CN108486172A - 一种两相法厌氧发酵产己酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两相法厌氧发酵产己酸的方法，属于废弃物资源化处理技术、环保净化处理技术领域。本发明将利用果蔬废弃物作为产酸相底物，在35℃、pH＝6.0，果蔬废弃物为产酸相底物建立稳定的产酸发酵体系；以产酸相发酵液为底物，在30℃、pH＝6.8‑7.0条件下，醇酸比＝4:1，即乙醇添加量为17.22g·L^‑1时，可使己酸产量达到12.85g·L^‑1，实现己酸的高效生成。

Description

一种两相法厌氧发酵产己酸的方法

技术领域

本发明涉及一种两相法厌氧发酵产己酸的方法，属于废弃物资源化处理技术、环保净化处理技术领域。

背景技术

己酸能够通过往产己酸菌群中添加乙醇或者乳酸为电子供体，运用羧酸碳链延伸的反向β-氧化途径(reverse β oxidation)合成。目前国内有关厌氧菌群定向合成己酸的研究较少，仅有的一些研究集中在己酸菌纯种培养与混合培养技术在窖泥和白酒生产中的作用相关方面。相关研究工作还主要集中在发酵条件的优化与控制，同时也有部分研究通过微生物分子生态学等手段对发酵过程中的优势微生物种群进行了探讨。但是目前仍然缺乏有关厌氧菌群己酸合成的代谢调控及其机制的研究，也正因如此，往往出现不充分的碳链延伸，从而影响了己酸的产率和生产强度。

分子态己酸浓度越高，对厌氧微生物的毒性越大，并可能危及碳链延伸过程。目前，很多研究厌氧发酵过程MCFAs的合成中，或多或少受到乙酸、丁酸或者己酸等对微生物的毒性，使得碳链延伸过程受到抑制。利用两相发酵分开酸化阶段和产己酸阶段，主要优点为：(1)能够避免高浓度的MCFAs和乙醇对水解速率和微生物的毒性；(2)能够分别对酸化相和产己酸相进行优化；(3)避免MCFAs被固体颗粒物吸附；(4)两相厌氧发酵系统使得农业和工业废弃物等复杂有机废物得到利用；(5)方便后续对体系中高浓度的己酸进行分离纯化。

发明内容

为了解决己酸合成过程中毒性抑制，提高己酸生产强度。本发明开发了一种两相法厌氧发酵产生己酸的方法。本发明以果蔬废弃物作为产酸相底物，以产酸相发酵液作为产己酸相底物，乙醇为电子供体，在厌氧酸化菌群和产己酸菌群之间建立高效的耦合关系，实现己酸的高效生成。乙醇作为电子供体是最重要、最常见的碳链延伸途径。反向β氧化途径是一个循环过程，每个循环延伸2个碳原子，NAD⁺氧化乙醇得到乙酰辅酶A，乙酰辅酶A能够引起底物磷酸化；电子被还原性铁氧化还原蛋白传递过程中释放能量，形成H₂并产生电化学Na⁺/H⁺梯度。产己酸菌转化乙酸和乙醇生成丁酸，再次结合乙醇生成己酸。

在本发明的一种实施方式中，在厌氧发酵过程中以乙酸、丁酸和乙醇为纽带，在产酸菌群和产己酸菌群间建立耦合关系，有助于实现己酸的高强度生产。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵体系产酸相含有厌氧颗粒污泥和果蔬废弃物。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵体系产己酸相含有厌氧颗粒污泥和产酸相发酵液。

在一种实施方式中，所述厌氧产酸相中果蔬废弃物和接种污泥接种比为1:2。

在一种实施方式中，所述厌氧产己酸相中，厌氧颗粒污泥与产酸相发酵液按照质量体积比1:4(g/mL)混合。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵体系产己酸相中，乙醇作为电子供体另外投加。

在一种实施方式中，所述厌氧产己酸相中，乙醇的投加量按照乙醇：(乙酸+丁酸)电子当量比0～9:1。

在一种实施方式中，所述厌氧产己酸相中，乙醇的投加量按照乙醇：(乙酸+丁酸)为以下任一种0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、7:1、9:1(g-COD/g-COD)。

在一种实施方式中，所述方法是利用果蔬废弃物建立稳定的厌氧酸化相，厌氧颗粒污泥与产酸相发酵液按照质量体积比1:4(m/v)混合，乙醇为电子供体，在厌氧酸化菌群和产己酸菌群之间建立高效的耦合关系，实现己酸的高效生成。

在一种实施方式中，所述厌氧消化体系是在厌氧瓶中进行。

在一种实施方式中，所述厌氧发酵产酸相的反应温度为35℃，产己酸相反应温度为30℃。

在一种实施方式中，所述产酸相初始pH用氢氧化钠溶液调节4～7，产己酸相pH调节为7.0±0.2，反应过程同时调节pH至设定值。

本发明还提供所述方法在制备抗菌剂、化工材料、食品添加剂方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述化工材料包括但不限于香水香料、润滑油的粘稠剂、橡胶加工助剂、清漆催干剂。

有益效果：本发明将两相发酵运用到厌氧发酵的己酸生产中，分别对产酸相和产己酸相进行优化，实现两种菌群的高效耦合，促进己酸的生产。厌氧发酵产酸相中，接种比为2:1，35℃，pH为6时能够得到最佳厌氧酸化相。通过向产酸相发酵液中投加乙醇能够有效的合成己酸，当乙醇浓度低于22.07g·L^-1、醇酸比≤5:1时产己酸菌能够富集，生成己酸；当乙醇浓度高于22.07g·L^-1时，会抑制微生物活性，几乎不产生己酸。本发明的工艺简单，易于操作，将果蔬废弃物作为产酸相发酵底物，不仅能够达到减量化的目的，还能将反应发酵液运用于二级发酵系统中，产生高附加值的己酸。本发明具有良好的研究应用前景。说明在35℃、pH＝6.0，果蔬废弃物为产酸相底物能够建立稳定的产酸发酵体系；另外，以产酸相发酵液为底物，在30℃、pH＝6.8-7.0条件下，醇酸比＝4:1，即乙醇添加量为17.22g·L^-1(357.3mM)时，最高己酸产量为12.85g·L^-1。

附图说明

图1两相法厌氧发酵产己酸流程图；

图2产酸相中pH变化情况；

图3产酸相中氨氮浓度变化情况；

图4产酸相中还原糖浓度变化情况；

图5产酸相中乙醇、乙酸、丁酸的变化情况；

图6产己酸相中乙醇、乙酸、丁酸和己酸的变化情况；

具体实施方式

实施例1

厌氧产酸过程如图1所示。产酸相设置5组，底物为果蔬残渣，接种污泥取自无锡某食品加工厂污水厌氧消化罐，接种比为2:1，总TS为5％。调节初始pH分别为4、5、6、7，未调节pH体系为对照实验，为维持pH稳定，每隔24小时用3mol·L^-1NaOH溶液调节pH。反应装置为厌氧瓶加集气袋，有效体积为1L，放置在35℃恒温水浴锅中。

产己酸相反应在1L厌氧瓶中进行，30℃，pH在6.8-7，反应总体积为500mL，每组实验添加产酸相发酵液400mL，驯化污泥100g(以乙醇和乙酸为底物驯化后的污泥)。根据乙醇和乙酸+丁酸的质量比(以COD计)设置8组不同实验，分别为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、7:1、9:1，乙醇的投加量见表2。反应过程中pH、氨氮测定方法均采用国家标准方法进行分析，还原糖测定为3,5－二硝基水杨酸法，醇类及羧酸用气相色谱仪测定。

对发酵过程两相的各指标进行测定，结果如下：

(1)厌氧产酸相中的pH及氨氮浓度变化情况

厌氧反应中pH的变化会直接影响酸化细菌细胞膜电荷的变化，从而影响细菌的活性，改变生长环境中其对营养物质的吸收。从图2可以看到，对照组pH在10小时内水解过程加速，从6.46降至4.82，随后反应稳定在4.48。其他几组pH均随着反应水解过程的进行，上下波动，并最终稳定在3.65、4.6、6.02、7.04。

图3为氨氮浓度变化，可以看到对照组氨氮浓度从303.14mg·L^-1逐渐下降至78.92mg·L^-1，其他四组氨氮浓度分别为150.54mg·L^-1、94.39mg·L^-1、93mg·L^-1、191.6mg·L^-1。5组氨氮去除率分别为73％、54％、74.4％、67.8％、35.5％。pH＝5、6两组氨氮降解率高，和对照组接近，说明pH调控对反应体系中氨氮有较大影响，能够降低氨氮浓度。

(2)厌氧产酸相中的还原糖浓度变化情况

在水解酸化阶段，底物中糖类物质等经水解生成单糖及其他小分子化合物，之后在发酵细菌的作用下单糖转化为醇和酸类发酵末端产物。实施例1的厌氧产酸反应实验结束后测定还原糖浓度，通过测定液相中还原糖浓度能够直观反应产酸相的水解酸化进程。如图4所示，反应结束后发酵液中对照组和pH为4、5、6、7还原糖浓度分别在46.5h、73h、58.5h、28h、11h从15.46g·L^-1、16.18g·L^-1、16.45g·L^-1、18.25g·L^-1、16.30g·L^-1降至0.11g·L^-1、0.64g·L^-1、0.35g·L^-1、0.05g·L^-1、0.04g·L^-1。果蔬废弃物中不能被微生物直接利用的大分子不溶性聚合物，在水解作用下迅速转化为还原性糖等简单的溶解性物质，对照组还原糖在46.5h降解完全，介于pH5和6之间，说明pH的提高会加快糖类物质的降解，加速水解过程。

(3)厌氧产酸相中乙醇、乙酸和丁酸的变化情况

通过观察产酸相中的VFAs浓度变化，以便确定最佳的pH条件。结合图5可以看出，对照组乙醇浓度稳定在0.28g·L^-1左右，乙酸波动上升后稳定在3.46g·L^-1，丁酸在53.5h达到最高值4.58g·L^-1。pH＝4组在前28小时出现停滞期，各类酸浓度变化不大，随着反应pH上升，酸性条件对微生物的抑制降低，乙醇最后稳定于0.16g·L^-1，乙酸从2.43g·L^-1先上升后稳定在2.75g·L^-1；pH＝5组丁酸浓度逐渐上升最高为4.36g·L^-1，乙酸最高值为3.57g·L^-1；pH＝6组丁酸产量最高，为5.19g·L^-1，乙酸和乙醇最高分别为3.70和0.36g·L^-1；pH＝7组反应速率最快，丁酸最高浓度为4.98g·L^-1，乙酸从1.73g·L^-1稳定上升至3.03g·L^-1，乙醇终浓度为0.06g·L^-1。说明pH会影响厌氧过程中液相末端产物的组成，pH＝6组丁酸产量最高。

(4)厌氧产己酸相中乙醇、乙酸、丁酸、己酸的变化情况

产己酸相实验设置的醇酸比分别为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、7:1、9:1，图6反应了不同醇酸比条件在70天反应过程中羧酸(乙酸、正丁酸、正己酸)和乙醇浓度的变化。图6(A)为乙醇变化情况，空白组前期产生少量乙醇，后期检测不到。醇酸比5:1、7:1、9:1三组乙醇浓度上下波动，变化不大，终浓度分别为17.10、28.86和38.35g·L^-1。另外，醇酸比≤4:1组(除空白组)乙醇作为电子供体参与碳链延伸过程，随着反应进行逐渐被消耗，1:1、2:1、3:1组乙醇分别在8、19、45d时降到1g·L^-1以下，并最终趋于零；4:1组乙醇初始17.22g·L^-1降至1.21g·L^-1。

图6(B、C)为乙酸和丁酸变化规律。乙酸和乙醇作为底物被微生物利用，通过反向β氧化途径合成丁酸。醇酸比≤4:1组(不包括空白组)乙酸在11d内迅速下降，均低于0.5g·L^-1，后期乙酸浓度稳定；同时，丁酸在11d内分别上升至各组最高值9.75g·L^-1、10.65g·L^-1、10.06g·L^-1、9.34g·L^-1，随后进入碳链延伸过程，最终分别稳定在6.61g·L^-1、6.24g·L^-1、5.00g·L^-1、3.50g·L^-1。醇酸比>4:1三组，乙酸分别从2.27g·L^-1、2.21g·L^-1、2.25g·L^-1上升至3.56g·L^-1、3.53g·L^-1、3.96g·L^-1，同样地，丁酸浓度上下波动，整体变化不大。空白组丁酸从3.68g·L^-1降至0g·L^-1，乙酸上下波动最终趋于零。

通过图6(D)观察己酸变化情况，醇酸比4:1组己酸在56d达到所有组最高值12.85g·L^-1。醇酸比<4:1组己酸分别在25、23、50d时趋于稳定，最高浓度分别为0.96、3.94、8.16g·L^-1，这三组乙醇能够被微生物充分利用合成己酸。醇酸比5:1组，在31d开始产生己酸，最高浓度为2.72g·L^-1；醇酸比>5:1两组由于乙醇浓度过高产生抑制因此几乎不产生己酸。各组己酸最高产量由高到低排序分别为4:1>3:1>2:1>5:1>1:1>9:1>0:1>7:1。同时，得益于前期的稳定型丁酸发酵，丙酸在液相组份中不高，因此奇数碳的中链脂肪酸碳链延伸在体系中未检测到，少量的异丁酸等支链脂肪酸通常认为是氨基酸分解产物，浓度在100mg·L^-1左右。

说明在35℃、pH＝6.0，果蔬废弃物为产酸相底物能够建立稳定的丁酸型发酵体系；另外，以产酸相发酵液为底物，在30℃、pH＝6.8-7.0条件下，醇酸比＝4:1，即乙醇添加量为17.22g·L^-1(357.3mM)时，己酸产量可达12.85g·L^-1。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种两相法厌氧发酵生产有机酸的方法，其特征在于，以果蔬废弃物作为产酸相底物，将厌氧颗粒污泥与产酸相发酵液按照质量体积比1:3～4混合，在30～37℃，pH6～7的条件下发酵。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机酸包括丁酸和己酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，厌氧发酵体系的产酸相含有厌氧颗粒污泥和果蔬废弃物；厌氧发酵体系的产己酸相含有厌氧颗粒污泥和产酸相发酵液。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述产酸相中果蔬废弃物和接种污泥接种比为2:1。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述产己酸相中，厌氧颗粒污泥与产酸相发酵液按照质量体积比1:4混合。

6.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，厌氧发酵体系的产己酸相中，乙醇作为电子供体另外投加；乙醇的投加量按照乙醇：(乙酸+丁酸)质量比(以COD计)0～9:1。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，乙醇的投加量按照乙醇：(乙酸+丁酸)质量比(以COD计)为以下任一种0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、7:1、9:1。

8.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于，厌氧发酵产酸相的反应温度为35～37℃，产己酸相反应温度为28～30℃。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，产酸相初始pH用氢氧化钠溶液调节4～7，产己酸相pH调节为7.0±0.2，反应过程控制pH。

10.权利要求1～9任一所述方法在制备抗菌剂、化工材料、食品添加剂方面的应用。