CN108444963B - 一种检测谷胱甘肽的方法和硫金复合物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测谷胱甘肽的方法和硫金复合物的应用。检测谷胱甘肽(GSH)的方法包括以下步骤：将氯金酸溶液与带有巯基的多肽溶液混合，反应1—3min，得到含硫金复合物的溶液；将含硫金复合物的溶液与荧光基团标记的DNA探针孵育，孵育条件为：在温度20—40℃、pH值为中性的条件下孵育1—3min；得到硫金复合物‑DNA探针；在得到的硫金复合物‑DNA探针中加入不同浓度的谷胱甘肽，用荧光光谱仪检测，根据荧光信号的强弱实现对GSH的检测。本发明检测方法在构建传感界面、增强传感响应的灵敏度具有独特的性能，具有简便、快速、免抗体识别等优异性质，是一种简便、快速、灵敏检测GSH的新方法。

Description

一种检测谷胱甘肽的方法和硫金复合物的应用
技术领域
本发明涉及一种检测谷胱甘肽的方法和硫金复合物的应用。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的三肽，分布所有器官细胞内。GSH主要参与氨基酸的转运，蛋白、核酸的合成，抗氧化作用，维持蛋白巯基的还原状态，维持酶的活性状态，保护细胞防止自由基、毒素的损伤等等。GSH具有抗氧化作用和整合解毒作用。其含量的异常可以作为HIV，帕金森综合征，肝损伤，炎症等疾病的诊断指标之一。因此，快速、简便、准确的测定谷胱甘肽的含量，对于研究GSH的生理学意义、疾病的诊断有非常重要的意义。目前现有的GSH检测方法多数需要较长的酶催化反应时间，涉及大型仪器的操作和使用。新开发的荧光检测方法需要合成具有荧光性质的纳米材料，合成时间长，对操作者要求较高。
发明内容
鉴于上述检测的瓶颈，我们发现了硫金复合物可以高效地淬灭荧光基团的荧光，而GSH可以打断硫金复合物中的Au-S键，实现荧光的恢复。利用这一新的识别机制结合金的复合材料的荧光淬灭性质，构建了免抗体识别传感器，有效实现了GSH的检测。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
提供一种检测谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
(1)将氯金酸溶液与带有巯基的多肽溶液混合，反应1—3min，得到含硫金复合物的溶液；
(2)将步骤(1)的含硫金复合物的溶液与荧光基团标记的DNA探针孵育，孵育条件为：在温度20—40℃、pH值为中性的条件下孵育1—3min；得到硫金复合物-DNA探针；
(3)在步骤(2)得到的硫金复合物-DNA探针中加入不同浓度的谷胱甘肽，用荧光光谱仪检测，根据荧光信号的强弱实现对GSH的检测。
优选地，在pH值为中性条件下，所述多肽为带正电的多肽。多肽中可以含有精氨酸(R)、赖氨酸(K)，使多肽在检测条件下(pH 7.0)显示正电。
优选地，所述多肽为等电点为8—12的多肽。
优选地，所述多肽为精氨酸-半胱氨酸-谷氨酸构成的三肽(精氨酸-半胱氨酸-精氨酸、赖氨酸-半胱氨酸-谷氨酸、赖氨酸-半胱氨酸-精氨酸等)。
优选地，步骤(1)中氯金酸溶液的浓度为0.5—2mmol/L；步骤(1)中多肽溶液的浓度为1—4mmol/L。
优选地，步骤(1)中氯金酸溶液与多肽溶液等体积混合。
优选地，步骤(3)中选取荧光光谱仪的激发波长为450nm—490nm。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种硫金复合物-DNA探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氯金酸溶液与带有巯基的多肽溶液混合，反应1—3min，得到含硫金复合物的溶液；
(2)将步骤(1)的含硫金复合物的溶液与荧光基团标记的DNA探针孵育，孵育条件为：在温度20—40℃、pH值为中性的条件下孵育1—3min；得到硫金复合物-DNA探针。
作为一个总的发明构思，本发明还提供所述的硫金复合物-DNA探针在检测谷胱甘肽中的应用。
作为一个总的发明构思，本发明还提供硫金复合物在检测谷胱甘肽中的应用，所述硫金复合物是将氯金酸溶液与带有巯基的多肽溶液混合，反应1—3min后得到。
本发明中采取的技术方案具体为：将三肽RCG(精氨酸-半胱氨酸-谷氨酸)的溶液(浓度为2mM)与氯金酸溶液(浓度为1mM)按体积比1:1充分混合，形成无色澄清的硫金复合物溶液。将硫金复合物与荧光标记的核酸探针混合，二者混合后的终浓度分别为80μM和200nM，得到检测GSH的硫金复合物-核酸探针储备液。在储备液中加入不同浓度的GSH，GSH破坏硫金复合物的结构，使得荧光标记核酸探针释放，实现荧光的恢复，从而实现GSH的检测。
优选地，硫金复合物合成的反应体系中，底物氯金酸在反应体系中的终浓度为0.5mM，RCG的的终浓度为1mM。
孵育时，负电的DNA探针与带正电的硫金复合物通过静电引力结合，硫金复合物将DNA探针修饰的荧光基团的荧光淬灭；通过GSH对硫金复合物中的Au-S键的破坏，释放荧光标记的核酸探针，实现对GSH的检测。其灵敏度主要取决于对硫金复合物与荧光标记的核酸探针之间的淬灭以及恢复后的信倍比。我们首先证明硫金复合物可以淬灭荧光标记的核酸探针的荧光，并优化硫金复合物可以淬灭荧光标记的核酸探针的比例。得到最优的硫金复合物可以淬灭荧光标记的核酸探针的比例。在最优浓度下，随着不同浓度的GSH的加入，标记荧光基团的核酸探针释放，荧光信号恢复，实现GSH检测，检测限为0.3μM(图5)，证明该方法可以实现GSH的检测。
我们构建的这种基于硫金复合物快速检测GSH方法，硫金复合物合成步骤简单制备方便，整个合成检测过程可以在3分钟内完成，较好地实现了对GSH的快速检测。与传统方法相比，该方法具有低成本、较高灵敏度等优点，同时该方法操作处理简单、检测时间短，为GSH相关研究提供了有力手段。
本发明检测方法在构建传感界面、增强传感响应的灵敏度具有独特的性能，具有简便、快速、免抗体识别等优异性质，是一种简便、快速、灵敏检测GSH的新方法。
附图说明
图1为本发明的原理示意图。
图2为多肽RCG及硫金复合物红外图。
图3为pH值优化结果。
图4为硫金复合物淬灭荧光探针荧光图；曲线说明：(1)DNA荧光探针；此时DNA探针处于自由状态，有较高的荧光信号；(2)DNA荧光探针+GSH；说明GSH不会增加或者降低荧光探针本身的信号；(3)DNA荧光探针+硫金复合物；硫金复合物会高效淬灭DNA荧光探针的荧光；(4)DNA荧光探针+硫金复合物+GSH。GSH可以使得DNA荧光探针的荧光信号恢复，实现GSH的检测。
图5为GSH检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)将RCG配成10mM的贮存液，用超纯水稀释为2mM溶液待用。RCG:精氨酸-半胱氨酸-谷氨酸构成的三肽，在检测条件(pH 7.0)下为带正电的三肽。
(2)将氯金酸配成10mM的贮存液，用超纯水稀释为1mM溶液待用。
分别取200μL的RCG溶液和氯金酸溶液，振荡器混合1分钟，得到澄清透明的溶液，即为硫金复合物(或称金-巯基配位聚合物)。
(3)GSH检测探针的制备
将已合成的硫金复合物与荧光基团标记的DNA探针(此处探针序列无特殊要求，一般选择碱基长度为20-40的无复杂二级结构的核酸探针)孵育，孵育条件为：20—40℃，1—3min；孵育时，负电的DNA探针与带正电的硫金复合物通过静电引力结合，硫金复合物将DNA探针修饰的荧光基团的荧光淬灭；
(4)GSH的检测
将经步骤(3)反应后得到的硫金复合物-核酸探针(或称硫金复合物-DNA探针)作为检测GSH的探针，加入不浓度的GSH，用荧光光谱仪检测，根据荧光信号的强弱实现对GSH的检测。
本发明的技术原理如图1所示，带正电的硫金复合物可以结合负电的核酸探针，并且可以高效淬灭标记在探针上的荧光基团的荧光。当目标物GSH加入后，GSH可以打断硫金复合物的硫金键，破坏硫金复合物，而探针被释放出来，恢复荧光，从而实现GSH的检测。
图2中，虚线显示RCG三肽在2527cm-1处有明显的巯基的红外吸收。当RCG形成复合物后，由于Au-S新键的形成，硫金复合物在此处红外吸收几乎消失。
图3表示不同pH的缓冲溶液的优化，其中S/N定义为DNA探针本身的荧光信号与DNA荧光探针与硫金复合物结合后的荧光信号的比值。优化得到的最佳pH＝7.0。在pH值偏小时，由于荧光基团本身的性质其荧光信号较小。当pH增大时，DNA荧光探针的荧光信号较大。硫金复合物对DNA探针的荧光淬灭效果在pH＝7.0-10.0左右较好。但是pH值过大时，例如pH＝12，此时pH大于多肽的等电点，使得多肽在此时带负电，不能有效结合同样带负电的DNA荧光探针，此时的淬灭效果大大降低。
图5为GSH检测结果图。随着GSH的浓度的增加，硫金复合物被破坏，DNA荧光探针释放增多，使得DNA荧光探针的荧光信号增加，实现GSH的检测。

Claims (9)

1.一种检测谷胱甘肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将氯金酸溶液与带有巯基的多肽溶液混合，反应1—3min，得到含硫金复合物的溶液；
（2）将步骤（1）的含硫金复合物的溶液与荧光基团标记的DNA探针孵育，孵育条件为：在温度20—40℃、pH值为中性的条件下孵育 1—3min；得到硫金复合物-DNA探针；
（3）在步骤（2）得到的硫金复合物-DNA探针中加入不同浓度的谷胱甘肽，用荧光光谱仪检测，根据荧光信号的强弱实现对谷胱甘肽的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在pH值为中性条件下，所述多肽为带正电的多肽。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽为等电点为8—12的多肽。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽为精氨酸-半胱氨酸-谷氨酸构成的三肽。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中氯金酸溶液的浓度为0.5—2mmol/L；步骤（1）中多肽溶液的浓度为1—4 mmol/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中氯金酸溶液与多肽溶液等体积混合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中选取荧光光谱仪的激发波长为450nm—490 nm。
8.一种硫金复合物-DNA探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将氯金酸溶液与带有巯基的多肽溶液混合，反应1—3min，得到含硫金复合物的溶液；
（2）将步骤（1）的含硫金复合物的溶液与荧光基团标记的DNA探针孵育，孵育条件为：在温度20—40℃、pH值为中性的条件下孵育 1—3min；得到硫金复合物-DNA探针。
9.权利要求8所述的制备方法获得的硫金复合物-DNA探针在检测谷胱甘肽中的应用。
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