CN108614064A - 一种二维色谱峰的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二维色谱峰的检测方法，该方法首先获取样品经过第一色谱仪后所分离得到的各组分在进入到第二色谱仪后所得到的第二维色谱图，以从中获取到各组分的各色谱峰。针对于获取到的各组分的各色谱峰，每次选择一个参比色谱峰，其中在选择一个参比色谱峰后，首先通过该参比色谱峰的位置以及预设的扫描宽度扫描到其他组分的各色谱峰，以获取到初始色谱峰簇；然后初始色谱峰簇依次进行色谱峰保留时间判定规则、双向色谱峰峰宽重叠判定方式、色谱峰簇中仅保存各组分的一个色谱峰原则、单峰性判定方法更新处理后最终得到二维色谱峰簇。本发明方法具有维色谱峰检测速度快并且检测简以及准确的优点。

Description

一种二维色谱峰的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于精密仪器分析领域，涉及一种色谱峰的检测方法，特别涉及一种二维色谱峰的检测方法及其应用。

背景技术

一维色谱主要包括一维液相色谱和一维气相色谱，随着科学研究的不断发展，一维色谱已被广泛应用于蛋白质、肽、多酚、芳香物质、油脂等各类物质的分析和检测，然而随着对复杂样品分离分析需求的增长，仅通过一维色谱的分离常难以获得满意的分离效果，二维色谱由此应运而生。目前国内外已发展和报道了多种二维液相色谱和二维气相色谱，将其用于复杂样品的分析获得了极高的分辨率和峰容量。

为了进一步完善二维色谱的检测和分析技术，国外学者目前发展了多种峰检测技术，其中主要有Bayesian两步检测法和Watershed图像法。Bayesian两步检测法主要以一维峰检测为第一步，借助于较为完善的一维峰检测技术，可获得较为准确的基础信息，再以此为基础，使用Bayesian定理对各种色谱峰组合形成峰簇的可能性进行计算，取其最大可能性的峰簇为处理结果，并以此为重复单元，直至所有一维色谱峰全部成功判定形成二维峰簇。Watershed图像法则借鉴原有的图像检测方法，对二维色谱分离结果中的峰顶点(图像中的凸出点)进行检测，再以每一个最高点为重复处理单元，向四周进行数据点对比，将响应值较上一点低的全部划入该二维色谱峰簇。目前这两种峰检测方法已被广泛应用于二维色谱峰的检测，但这两种也存在其缺点，Bayesian两步检测法因其需要对各种可能的组合进行概率计算和对比，因而需要一个对比库，且进行概率计算会增加较多的计算量，加大计算机程序处理负担。Watershed图像法虽然借鉴前期图像法，处理技术较为成熟，但实际上这种方法的准确性较低，因为二维色谱的实际数据密度远远低于图像中所获取的数据密度，在二维色谱分析中，理论上每一个一维色谱峰的切割次数为3～4，但实际操作时，为了减少第二维色谱分析的循环次数和二维分析时间，每个一维色谱峰的切割次数常小于3，尤其在使用补集柱替代样品环的二维色谱分析中，其切割次数甚至小于1，此时使用图像法检测其二维峰簇出现误判的几率极高。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种简单、快速以及准确的二维色谱峰的检测方法。

本发明的第二目的在于提供一种二维色谱峰的检测方法的应用。

本发明的第一目的通过下述技术方案实现：一种二维色谱峰的检测方法，步骤如下：

步骤S1、获取样品经过第一色谱仪后所分离得到的各组分在进入到第二色谱仪后所得到的第二维色谱；针对于上述获取到的各组分的第二维色谱，分别从中获取到每一组分的各色谱峰，并且获取到各色谱峰的保留时间、起始和结束时间以及各色谱峰的宽度；

步骤S2、选择上述其中一个组分第二维色谱中的一个色谱峰，以该色谱峰作为检测起点，并且将该色谱峰作为参比色谱峰；进入步骤S3；

步骤S3、根据参比色谱峰的位置以及预设的扫描宽度扫描到其他组分的各色谱峰，然后将参比色谱峰和上述扫描到的各组分的各色谱峰存储为初始色谱峰簇；

步骤S4、针对于初始色谱峰簇中存储的每一组分的各色谱峰，首先计算该组分的各色谱峰相对于参比色谱峰的保留时间偏移率，然后将相对于参比色谱峰的保留时间偏移率大于偏移率阈值的该组分的色谱峰进行丢弃，其中若初始色谱峰簇中存储的该组分的各色谱峰相对于参比色谱峰的保留时间偏移率均大于偏移率阈值，则将初始色谱峰簇中存储的该组分的各色谱峰以及该组分后续组分的各色谱峰全部予以丢弃，从而得到更新后的第二色谱峰簇；

步骤S5、针对于第二色谱峰簇中存储的各组分对应的各色谱峰，从参比色谱峰开始，分别计算该色谱峰与下一色谱峰的重叠率，然后判断该色谱峰与下一色谱峰的重叠率是否小于重叠率阈值，若是，则将该色谱峰进行丢弃，其中若第二色谱峰簇中存储的某组分的各色谱峰均满足与下一色谱峰的重叠率小于重叠率阈值，则将第二色谱峰簇中存储的该组分的各色谱峰以及该组分后续组分的各色谱峰全部予以丢弃，从而得到更新后的第三色谱峰簇；

步骤S6、检测第三色谱峰簇中每一组分的色谱峰个数，若第三色谱峰簇中存储的该组分的色谱峰个数大于1，则根据最近原则，保留该组分距离参比色谱峰最近的一个色谱峰，其他比色谱峰均丢弃，得到第四色谱峰簇；

步骤S7、检测第四色谱峰簇中总共存储的各组分的色谱峰是否超过2个；

若否，则直接保留这2个色谱峰，直接将第四色谱峰簇作为更新后的第五色谱峰簇；

若是，则针对于第四色谱峰簇中存储的每一组分的色谱峰，获取该组分的色谱峰的峰值，并且获取到样品得到该组分时在第一色谱仪中的洗脱时间，然后根据上述获取到的各组分的色谱峰的峰值以及各组分的洗脱时间得到组分的色谱峰的峰值和组分洗脱时间之间的关系曲线，通过关系曲线判断第四色谱峰簇存储的各组分的色谱峰的峰值是否呈单调分布或单峰分布，若是单调分布或单峰分布，则直接将第四色谱峰簇作为更新后的第五色谱峰簇；若即不是单调分布，也不是单峰分布，则从中寻找到第一个单峰的结束点，将第一个单峰外的其他峰值对应的色谱峰从第四色谱峰簇中丢弃，得到更新后的第五色谱峰簇；

步骤S8、将第五色谱峰簇存储为一个已识别的二维色谱峰簇；

步骤S9、选择步骤S1中得到其中一组分的色谱峰，该色谱峰为未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰，然后以该色谱峰作为下一个参比色谱峰，重复执行步骤S3至步骤S9，直到步骤S1中得到各组分的各色谱峰均存储在各二维色谱峰簇中。

优选的，所述步骤S2中，选择样品经过第一色谱仪后所分离得到的第一个组分第二维色谱中的第一个色谱峰或最后一个色谱峰为参比色谱峰；或者选择样品经过第一色谱仪后所分离得到的最后一个组分第二维色谱中的第一个色谱峰或最后一个色谱峰为参比色谱峰；

所述步骤S9中，根据当前参比色谱峰选择下一个参比色谱峰，具体过程如下：寻找与当前参比色谱峰属于同一组分、距离当前参比色谱峰最近并且未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰作为下一个参比色谱峰；若与当前参比色谱峰属于同一组分的所有色谱峰均已存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中，则针对于当前参比色谱峰所属组分的后面的各组分，依次检测各组分的色谱峰，直到寻找到某组分中与参比色谱峰距离最近且未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰，则将该色谱峰作为下一个参比色谱峰。

优选的，所述步骤S3中根据参比色谱峰的位置以及预设的扫描宽度扫描到其他组分的各色谱峰的具体过程如下：从参比色谱峰开始，沿着从参比色谱峰到检测起点到的相反方向以预设的扫描宽度进行扫描，得到预设的扫描宽度范围内的其他组分的各色谱峰。

优选的，所述步骤S4中，针对于初始色谱峰簇中存储的每一组分的各色谱峰，计算该组分的各色谱峰相对于参比色谱峰的保留时间偏移率d为：

其中t′为该组分的色谱峰的保留时间，t为参比色谱峰的保留时间。

优选的，所述步骤S4中偏移率阈值为0～0.04％。

优选的，所述步骤S5中，针对于第二色谱峰簇中存储的各组分对应的各色谱峰，从参比色谱峰开始，计算该色谱峰与下一色谱峰的重叠率，具体为：首先获取该色谱峰与下一色谱峰重叠部分的峰宽，将该峰宽作为分子；同时比较该色谱峰的峰宽和下一色谱峰的峰宽，选择小的峰宽作为分母；然后将上述分子和分母的比值作为该色谱峰与下一色谱峰的重叠率。

优选的，所述步骤S5中重叠率阈值为20～100％。

优选的，所述步骤S7中，当通过关系曲线判断第四色谱峰簇存储的各组分的色谱峰即不是单调分布，也不是单峰分布时，得到第一个单峰结束时间点的具体过程如下：

使用插值函数在关系曲线中各色谱峰的峰值点之间插入1个或多个数值，然后对上述插值处理后得到的数据进行求导，寻找其导数由负数向正数的变化点，将该变化点作为第一个单峰结束时间点，将该变化点之后出现的其他峰值对应的色谱峰从第四色谱峰簇中丢弃；其中若不存在这样的变化点，则第四色谱峰簇中存储的所有组分的色谱峰均保留，即将第四色谱峰簇直接作为更新后的第五色谱峰簇。

优选的，所述步骤S8中将第五色谱峰簇存储为一个已识别的二维色谱峰簇后，针对第五色谱峰簇存储的各组分的各色谱峰进行标注；所述步骤S9中，获取未被标注的组分的色谱峰即可得到未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰。

本发明的第二目的通过下述技术方案实现：一种二维色谱峰的检测方法的应用，其特征在于，通过上述所述的二维色谱峰的检测方法获取到二维色谱峰后，计算二维色谱峰面积，将二维色谱峰在两个色谱分离维度上的保留时间和计算得到二维色谱峰面积应用于多维色谱定性和定量分析中。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明一种二维色谱峰的检测方法，该方法首先获取样品经过第一色谱仪后所分离得到的各组分在进入到第二色谱仪后所得到的第二维色谱图，以从中获取到各组分的各色谱峰。针对于获取到的各组分的各色谱峰，每次选择一个参比色谱峰，其中在选择一个参比色谱峰后，首先通过该参比色谱峰的位置以及预设的扫描宽度扫描到其他组分的各色谱峰，以获取到初始色谱峰簇；然后对初始色谱峰簇进行多次更新处理后最终得到二维色谱峰簇。其中本发明方法在获取到二维色谱峰簇过程中，通过色谱峰保留时间判定规则对色谱峰簇进行分类处理，可以大大提高了方法的可接受度，同时大大简化了二维色谱峰的检测过程；另外，本发明方法在获取到二维色谱峰簇过程中采用双向色谱峰峰宽重叠判定方式对色谱峰簇进行更新处理，大大减少了单向计算时所产生的误判，进一步提高了二维色谱峰检测的准确度，同时减少了二维色谱峰检测结果因数据读取方向不同而造成的差异；再者，本发明方法在获取到二维色谱峰簇过程中采用一种具体可行的单峰性判定方法对色谱峰簇进行更新处理，能够大大提高了方法的实用性和适用范围。

(2)本发明二维色谱峰的检测方法中，根据参比色谱峰的位置，通过预设的扫描宽度扫描到其他组分的各色谱峰，从而得到初始色谱峰簇；本发明方法中通过预设的扫描的宽度，能够限制二维色谱峰检测过程中的最大扫描宽度，从而大大提高了在第一色谱仪得到的一维色谱峰切割次数较少时二维色谱峰检测的准确性。

(3)本发明二维色谱峰检测方法所检测到的二维色谱峰，将二维色谱峰在两个色谱分离维度上的保留时间和计算得到二维色谱峰面积应用于多维色谱定性和定量分析中。

附图说明

图1是本发明方法流程图。

图2是本发明实施例1中混合标准品的二维色谱峰检测结果。

图3是本发明实施例1中混合标准品的二维色谱峰局部放大图。

图4是本发明实施例2中混合标准品的二维色谱峰检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

本实施例公开了一种二维色谱峰的检测方法，如图1所示，步骤如下：

步骤S1、获取样品经过第一色谱仪后所分离得到的各组分在进入到第二色谱仪后所得到的第二维色谱；针对于上述获取到的各组分的第二维色谱，分别从中获取到每一组分的各色谱峰，并且获取到各色谱峰的保留时间、起始和结束时间以及各色谱峰的宽度；

步骤S2、选择上述其中一个组分第二维色谱中的一个色谱峰，以该色谱峰作为检测起点，并且将该色谱峰作为参比色谱峰；进入步骤S3；

在本步骤中，选择样品经过第一色谱仪后所分离得到的第一个组分第二维色谱中的第一个色谱峰或最后一个色谱峰为参比色谱峰；或者选择样品经过第一色谱仪后所分离得到的最后一个组分第二维色谱中的第一个色谱峰或最后一个色谱峰为参比色谱峰。

步骤S3、根据参比色谱峰的位置以及预设的扫描宽度扫描到其他组分的各色谱峰，然后将参比色谱峰和上述扫描到的各组分的各色谱峰存储为初始色谱峰簇；

在本步骤中根据参比色谱峰的位置以及预设的扫描宽度扫描到其他组分的各色谱峰的具体过程如下：从参比色谱峰开始，沿着从参比色谱峰到检测起点到的相反方向以预设的扫描宽度进行扫描，得到预设的扫描宽度范围内的其他组分的各色谱峰。

步骤S4、针对于初始色谱峰簇中存储的每一组分的各色谱峰，首先逐个计算该组分的各色谱峰相对于参比色谱峰的保留时间偏移率，然后将相对于参比色谱峰的保留时间偏移率大于偏移率阈值的该组分的色谱峰进行丢弃，其中若初始色谱峰簇中存储的该组分的各色谱峰相对于参比色谱峰的保留时间偏移率均大于偏移率阈值，则将初始色谱峰簇中存储的该组分的各色谱峰以及该组分后续组分的各色谱峰全部予以丢弃，从而得到更新后的第二色谱峰簇；

本步骤中，针对于初始色谱峰簇中存储的每一组分的各色谱峰，计算该组分的各色谱峰相对于参比色谱峰的保留时间偏移率d为：

其中t′为该组分的色谱峰的保留时间，t为参比色谱峰的保留时间。

在本实施例中，上述偏移率阈值可以为0～0.04％。

步骤S5、针对于第二色谱峰簇中存储的各组分对应的各色谱峰，从参比色谱峰开始，分别计算该色谱峰与下一色谱峰的重叠率，然后判断该色谱峰与下一色谱峰的重叠率是否小于重叠率阈值，若是，则将该色谱峰进行丢弃，其中若第二色谱峰簇中存储的某组分的各色谱峰均满足与下一色谱峰的重叠率小于重叠率阈值，则将第二色谱峰簇中存储的该组分的各色谱峰以及该组分后续组分的各色谱峰全部予以丢弃，从而得到更新后的第三色谱峰簇；

本步骤中，上述针对于第二色谱峰簇中存储的各组分对应的各色谱峰，从参比色谱峰开始，计算该色谱峰与下一色谱峰的重叠率，具体为：首先获取该色谱峰与下一色谱峰重叠部分的峰宽，将该峰宽作为分子；同时比较该色谱峰的峰宽和下一色谱峰的峰宽，选择小的峰宽作为分母；然后将上述分子和分母的比值作为该色谱峰与下一色谱峰的重叠率。在本实施例中重叠率阈值为20％～100％。

步骤S6、检测第三色谱峰簇中每一组分的色谱峰个数，若第三色谱峰簇中存储的该组分的色谱峰个数大于1，则根据最近原则，保留该组分距离参比色谱峰最近的一个色谱峰，其他比色谱峰均丢弃，得到第四色谱峰簇；

步骤S7、检查第四色谱峰簇中总共存储的各组分的色谱峰是否超过2个；

若否，则直接保留这2个色谱峰，直接将第四色谱峰簇作为更新后的第五色谱峰簇；

若是，则针对于第四色谱峰簇中存储的每一组分的色谱峰，获取该组分的色谱峰的峰值，并且获取到样品得到该组分时在第一色谱仪中的洗脱时间，然后以上述获取到的各组分的色谱峰的峰值为纵坐标，以上述获取到的各组分的洗脱时间为横坐标进行作图，图中某点的横坐标即为某组分的洗脱时间，纵坐标即为某组分的色谱峰的峰值，将坐标中的各点连接后得到组分的色谱峰的峰值和组分洗脱时间之间的关系曲线，通过关系曲线判断第四色谱峰簇存储的各组分的色谱峰的峰值是否呈单调分布或单峰分布，若是单调分布或单峰分布，则直接将第四色谱峰簇作为更新后的第五色谱峰簇；若即不是单调分布，也不是单峰分布，则从中寻找到第一个单峰的结束点，将第一个单峰外的其他峰值对应的色谱峰从第四色谱峰簇中丢弃，得到更新后的第五色谱峰簇；

其中，在本步骤中，当通过关系曲线判断第四色谱峰簇存储的各组分的色谱峰即不是单调分布，也不是单峰分布时，得到第一个单峰结束时间点的具体过程如下：使用插值函数在关系曲线中各色谱峰的峰值点之间插入1个或多个数值，然后对上述插值处理后得到的数据进行求导，寻找其导数由负数向正数的变化点，将该变化点作为第一个单峰结束时间点，将该变化点之后出现的其他峰值对应的色谱峰从第四色谱峰簇中丢弃；其中若不存在这样的变化点，则第四色谱峰簇中存储的所有组分的色谱峰均保留，即将第四色谱峰簇直接作为更新后的第五色谱峰簇。在本实施例中，上述所使用的插值函数可以为线性插值、球面插值和多项式插值(如spline、cubic函数差值等)中的任意一种。

步骤S8、将第五色谱峰簇存储为一个已识别的二维色谱峰簇；在本步骤中，将第五色谱峰簇存储为一个已识别的二维色谱峰簇后，针对第五色谱峰簇存储的各组分的各色谱峰进行标注；

步骤S9、选择步骤S1中得到其中一组分的色谱峰，该色谱峰为未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰，在本步骤中获取未被标注的组分的色谱峰即可得到未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰。然后以该色谱峰作为下一个参比色谱峰，重复执行步骤S3至步骤S9，直到步骤S1中得到各组分的各色谱峰均存储在各二维色谱峰簇中。

其中本步骤中，根据当前参比色谱峰选择下一个参比色谱峰，具体过程如下：寻找与当前参比色谱峰属于同一组分、距离当前参比色谱峰最近并且未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰作为下一个参比色谱峰；若与当前参比色谱峰属于同一组分的所有色谱峰均已存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中，则针对于当前参比色谱峰所属组分的后面的各组分，依次检测各组分的色谱峰，直到寻找到某组分中与参比色谱峰距离最近且未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰，则将该色谱峰作为下一个参比色谱峰。

本实施例还公开了一种二维色谱峰的检测方法的应用，通过上述二维色谱峰的检测方法获取到二维色谱峰后，计算二维色谱峰面积，将二维色谱峰在两个色谱分离维度上的保留时间和计算得到二维色谱峰面积应用于多维色谱定性和定量分析中。其中上述二维色谱峰在两个色谱分离维度上的保留时间分别是指该二维色谱峰在第一色谱仪得到的第一维色谱上的保留时间以及在第二色谱仪得到的第二维色谱上的保留时间。

在本实施例中，上述方法所要使用到的装置如下，该装置包括第一色谱仪和第二色谱仪，其中第一色谱仪和第二色谱仪之间由阀切换装置连接，其中样品先经过第一色谱仪中的色谱柱分离后，通过阀切换装置将分离得到的各组分转移到第二色谱仪中的色谱柱进行二次分离，本实施例上述步骤S1中获取的各组分的第二维色谱即为各组分在第二色谱仪中二次分离时得到的色谱，各组分的第二维色谱图中提取的各色谱峰即为步骤S1中各组分的各色谱峰。

实施例1

在本实施例中，对上述步骤S1的样品进行分离的第一色谱仪和第二色谱仪由DIONEX ultimate双三元液相色谱实现，其中第一色谱仪和第二色谱仪中采用的分离方法为停流型二维液相色谱(凝胶色谱(SEC)/反相液相色谱(RPLC))；其中第一色谱仪中采用凝胶色谱(SEC)分离方法，第二色谱仪中采用反相液相色谱(RPLC)分离方法。第一色谱仪中凝胶色谱分离方法的洗脱条件为等度洗脱(流速0.3mL/min，乙腈：水：三氟乙酸＝90:10:0.1)，第二色谱仪中反相液相色谱分离方法的洗脱条件使用1.2mL/min的流速进行梯度洗脱，洗脱溶剂由分别含0.1％三氟乙酸的乙腈和水组成，梯度分析条件为：0～2min(88％乙腈)，2～5min(88％-65％乙腈)，5～6min(65％-88％乙腈)，6～9min(88％乙腈)。

在本实施例中设置上述步骤S2在扫描宽度为4，设置上述步骤S4中偏移率阈值为0.02％，设置上述步骤S5中重叠率阈值为80％，上述步骤S7中使用插值函数在关系曲线中各色谱峰的峰值点之间插入2个数值，设置第一色谱仪中组分的切割时间为0.5min，即每次从第一色谱仪流出组分中获取0.5min时长对应的组分转移至第二色谱仪进行分析，直至所有组分全部分析完成。同时设置检测波长为214nm，采集频率25HZ，进样体积为30μL。则当样品的组分为如下时：His-Gly(4mg/mL)、Gly-Gly-Tyr-Arg(1mg/mL)、Tyr-Ala(2mg/mL)、Pro-Tyr(2mg/mL)、Trp-Ser-Arg-Glu-Glu-Gln(2mg/mL)、Trp-Ser-Arg-Glu-Glu-Gln-Gln-Glu(2mg/mL)、Trp-Ser-Arg-Glu-Glu-Gln-Glu-Arg-Glu-Glu(2mg/mL)、Leu-Tyr(2mg/mL)、Ala-Asp-Ile-Tyr-Thr-Glu-Glu-Ala-Gly-Arg(2mg/mL)、YL(2mg/mL)、Ala-Leu-Pro-Glu-Glu-Val(2mg/mL)、Ala-Asp-Ile-Tyr-Glu(2mg/mL)、Tyr-Val(4mg/mL)、Glu-Ala-Gly-Ile-Gln(2mg/mL))，通过上述步骤S1至S9后得到的二维色谱峰检测结果如图2中所示，图3为图2中3.9～4.1min(RPLC保留时间)的部分样品局部旋转放大图。

实施例2

在本实施例中，与实施例中的区别主要在于，其中第一色谱仪和第二色谱仪中采用的分离方法为停流型二维液相色谱(反相液相色谱(RPLC)/凝胶色谱(SEC))；其中第一色谱仪中采用反相液相色谱(RPLC)分离方法，第二色谱仪中采用凝胶色谱(SEC)分离方法，并且设置上述步骤S2在扫描宽度为2，设置上述步骤S4中偏移率阈值为0.03％，设置上述步骤S5中重叠率阈值为70％，上述步骤S7中使用插值函数在关系曲线中各色谱峰的峰值点之间插入4个数值，设置第一色谱仪中组分的切割时间为1.05min，即每次从第一色谱仪流出组分中获取1.05min时长对应的组分转移至第二色谱仪进行分析，直至所有组分全部分析完成。则当样品的组分为如下时：His-Gly(4mg/mL)、Gly-Gly-Tyr-Arg(1mg/mL)、Tyr-Ala(2mg/mL)、Pro-Tyr(2mg/mL)、Trp-Ser-Arg-Glu-Glu-Gln(2mg/mL)、Trp-Ser-Arg-Glu-Glu-Gln-Gln-Glu(2mg/mL)、Trp-Ser-Arg-Glu-Glu-Gln-Glu-Arg-Glu-Glu(2mg/mL)、Leu-Tyr(2mg/mL)、Ala-Asp-Ile-Tyr-Thr-Glu-Glu-Ala-Gly-Arg(2mg/mL)、YL(2mg/mL)、Ala-Leu-Pro-Glu-Glu-Val(2mg/mL)，通过步骤S1到步骤S9得到的二维色谱峰检测结果如图4中所示。

上述实施例1和2得到的图2至图4中，每一个小圆圈表示该处色谱峰的峰值点，圆圈之间的连线表示本实施例方法检测其属于同一二维色谱峰簇。由图2可知，本实施例方法可极为准确地检测实施例1样品中14种组分的主峰，此外，本实施例检测方法亦可检测到标准品中的部分杂峰。图3显示了本实施例中单峰性判定的重要性，可将两个二维色谱峰根据单峰性原则进行准确地区分。图4中通过设定扫描宽度范围为3，可准确地检测样品中的10种组成。通过实施例1和实施例2的检测结果，可以充分说明了本实施例上述方法在二维色谱峰检测中的广阔应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种二维色谱峰的检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤S1、获取样品经过第一色谱仪后所分离得到的各组分在进入到第二色谱仪后所得到的第二维色谱；针对于上述获取到的各组分的第二维色谱，分别从中获取到每一组分的各色谱峰，并且获取到各色谱峰的保留时间、起始和结束时间以及各色谱峰的宽度；

步骤S2、选择上述其中一个组分第二维色谱中的一个色谱峰，以该色谱峰作为检测起点，并且将该色谱峰作为参比色谱峰；进入步骤S3；

步骤S3、根据参比色谱峰的位置以及预设的扫描宽度扫描到其他组分的各色谱峰，然后将参比色谱峰和上述扫描到的各组分的各色谱峰存储为初始色谱峰簇；

步骤S4、针对于初始色谱峰簇中存储的每一组分的各色谱峰，首先计算该组分的各色谱峰相对于参比色谱峰的保留时间偏移率，然后将相对于参比色谱峰的保留时间偏移率大于偏移率阈值的该组分的色谱峰进行丢弃，其中若初始色谱峰簇中存储的该组分的各色谱峰相对于参比色谱峰的保留时间偏移率均大于偏移率阈值，则将初始色谱峰簇中存储的该组分的各色谱峰以及该组分后续组分的各色谱峰全部予以丢弃，从而得到更新后的第二色谱峰簇；

步骤S5、针对于第二色谱峰簇中存储的各组分对应的各色谱峰，从参比色谱峰开始，分别计算该色谱峰与下一色谱峰的重叠率，然后判断该色谱峰与下一色谱峰的重叠率是否小于重叠率阈值，若是，则将该色谱峰进行丢弃，其中若第二色谱峰簇中存储的某组分的各色谱峰均满足与下一色谱峰的重叠率小于重叠率阈值，则将第二色谱峰簇中存储的该组分的各色谱峰以及该组分后续组分的各色谱峰全部予以丢弃，从而得到更新后的第三色谱峰簇；

步骤S6、检测第三色谱峰簇中每一组分的色谱峰个数，若第三色谱峰簇中存储的该组分的色谱峰个数大于1，则根据最近原则，保留该组分距离参比色谱峰最近的一个色谱峰，其他比色谱峰均丢弃，得到第四色谱峰簇；

步骤S7、检测第四色谱峰簇中总共存储的各组分的色谱峰是否超过2个；

若否，则直接保留这2个色谱峰，直接将第四色谱峰簇作为更新后的第五色谱峰簇；

若是，则针对于第四色谱峰簇中存储的每一组分的色谱峰，获取该组分的色谱峰的峰值，并且获取到样品得到该组分时在第一色谱仪中的洗脱时间，然后根据上述获取到的各组分的色谱峰的峰值以及各组分的洗脱时间得到组分的色谱峰的峰值和组分洗脱时间之间的关系曲线，通过关系曲线判断第四色谱峰簇存储的各组分的色谱峰的峰值是否呈单调分布或单峰分布，若是单调分布或单峰分布，则直接将第四色谱峰簇作为更新后的第五色谱峰簇；若即不是单调分布，也不是单峰分布，则从中寻找到第一个单峰的结束点，将第一个单峰外的其他峰值对应的色谱峰从第四色谱峰簇中丢弃，得到更新后的第五色谱峰簇；

步骤S8、将第五色谱峰簇存储为一个已识别的二维色谱峰簇；

步骤S9、选择步骤S1中得到其中一组分的色谱峰，该色谱峰为未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰，然后以该色谱峰作为下一个参比色谱峰，重复执行步骤S3至步骤S9，直到步骤S1中得到各组分的各色谱峰均存储在各二维色谱峰簇中。

2.根据权利要求1所述的二维色谱峰的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，选择样品经过第一色谱仪后所分离得到的第一个组分第二维色谱中的第一个色谱峰或最后一个色谱峰为参比色谱峰；或者选择样品经过第一色谱仪后所分离得到的最后一个组分第二维色谱中的第一个色谱峰或最后一个色谱峰为参比色谱峰；

所述步骤S9中，根据当前参比色谱峰选择下一个参比色谱峰，具体过程如下：寻找与当前参比色谱峰属于同一组分、距离当前参比色谱峰最近并且未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰作为下一个参比色谱峰；若与当前参比色谱峰属于同一组分的所有色谱峰均已存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中，则针对于当前参比色谱峰所属组分的后面的各组分，依次检测各组分的色谱峰，直到寻找到某组分中与参比色谱峰距离最近且未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰，则将该色谱峰作为下一个参比色谱峰。

3.根据权利要求1所述的二维色谱峰的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中根据参比色谱峰的位置以及预设的扫描宽度扫描到其他组分的各色谱峰的具体过程如下：从参比色谱峰开始，沿着从参比色谱峰到检测起点到的相反方向以预设的扫描宽度进行扫描，得到预设的扫描宽度范围内的其他组分的各色谱峰。

4.根据权利要求1所述的二维色谱峰的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，针对于初始色谱峰簇中存储的每一组分的各色谱峰，计算该组分的各色谱峰相对于参比色谱峰的保留时间偏移率d为：

其中t′为该组分的色谱峰的保留时间，t为参比色谱峰的保留时间。

5.根据权利要求1所述的二维色谱峰的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中偏移率阈值为0～0.04％。

6.根据权利要求1所述的二维色谱峰的检测方法，其特征在于，所述步骤S5中，针对于第二色谱峰簇中存储的各组分对应的各色谱峰，从参比色谱峰开始，计算该色谱峰与下一色谱峰的重叠率，具体为：首先获取该色谱峰与下一色谱峰重叠部分的峰宽，将该峰宽作为分子；同时比较该色谱峰的峰宽和下一色谱峰的峰宽，选择小的峰宽作为分母；然后将上述分子和分母的比值作为该色谱峰与下一色谱峰的重叠率。

7.根据权利要求1所述的二维色谱峰的检测方法，其特征在于，所述步骤S5中重叠率阈值为20～100％。

8.根据权利要求1所述的二维色谱峰的检测方法，其特征在于，所述步骤S7中，当通过关系曲线判断第四色谱峰簇存储的各组分的色谱峰即不是单调分布，也不是单峰分布时，得到第一个单峰结束时间点的具体过程如下：

使用插值函数在关系曲线中各色谱峰的峰值点之间插入1个或多个数值，然后对上述插值处理后得到的数据进行求导，寻找其导数由负数向正数的变化点，将该变化点作为第一个单峰结束时间点，将该变化点之后出现的其他峰值对应的色谱峰从第四色谱峰簇中丢弃；其中若不存在这样的变化点，则第四色谱峰簇中存储的所有组分的色谱峰均保留，即将第四色谱峰簇直接作为更新后的第五色谱峰簇。

9.根据权利要求1所述的二维色谱峰的检测方法，其特征在于，所述步骤S8中将第五色谱峰簇存储为一个已识别的二维色谱峰簇后，针对第五色谱峰簇存储的各组分的各色谱峰进行标注；所述步骤S9中，获取未被标注的组分的色谱峰即可得到未存储在当前已经获取到的二维色谱峰簇中的色谱峰。

10.一种二维色谱峰的检测方法的应用，其特征在于，通过权利要求1至9中任一项所述的二维色谱峰的检测方法获取到二维色谱峰后，计算二维色谱峰面积，将二维色谱峰在两个色谱分离维度上的保留时间和计算得到二维色谱峰面积应用于多维色谱定性和定量分析中。