CN108719691A - 一种对虾抗应激复合添加剂及其应用 - Google Patents

一种对虾抗应激复合添加剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水产配合饲料添加剂及其应用，提供了一种对虾抗应激复合添加剂及其应用。同时本发明还提供了包含所述对虾抗应激复合添加剂的饲料。所述对虾抗应激复合添加剂，以质量分数计，它包括维生素C30％‑60％、维生素E10％‑40％、穿心莲内酯10％‑50％。该对虾抗应激复合添加剂主要由穿心莲内酯与能够提高对虾免疫的两种维生素组成，增强对虾抗应激能力和免疫防御能力，能抵抗环境突变对机体造成的损伤，提高对虾抗病能力，为对虾养殖健康可持续发展提供了保障。

Description

一种对虾抗应激复合添加剂及其应用
技术领域
本发明涉及水产配合饲料添加剂及其应用，尤其涉及一种对虾抗应激复合添加剂及其应用。
背景技术
近年来，水产养殖产业蓬勃发展，病害始终是制约对虾养殖业健康发展的中重要因素，目前我国对虾养殖业出现了白斑综合症(WSSV)、桃拉综合症(TSV)、早期死亡综合症(EMS)、急性肝胰腺坏死病(AHPNS)和肝肠胞虫病(EHP)等疾病，主要由环境变化和极端天气有关，如阴天下雨、浮游植物突然变化、台风、寒流等引起的盐度、pH、溶氧突变，对虾因环境应激生理代谢失调，免疫力下降，极易爆发病害，给对虾养产业造成了巨大经济损失，所以对虾对环境胁迫的生理适应尤为重要，因此开发对虾的抗应激调节剂是防止病害十分重要的技术手段，具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种药性稳定的对虾抗应激复合添加剂，主要由穿心莲内酯与能够提高对虾免疫的两种维生素组成，增强对虾抗应激能力和免疫防御能力，能抵抗环境突变对机体造成的损伤，提高对虾抗病能力，为对虾养殖健康可持续发展提供了保障。
为实现上述目的，本发明采取的具体技术方案为：一种对虾抗应激复合添加剂，以质量分数计，包括维生素C30％-60％、维生素E10％-40％、穿心莲内酯10％-50％。
进一步地，维生素C30％-60％、维生素E20％-40％、穿心莲内酯15％-50％。
进一步地，维生素C30％-60％、维生素E20％-40％、穿心莲内酯20％-45％。
作为本发明的一个实施例，维生素C:维生素E:穿心莲内酯的质量比为3:2:1。
作为本发明的另一个实施例，维生素C:维生素E:穿心莲内酯的质量比为3:2:4。
所述的穿心莲内酯为穿心莲的有效成分，其提取方法为将穿心莲均匀粉碎后与95％乙醇按照1:8～10的质量体积比混匀，煎煮1.5～2h，重复1次，回收乙醇，经石油醚洗除叶绿素等酯溶性杂质，水液用氯仿振摇，放置过夜，水和氯仿层之间析出物分离穿心莲有效成分，即所用的穿心莲内酯。
本发明的目的之二在于提供上述对虾抗应激复合添加剂的应用。具体地，涉及所述对虾抗应激复合添加剂作为饲料添加剂在对虾养殖中进行应用，提高对虾抗应激能力。
本发明的目的之三在于提供包含上述对虾抗应激复合添加剂的饲料。
具体地，所述饲料包括基础饲料和对虾抗应激复合添加剂，所述对虾抗应激复合添加剂的添加量为基础饲料总量的0.5-1‰。
所述的基础饲料包括以下质量分数的组分：鱼粉30-35％、豆粕15-25％、花生粕15-20％、小麦粉20-25％、大豆磷脂3-6％、复合维生素0.1-1％、复合矿物质1-2％。
本发明具有的有益效果：
(1)提高了凡纳滨对虾血细胞数量。在对虾非特异免疫系统中，血细胞扮演着重要的角色，既是细胞免疫的执行者又是体液免疫的提供者。试验中，在投喂对虾抗应激复合添加剂的21天内，试验组对虾血细胞数量均显著于对照组(P<0.05)，而对照组无显著差异，在28以后进行盐度胁迫，对照组与试验组均有血细胞数量下降，到35天恢复到盐度胁迫前的血细胞数量，胁迫过程中试验组血细胞数量均显著高于对照组(P<0.05)。
(2)提高了凡纳滨对虾血细胞吞噬活性。血细胞能通过吞噬作用包裹、破坏和消除外来物质，因此，血细胞吞噬活性可以用于衡量凡纳滨对虾抵抗外来入侵病原菌的能力。试验中，在投喂对虾抗应激复合添加剂的21天内，试验组对虾血细胞吞噬活性均显著高于对照组(P<0.05)，而对照组无显著差异，在28以后进行盐度胁迫，对照组与试验组均吞噬活性下降，到35天恢复到盐度胁迫前的血细胞吞噬活性，试验组血细胞吞噬活性均显著高于对照组(P<0.05)。
(3)提高了凡纳滨对虾抗菌活力。试验中，在投喂对虾抗应激复合添加剂的21天内，凡纳滨对虾血清抗菌活力有明显提高，各试验组与对照组之间差异显著(P<0.05)。在28以后进行盐度胁迫，对照组与试验组均抗菌活性下降，到35天恢复到盐度胁迫前的抗菌活力，试验组抗菌活力均显著高于对照组(P<0.05)。
(4)提高了凡纳滨对虾血清溶菌酶活力。溶菌酶能够破坏细菌细胞壁，因此被视为重要的体液免疫因子。试验中，在投喂对虾抗应激复合添加剂的21天内，凡纳滨对虾血清溶菌活力有明显提高，各试验组与对照组之间差异显著(P<0.05)。在28以后进行盐度胁迫，对照组与试验组均溶菌活性下降，到35天恢复到盐度胁迫前的溶菌活力，试验组溶菌酶活力均显著高于对照组(P<0.05)。
试验证明，本发明所提供的对虾抗应激复合添加剂能够明显增强对虾的抗应激能力，提高对虾免疫力；该添加剂选用维生素C、维生素E和穿心莲内酯三种物质进行科学配伍，定性定量地添加到基础饲料中，有利于维持药效的稳定性及标准化生产；本发明制备简单，成本较低，能够提高对虾养殖业的经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例1和2的对虾抗应激复合添加剂对凡纳滨对虾血细胞数量影响的结果图。
图2为本发明实施例1和2的对虾抗应激复合添加剂对凡纳滨对虾血细胞吞噬活性影响的结果图。
图3为本发明实施例1和2的对虾抗应激复合添加剂对凡纳滨对虾血浆抗菌活力影响的结果图。
图4为本发明实施例1和2的对虾抗应激复合添加剂对凡纳滨对虾血浆溶菌活力影响的结果图。
具体实施方式
实施例1
制备中草药活性成分：所述的穿心莲内酯为穿心莲的有效成分，其提取方法为将穿心莲均匀粉碎后与95％乙醇按照1:10的质量体积比混匀，煎煮2h，重复1次，回收乙醇，经石油醚洗除叶绿素等酯溶性杂质，水液用氯仿振摇，放置过夜，水和氯仿层之间析出物分离穿心莲有效成分，即所用的穿心莲内酯。中草药有效成分的含量可以按照现有文献所提供的方法进行测定。穿心莲内酯含量的测定方法参照：HPLC法测定穿心莲及其提取物中穿心莲内酯的含量，中国现代中药,2001年第3卷第08期。
维生素C、维生素E购于杭州爱力迈药业有限公司。将维生素E、维生素C、胆汁酸溶于水后均匀喷洒在基础饲料表面，再利用鱼油包裹饲料，晾干即得到含复合免疫生长增强剂的基础饲料。其中，每千克基础饲料添加维生素C0.3g、维生素E0.2g、穿心莲内酯0.1g。
实施例2
与实施例1不同的是，每千克基础饲料添加维生素C0.3g、维生素E0.2g、穿心莲内酯0.4g。
以下结合实验对本发明对凡纳滨对虾抗应激能力和免疫防御能力的作用进行阐述。
试验中，将实施例1和2制备的两种对虾抗应激复合添加剂饲喂凡纳滨对虾，对其非特异性免疫指标进行测定，旨在筛选出提高凡纳滨对虾非特异性免疫功能和病菌抵抗能力的对虾抗应激复合添加剂。
1.材料与方法
1.1材料
试验用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)购于青岛市崂山区沙子口对虾养殖厂，平均体重为7.25±0.31克，试验用基础饲料的成分为：以质量分数计，鱼粉34％、豆粕20％、花生粕16.4％、小麦粉22％、大豆磷脂5％、多种维生素0.6％、复合矿物质2％。经实验计算饲料中营养成分为：以质量分数计，粗蛋白42.4％、粗脂肪7.2％、灰分8.4％。
1.2方法
1.2.1试验设计
试验用凡纳滨对虾暂养7天后随机分成3组，分别为对照组、试验组1和试验组2，每组70尾，每组3平行，饲养于100L PVC桶中，24小时通气饲养。对照组投喂基础饲料，试验1投喂实施例1所制备的饲料，试验2组投喂实施例2所制备的饲料，日投喂量为体重5％，每天投喂2次。试验期间，水温25-27℃，盐度31，PH7.8-8.0。在养殖28天以后，进行低盐度胁迫，淡水将海水盐度下调到21，养殖实验共持续35天。
1.2.2测定指标和方法
在试验开始的第0、7、14、21、28、29、33、35天取血。使用消毒的5号针头和1mL注射器直接插入对虾头胸甲后缘围心腔内3mm左右进行采血，抽血前注射器内预先吸入了0.3mL改进的预冷凡纳滨对虾抗凝剂(0.34M NaCl，0.01M KCl，0.01M EDTA-Na2，0.01M HEPES，pH7.45，渗透压为780mOsm.kg-1)，最终使得抗凝剂和血淋巴的比例为1:1。一部分血淋巴样品进行血细胞数量及吞噬率的测定，剩余血淋巴样品于4℃下800×g离心10min后，取蓝色上清，即为血浆样品，于-80℃条件下保存。
血细胞数量的测定使用血球计数板在光学显微镜下进行计数；吞噬活性的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：《太平洋白对虾(凡纳滨对虾)在急性pH应激下的氧化应激，DNA损伤和抗氧化酶基因表达》(Oxidative stress,DNA damage and antioxidantenzyme gene expression in the Pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei whenexposedto acute pH stress.Comparative Biochemistry and Physiology Part C,2009,150(4):428-435.)；抗菌活力、溶菌活力的测定方法按照现有文献的方法操作，可以参照：《从刻克罗普斯蚕蛾免疫蛹的血淋巴中分离纯化三种可诱导杀菌蛋白及性质研究》(Insect immunity.Purification andproperties ofthree inducible bactericidalproteins from hemolymph ofimmunizedpupae ofHyalophora cecropia.EuropeanJournal of Biochemistry.1980,106(1),7-16.)；脂肪酶的测定方法可以参考：《虱目鱼消化脂肪酶的研究》(Studies on the digestive lipases ofmilkfish.Aquaculture,1990,89(3):315-325.)；蛋白酶的测定方法可以参考：《胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和组织蛋白酶与血红蛋白的测定》(The estimation ofpepsin,trypsin,papain,and cathepsinwith hemoglobin..The Journal of general physiology.vol.22,pp.79–89,1938.)。
2.结果
2.1血细胞数量
由图1可知：投喂含对虾抗应激复合添加剂的饲料21天后，凡纳滨对虾血细胞数量有明显增加，试验组1和2血细胞数量分别增加11.2％和16.1％，试验组和对照组差异显著(P<0.05)。在28天后进行盐度胁迫，对照组和实验组血细胞数目均有所下降，但实验组血细胞数量始终高于对照组差异显著(P<0.05)。
2.2血细胞吞噬活性
由图2可知：投喂含对虾抗应激复合添加剂的饲料7天后，凡纳滨对虾血细胞吞噬率开始显著高于对照组，但试验组1和试验组2差异不显著(P>0.05)，在28天后进行盐度胁迫，对照组和实验组血细胞吞噬活性均有所下降，实验组血细胞吞噬活性始终高于对照组差异显著(P<0.05)，试验组2和试验组1差异极显著(P<0.05)，说明高含量的穿心莲内酯在盐度胁迫的环境下能更快的提高血细胞吞噬活性。
2.3抗菌活力
由图3可知：投喂含对虾抗应激复合添加剂的饲料7天后，凡纳滨对虾血清抗菌活力有明显增加，并且在第21天试验组1和试验组2血清抗菌活力达到最高值，与对照组差异显著(P<0.05)。从第28天后，进行低盐度胁迫，对照组和试验组抗菌活力有所下降，试验组始终高于对照组差异显著(P<0.05)。到35天抗菌活力恢复到胁迫前，整个试验周期，试验组1和试验组2血清抗菌活力差异不显著。综合以上结果可得，饲料中添加维生素C、维生素E、穿心莲内酯能提高凡纳滨对虾血清抗菌活力，但穿心莲内酯含量的进一步提升不能继续增强对虾血清抗菌活力。
2.4溶菌活力
由图4可知：投喂含对虾抗应激复合添加剂的饲料7天后，凡纳滨对虾血清溶菌活力有明显增加，且在第14天达到最大值，与对照组相比，试验组1血清溶菌活力提高了53.84％，试验组2血清溶菌活力提高了55.32％，在28天以后，进行低盐度胁迫可以看出对照组和试验组溶菌活力有所下降，试验组始终高于对照组差异显著(P<0.05)试验组1和试验组2差异不显著(P＞0.05)，综合以上结果可得，饲料中添加维生素C、维生素E、穿心莲能提高凡纳滨对虾血清溶菌酶活力，但穿心莲内酯含量的进一步提升不能继续增强对虾血清溶菌活力。

Claims (8)

1.一种对虾抗应激复合添加剂，其特征是，以质量分数计，它包括维生素C30％-60％、维生素E10％-40％、穿心莲内酯10％-50％。
2.根据权利要求1所述的对虾抗应激复合添加剂，其特征是，维生素C30％-60％、维生素E20％-40％、穿心莲内酯15％-50％。
3.根据权利要求1所述的对虾抗应激复合添加剂，其特征是，维生素C30％-60％、维生素E20％-40％、穿心莲内酯20％-45％。
4.根据权利要求1所述的对虾抗应激复合添加剂，其特征是，维生素C:维生素E:穿心莲内酯的质量比为3:2:1。
5.根据权利要求1所述的对虾抗应激复合添加剂，其特征是，维生素C:维生素E:穿心莲内酯的质量比为3:2:4。
6.权利要求1-5任一项所述对虾抗应激复合添加剂作为饲料添加剂的应用。
7.包含权利要求1-5任一项所述对虾抗应激复合添加剂的饲料，其特征是，包括基础饲料和对虾抗应激复合添加剂，所述对虾抗应激复合添加剂的添加量为基础饲料总量的0.5-1‰。
8.根据权利要求7所述对虾抗应激复合添加剂的饲料，其特征是，所述的基础饲料包括以下质量分数的组分：鱼粉30-35％、豆粕15-25％、花生粕15-20％、小麦粉20-25％、大豆磷脂3-6％、复合维生素0.1-1％、复合矿物质1-2％。
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