CN108430579A - 通过使用超声系统治疗脑肿瘤的方法和试剂盒 - Google Patents

通过使用超声系统治疗脑肿瘤的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种减少治疗脑肿瘤所需的贝伐单抗有效量的方法。本发明也提供一种用于所述方法的试剂盒。该方法采用结合贝伐单抗治疗与超声辐照的组合策略，其包括至少以下步骤：对受试者施用贝伐单抗；对该受试者施用超声响应介质；以及对该受试者施用超声辐照。确定了贝伐单抗治疗和超声辐照的具体有效量。常规贝伐单抗治疗的效能显著提高。

Description

通过使用超声系统治疗脑肿瘤的方法和试剂盒
相关申请
本申请的基础为2015年11月11日于美国提出的临时申请第62/253,805号。
背景技术
一般而言，多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)患者经过积极手术并接受术后辅助性化疗和放疗后，其5年存活率仅不到5％，总体中位存活期仅15个月。由于多型性胶质母细胞瘤为高度血管化的肿瘤，伴随不规则且广泛的血管增生、血管生成因子表达增加以及分泌血管内皮生长因子(VEGF)的极高水平，使得抗血管新生疗法成为近来治疗剂开发工作的重点。与多形性胶质母细胞瘤相关的高血管内皮生长因子表达导致血管内皮细胞的生长及增殖，这与肿瘤缺氧坏死相关，且促发肿瘤血管新生和进展。
贝伐单抗(Bevacizumab)是人源化单克隆抗体，其特异性地结合VEGF-A亚型并中和内皮细胞增殖。贝伐单抗减少肿瘤血管新生、增强血管完整性、减少肿瘤相关水肿并提升临床生活质量。理论上，持续给予抗血管新生药物应导致血管网络破坏，阻止氧气与养分输送，并最终引起肿瘤饥饿。然而，这些抗肿瘤效应也受到由抗血管内皮生长因子药剂有效降低血管渗透性并暂时逆转异常毛细血管渗漏的能力介导的“血管正常化”阻碍。暂时的“血管正常化”使血脑屏障完整性恢复，并限制贝伐单抗进一步渗透到脑实质中，从而降低多形性胶质母细胞瘤细胞的血管新生抑制和持续的肿瘤饥饿以提升病患存活。
发明内容
有鉴于前述内容，本发明目的之一是提供一种通过使用抗血管新生疗法治疗脑癌的方法。本发明另一目的是提供一种治疗脑肿瘤的试剂盒。所述方法与所述试剂盒能够在减少抗血管生成药物的剂量的同时提供更好的疗法。
为达到前述目的，本发明提供一种减少治疗脑肿瘤所需贝伐单抗的有效量的方法，此方法包括以下步骤：施用贝伐单抗于受试者，其中所述贝伐单抗的量为0.011至11mg/kg体重；施用超声响应介质(ultrasound-response medium)于所述受试者；以及施用0.1至2MI(机械指数)的超声辐照(ultrasound exposure)于所述受试者。所述超声辐照优选为0.47至1.26MI，更优选为0.55至0.84MI。
所述贝伐单抗的量优选为0.11至11mg/kg体重，更优选为1.1至11mg/kg体重。优选地，所述贝伐单抗的施用为通过静脉内注射。
优选地，所述超声响应介质的施用为通过静脉内注射。优选地，所述超声响应介质为多个颗粒。优选地，所述颗粒平均粒径为0.1至10μm。优选地，所述多个颗粒用于施用的量为1.9×106至1.17×108个颗粒/kg体重。优选地，所述颗粒为微泡。
优选地，所述超声辐照施用于所述受试者的中枢神经系统。优选地，所述脑肿瘤为多形性胶质母细胞瘤。
本发明也提供一种治疗脑肿瘤的试剂盒，其包含：贝伐单抗制剂；超声响应介质；以及包含超声换能器的聚焦超声系统。
优选地，所述贝伐单抗制剂包含0.11至25mg/ml的贝伐单抗及注射用载体；其中所述mg/ml是基于所述贝伐单抗制剂的总体积。优选地，所述注射用载体为水、盐水、聚合物、乳化剂、表面活性剂或其组合。
优选地，所述超声响应介质包含1×104至1×1012个颗粒/ml的颗粒；其中所述颗粒/ml是基于所述超声响应介质的总体积。优选地，所述颗粒平均粒径为0.1至10μm。
优选地，所述超声响应介质与注射用载体混合。优选地，所述注射用载体为水、盐水、聚合物、乳化剂、表面活性剂或其组合。
优选地，所述脑肿瘤为多形性胶质母细胞瘤。
优选地，所述超声系统为基于医学成像的引导超声系统。优选地，该医学成像包括神经导航、超声波造影术、光学成像、计算机断层扫描术、核成像(CT)或核磁共振成像(MRI)。
附图说明
图1为利用超声血脑屏障开启以增强贝伐单抗在具有神经胶质瘤的小鼠中的递送的实验设计的时程。贝伐单抗经由静脉内注射以50mg/kg体重每周(首次MRI扫描后第1、8、15、22和29天)施用，且肿瘤进展和存活使用T2-MRI纵向追踪。超声辐照每周进行(首次MRI扫描后第1、8、15、22和29天，贝伐单抗IV施用前)。
图2描绘利用超声诱导的血脑屏障(BBB)开启的概念和代表性核磁共振成像技术观察。(a)实验方法概念图，其使用超声诱导的血脑屏障开启以增强用于神经胶质瘤治疗的贝伐单抗递送。(B至I)采用中等(0.4MPa，即0.63MI)与强烈(0.8MPa，即2MI)超声辐照水平的超声诱导血脑屏障开启的代表性CE-MRI分析。(b、c)对比增强T1权重图像的信号强度水平增加图谱(以％计)；(d、e)R1图谱的曲线下面积(AUC)累积(以s-1·min计)；(f、g)Ktran图谱(以min-1计)；(h、i)Ve图谱。
图3显示递送的贝伐单抗渗透的量化、与MR成像的相关性及蛋白质印迹。(a)在不同超声辐照水平(0、0.4和0.8MPa，即分别0、0.63和2MI)下的贝伐单抗浓度，通过高效液相测量的；(b至e)贝伐单抗浓度与不同的对比增强MRI指数的相关性，包括T1-WI的SI增加(图(b))、R1-AUC水平变化(图(c))、Ktrans水平变化(图(d))及Ve水平变化(图(e))。(f)蛋白质印迹，其显示超声诱导血脑屏障开启后增加的贝伐单抗进入中枢神经系统的渗透。(g)蛋白质印迹强度的定量分析的比较。符号“***”代表p<0.001。BEV代表贝伐单抗。
图4显示超声辅助的70kDa荧光标记的葡聚糖进入中枢神经系统的递送的荧光显微观察。(a、b)没有超声辐照的对照动物的左和右半球，且由于完整的血脑屏障而未检测到荧光信号。(c、d)在右半球用0.3MPa超声辐照处理的动物(荧光强度为42354±3937a.u.)。(e、f)在右半球用0.4MPa(即0.63MI)超声辐照处理的动物(荧光强度为81329±7926a.u.)。(g、h)在右半球用0.53MPa(即0.84MI)超声辐照处理的动物(荧光强度为85348±1050a.u.)。比例尺＝100μm。
图5显示超声辅助的150kDa荧光标记葡聚糖进入中枢神经系统的递送的荧光显微镜观察结果。(a、b)没有超声辐照的对照动物的左和右半球，且由于完整的血脑屏障，未检测到荧光信号。(c、d)在右半球用0.3MPa/0.4MHz超声辐照处理的动物(荧光强度为22716±3706a.u.)。(e、f)在右半球用0.4MPa(即0.63MI)超声辐照处理的动物(荧光强度为29208±7518a.u.)。(g、h)在右半球用0.53MPa/0.4MHz(即0.84MI)超声辐照处理的动物(荧光强度为52643±11644a.u.)。比例尺＝100μm。
图6显示超声辅助的250kDa荧光标记葡聚糖进入中枢神经系统的递送的荧光显微观察结果。(a、b)没有超声辐照的对照动物的左和右半球，且由于完整的因血脑屏障未开启，故未检测到任何荧光信号。(c、d)在右半球用0.3MPa(即0.47MI)超声辐照处理的动物(荧光强度为42012±5764a.u.)。(e、f)在右半球用0.4MPa(即0.63MI)超声辐照处理的动物(荧光强度为60504.81±1956.97a.u.)。(g、h)在右半球用0.53MPa(即0.84MI)超声辐照处理的动物(荧光强度为71672±7770a.u.)。比例尺＝100μm。
图7显示在各种不同触发压力和分子大小下通过超声增强的荧光强度变化的比较。未接受超声辐照的对照动物由于血脑屏障的阻断不允许葡聚糖渗透。当施加较高声压或施用较小尺寸的荧光标记葡聚糖时，可检测到较高荧光强度。
图8显示荧光强度与三种荧光标记葡聚糖浓度的相关性。(a至c)各种大小的荧光标记葡聚糖全部显示荧光强度与浓度之间的高度相关性(对于70kDa(图(a))、150kDa(图(b))和250kDa(图(c))，r2分别为0.9517、0.8447和0.9679)。
图9显示代表性T2加权MRI以追踪肿瘤进展。(a至d)在各实验组中自第7天至第35天每周使用T2加权MRI监测脑肿瘤进展。单独的超声诱导血脑屏障开启(图(b))呈现与未处理的对照(图(a))类似的肿瘤进展；而单独的贝伐单抗施用提高肿瘤进展的抑制(图(c))。在组之间，超声诱导血脑屏障开启与贝伐单抗施用的组合提供最显著的肿瘤抑制效果(图(d))。
图10显示肿瘤进展与动物存活分析。(a、b)各实验组自第7天至第35天的肿瘤进展。图(a)显示肿瘤体积(单位为mm3)，图(b)显示肿瘤每周进展率(单位为百分比)。(c)Kaplan-Meier曲线以显示各实验组中的动物存活。BEV代表贝伐单抗。
图11显示HE染色及CD-31染色免疫组织化学(IHC)荧光显微分析的比较。(a至c)HE染色和CD-31IHC显微分析显示用单独贝伐单抗施用处理的脑肿瘤。(d至f)HE染色和CD-31IHC显微分析显示用结合的超声诱导血脑屏障开启与贝伐单抗施用处理的脑肿瘤。比例尺＝500μm。(g)肿瘤区域内测量的血管密度的定量比较。(h、i)放大图像显示分别获自(c)和(f)的CD-31标记的脉管系统。比例尺＝100μm。
图12显示显示经注射镓-68-贝伐单抗15分钟后的BBB-开启小鼠的代表性衰减校正PCT/CT图像。(a)实验组(n＝3)，小鼠用超声处理以及注射镓-68-贝伐单抗。圆圈表示超声靶向部位。对照组(n＝3)接受同剂量的镓-68-贝伐单抗注射，但未接受超声处理。b.血脑屏障开启效应的PET量化，以及所有组中主要器官(心脏、肝脏、肾脏、肺、肌肉)的生物分布特征。
图13显示递送的贝伐单抗渗透的量化。“空白”代表对照组(未处理组)。“50mg”、“30mg”和“10mg”分别代表接受50mg/kg体重、30mg/kg体重、10mg/kg体重的贝伐单抗处理，但没有超声辐照的组。“超声+50mg”、“超声+30mg”和“超声+10mg”分别代表接受50mg/kg体重、30mg/kg体重和10mg/kg体重的贝伐单抗处理及超声辐照的组。
图14显示按照体积的肿瘤进展。“对照”代表对照组(未处理组)。“50mg”代表接受50mg/kg体重的贝伐单抗处理但没有超声辐照的组。“超声+30mg”及“超声+10mg”分别代表接受30mg/kg体重或10mg/kg体重的贝伐单抗及超声辐照的组。
图15显示小鼠模型实验的存活概率。“对照”代表对照组(未处理组)。“50mg”代表接受50mg/kg体重的贝伐单抗但没有超声辐照的组。“超声+30mg”及“超声+10mg”分别代表接受30mg/kg体重或10mg/kg体重的贝伐单抗及超声辐照的组。
具体实施方式
低压爆发模式(burst mode)经颅超声辐照可以局部、暂时和可逆地开启血脑屏障。经颅超声辐照能够将聚焦能量非侵入地输送至深部大脑位置。血脑屏障破坏可增加脑内治疗剂的局部浓度而不损伤正常组织。
本说明书中使用的“有效量”一词是指试剂、药物或药品足以对需要的受试者获得预期效果的量。本说明书中使用的“治疗脑肿瘤”或类似叙述是指，但不限于减少/阻止肿瘤进展、减小肿瘤大小、减少/阻止肿瘤对受试者的正常生理的影响，或其组合。
本说明书中采用的“超声响应介质”一词是指能响应于超声的声功率而提供空化的介质。在优选实施方式中，该空化能开启血脑屏障，且更优选能增加跨血脑屏障的渗透性。不受理论所限，该超声响应介质与该超声辐照协同地使用以开启或破坏血脑屏障，由此增加药物的渗透性。
本发明一方面是提供一种增强贝伐单抗治疗脑肿瘤的效果的方法。通过使用本方法，可减少治疗脑肿瘤所需的贝伐单抗的有效量。在替代实施方式中，该脑肿瘤可为脑膜瘤或星形细胞瘤。在特定实施方式中，该星形细胞瘤为多形性胶质母细胞瘤。
本发明的方法包括施用贝伐单抗于受试者；施用超声响应介质于该受试者；以及施用超声辐照于该受试者。在替代实施方式中，没有用于实施以上三个步骤时的特定顺序。
在优选实施方式中，用于施用的该贝伐单抗量是针对人类。在替代实施方式中，用于施用的该贝伐单抗量由从小鼠模型实验取得的数据计算。举例而言，此计算是基于Reagan-Shaw et al.,FASEB J.2008Mar；22(3):659-61所教导的公式。在一实施方式中，该贝伐单抗的量为0.011至11mg/kg体重；优选为0.11至11mg/kg体重；更优选为1.1至11mg/kg体重。
在替代实施方式中，该超声响应介质是多个颗粒。在优选实施方式中，1.9×106至1.17×108个颗粒/kg体重的量的所述颗粒。在替代实施方式中，该颗粒的平均粒径为0.1至10μm。
优选地，该颗粒为微泡(microbubble)。在替代实施方式中，该微泡具有核壳结构；其中该壳由生物相容性材料(包括但不限于白蛋白、脂质或聚合物等等)制成，且该核为生物相容的气态介质。在替代实施方式中，该微泡包含白蛋白涂覆的微泡、脂质壳微泡、气体填充的微泡或其组合。在另一替代实施方式中，该微泡可以为市场上销售的商业产品，如或的产品。
在替代实施方式中，该超声辐照为0.1至2MI(机械指数，定义为P为峰值负压(单位为MPa)和f为频率(单位为MHz))；优选为0.47至1.26MI；更优选为0.55至0.84MI。优选地，该超声辐照施用于受试者的中枢神经系统；更优选地，施用在受试者的脑上。
本发明的另一方面是一种治疗脑肿瘤的试剂盒。在替代实施方式中，该试剂盒用于实施本发明的方法。在替代实施方式中，该脑肿瘤可为脑膜瘤或星形细胞瘤。在特定实施方式中，该星形细胞瘤为多形性胶质母细胞瘤。本发明的试剂盒包含贝伐单抗制剂；超声响应介质；以及超声系统。在替代实施方式中，该贝伐单抗制剂包含0.11至25mg/ml的贝伐单抗以及注射用载体。该注射用载体可为，但不限于水、盐水、聚合物、乳化剂、表面活性剂或其组合。
本发明试剂盒中的该超声响应介质与先前关于本发明方法的段落中所载明的相同。在优选实施方式中，该超声响应介质与注射用载体混合成制剂，且该制剂包含1×104至1×1012颗粒/ml的颗粒；其中该颗粒/ml是基于该制剂的总体积。可选地，该注射用载体为水、盐水、聚合物、乳化剂、表面活性剂或其组合。在优选实施方式中，该颗粒配制为包含该颗粒、盐水及肝素的制备物。
典型超声系统通常包含超声换能器以及水槽。在特定实施方式中，该超声系统为基于医学成像的引导超声系统。在优选实施方式中，该超声系统为神经导航引导的超声系统，其还包括神经导航系统(Tsai et al.,Ultrasonics Symposium(ICU),2015年国际电机电子工程师学会超声研讨会)。在替代实施方式中，该超声系统可为超声波造影术引导的超声系统、光学成像引导的超声系统、计算机断层扫描术引导的超声系统、核成像(CT)引导的超声系统或MRI引导的超声系统。
以下实验与细节提供更多关于本发明的精神与概念的解释。应注意，以下信息无意限制本发明的保护范围。所属技术领域普通技术人员在不违背本发明的精神下将能够针对以下的本发明详细描述进行改变。
实验1-4
以下实验1-4的材料与方法：
1.U87神经胶质瘤动物模型
将U87小鼠神经胶质瘤细胞在37℃下以5％的CO2培养于含有10％胎牛血清及1％青霉素/链霉素的MEM(Invitrogen)中。来自乐斯科(BioLASCO)(Taiwan)的无病原雄性NU/NU小鼠(5到7周大，20-25克)饲养于受控环境中，且所有实验皆获实验动物照护及使用委员会批准。为植入U87细胞，将动物以2％异氟烷气体麻醉，并将动物固定在立体定位框架上。自覆盖颅盖的皮肤进行矢状切割，并使用27G针头在前囟前方1.5mm和侧面2mm的暴露头盖中形成孔洞。将5μl的U87细胞悬浮液(1×105个细胞/μl)在距大脑表面2mm的深度处注射5分钟的时间，且将针头经2分钟抽出。异种移植物的生长通过核磁共振成像监测移植后10天。
2.实验设计
使用12只正常小鼠和42只荷瘤小鼠。在组1中，目的为评估超声诱导的血脑屏障开启是否增强正常小鼠(n＝4)的贝伐单抗渗透，并确定适当的超声功率范围(n＝4)及进行蛋白质印迹分析(n＝8；4只正常小鼠和4只荷瘤小鼠)。在组2中，目的为评估与超声辐照组合的贝伐单抗在荷瘤小鼠中的治疗功效。具有四个亚组：(1)假治疗组(n＝7)；(2)仅超声辐照(n＝9)；(3)仅贝伐单抗(n＝6)，贝伐单抗通过静脉内注射每周(首次MRI扫描后的第1、8、15、22和29天)以50mg/kg体重给予；和(4)贝伐单抗+超声-BBB开启(n＝12)，贝伐单抗通过静脉内注射每周(首次MRI扫描后的第1、8、15、22和29天)以50mg/kg体重给予。在组2中，终点为MRI测定的肿瘤体积>200mm3或一周内体重降低超过20％。实验设计的时程显示于图1中。
3.超声辐照
超声是根据Tsai et al.,Ultrasonics Symposium(IUS),2015年国际电机电子工程师学会超声研讨会的神经导航引导超声。超声换能器(美国华盛顿州Sonic ConceptsInc.，直径＝60mm、曲率半径＝52mm、频率＝400kHz)用于产生聚焦的超声能量。任意函数发生器(33220A,Agilent,Palo Alto,California)用于产生驱动信号，该驱动信号送入以爆发模式操作的射频功率放大器(No.500-009,Advanced Surgical Systems,Tucson,AZ)中。被麻醉的动物被固定在立体定位框架上，且PE-10导管插入尾部静脉中。动物被直接放置在压克力水槽下，使头部牢固地贴附在底部的4×4cm2薄膜窗上以允许超声能量进入。超声之前，将SF6填充的超声颗粒(2-5μm，10μl/小鼠，2×108个微泡/ml；Bracco,Milan,Italy)静脉内施用。肿瘤植入的半球脑部位然后暴露于爆发-音频(burst-tone)模式超声(电功率＝4-18W；峰值负压＝0.1-2MI；爆发长度＝10ms；脉冲重复频率＝1Hz；辐照时间＝60s)。
4.核磁共振成像(MRI)
使用对比增强核磁共振成像通过Gd-DTPA施用(Magnevist,Wayne,NJ,USA)评估提高的血脑屏障渗透性，并取得以下成像指数：(1)注射Gd-DTPA后，T1加权图像中信号强度增加；(2)一段时间上R1弛豫效率的曲线下面积(表示为R1-AUC)；(3)动力学参数“Ktrans”，从血管内系统至细胞外血管外空间的转移速率常数，从Kety’s区室模型表征的；(4)动力学参数“Ve”，EES中对比剂的体积分数，从Kety’s区室模型表征的。
取得磁敏感加权成像序列以确定大规模红细胞外渗(参数：TR/TE＝30ms/18ms；翻转角＝40°；层面厚度＝0.6mm；矩阵大小＝256×384；和FOV＝80×130mm2)。MRI图像在7-特斯拉核磁共振扫描仪(Bruker ClinScan,Germany)上取得，且4通道表面线圈用于小鼠脑的顶部上。被麻醉的动物置于压克力支架上，并定位在磁心(magnet center)中。肿瘤大小使用基于快速自旋回波的T2加权图像用以下参数量化：脉冲重复时间(TR)/回波时间(TE)＝2540/41ms；FOV＝19×30mm2(156×320像素)；层面厚度＝0.5mm；翻转角＝180；总采集时间＝155秒。相对肿瘤大小通过测量含有最大肿瘤面积的单图像玻片来估计，和动物每7天纵向成像直到第一次MRI扫描后的35天。
5.组织学检验
将伊文思蓝染剂通过静脉内注射，且2小时后牺牲动物。在来自多聚甲醛固定的石蜡包埋的脑的10μm切片上进行组织病理学分析。在室温下将玻片置于容纳盐酸-亚铁氰化钾溶液的染色壶中30分钟。玻片以核快红(nuclear fast red)复染5分钟。使用苏木精和曙红(H&E)染色评估脑组织损伤及肿瘤进展。
为评价血管分布，使用抗小鼠CD-31抗体(1:500,550274,BD Pharmingen,NJ,USA)以及山羊抗大鼠Dylight 488抗体(1:200,405409,Biolegend CA,USA)对玻片进行免疫荧光分析。肿瘤血管量化为相对于肿瘤横截面积的总血管面积。
6.蛋白质印迹
来自均质化脑组织的50μg蛋白质(山羊抗人IgG,AP112P,Millipore,USA)用于蛋白质印迹分析。薄膜上的条带光密度使用BioSpectrum Imaging System(UVP LLC,Upland,CA)分析。
7.定量贝伐单抗分析
动物在超声后2小时牺牲，且脑分为左和右半球和用10μl/mg的甲醇均质化。提取的贝伐单抗通过具有L-2400紫外检测器和L-2132型泵(Hitachi)及SUPELCOSILTMLC-18柱(4.6 250mm)的高效液相进行分析。
8.统计分析
使用双侧非配对t检验或Mantel-Cox检验计算统计学显著性。Kaplan-Meier法用于存活分析。统计学显著性设定为p<0.05。
实验1：超声有效地开启血脑屏障且增加贝伐单抗在脑内的浓度
本实验中，根据上述方法进行0.63MI或2MI(即峰值负压0.4MPa或0.8MPa)的经颅超声辐照，以评估其对开启血脑屏障的效果。而且，贝伐单抗在进行超声辐照前施用以观察超声辐照是否对贝伐单抗穿过血脑屏障的渗透产生任何益处。
血脑屏障的开启通过对比增强核磁共振成像进行确认。使用四种类型的CE-MRI指数进行这一确认。图2中显示的结果表明0.63MI和2MI超声辐照再者皆有效地在目标脑区开启血脑屏障。另外，较高压力造成较大的血脑屏障开启效应。
高效液相用于定量脑中的贝伐单抗浓度。结果显示，超声提升了贝伐单抗在中枢神经系统实质(parenchyma)中的浓度。中等的0.63MI超声辐照导致0.175±0.15μM的贝伐单抗渗入中枢神经系统中(即提高5.73倍)，而强烈的2MI超声辐照大量提高贝伐单抗至1.554±0.37μM(即提高58.77倍)(图3a)。在对照中，贝伐单抗通常限制于循环中，仅非常少量渗透入中枢神经系统中(0.026±0.02μM)。也分析具有与贝伐单抗浓度的相关性的四种CE-MRI指数(图3b至e)。观察到R1-AUC具有与测得的贝伐单抗水平的最高线性相关性(图3c；r2＝0.738)。T1加权图像中的信号强度增加或Ktrans提供与贝伐单抗水平的中等相关性，相关系数大于0.6(r2分别为0.678和0.606；图3b和3d)；而Ve与贝伐单抗水平最少相关(r2＝0.56；图3e)。总体上，四种指数提供与体内超声诱导血脑屏障开启增强中枢神经系统贝伐单抗递送的充分相关。
实验2：超声诱导血脑屏障开启对不同分子大小的分子渗透的作用
为理解分子大小和超声辐照水平对分子渗透的影响，使用与贝伐单抗分子量(150kDa)相似的荧光标记葡聚糖(70至250kDa)作为替代物在中等辐照水平(即0.4MPa/0.63MI)周围微调辐照水平(0.55MI至0.84MI)。0.55MI以上的压力水平发现能够诱导血脑屏障开启，并允许所有大小的分子的渗透，包括70kDa(图4)、150kDa(图5)和250kDa(图6)的荧光标记葡聚糖，表明0.63MI辐照水平应当对于最少高达250kDa的分子提供稳定和一致的分子渗透。然而，通过提高超声辐照水平或降低分子量，荧光强度在脑中提高，表明较小分子或较高辐照水平造成较高的分子渗透(图7)。超声辐照提高至0.84MI开始诱导明显的但最小的红细胞外渗(图8c)，但在较低辐照水平下未观察到(图8a至b)。0.84MI辐照引起的这些外渗不能在T2*MRI中检测到；相反，2MI辐照诱导T2*MRI中信号强度的明显下降，表明相对0.84MI辐照诱导相对更大规模的红细胞外渗。总之，选择0.63MI超声辐照水平用于以下神经胶质瘤的肿瘤超声处理。
进行蛋白质印迹以测定超声辐照脑内的贝伐单抗蛋白水平(图3f)。在对照或仅超声动物中未检测到贝伐单抗。使用单独的贝伐单抗，仅检测出150kDa条带峰，指示中枢神经系统中存在贝伐单抗。相反，超声辐照(0.63MI)与贝伐单抗施用的组织明显提升了可检测的贝伐单抗蛋白的水平。超声与贝伐单抗施用产生杂交强度的将近3倍的提高(图3g)，这与由高效液相分析测定的提高的渗透相似(检测的计数中12,238相对于4,138)。
实验3：用于神经胶质瘤治疗的超声与贝伐单抗组合策略
本实验试图评估超声诱导血脑屏障开启促进贝伐单抗递送是否改善神经胶质瘤治疗。实验选择0.63MI的超声辐照水平以避免在计划的5周重复处理方案期间发生红细胞外渗。请参见“实验设计”章节与图1。
典型的肿瘤追踪图像如图9所示(第7天至第35天)，肿瘤体积进展通过T2-MRI测量(图10a-b)。整体而言，未处理对照(图9a)和单独的超声辐照(图9b)皆出现进行性的肿瘤生长(10至35天的追踪期的肿瘤进展率分别为172±33.2％和185±22.6％)。单独贝伐单抗的疗法(图9b)在施用前4个处理周中显示肿瘤抑制效果，但在第5周时肿瘤进展加速。总体肿瘤进展(152±27.7％)与对照(p＝0.6477)或仅超声(p＝0.3735)组没有显著差异。结合超声血脑屏障开启的贝伐单抗施用(图9d)在整个5周治疗方案期间持续地降低肿瘤进展，且在通过T2-MRI评估时显示最充分的肿瘤进展控制(45±16.11％、p＝0.0016，相对于对照组；图10a-b)。这一结果显示，由超声辐照促进的加强贝伐单抗渗透带来稳定且持续的抗血管生成效果，从而控制肿瘤进展。
组合的超声和贝伐单抗疗法共进行5周(第7天至第35天)，然后评估100天时的动物存活(图10c与表1)。仅超声的动物并未显示有效的存活时间延长，与MRI监测的肿瘤进展中观察到的相同(中位存活期＝34天，相对于对照组的31天；IST中位＝9.68％；p＝0.5407)。相较于对照，施用贝伐单抗5周显著延长存活期至46天(IST中位＝48.39％；p＝0.0369)。结合超声诱导血脑屏障开启与贝伐单抗施用的策略导致73天的显著提升的中位存活期，为对照组中位存活期的2.35倍和仅贝伐单抗组的1.58倍。当计算平均存活期和IST平均时，也得到同样的观察。
表1：动物存活分析的概要。组合超声/贝伐单抗组的中位存活时间的增加(IST中位，以％计)为135％，远超过仅贝伐单抗组的48％。类似地，组合超声/贝伐单抗组的平均存活时间的增加(IST平均，以％计)为143％，远超过仅贝伐单抗组的76％；p值皆相对于对照组。
H&E染色和CD-31免疫组织化学(IHC)用于评价单独或与超声诱导血脑屏障开启组合的贝伐单抗施用后第4周肿瘤异种移植的形态学改变和血管分布(图11)。在单独贝伐单抗或贝伐单抗+超声血脑屏障开启中检测到类似的肿瘤形态：坏死肿瘤核心，伴随高度增殖的肿瘤边缘。在以单独贝伐单抗治疗的肿瘤(白色箭头指示处)，CD-31免疫组织化学染色呈现肿瘤边缘而非坏死核心内部的密集血管结构。相反，在贝伐单抗+超声处理的异种移植物中，观察到CD-31标示的血管分布的明显减少，且肿瘤边缘的尺寸也较仅单独贝伐单抗处理的肿瘤显著更小(以虚线勾画；图11c和图11f)。肿瘤血管的量化分析显示，以单独贝伐单抗处理的异种移植肿瘤中的平均(±SD)百分血管面积为0.93±0.19％。以组合超声和贝伐单抗处理的异种移植肿瘤中血管面积明显缩小，其为0.2±0.07％(图11c、图11f、图11g)。使用H&E染色在肿瘤周边区域中也出现组织坏死(图11b、图11e)。这些数据显示，增加超声血脑屏障开启增强贝伐单抗渗透且有效抑制血管生成，特别地在肿瘤外周，导致改善的肿瘤控制。
实验4：超声诱导血脑屏障开启提升贝伐单抗的渗透
先前实验中我们已显示超声提升不同大小分子的分子渗透。我们接着提出超声辐照可降低贝伐单抗治疗多形性胶质母细胞瘤的所需剂量。为验证此假设，正常小鼠和荷瘤小鼠在有或没有超声的情况下用不同剂量的贝伐单抗处理。中枢神经系统实质中的贝伐单抗浓度由高效液相法测定。因此制成渗透曲线(给定剂量vs.中枢神经系统实质中的贝伐单抗浓度)。超声和高效液相的操作与之前实验1至4中给出的相同。
具体地在该实验中，使用42只正常小鼠42只荷瘤小鼠。在组1中，小鼠仅施用50mg/kg体重的贝伐单抗(n＝3)，或组合施用超声(n＝3)；在组2中，小鼠仅施用25mg/kg体重的贝伐单抗(n＝3)，或组合施用超声(n＝3)；在组3中，小鼠仅施用10mg/kg体重的贝伐单抗(n＝3)，或组合施用超声(n＝3)；在组4中，小鼠不处理(n＝3)用作阴性对照。贝伐单抗浓度也可通过微型PET/微型-CT测定。以下为使用微型PET/微型-CT评估贝伐单抗分布的动态变化的初步结果。
通过微型PET/微型-CT融合成像测定贝伐单抗分布的动态变化，贝伐单抗用放射性同位素68Ga3+(半衰期68分钟；过程参见补充方法)进行放射性标记。对两组在进行静脉内注射后15分钟获取PET图像及代表性冠状PET图像，此时目标区域的对比度由于非特异性结合达到最大。
血脑屏障开启的小鼠中镓-68-贝伐单抗的渗透通过使用超声处理结合的颗粒施用在未超声处理区域中显示显著的增强。镓-68-贝伐单抗的渗透从0.16±0.026SUVmax提升至0.64±0.09SUVmax(图12a)，对应于4倍增强，此结果与高效液相量化的结果相当(5.73倍)。系统摄取显示，贝伐单抗大多由肾脏吸收并代谢。经历超声血脑屏障开启的动物不改变贝伐单抗的代谢途径，虽然相较于对照具有些微的SUVmax降低(7.53±4.05SUVmaxv.s.8.19±7.29SUVmax；p>0.05；见图12b)。
实验5
以下实验5的材料和方法：
1.实验设计
总共使用45只荷瘤小鼠，其中包括正常小鼠(n＝19)与荷瘤小鼠(n＝26)。实验分为两组，在实验组1中，主要目的为评估超声诱导血脑屏障开启是否增强贝伐单抗渗透及在脑组织中的沉积(n＝19)。大多数正常动物被分为两组，没有超声诱导的血脑屏障开启(n＝10)和具有超声诱导的血脑屏障开启(n＝9)，且具有贝伐单抗浓度的脑样品以酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒进行量化。于施用贝伐单抗2小时后，将所有动物牺牲，并留存脑样品。
在实验组2中，目的为评估与超声结合的贝伐单抗在荷瘤小鼠中的疗效。U87神经胶质瘤细胞植入后10天，进取贝伐单抗摄取。贝伐单抗静脉内施用5次(U87神经胶质瘤细胞植入后第10、17、24、31和38天)，并纵向追踪肿瘤进展和存活。动物分为4个亚组：(1)假治疗组(不施用贝伐单抗)(n＝10)；(2)每周10mg/kg的贝伐单抗，连续5周，组合超声诱导的血脑屏障开启(n＝8)；(3)每周30mg/kg贝伐单抗，连续5周，组合超声诱导的血脑屏障开启(n＝12)；和(4)每周50mg/kg的贝伐单抗，连续5周(n＝6)。
2.超声参数
超声是根据Tsai et al.,Ultrasonics Symposium(IUS),2015年国际电机电子工程师学会超声研讨会的神经导航引导超声。超声换能器(Imasonics,Besancon,France；直径＝60mm、曲率半径＝80mm、频率＝400kHz)用于产生聚焦的超声能量任意函数发生器(33120A,Agilent,Palo Alto,CA)用于产生驱动信号，该驱动信号送入以爆发模式运行的射频功率放大器(No.500-009,Advanced Surgical Systems,Tucson,AZ)中。以2％异氟烷麻醉动物，并将其固定在立体定位框架上，使用理发器剃除颅骨顶端毛发，并于尾部静脉中插入PE-10导管。动物被直接放在压克力水槽下(在底部的4×4cm2的窗口用薄膜密封以允许超声能量进入)，头部使固定牢固地贴附至薄膜窗口。处理前，将SF6填充的超声颗粒(2-5μm，10μl/小鼠，2×108个微泡/ml；Bracco,Milan,Italy)以静脉内注射方式施用。植入肿瘤的脑部位接着暴露于爆发-音频模式超声以局部开启血脑屏障(0.63MI；爆发长度＝10ms；脉冲重复频率＝1Hz；辐照时间＝60s)。
3.小鼠神经胶质瘤模型
将U87小鼠神经胶质瘤细胞在37℃下湿润的5％CO2气氛中在补充10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的最小必要培养基(MEM)(Invitrogen)中培养。接着以胰蛋白酶处理收集细胞，并以磷酸缓冲盐水(PBS)清洗一次，和于MEM中再悬浮(1.6×105个细胞/μl)以植入小鼠脑的纹状体中。无病原雄性NU/NU小鼠(5到7周大)购自台湾乐斯科(BioLASCO)(Taiwan)。小鼠饲养和维持在受控环境中，所有实验程序遵循长庚大学实验动物照护及使用委员会的实验动物照护细则进行。为植入U87肿瘤细胞，先将动物以2％异氟烷气体麻醉，并将动物固定在立体定位框架上。自覆盖颅盖的皮肤进行矢状切割，并使用23G针头前囟前方2mm和侧向2mm的暴露头盖中形成孔洞。将3μl的U87神经胶质瘤细胞悬浮液注射至距大脑表面2mm深度处，注射经3分钟进行，再经2分钟将针头抽出。核磁共振成像监测小鼠脑的生长共肿瘤细胞植入10天。
4.定量贝伐单抗分析
施用贝伐单抗2小时后采集脑组织。将脑组织均质化、以5000rpm离心分离10分钟直到可见上清液流体与组织成分的明显分离。贝伐单抗的浓度以酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒(My Biosource,Inc.San Diego,CA,USA)测定。光密度使用吸收光谱仪于450nm下测定，减去620nm的背景。
实验5：超声提高贝伐单抗的渗透以及促进贝伐单抗治疗多形性胶质母细胞瘤的疗效
根据图13呈现的结果，基本上可以发现施用较高剂量的贝伐单抗导致进入大脑的贝伐单抗渗透增加。此外，10mg/kg体重的贝伐单抗与超声的处理在脑样品中表现出与50mg/kg体重的贝伐单抗但没有超声辐照的处理相当的贝伐单抗浓度。30mg/kg体重的贝伐单抗与超声的处理与50mg贝伐单抗而无超声辐照的处理相比显示出多得多的贝伐单抗渗透。结果显示，在超声辅助下，脑内达到相当的贝伐单抗浓度所需贝伐单抗量较少。此外，与对照组相比，处理组中的肿瘤进展为中等的。另外，超声辐照的组虽然接受较少量的贝伐单抗，也表现出类似结果(图14)。
进一步在存活实验中(图15)，特别地，30mg/kg体重的贝伐单抗组合超声的处理造成最佳的存活概率。10mg/kg体重贝伐单抗组合超声处理的组的存活概率与50mg/kg体重的贝伐单抗而无超声处理的组几乎一样好。该结果与上述的渗透实验一致，表明超声辅助更多的贝伐单抗渗透且由此提高存活率。
结论
综上所述，利用超声诱导的血脑屏障开启促进抗血管新生的单克隆抗体贝伐单抗的中枢神经系统递送。中枢神经系统的贝伐单抗浓度提升高达57倍(图2a)，导致对肿瘤外周的显著抗血管生成效果，且更重要的是，克服目前多形性胶质母细胞瘤治疗中贝伐单抗的血管正常化挑战。除此之外，本研究发现与仅贝伐单抗施用的48％提高相比更显著的疗效提升，其中增强贝伐单抗递送的组合超声得到135％的中位存活提高(表1)。本研究提供开发结合超声以提升单克隆抗体(或其他大分子)的中枢神经系统递送的治疗策略的原理验证，并表明以超声/贝伐单抗组合为在希望的抗-GBM策略。

Claims (23)

1.一种减少治疗脑肿瘤所需贝伐单抗有效量的方法，所述方法包括以下步骤：
对受试者施用贝伐单抗，其中所述贝伐单抗的量为0.011至11mg/kg体重；
对所述受试者施用超声响应介质；及
对所述受试者施用0.1至2MI的超声辐照。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述超声辐照为0.47至1.26MI。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述超声辐照为0.55至0.84MI。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述贝伐单抗的量为0.11至11mg/kg体重。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述贝伐单抗的量为1.1至11mg/kg体重。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述贝伐单抗的所述施用是通过静脉内注射。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述超声响应介质的所述施用是通过静脉内注射。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述超声响应介质是多个颗粒。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述颗粒具有0.1至10μm的平均粒径。
10.如权利要求8所述的方法，其中用于所述施用的所述多个颗粒的量为1.9×106至1.17×108个颗粒/kg体重。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述颗粒是微泡。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述超声辐照施用于所述受试者的中枢神经系统上。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述脑肿瘤是多形性胶质母细胞瘤。
14.一种治疗脑肿瘤的试剂盒，其包含：
贝伐单抗制剂；
超声响应介质；及
超声系统，其包含超声换能器。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述贝伐单抗制剂包含0.11至25mg/ml的贝伐单抗及注射用载体，其中所述的mg/ml是基于所述贝伐单抗制剂的总体积。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述注射用载体是水、盐水、聚合物、乳化剂、表面活性剂或其组合。
17.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述超声响应介质包含1×104至1×1012个颗粒/ml的颗粒；其中所述的颗粒/ml是基于该超声响应介质的总体积。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述颗粒具有0.1至10μm的平均粒径。
19.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述超声响应介质与注射用载体混合。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述注射用载体是水、盐水、聚合物、乳化剂、表面活性剂或其组合。
21.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述脑肿瘤是多形性胶质母细胞瘤。
22.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述超声系统是基于医学成像的引导超声系统。
23.如权利要求22所述的试剂盒，其中所述医学成像包括神经导航、超声波造影术、光学成像、计算机断层扫描术(CT)、核成像或核磁共振成像(MRI)。
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