CN108530170A - 一种茶树水培营养液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物培养技术领域，公开了一种茶树水培营养液及其制备方法，在1L蒸馏水中，按摩尔量添加盐酸乙胺、谷氨酰胺、硝普钠、丙氨酸、谷氨酸钠、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、硫酸铜、硝酸钙、硫酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钙、硼酸、硫酸铝、钼酸钠、铁盐溶液及微量元素液。本发明培养效果好，植株抗逆性强；同时营养液配方合理，富含了茶树需要的各种养分，使树苗能够充分获得所需养分，为树苗的培养提供了可靠的前提条件，培养过程中合理控制温度、湿度以及光照条件，使得茶树能够获得快速的生长，提高了产量，增加了经济效益。

Description

一种茶树水培营养液及其制备方法

技术领域

本发明属于植物培养技术领域，尤其涉及一种茶树水培营养液及其制备方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

茶树的叶子可制茶(有别于油茶树)，种子可以榨油，茶树材质细密，其木可用于雕刻。分布主要集中在南纬16度至北纬30度之间，茶树喜欢温暖湿润气候，平均气温10℃以上时芽开始萌动，生长最适温度为20～25℃；年降水量要在1000毫米以上；喜光耐阴，适于在漫射光下生育；一生分为幼苗期、幼年期、成年期和衰老期。树龄可达一二百年，但经济年龄一般为40～50年。我国西南部是茶树的起源中心，世界上有60多个国家引种了茶树。在热带亚热带地区也有乔木型茶树高达15-30米，基部树围1.5米以上，树龄可达数百年至上千年。然而，现有的茶树水培营养液效果差，培养出的植株抗逆性差；同时营养不充分，生长速度慢。

茶氨酸(theanine,N-乙基-_-L-谷氨酰胺),是日本学者Sakato首次从绿茶中分离并命名的茶树特征性的非蛋白质氨基酸。迄今为止,除茶树外,只在1种蕈(Xercomousbadins)内及2种山茶属(CamelliajaponicaandCamelliasasanqua)中发现有茶氨酸,其中,茶氨酸在茶树(Camelliasinensis)中含量最高。茶氨酸是茶叶中的主要氨基酸,占茶树鲜叶干质量的1％～2％,具有焦糖香和类似味精的鲜爽味,能缓解苦涩味,增加茶汤的香甜味及改善滋味等作用。茶氨酸的含量与茶叶品质和等级呈强正相关,高达0.787～0.876,在很大程度上影响了绿茶的滋味品质,已成为评价茶叶品质的一个重要因子。同时,大量的研究表明,茶氨酸具有保健功能和药理作用,如神经保护、放松镇静、兴奋拮抗、抗癌、改善睡眠、增加免疫、降血压血脂及消除疲劳等功效。

茶氨酸不仅具有保健功能和药理作用,而且茶氨酸的合成与分解还与茶树氮代谢的调节和控制有关,茶氨酸以非毒性的形式储存和转运茶树中的氮,可缓解茶树高氮压力,改善茶树叶品质。尽管如此,目前对茶氨酸的合成机理还缺乏深入的研究

为此,安徽农业大学茶叶重点实验室通过Sanger测序和Illumina测序方法获得了大量的unigenes,并且KEGGpathway分析结果显示:所获得的un-igenes涵盖氨基酸等氮代谢途径中绝大多数基因,这将为今后建立数字化基因表达谱来研究茶氨酸代谢及相关氮代谢机理提供基础。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有的茶树水培营养液效果差，培养出的植株抗逆性差；同时营养不充分，生长速度慢。

现有技术中，对培养基中添加盐酸乙胺的用量，对茶氨酸含量影响缺乏指导意义。现有技术对培养基质中没有对添加外源物对茶氨酸生物合成的影响进行分析,没有对信号分子NO对茶氨酸的生物合成的影响进行分析。不能为培养优质茶提供依据。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种茶树水培营养液及其制备方法。

本发明是这样实现的，一种茶树水培营养液，所述茶树水培营养液在1L蒸馏水中，按摩尔量添加盐酸乙胺20mmol/L-25mmol/L、谷氨酰胺2.5mmol/L～5mmol/L、硝普钠0.05mmol/L～0.075mmol/L、丙氨酸5mmol/L～10mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L～5mmol/L、硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5mol/L及微量元素液1mol/L～5mol/L。

进一步，所述铁盐溶液组分为：七水硫酸亚铁0.3mol、EDTA0.2mol、蒸馏水1000ml。

进一步，盐酸乙胺为25mmol/L，谷氨酰胺为5mmol/L。

本发明的另一目的在于提供一种所述茶树水培营养液的制备方法，包括：

步骤一，称取20mmol/L-25mmol/L盐酸乙胺、2.5mmol/L～5mmol/L的谷氨酰胺、硝普钠0.05mmol/L～0.075mmol/L、丙氨酸5mmol/L～10mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L～5mmol/L，制得茶氨酸标样培养液后与硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5ml、微量元素液1～5ml、蒸馏水1L混合，用氢氧化钠溶液调节pH值在5.0～5.5之间；

步骤二，将称取的原料进行混合配置成营养液；

步骤三，选择培养容器进行培养，在培养箱中放入营养液，在培养箱内放置网孔板，每个网孔板的网孔内均插入茶树，使茶树的根部伸入到营养液中；

步骤四，将营养放置在温室内，温室温度控制为21～23℃；控制相对湿度70～90％；控制光照时间为8.5～9小时；

步骤五，在培养过程中及时补充营养液，每隔8～9天更换一次营养液。

进一步，制得茶氨酸标样培养液的方法包括：

1)将从茶树上摘下的嫩叶置于水中,加入洗涤剂后流动水冲洗2h，然后在超净工作台上进行消毒处理；先用70％的乙醇浸泡15～30s,取出并用无菌水冲洗1次,接着倒入0.1％HgCl₂,摇动10min,再用5％的次氯酸钠浸泡2～3min,最后用无菌水冲洗5～6次；

将消毒后的嫩叶转入放有滤纸的培养皿中,将叶片分成2～4mm²的去脉小块,分别放置于具有不同激素配比的MS固体培养基中,激素配比分别为

2,4-D_2.5+KT_0.5、2,4-D_2.0+KT_0.5、NAA_2.0+6-BA_0.5、NAA_1.0+2,4-D_1.0+6-BA_0.5，其中，下标表示添加激素的质量浓度,mg/L,并用Parafilm膜封口后置于光照培养箱中培养；培养条件为25摄氏度培养,光暗周期为12h/12h,覆盖遮盖物形成弱散光照射；每3周继代培养1次,继代培养16次后用作试验材料；

2)培养基中添加盐酸乙胺；在处理组培养基中添加盐酸乙胺,使盐酸乙胺的浓度为20mmol/L-25mmol/L,然后分别在培养0、1、1.5、6、12、24d时取对照组和处理组样品测定茶氨酸含量；

3)培养基中分别添加不同浓度的谷氨酸钠、丙氨酸和谷氨酰胺；在处理组培养基中分别添加不同浓度丙氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸钠,各个浓度分别为5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、25mmol/L,在愈伤组织培养12d时分别取处理和对照材料测定茶氨酸含量；

4)培养基中添加硝普钠，在处理组培养基中添加外源NO供体硝普钠,浓度分别为0.05、0.075、0.15mmol/L,于愈伤组织培养12d时分别取处理和对照材料测定茶氨酸含量；

5)茶籽苗水培及(NH₄)₂SO₄诱导；在茶籽苗萌发后生长4个月,去掉子叶后先在稀释的处理组培养基中预培养1周,然后通气培养；将处理组培养基的培养液中的初始硫酸铵浓度降低至原来的一半,每2周更换1次培养基；待4～5月份长出大量新生根时,添加(NH₄)₂SO₄使处理组培养基中的N质量浓度为100mg/L,并分别在添加(NH₄)₂SO₄后的0、1、3、6、9d时取茶苗根部,同时取未添加(NH₄)₂SO₄的水培茶苗根部作为对照；

进一步，制得茶氨酸标样培养液的方法进一步包括：

样品制备，分别称取诱导和对照材料放入已称质量的铝盒中,微波中火,450W，25s后,放入烘箱内105摄氏度烘干至恒质量；然后用研钵研碎,分别称取适量的样品,加入超纯水进行100；的水溶浸提1h,冷却后定容；浸提后先用滤纸过滤,然后用0.45_m的滤膜过滤至洗净的Eppendorf管中待用。

进一步，制得茶氨酸标样培养液的方法进一步包括：

色谱条件；Tag氨基酸分析柱3.9mm*150mm,吸附剂颗粒直径4μm,柱温37摄氏度；流动相为醋酸盐-磷酸盐缓冲液A相、乙腈B相和水C相,梯度洗脱:

0～18minA相100％～95％、B相0％～5％,18～19minA相95％～91％、B相5％～9％,19～29.5minA相91％～83％、B相9％～17％,29.5～33minB相17％～60％、C相0％～40％,33～36minA相0％～100％、B相60％～0％,36～45minA相100％～0％、B相0％～60％；流速1mL/min；紫外检测器波长为248nm,荧光检测器激发光波长为250nm,发射光波长为395nm；进样量为5μL；

茶氨酸标样的制备及试样衍生。

进一步，茶氨酸标样的制备及试样衍生具体包括：

a)氨基酸标样的制备及标准曲线的制作；取40μLWaters水解氨基酸混合标样溶液2.5mmol/L,置于清洁的自动进样瓶中,加40μL茶氨酸储存液+920μL超纯水,其中，0.0218g茶氨酸标样至10mL超纯水中,浓度为12.5mmol/L,涡旋混匀后再用超纯水稀释成一系列梯度溶液,衍生后制作标准曲线；

b)试样衍生,取衍生管1支,加入10μL用0.45μm滤头过滤的待测样或氨基酸混合标样,再加入70μL的AccQ_Fluor硼酸盐缓冲液,涡旋混匀后加20μL的AccQ_Fluor衍生试剂,涡旋10s后室温下放置1min,用Parafilm膜封口,在55摄氏度烘箱中加热10min,上机检测；

进一步，茶氨酸标样的制备及试样衍生后，需进行数据统计分析；采用Excel和DPS进行数据统计分析。

本发明的另一目的在于提供一种茶树水培营养液及其制备系统包括：

原料称取模块，与混合配置模块连接，用于称取20mmol/L-25mmol/L盐酸乙胺、2.5mmol/L～5mmol/L的谷氨酰胺、硝普钠0.05mmol/L～0.075mmol/L、丙氨酸5mmol/L～10mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L～5mmol/L，制得茶氨酸标样培养液后与硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5ml、微量元素液1～5ml、蒸馏水1L混合，用氢氧化钠溶液调节pH值在5.0～5.5之间；

混合配置模块，与原料称取模块、培养模块连接，用于将称取的原料进行混合配置成营养液；

培养模块，与混合配置模块、温度控制模块连接，用于选择培养容器进行培养，在培养箱中放入营养液，在培养箱内放置网孔板，每个网孔板的网孔内均插入茶树，使茶树的根部伸入到营养液中；

温度控制模块，与培养模块、湿度控制模块连接，用于将营养放置在温室内，温室温度控制为为21～23℃；

湿度控制模块，与温度控制模块、光照控制模块连接，用于控制相对湿度70～90％；

光照控制模块，与湿度控制模块、换液模块连接，用于控制光照时间为8.5～9小时；

换液模块，与光照控制模块连接，用于在培养过程中及时补充营养液，每隔8～9天更换一次营养液。

本发明的优点及积极效果为：

本发明培养效果好，植株抗逆性强；同时营养液配方合理，富含了茶树需要的各种养分，使茶树能够充分获得所需养分，为茶树的培养提供了可靠的前提条件，培养过程中合理控制温度、湿度以及光照条件，使得茶树能够获得快速的生长，提高了产量，增加了经济效益。

本发明对培养基质中添加外源物对茶氨酸生物合成的影响进行了分析,并对信号分子NO对茶氨酸的生物合成的影响进行了分析。一方面以茶树嫩叶为材料,诱导培养出茶愈伤组织,加入前体物、代谢中间物及信号分子等来诱导茶氨酸的合成；另一方面通过往茶籽苗水培液中添加(NH4)₂SO₄来诱导茶氨酸的合成。应用高效液相色谱来分析材料在诱导前后茶氨酸等成分含量的差异。

在培养基中添加前体物和代谢中间产物来提高茶氨酸的含量以筛选茶氨酸差异材料。

试验结果显示,培养基中添加25mmol/L盐酸乙胺后,在愈伤组织生长6d和12d时,相对于对照,茶氨酸含量增加量明显,因此选取生长6～12d的对照和盐酸乙胺诱导的愈伤组织作为差异表达材料是较好的选择。培养基中添加谷氨酰胺、丙氨酸或谷氨酸钠,低浓度时对茶氨酸的合成有一定的促进作用,特别是添加5mmol/L的谷氨酰胺,增加效果较为明显,但相对于添加前体物盐酸乙胺,茶氨酸总量偏低；而高浓度时反而抑制愈伤组织中的茶氨酸合成。就添加前体物至愈伤组织培养基中而言添加盐酸乙胺是增加愈伤中茶氨酸含量的最有效手段,这可能与乙胺是茶氨酸合成的最直接前体有关；同时,添加谷氨酸及丙氨酸对愈伤组织中茶氨酸含量的增加不显著,推测乙胺是愈伤组织中合成茶氨酸的限制因子。对于同时添加谷氨酰胺和盐酸乙胺是否会更显著地提高材料中的茶氨酸含量。

植物体内次生代谢物质的合成是受细胞内部相关基因调控的一系列复杂的生化反应过程,而环境因素等作为外界信号并不直接参与细胞内的次生代谢过程,因此,在植物细胞体内必然存在着相关胞内信号分子和相应的信号转导机制来感受并传导外界因子的刺激信号。NO作为一种重要的信号分子,近年来被广泛应用于调节一系列植物次生代谢产物的合成,因此，本发明在培养基中试着添加作为NO供体的硝普钠(SNP)来增加材料中的茶氨酸含量。结果显示,当硝普钠浓度为0.05和0.075mmol/L时,一定程度上可促进茶氨酸含量的增加,但相对于添加前体物及代谢中间物而言,茶氨酸总量偏低。可能与愈伤组织培养转接次数过多、分化较为严重而引起茶氨酸起始含量偏低有关,也可能与NO作用效果有关。NO在促进茶氨酸含量增加的同时,丝氨酸和脯氨酸含量则明显减少。NO是否通过抑制丝氨酸和脯氨酸的合成途径而促进茶氨酸合成；

茶树高度适应重氨氮的饲喂,且氨氮主要通过谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶途径及谷氨酸脱氢酶途径合成茶氨酸、谷氨酰胺和精氨酸,保存在茶树的各个器官。因此,设计在水培茶苗中添加(NH4)₂SO₄,结果显示,添加后3d内可明显地促进茶苗合成茶氨酸,3d时最高,是对照茶苗中的2.25倍。但相对于愈伤组织,茶苗中茶氨酸的增加倍数要低,这可能是因为茶苗吸收的(NH4)₂SO₄不仅用于茶氨酸的合成,也应用于增加精氨酸、谷氨酰胺等其他一些氨基酸的含量。

附图说明

图1是本发明实施提供的茶树水培营养液制备方法流程图。

图2是本发明实施提供的茶树水培营养液及其制备系统结构图。

图中：1、原料称取模块；2、混合配置模块；3、培养模块；4、温度控制模块；5、湿度控制模块；6、光照控制模块；7、换液模块。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施提供的茶树水培营养液，在1L蒸馏水中，按摩尔量添加盐酸乙胺20mmol/L-25mmol/L、谷氨酰胺2.5mmol/L～5mmol/L、硝普钠0.05mmol/L～0.075mmol/L、丙氨酸5mmol/L～10mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L～5mmol/L、硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5mol/L及微量元素液1mol/L～5mol/L。

所述铁盐溶液组分为：七水硫酸亚铁0.3mol、EDTA0.2mol、蒸馏水1000ml。

盐酸乙胺为25mmol/L，谷氨酰胺为5mmol/L。

如图1，本发明实施提供,茶树水培营养液的制备方法，包括：

S101：称取20mmol/L-25mmol/L盐酸乙胺、2.5mmol/L～5mmol/L的谷氨酰胺、硝普钠0.05mmol/L～0.075mmol/L、丙氨酸5mmol/L～10mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L～5mmol/L，制得茶氨酸标样培养液后与硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5ml、微量元素液1～5ml、蒸馏水1L混合，用氢氧化钠溶液调节pH值在5.0～5.5之间；

S102：将称取的原料进行混合配置成营养液；

S103：选择培养容器进行培养，在培养箱中放入营养液，在培养箱内放置网孔板，每个网孔板的网孔内均插入茶树，使茶树的根部伸入到营养液中；

S104：将营养放置在温室内，温室温度控制为21～23℃；控制相对湿度70～90％；控制光照时间为8.5～9小时；

S105：在培养过程中及时补充营养液，每隔8～9天更换一次营养液。

制得茶氨酸标样培养液的方法包括：

1)将从茶树上摘下的嫩叶置于水中,加入洗涤剂后流动水冲洗2h，然后在超净工作台上进行消毒处理；先用70％的乙醇浸泡15～30s,取出并用无菌水冲洗1次,接着倒入0.1％HgCl₂,摇动10min,再用5％的次氯酸钠浸泡2～3min,最后用无菌水冲洗5～6次；

将消毒后的嫩叶转入放有滤纸的培养皿中,将叶片分成2～4mm²的去脉小块,分别放置于具有不同激素配比的MS固体培养基中,激素配比分别为

2,4-D_2.5+KT_0.5、2,4-D_2.0+KT_0.5、NAA_2.0+6-BA_0.5、NAA_1.0+2,4-D_1.0+6-BA_0.5，其中，下标表示添加激素的质量浓度,mg/L,并用Parafilm膜封口后置于光照培养箱中培养；培养条件为25摄氏度培养,光暗周期为12h/12h,覆盖遮盖物形成弱散光照射；每3周继代培养1次,继代培养16次后用作试验材料；

2)培养基中添加盐酸乙胺；在处理组培养基中添加盐酸乙胺,使盐酸乙胺的浓度为20mmol/L-25mmol/L,然后分别在培养0、1、1.5、6、12、24d时取对照组和处理组样品测定茶氨酸含量；

3)培养基中分别添加不同浓度的谷氨酸钠、丙氨酸和谷氨酰胺；在处理组培养基中分别添加不同浓度丙氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸钠,各个浓度分别为5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、25mmol/L,在愈伤组织培养12d时分别取处理和对照材料测定茶氨酸含量；

4)培养基中添加硝普钠，在处理组培养基中添加外源NO供体硝普钠,浓度分别为0.05、0.075、0.15mmol/L,于愈伤组织培养12d时分别取处理和对照材料测定茶氨酸含量；

5)茶籽苗水培及(NH₄)₂SO₄诱导；在茶籽苗萌发后生长4个月,去掉子叶后先在稀释的处理组培养基中预培养1周,然后通气培养；将处理组培养基的培养液中的初始硫酸铵浓度降低至原来的一半,每2周更换1次培养基；待4～5月份长出大量新生根时,添加(NH₄)₂SO₄使处理组培养基中的N质量浓度为100mg/L,并分别在添加(NH₄)₂SO₄后的0、1、3、6、9d时取茶苗根部,同时取未添加(NH₄)₂SO₄的水培茶苗根部作为对照；

制得茶氨酸标样培养液的方法进一步包括：

样品制备，分别称取诱导和对照材料放入已称质量的铝盒中,微波中火,450W，25s后,放入烘箱内105摄氏度烘干至恒质量；然后用研钵研碎,分别称取适量的样品,加入超纯水进行100；的水溶浸提1h,冷却后定容；浸提后先用滤纸过滤,然后用0.45_m的滤膜过滤至洗净的Eppendorf管中待用。

制得茶氨酸标样培养液的方法进一步包括：

色谱条件；Tag氨基酸分析柱3.9mm*150mm,吸附剂颗粒直径4μm,柱温37摄氏度；流动相为醋酸盐-磷酸盐缓冲液A相、乙腈B相和水C相,梯度洗脱:

0～18minA相100％～95％、B相0％～5％,18～19minA相95％～91％、B相5％～9％,19～29.5minA相91％～83％、B相9％～17％,29.5～33minB相17％～60％、C相0％～40％,33～36minA相0％～100％、B相60％～0％,36～45minA相100％～0％、B相0％～60％；流速1mL/min；紫外检测器波长为248nm,荧光检测器激发光波长为250nm,发射光波长为395nm；进样量为5μL；

茶氨酸标样的制备及试样衍生。

茶氨酸标样的制备及试样衍生具体包括：

a)氨基酸标样的制备及标准曲线的制作；取40μLWaters水解氨基酸混合标样溶液2.5mmol/L,置于清洁的自动进样瓶中,加40μL茶氨酸储存液+920μL超纯水,其中，0.0218g茶氨酸标样至10mL超纯水中,浓度为12.5mmol/L,涡旋混匀后再用超纯水稀释成一系列梯度溶液,衍生后制作标准曲线；

b)试样衍生,取衍生管1支,加入10μL用0.45μm滤头过滤的待测样或氨基酸混合标样,再加入70μL的AccQ_Fluor硼酸盐缓冲液,涡旋混匀后加20μL的AccQ_Fluor衍生试剂,涡旋10s后室温下放置1min,用Parafilm膜封口,在55摄氏度烘箱中加热10min,上机检测；

茶氨酸标样的制备及试样衍生后，需进行数据统计分析；采用Excel和DPS进行数据统计分析。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

本发明实施提供的茶树水培营养液，在1L蒸馏水中，按摩尔量添加盐酸乙胺20mmol/L、谷氨酰胺2.5mmol/L、硝普钠0.05mmol/L、丙氨酸5mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L、硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5mol/L及微量元素液1mol/L～5mol/L。

实施例2

本发明实施提供的茶树水培营养液，在1L蒸馏水中，按摩尔量添加盐酸乙胺25mmol/L、谷氨酰胺5mmol/L、硝普钠0.075mmol/L、丙氨酸10mmol/L、谷氨酸钠5mmol/L、硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5mol/L及微量元素液1mol/L～5mol/L。

实施例3

本发明实施提供的茶树水培营养液，在1L蒸馏水中，按摩尔量添加盐酸乙胺22.5mmol/L、谷氨酰胺3.5mmol/L、硝普钠0.065mmol/L、丙氨酸7mmol/L、谷氨酸钠3.5mmol/L、硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5mol/L及微量元素液1mol/L～5mol/L。

如图2所示，本发明提供的茶树水培营养液及其制备系统包括：原料称取模块1、混合配置模块2、培养模块3、温度控制模块4、湿度控制模块5、光照控制模块6、换液模块7。

原料称取模块1，与混合配置模块2连接，用于称取盐酸乙胺20mmol/L-25mmol/L、谷氨酰胺2.5mmol/L～5mmol/L、硝普钠0.05mmol/L～0.075mmol/L、丙氨酸5mmol/L～10mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L～5mmol/L、硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5ml、微量元素液4～40.5ml、蒸馏水1L，用氢氧化钠溶液调节pH值在5.0～5.5之间；

混合配置模块2，与原料称取模块1、培养模块3连接，用于将称取的原料进行混合配置成营养液；

培养模块3，与混合配置模块2、温度控制模块4连接，用于选择培养容器进行培养，在培养箱中放入营养液，在培养箱内放置网孔板，每个网孔板的网孔内均插入茶树，使茶树的根部伸入到营养液中；

温度控制模块4，与培养模块3、湿度控制模块5连接，用于将培养装置放置在温室内，温室温度控制在21～23℃；

湿度控制模块5，与温度控制模块4、光照控制模块6连接，用于控制相对湿度70～90％；

光照控制模块6，与湿度控制模块5、换液模块7连接，用于控制光照时间为8.5～9小时；

换液模块7，与光照控制模块6连接，用于在培养过程中及时补充营养液，每隔8～9天更换一次营养液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种茶树水培营养液，其特征在于，所述茶树水培营养液在1L蒸馏水中，按摩尔量添加盐酸乙胺20mmol/L～25mmol/L、谷氨酰胺2.5mmol/L～5mmol/L、硝普钠0.05mmol/L～0.075mmol/L、丙氨酸5mmol/L～10mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L～5mmol/L、硫酸锰2.7mmol/L～3mmol/L、硫酸锌0.25mmol/L～0.3mmol/L、硫酸镁125mmol/L～130mmol/L、硫酸铜0.06mmol/L～0.1mmol/L、硝酸钙58mmol/L～60mmol/L、硫酸钾80mmol/L～85mmol/L、硫酸铵140mmol/L～145mmol/L、磷酸二氢钾13mmol/L～15mmol/L、氯化钙43mmol/L～45mmol/L、硼酸0.55mmol/L～0.6mmol/L、硫酸铝68mmol/L～70mmol/L、钼酸钠0.1mmol/L～0.2mmol/L、铁盐溶液5mol/L及微量元素液1mol/L～5mol/L。

2.如权利要求1所述的茶树水培营养液，其特征在于，所述铁盐溶液组分为：七水硫酸亚铁0.3mol、EDTA0.2mol、蒸馏水1000ml。

3.如权利要求1所述的茶树水培营养液，其特征在于，盐酸乙胺为25mmol/L，谷氨酰胺为5mmol/L。

4.一种如权利要求1所述茶树水培营养液的制备方法，其特征在于，所述茶树水培营养液的制备方法包括：

步骤一，称取20mmol/L-25mmol/L盐酸乙胺、2.5mmol/L～5mmol/L的谷氨酰胺、硝普钠0.05mmol/L～0.075mmol/L、丙氨酸5mmol/L～10mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L～5mmol/L，制得茶氨酸标样培养液后与硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5ml、微量元素液1～5ml、蒸馏水1L混合，用氢氧化钠溶液调节pH值在5.0～5.5之间；

步骤二，将称取的原料进行混合配置成营养液；

步骤三，选择培养容器进行培养，在培养箱中放入营养液，在培养箱内放置网孔板，每个网孔板的网孔内均插入茶树，使茶树的根部伸入到营养液中；

步骤四，将营养放置在温室内，温室温度控制为21～23℃；控制相对湿度70～90％；控制光照时间为8.5～9小时；

步骤五，在培养过程中及时补充营养液，每隔8～9天更换一次营养液。

5.如权利要求4所述茶树水培营养液的制备方法，其特征在于，制得茶氨酸标样培养液的方法包括：

1)将从茶树上摘下的嫩叶置于水中,加入洗涤剂后流动水冲洗2h，然后在超净工作台上进行消毒处理；先用70％的乙醇浸泡15～30s,取出并用无菌水冲洗1次,接着倒入0.1％HgCl₂,摇动10min,再用5％的次氯酸钠浸泡2～3min,最后用无菌水冲洗5～6次；

将消毒后的嫩叶转入放有滤纸的培养皿中,将叶片分成2～4mm²的去脉小块,分别放置于具有不同激素配比的MS固体培养基中,激素配比分别为

2,4-D_2.5+KT_0.5、2,4-D_2.0+KT_0.5、NAA_2.0+6-BA_0.5、NAA_1.0+2,4-D_1.0+6-BA_0.5，其中，下标表示添加激素的质量浓度,mg/L,并用Parafilm膜封口后置于光照培养箱中培养；培养条件为25摄氏度培养,光暗周期为12h/12h,覆盖遮盖物形成弱散光照射；每3周继代培养1次,继代培养16次后用作试验材料；

2)培养基中添加盐酸乙胺；在处理组培养基中添加盐酸乙胺,使盐酸乙胺的浓度为20mmol/L-25mmol/L,然后分别在培养0、1、1.5、6、12、24d时取对照组和处理组样品测定茶氨酸含量；

3)培养基中分别添加不同浓度的谷氨酸钠、丙氨酸和谷氨酰胺；在处理组培养基中分别添加不同浓度丙氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸钠,各个浓度分别为5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、25mmol/L,在愈伤组织培养12d时分别取处理和对照材料测定茶氨酸含量；

4)培养基中添加硝普钠，在处理组培养基中添加外源NO供体硝普钠,浓度分别为0.05、0.075、0.15mmol/L,于愈伤组织培养12d时分别取处理和对照材料测定茶氨酸含量；

5)茶籽苗水培及(NH₄)₂SO₄诱导；在茶籽苗萌发后生长4个月,去掉子叶后先在稀释的处理组培养基中预培养1周,然后通气培养；将处理组培养基的培养液中的初始硫酸铵浓度降低至原来的一半,每2周更换1次培养基；待4～5月份长出大量新生根时,添加(NH₄)₂SO₄使处理组培养基中的N质量浓度为100mg/L,并分别在添加(NH₄)₂SO₄后的0、1、3、6、9d时取茶苗根部,同时取未添加(NH₄)₂SO₄的水培茶苗根部作为对照。

6.如权利要求5所述茶树水培营养液的制备方法，其特征在于，制得茶氨酸标样培养液的方法进一步包括：

样品制备，分别称取诱导和对照材料放入已称质量的铝盒中,微波中火,450W，25s后,放入烘箱内105摄氏度烘干至恒质量；然后用研钵研碎,分别称取适量的样品,加入超纯水进行100；的水溶浸提1h,冷却后定容；浸提后先用滤纸过滤,然后用0.45_m的滤膜过滤至洗净的Eppendorf管中待用。

7.如权利要求5所述茶树水培营养液的制备方法，其特征在于，制得茶氨酸标样培养液的方法进一步包括：

色谱条件；Tag氨基酸分析柱3.9mm*150mm,吸附剂颗粒直径4μm,柱温37摄氏度；流动相为醋酸盐-磷酸盐缓冲液A相、乙腈B相和水C相,梯度洗脱:

0～18minA相100％～95％、B相0％～5％,18～19minA相95％～91％、B相5％～9％,19～29.5minA相91％～83％、B相9％～17％,29.5～33minB相17％～60％、C相0％～40％,33～36minA相0％～100％、B相60％～0％,36～45minA相100％～0％、B相0％～60％；流速1mL/min；紫外检测器波长为248nm,荧光检测器激发光波长为250nm,发射光波长为395nm；进样量为5μL；

茶氨酸标样的制备及试样衍生。

8.如权利要求7所述茶树水培营养液的制备方法，其特征在于，

茶氨酸标样的制备及试样衍生具体包括：

a)氨基酸标样的制备及标准曲线的制作；取40μLWaters水解氨基酸混合标样溶液2.5mmol/L,置于清洁的自动进样瓶中,加40μL茶氨酸储存液+920μL超纯水, 其中，0.0218g茶氨酸标样至10mL超纯水中,浓度为12.5mmol/L,涡旋混匀后再用超纯水稀释成一系列梯度溶液,衍生后制作标准曲线；

b)试样衍生,取衍生管1支,加入10μL用0.45μm滤头过滤的待测样或氨基酸混合标样,再加入70μL的AccQ_Fluor硼酸盐缓冲液,涡旋混匀后加20μL的AccQ_Fluor衍生试剂,涡旋10s后室温下放置1min,用Parafilm膜封口,在55摄氏度烘箱中加热10min,上机检测。

9.如权利要求8所述茶树水培营养液的制备方法，其特征在于，茶氨酸标样的制备及试样衍生后，需进行数据统计分析；采用Excel和DPS进行数据统计分析。

10.一种如权利要求1所述茶树水培营养液的茶树水培营养液制备系统，其特征在于，所述茶树水培营养液及其制备系统包括：

原料称取模块，与混合配置模块连接，用于称取20mmol/L-25mmol/L盐酸乙胺、2.5mmol/L～5mmol/L的谷氨酰胺、硝普钠0.05mmol/L～0.075mmol/L、丙氨酸5mmol/L～10mmol/L、谷氨酸钠2.5mmol/L～5mmol/L，制得茶氨酸标样培养液后与硫酸锰2.7～3mmol/L、硫酸锌0.25～0.3mmol/L、硫酸镁125～130mmol/L、硫酸铜0.06～0.1mmol/L、硝酸钙58～60mmol/L、硫酸钾80～85mmol/L、硫酸铵140～145mmol/L、磷酸二氢钾13～15mmol/L、氯化钙43～45mmol/L、硼酸0.55～0.6mmol/L、硫酸铝68～70mmol/L、钼酸钠0.1～0.2mmol/L、铁盐溶液5ml、微量元素液1～5ml、蒸馏水1L混合，用氢氧化钠溶液调节pH值在5.0～5.5之间；

混合配置模块，与原料称取模块、培养模块连接，用于将称取的原料进行混合配置成营养液；

培养模块，与混合配置模块、温度控制模块连接，用于选择培养容器进行培养，在培养箱中放入营养液，在培养箱内放置网孔板，每个网孔板的网孔内均插入茶树，使茶树的根部伸入到营养液中；

温度控制模块，与培养模块、湿度控制模块连接，用于将营养放置在温室内，温室温度控制为为21～23℃；

湿度控制模块，与温度控制模块、光照控制模块连接，用于控制相对湿度70～90％；

光照控制模块，与湿度控制模块、换液模块连接，用于控制光照时间为8.5～9小时；

换液模块，与光照控制模块连接，用于在培养过程中及时补充营养液，每隔8～9天更换一次营养液。