用紫外-可见吸收光谱法对AcO-的检测是：在乙腈溶液中，检测波长为530nm；
用紫外-可见吸收光谱法对H2PO4 -的检测是：在乙腈溶液中，检测波长为505nm；
用紫外-可见吸收光谱法对Hg2+的检测是；在乙腈/H2O溶液中，检测波长为560nm；
用荧光光谱法对Hg2+的检测是；在乙腈/H2O溶液中，以500nm为激发波长，检测波长为583nm。
2.如权利要求1所述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，其特征在于：所述的以探针为试剂，用紫外-可见吸收光谱法对pH、F-、AcO-和/或H2PO4 -的检测是；
用紫外-可见吸收光谱法对pH的检测是：在体积比为95/5的二甲基亚砜/三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液中，在pH 2～10的范围，探针在500nm～550nm范围的最大吸收波长处的吸光度与pH值呈线性关系，pKa为6.685，用校正曲线法检测pH；在体积比为95/5的二甲基亚砜/N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙磺酸(HEPES)-NaOH缓冲溶液中，在pH 10～13的范围，探针在550nm～595nm范围的最大吸收波长处的吸光度与pH值呈线性关系，pKa为11.50，用校正曲线法检测pH，检测的最低pH值为2，最高pH值为13；
用紫外-可见吸收光谱法对F-的检测是：在乙腈溶液中，探针在575nm处的吸光度与F-浓度呈线性关系，用校正曲线法检测F-，检测的浓度线性范围为1.0～20μM，检出限为0.47μM，其他共存阴离子包括AcO-、HSO4 -、H2PO4 -、PF6 -、Cl-、Br-、I-、NO3 -之一，在浓度与F-浓度相同时，对F-的测定无干扰；
用紫外-可见吸收光谱法对AcO-的检测是：在乙腈溶液中，探针在530nm处的吸光度与AcO-浓度呈线性关系，用校正曲线法检测AcO-，检测的浓度线性范围为1.0～20μM，检出限为0.98μM，其他共存阴离子包括F-、HSO4 -、H2PO4 -、PF6 -、Cl-、Br-、I-、NO3 -之一，在浓度与AcO-浓度相同时，其他共存阴离子对AcO-的测定无干扰；
用紫外-可见吸收光谱法对H2PO4 -的检测是：在乙腈溶液中，探针在505nm处的吸光度与H2PO4 -浓度呈线性关系，用校正曲线法检测H2PO4 -，检测的浓度线性范围为1.0～20μM，检出限为0.83μM，其他共存阴离子包括：F-、AcO-、HSO4 -、PF6 -、Cl-、Br-、I-、NO3 -之一，在浓度与H2PO4 -浓度相同时，对H2PO4 -的测定无干扰。
3.如权利要求1所述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，其特征在于：所述的以探针为试剂，用紫外-可见吸收光谱法对Hg2+的检测是；在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，探针在560nm处的吸光度与Hg2+浓度呈线性关系，用校正曲线法检测Hg2+，检测的浓度线性范围为10～20μM，检出限为5.5μM，其他共存金属离子包括：Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Sr2+、Fe3+、、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Pb2+、Cr3+、Al3+、Ag+、Cu2+或Mn2+，在浓度与Hg2+浓度相同时，对Hg2+的测定无干扰。
4.如权利要求1所述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，其特征在于：所述的以探针为试剂，用荧光光谱法对Hg2+的检测是；在体积比为95/5的乙腈/H2O溶液中，以500nm为激发波长，探针在583nm处的荧光强度与Hg2+浓度呈线性关系，用校正曲线法检测Hg2+，检测的浓度线性范围为5.0～10μM，检出限为0.017μM，其他共存金属离子包括：Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Sr2+、Fe3+、、Zn2 +、Co2+、Ni2+、Cd2+、Pb2+、Cr3+、Al3+、Ag+、Cu2+或Mn2+，在浓度与Hg2+浓度相同时，对Hg2+的测定无干扰。
5.如权利要求1所述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，其特征在于：所述的以探针为试剂，用目视比色法对pH、F-、AcO-、H2PO4 -和/或Hg2+离子的检测是；
用目视比色法对pH是；日光下，在体积比为95/5的二甲基亚砜/三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液中，在pH 2～10范围，探针溶液颜色随pH值增大由淡黄色、粉色、粉红色、紫红色、紫色到蓝色的变化过程；在体积比为95/5的二甲基亚砜/N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙磺酸(HEPES)-NaOH缓冲溶液中，在pH 10～13范围，探针溶液颜色随pH值增大由紫色、蓝紫色到蓝色的变化过程；
用目视比色法对F-的检测是；是日光下，在乙腈溶液中，F-的加入使探针溶液颜色明显变化，F-浓度在0～200μM范围，探针从橙黄色逐渐变化粉红色最后变化到紫蓝色，可目视检测浓度在0～200μM的F-；
用目视比色法对AcO-的检测是；日光下，在乙腈溶液中，AcO-的加入使探针溶液颜色明显变化，AcO-浓度在0～200μM范围，探针从橙黄色逐渐变化到暗红色，可目视检测浓度在0～200μM的AcO-；
用目视比色法对H2PO4 -的检测是；日光下，在乙腈溶液中，H2PO4 -的加入使探针溶液颜色明显变化，H2PO4 -浓度在0～200μM范围，探针从橙黄色逐渐变化到暗红色，可目视检测浓度在0～200μM的H2PO4 -；
用目视比色法对Hg2+离子的检测是；日光下，在体积比为95/5的乙腈/H2O 溶液中，Hg2+的加入使探针溶液颜色明显变化，Hg2+浓度在0～200μM范围，探针从橙黄色逐渐变化到玫红色，可目视检测浓度在0～200μM的Hg2+。
6.如权利要求1所述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，其特征在于：所述的以探针为试剂，用探针测试滤纸法对pH的检测是；日光下，负载有探针的二甲基亚砜溶液的测试滤纸条，对pH 2～12范围的缓冲溶液，测试滤纸条颜色从淡黄色、橙色、粉红色、桃红色至紫色的变化过程，可目视检测范围在2～12的pH。
7.如权利要求1-6中任一项所述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，其特征在于：所述的探针试剂是以三(2-氨乙基)胺、罗丹明B和2-羟基-5-[(4-硝基苯基)二氮烯基]苯甲醛为主要原料，以乙醇为溶剂，首先合成中间体，再由中间体和2-羟基-5-[(4-硝基苯基)二氮烯基]苯甲醛在二氯甲烷和甲醇溶剂中反应得到。
8.如权利要求1-6中任一项所述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，其特征在于：所述的探针试剂的合成路线为：
Figure FDA0002824572620000041
9.如权利要求1-6中任一项所述的三[2,2’-二[3-(4-硝基苯偶氮)-6-羟基]苯甲氨基乙基-2”-罗丹明甲酰氨基乙基]胺探针试剂的应用，其特征在于：所述的探针试剂是这样制备的：100ml的三口瓶中，加入三(2-氨乙基)胺27.36mmol、罗丹明B3.42mmol和60ml的无水乙醇，氮气保护下回流36小时，减压蒸去乙醇，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，经硅胶柱层析分离，得到中间体；反应时间：36h，反应溶剂：无水乙醇，洗脱剂：体积比为甲醇/三氯甲烷/三乙胺＝9/1/1的混合液；
10ml的三口烧瓶中加入中间体1mmol、2-羟基-5-[(4-硝基苯基)二氮烯基]苯甲醛2mmol和50ml二氯甲烷，氮气保护下常温反应12h，加入10ml的甲醇，分批加入硼氢化钠8.6mol，继续反应5h，减压蒸去溶剂，用三氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂得深红色的油状液体，硅胶柱层析分离和洗脱，得探针化合物，反应时间：17h，反应溶剂：二氯甲烷和甲醇，洗脱剂：体积比为二氯甲烷/甲醇/三乙胺＝100/2/1的混合液。
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