CN108721307B - Cdk2激酶抑制剂在制备乙型肝炎治疗药物中的应用 - Google Patents

Cdk2激酶抑制剂在制备乙型肝炎治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CDK2激酶抑制剂在乙型肝炎治疗药物中的应用。本发明在众多CDK激酶抑制剂中，发现CDK2激酶抑制剂能够显著抑制HBV复制，并且发现这种抑制作用依赖于宿主限制性因子SAMHD1；通过实验证明CDK2 inhibitorⅡ能够抑制HBV复制，且该化合物在肝细胞上毒性很小，半数毒性常数TC 50>50μM,在HBV复制转染模型，HBV稳定复制模型HepAD38和基于NTCP‑HepG2.0的HBV感染模型都能够显著抑制病毒复制，因此CDK2 inhibitorⅡ可用于制备治疗慢性乙肝感染的药物，具有广阔的应用前景。

Description

CDK2激酶抑制剂在制备乙型肝炎治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物研发领域，具体涉及一种CDK2激酶抑制剂在制备乙型肝炎治疗药物中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝DNA病毒，感染呈世界范围广泛流行，全球大约有250万左右的慢性乙肝患者。HBV感染分急性和慢性感染，其中慢性感染可引起慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)和原发性肝细胞癌(HCC)等相关疾病，由慢性HBV感染引起的HCC为全球第5位。目前我国仍有8000多万的HBV慢性感染者，而治疗慢性乙型肝炎的首要目标是持久抑制病毒复制。
目前治疗慢性乙型肝炎的抗病毒药物主要有两种：干扰素(IFN)和核苷/核苷酸类似物。干扰素治疗仅仅只有5－20％患者实现持续的病毒学应答，同时副作用较大；而核苷/核苷酸类似物药物(包括拉米夫定，阿德福韦酯，恩替卡韦和替诺福韦)由于HBV耐药突变株的出现，效果常常不能持久。因此从病毒--宿主角度出发，寻找新的抗病毒药物来治疗慢性乙肝患者显得尤为重要和迫切。
HBV的复制周期主要包括以下几个环节：(1)病毒颗粒的感染：在宿主因子钠离子/牛磺酸共转运多肽(Sodium taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP)的介导下，病毒颗粒进入肝细胞内，释放出松弛环状的DNA(Relaxed circular DNA,rc-DNA)，在核内转变成共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA,cccDNA)；(2)：病毒基因组的转录，复制：以cccDNA为模板，HBV转录生成4种不同长度(3.5kb，2.4kb，2.1kb和0.7kb)的mRNA，编码4种病毒蛋白(HBV聚合酶，包膜蛋白，核心蛋白core和X蛋白。其中3.5kb的前基因组RNA(Pregenomic RNA,pgRNA)结合HBV聚合酶和核心蛋白包装形成核衣壳(nucleocapsids)，在核衣壳内以pgRNA为模板，逆转录合成病毒基因组RC-DNA；(3)病毒颗粒的释放：成熟的病毒颗粒可以被病毒包膜蛋白分泌到胞外，也可以内循环到进入细胞核，转变成cccDNA。从病毒复制的周期看，乙肝病毒建立感染复制必然涉及与肝细胞及相关因子的相互作用，而在长期进化中，宿主形成了一系列具有抗病毒作用的限制性因子，可直接专一地捕获复制周期中的病毒，从而影响病毒的感染复制过程，同时病毒也通过多种方式逃逸这些限制性因子的作用，因此深入研究HBV和宿主限制性因子的相互作用无疑有助于抗病毒靶点的确定和药物的筛选。
SAMHD1(SAM domain and HD domain containing protein 1)是一种重要的宿主限制性因子，能够抑制多种病毒如HIV-1，HBV和HSV-1的复制，主要通过降解病毒复制需要的dNTP原料来有效抑制病毒的复制，发挥其抗病毒作用；但是最近报道SAMHD1蛋白被宿主激酶磷酸化后，丧失了其抗病毒作用，因此抑制SAMHD1的磷酸化有助于抑制病毒的感染和复制。然而，在HBV感染中，SAMHD1如何受宿主蛋白激酶的磷酸化调控尚不清楚。
真核生物细胞周期主要分成Gap 1(G1),合成期(S),Gap 2(G2)和有丝分裂M，其中细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1,CDK2和CDK6在细胞周期中表达相对稳定，其活性主要通过正向调节因子细胞周期蛋白cyclin和负向调节因子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白CKIs双向调节。其中CDK2激酶由298个氨基酸残基组成，能够催化底物蛋白丝氨酸/苏氨酸的磷酸化。在细胞周期中，CDK2是调控细胞周期中的重要因子，当CDK2与Cyclin E结合后，推动细胞进入G1末期，当CDK2与CyclinA结合后，促使细胞进入S期。报道认为CDK2的异常表达与肿瘤的形成发展过程中都起着重要的作用，因此CDK2可作为肿瘤治疗的靶点。
发明内容
本发明的目的是提供一种CDK2激酶抑制剂在乙型肝炎治疗药物中的应用。
所述CDK2激酶抑制剂为CDK2 inhibitorⅡ(Santa Cruz公司，CAS:222035-13-4)
所述应用为CDK2激酶抑制剂通过抑制乙肝病毒复制来起到治疗慢性乙型肝炎的作用。
所述应用为CDK2激酶抑制剂通过抑制SAMHD1磷酸化，从而抑制HBV复制来起到治疗乙型肝炎的作用。
本发明的有益效果是：申请人在众多CDK激酶抑制剂中，发现CDK2激酶抑制剂能够显著抑制HBV复制，并且发现这种抑制作用依赖于宿主限制性因子SAMHD1；通过实验证明CDK2 inhibitorⅡ能够抑制HBV复制，且该化合物在肝细胞上毒性很小，半数毒性常数TC50>50μM,在HBV复制转染模型，HBV稳定复制模型HepAD38和基于NTCP-HepG2.0的HBV感染模型都能够显著抑制病毒复制，因此CDK2 inhibitorⅡ可用于制备治疗慢性乙肝感染的药物，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为干扰细胞周期激酶CDKs对HBV复制和宿主限制性因子SMAHD1磷酸化的影响，其中，A：Huh7.0细胞中，siRNA CDK1、siRNA CDK2、siRNA CDK6干扰后Southernblot检测病毒DNA的变化；B：siRNA分别干扰CDK1,CDK2和CDK6后Huh7.0细胞周期的变化；C:荧光定量PCR检测siRNA干扰CDK1,CDK2和CDK6病毒DNA的变化；D：HBV稳定复制的细胞-HepAD38上Western Blotting检测siRNA干扰CDK1,CDK2或CDK6后SAMHD1磷酸化水平的变化；E：HepAD38上荧光定量PCR检测siRNA干扰CDK1,CDK2或CDK6后病毒DNA的变化
图2为HepAD38细胞上不同CDK激酶抑制剂对病毒复制的抑制和CDK2 inhibitorⅡ对SAMHD1磷酸化水平的作用。A:不同CDK激酶抑制剂对HBV复制的抑制作用；B:CDK2inhibitorⅡ对SAMHD1磷酸化的作用。
图3为Huh7.0细胞中CDK2 inhibitorⅡ对病毒复制的抑制和SAMHD1磷酸化水平的作用。
图4为在基于NTCP-HepG2.0的HBV感染模型上检测CDK2 inhibitorⅡ对病毒复制的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1鉴定和筛选参与调控限制性因子SAMHD1磷酸化的宿主蛋白激酶为了鉴定和筛选参与调控限制性因子SAMHD1磷酸化的宿主蛋白激酶，申请人通过siRNA特异性干扰细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK1，CDK2和CDK6)(干扰序列如实施例2中表2所示)的表达后，分析病毒复制水平的变化及SAMHD1磷酸化水平的变化(分析方法与实施例2中的分析方法相同)：结果表明(如图1所示)干扰CDK2激酶的表达后，明显可导致限制性因子SAMHD1磷酸化降低和HBV复制水平下降，表明CDK2激酶参与了限制性因子SAMHD1的磷酸化，可以把CDK2/SAMHD1可作为治疗HBV感染的靶点。
实施例2
申请人实施例1的研究基础上：发现CDK2激酶抑制剂可以通过抑制宿主限制性因子SAMHD1的磷酸化，从而抑制HBV复制而发挥抗病毒作用；在HBV复制转染模型和基于NTCP-HepG2.0感染模型上，从现有的CDK2激酶抑制剂中筛选出发挥抗病毒作用的小分子化合物。实验流程为：
(1)：首先在HBV稳定复制的细胞系HepAD38细胞中利用MTT法检测Selleck公司，Santa公司和Merckmillipore公司的CDK2激酶抑制剂对肝细胞的毒性；
(2)在共转染SAMHD1的HBV稳定复制的细胞系HepAD38细胞中，检测上述CDK2激酶抑制剂对病毒复制的抑制及宿主限制性因子SAMHD1磷酸化的作用；
(3)在基于NTCP-HepG2.0的HBV感染模型上，验证筛选出最佳的CDK2激酶抑制剂—CDK2 inhibitorⅡ的抗病毒作用。
实验具体使用的材料、方法、结果如下：
1材料和方法
1.1仪器:CO2培养箱(Thermo，美国)，小型高速离心机(Thermo，美国)，超速离心机(BECKMAN，美国)，酶标仪(BioTek，美国)，Real-Time System仪器(BIO-RAD，美国)。
1.2试剂耗材:肝癌细胞系HepAD38细胞，胎牛血清(BI公司)，DMEM培养基、丙酮酸钠及青链霉素(Hyclone公司)，胰酶(GIBCO公司)，Prime STAR高保真PCR酶,
Figure GDA0001776984700000061
3000Reagent转染试剂(Thermo，美国)，细胞增殖检测试剂盒(CellTiter96
Figure GDA0001776984700000062
Non-radioactive Cell Proliferation Assay)(Promega公司)，SYBR(Roche公司)，蛋白酶K(Roche公司)、微管酶(NEB公司)。所筛选的CDK激酶抑制剂见表1。
表1筛选的CDK激酶抑制剂
Figure GDA0001776984700000063
(细胞毒性定义为MTT法检测该化合物在5μM浓度细胞活力显著下降：下降25％为+，下降50％为++)
1.3方法：
1.3.1细胞培养
肝癌细胞Huh7、HepG2.2.15用含10％FBS,1％PS的DMEM细胞培养液进行培养，HepAD8用含10％FBS,1％PS,1μg/ml的四环素DMEM细胞培养液进行培养。
1.3.2MTT法检测各药物及化合物对细胞毒性的影响
96孔板中接种4.0×103个HepAD38细胞,加入不同浓度的化合物。培养72h后加入MTS/PML混合液,37℃孵箱放置2h后在490nm测定吸光度。
1.3.3小干扰RNA及转染
小干扰RNA(siRNAs)CDK1、CDK2、SAMHD1(上海吉玛基因公司合成)，干扰序列如表2所示。细胞均用50nM的siRNA进行干扰，转染试剂为Lipofectamine 3000(Invitrogen,美国)，按照说明书进行操作。
表2siRNA序列
siRNA靶基因 siRNA序列(5’-3’)
CDK1-343 GGAUGUGCUUAUGCAGGAU
CDK1-428 CCUGGUCAGUACAUGGAUU
CDK2-387 CCGAGAGAUCUCUCUGCUU
CDK2-870 CCAGCUCUUCCGGAUCUUU
CDK6-675 GACAGAGAAACCAAACUAA
CDK6-1038 GCAGAAAUGUUUCGUAGAA
SAMHD1 GCAGCCAACAGGACAAAUA
1.3.4磷酸化蛋白提取和WesternBlotting
肝癌细胞Huh7通过转染质粒，加CDK2激酶抑制剂处理细胞48小时后，使用磷酸化蛋白提取试剂盒提取蛋白，冰上裂解细胞30分钟。BCA法测定蛋白浓度，分装后，用12％的SDS-PAGE胶电泳分离样本，转膜至PVDF膜(罗氏)，用对应的一抗、二抗进行孵育，ECL发光显影，Image J软件进行定量分析。实验所用的一抗为：HBV core抗体(B0586，Dako，丹麦)、HA抗体(26183,Thermo,USA)、GAPDH(碧云天公司)、CDK1抗体(sc-130955，Santa Cruz，美国)、CDK2抗体(#2546,Cell Signaling，美国)、CDK6抗体(#13331,Cell Signaling，美国)、SAMHD1抗体(#12361,Cell Signaling，美国)和pSAMHD1抗体(#15038,Cell Signaling，美国)。
1.3.5病毒DNA提取及Southern blot检测
采用蔗糖密度梯度离心法提取病毒核心颗粒中HBV DNA:转染3天后,细胞用CPLB裂解液(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,1％NP-40,2％蔗糖)裂解后,10 000r/min离心5min,上清液用微管酶(Micrococcal Nuclease,M′Nase)37℃消化1h,然后在30％蔗糖密度介质中,45000r/min超速离心2h提取病毒颗粒,蛋白酶K消化过夜后用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀得到HBV DNA。通过Southern blot检测HBV DNA水平，提取的HBV DNA通过琼脂糖电泳后，转膜至nylon膜上，用地高辛标记的探针杂交后检测。采用荧光定量PCR检测HBV DNA：10ul体系，2×SYBR 5ul，HBV引物FP384(5’-TGCGGCGTTTTATCATATTCC-3’)，RP438(5’-ATACCTTGGTAGTCCAGAAGAACCA-3’)各0.25ul，RNAse free water 3ul，HBV DNA 1ul。采用实时荧光定量核酸扩增检测系统，检测HBV DNA的量。
2结果
2.1在Huh7.0中检测小分子化合物对细胞的毒性
利用MTT法，我们检测了现有的CDK激酶抑制剂对肝细胞HepAD38的毒性：其中RO-3306(CDK1抑制剂，CDK2 inhibitor Ⅱ，CDK2 inhibitor Ⅲ，Roscovitine，Palbociclib(HCL)在肝细胞HepAD38毒性相对较小，而其它化合物在5uM下对细胞具有较强的毒性(见表1)。
2.2在HepAD38细胞上检测上述小分子化合物对HBV复制的影响
通过MTT法，筛选出相对细胞毒性较小的小分子化合物：RO-3306(CDK1抑制剂，CDK2 inhibitorⅡ，CDK2 inhibitorⅢ，Roscovitine，Palbociclib(HCL)用于检测这些化合物对HBV复制的抑制效应，其中CDK2 inhibitorⅡ这种化合物细胞毒性很小，且在1uM浓度下能够抑制率为46％(图2)，因此重点检测CDK2 inhibitorⅡ在不同细胞模型上对HBV复制的抑制效应。
2.3 CDK2 inhibitorⅡ对SAMHD1磷酸化的抑制
不同浓度CDK2 inhibitorⅡ不同浓度处理后，SAMDH1磷酸化水平显著降低(图2B)，表明CDK2 inhibitorⅡ对HBV DNA抑制依赖于SAMHD1的磷酸化。
2.4 CDK2 inhibitorⅡ在不同细胞模型上对HBV复制的抑制
同样申请人检测了CDK2 inhibitorⅡ在HBV复制转染模型上对病毒的抑制及SAMHD1磷酸化影响，如图3，随着CDK2 inhibitorⅡ浓度的增加，病毒复制水平逐渐下降，同时SAMHD1磷酸化水平也逐渐降低；利用siRNA干扰降低SAMHD1的表达后，CDK2 inhibitorⅡ对病毒复制的抑制作用消失(图3)，说明CDK2 inhibitorⅡ对病毒复制的抑制作用依赖于SAMHD1。
同样，我们在基于NTCP-HepG2.0的HBV感染模型上检测了CDK2 inhibitorⅡ对病毒复制的影响，结果(如图4所示)表明随着CDK2 inhibitorⅡ浓度的增加，HBV复制的水平逐渐降低，CDK2 inhibitorⅡ浓度在5uM时，病毒DNA下降42％，表明在HBV感染模型中，CDK2inhibitorⅡ同样可以抑制病毒复制。

Claims (3)

1.CDK2激酶抑制剂在制备乙型肝炎治疗药物中的应用，所述CDK2激酶抑制剂为CDK2inhibitorⅡ。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为CDK2激酶抑制剂通过抑制乙肝病毒复制来起到治疗慢性乙型肝炎的作用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为CDK2激酶抑制剂通过抑制SAMHD1磷酸化，从而抑制HBV复制来起到治疗乙型肝炎的作用。
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