CN108392510A - 玛咖水提取物在缓解酒精引起的运动障碍中的应用 - Google Patents

玛咖水提取物在缓解酒精引起的运动障碍中的应用 Download PDF

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Abstract

一种玛咖水提取物在缓解酒精引起的运动障碍中的应用，通过以野生型秀丽隐杆线虫为建模基础建立醉酒模型，醉酒模型中的线虫反映出明显的运动障碍，而多巴胺神经递质的传导与线虫运动相关，因此测定在酒精引起的运动障碍中α‑突触核蛋白的表达情况及多巴胺神经元表达量，可反映出药物在酒精引起的运动障碍中对多巴胺神经元的影响。玛咖水提取物水溶液以5‑15mg/ml的体积终浓度加入到醉酒模型中时，线虫α‑突触核蛋白平均荧光强度大为提高，较少有聚集情况，多巴胺神经元平均荧光强度大为提高，轮廓较清晰，表明，玛咖水提取物能有效缓解由于酒精引起的运动障碍，且对与运动相关的多巴胺神经元有保护作用，能减轻多巴胺神经元的损伤。

Description

玛咖水提取物在缓解酒精引起的运动障碍中的应用
技术领域
本发明涉及一种玛咖水提取物在缓解酒精引起的运动障碍中的应用，特别是基于野生型秀丽隐杆线虫的醉酒模型，玛咖水提取物在缓解酒精引起的运动障碍中的应用。
背景技术
中国传统礼仪是以酒待客。逐渐地，酒在社交中成为了不可或缺的一部分，但长期大量喝酒会对身体造成严重地影响。例如，阿尔茨海默症、帕金森氏病等神经退行性疾病。因为酒是纯热能食物之一，在体内分解可产生能量，但不含任何营养素，喝酒过多会限制其它营养素的摄入，造成多种营养素的缺乏，间接导致多种神经系统伤害。同时，过量饮酒，若酒精分解能力不足极易引起酒精中毒，甚至导致休克。因此，酗酒对人体产生的神经伤害越来越受到重视。
秀丽线虫是一种研究神经系统功能及相关疾病常用的模式动物，主要的神经递质系统和遗传传递网络在系统发生上都高度保守，具有丰富的易于获得的突变体资源，且生命周期短、实验操作简单，是一种最佳的建模生物，可以此建立模型研究药物对抑制酒精引起的神经毒性作用，尤其是对多巴胺神经递质传导，及神经元功能的影响。
中草药是我国巨大的宝藏，药食两用的中草药资源也是极为丰富，为神经保护方面的防治研究提供了庞大的资源库。玛咖含有丰富的蛋白质、氨基酸等多种营养物质，还含有玛咖烯、玛咖酰胺、多糖等活性成分。玛咖具有抗疲劳、提高生育能力、抗骨质疏松、抗氧化等功效(潘明佳，时圣明，王文倩,等.玛咖的化学成分、药理作用及质量评价研究进展[J].现代药物与临床,2015,30(12):1558-1562.)，是一种具有高食用价值及药用价值的植物。但目前还未报道玛咖的解酒功效及对抗酒精神经毒害的作用。本申请基于野生型秀丽隐杆线虫模型验证，了解其对神经系统的影响，为开发新型抗酒精神经毒害作用的药物或保健食品提供了理论依据。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提供一种玛咖水提取物在缓解酒精引起的运动障碍中的应用，其以野生型秀丽隐杆线虫醉酒模型为基础进行研究，研究在酒精引起的运动障碍中玛咖水提取物对与运动有关的多巴胺神经元的保护作用。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：玛咖水提取物在缓解酒精引起的运动障碍中的应用，其中，该应用是指减轻多巴胺神经元损伤。
本发明以野生型秀丽隐杆线虫为建模基础建立醉酒模型，醉酒模型中的线虫表现出明显的运动障碍，而多巴胺神经递质的传导与线虫运动相关，因此测定在酒精引起的运动障碍中α-突触核蛋白的表达情况及多巴胺神经元表达量，可反映出药物在酒精引起的运动障碍中对多巴胺神经元的影响。具体操作过程如下：
1.建立野生型秀丽隐杆线虫醉酒模型
以野生型秀丽隐杆线虫(N2)为建模基础，对其进行液体培养(参照文献Stiernagle T.Maintenance of C.elegans[J].Wormbook,2006:1-11.对秀丽隐杆线虫进行同期化与基础培养)，使虫液浓度控制为2000-2500虫/mL，秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩OP50菌液为食；其中，虫液浓度是指液体培养时培养液的秀丽隐杆线虫浓度；而文中的虫液则是指培养秀丽隐杆线虫后的秀丽隐杆线虫浓度为2000-2500虫/mL的培养液。
待秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时，于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％-5％，干预24h，此时，秀丽隐杆线虫表现为醉酒状态。
2.玛咖水提取物的应用
玛咖水提取物的制备：将干制的玛咖粉碎成粉，用水以1g:10ml的料液比利用水浸提法反复浸提两次，过滤，合并两次滤液；然后转至旋转真空浓缩机中进行滤液浓缩，将浓缩液置于玻璃皿中密封，于-80℃冷冻至少2h，最后快速取出，冷冻干燥成粉。
将玛咖水提取物粉末用水完全溶解，并通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以5-30mg/ml的体积终浓度加入到上述醉酒模型中，干预24h，检测野生型秀丽隐杆线虫的头部摆动频率、吞咽运动、线虫内部酒精浓度，α-突触核蛋白的表达情况及多巴胺神经元表达量(分别采用NL5901和BZ555转基因虫株的荧光强度表示)。以醉酒状态的秀丽隐杆线虫为对照，培养后未加入酒精溶液的秀丽隐杆线虫为空白组。
结果显示：玛咖水提取物水溶液以5-15mg/ml的体积终浓度加入到上述醉酒模型中时，线虫α-突触核蛋白平均荧光强度大为提高，较少有聚集情况，多巴胺神经元平均荧光强度大为提高，轮廓较清晰，表明，玛咖水提取物能有效缓解由于酒精引起的运动障碍，且对与运动相关的多巴胺神经元有保护作用，能减轻多巴胺神经元的损伤。
本发明的有益效果：利用秀丽隐杆线虫这种公认的模式生物用于评价，方便易得，能有效降低试验成本；秀丽隐杆线虫通身透明，各器官与神经系统容易观察，主要的神经递质系统和遗传传递网络在系统发生上都高度保守；可结合GFP融合荧光蛋白技术标记特定神经元，也可直接从CGC申请有荧光标记神经元的虫株，利用荧光成像技术反映该基因表达水平及细胞成型形态，操作简单方便，结果更直观；玛咖水提取物的处理方式简单，且水提取法相比醇提取法能有效避免有机物的残留；采用模式生物线虫，生长周期短，繁殖速度快，能快速高效地筛选出最佳药效的药物浓度，为开发新型抗酒精神经毒害作用的药物或保健食品提供了理论依据。
附图说明
图1是秀丽隐杆线虫呈正常态时α-突触核蛋白及多巴胺神经元的荧光图。
图2是秀丽隐杆线虫呈醉酒态时α-突触核蛋白及多巴胺神经元的荧光图。
图3是5mg/ml玛咖药物组中秀丽隐杆线虫的α-突触核蛋白及多巴胺神经元的荧光图。
图4是10mg/ml玛咖药物组中秀丽隐杆线虫的α-突触核蛋白及多巴胺神经元的荧光图。
图5是15mg/ml玛咖药物组中秀丽隐杆线虫的α-突触核蛋白及多巴胺神经元的荧光图。
图6是20mg/ml玛咖药物组中秀丽隐杆线虫的α-突触核蛋白及多巴胺神经元的荧光图。
图7是30mg/ml玛咖药物组中秀丽隐杆线虫的α-突触核蛋白及多巴胺神经元的荧光图。
以上各图中，左图为NL5901转基因虫株，标记的是unc-54基因，右图为BZ555转基因虫株，标记的是dat-1基因(见图中方框内)，根据荧光强度来表征蛋白或基因标定。
具体实施方式
以下实施例中，NL5901转基因虫株和BZ555转基因虫株购自CGC(CaenorhabditisGenetics Center)。
实施例1秀丽隐杆线虫醉酒模型的建立
以野生型秀丽隐杆线虫(N2)作为模型建立基础，秀丽隐杆线虫的同期化与基础培养参照参考文献(Stiernagle T.Maintenance of C.elegans[J].Wormbook,2006:1-11.)中的液体培养法进行。秀丽隐杆线虫以菌液浓度为100mg/ml的浓缩OP50为食，虫液浓度控制为2000-2500虫/mL。此时，检测秀丽隐杆线虫，其头部摆动频率为50-100次/30s，吞咽运动为50-90次/30s，运动轨迹呈现出左右协调的正弦波长，线虫体内未检出外部摄入的酒精。α-突触核蛋白平均荧光强度(α-突触核蛋白是多巴胺神经元退变中重要特征性蛋白，采用NL5901转基因虫株，黄色荧光标记α-突触核蛋白)设定为1，多巴胺神经元平均荧光强度(采用BZ555转基因虫株，绿色荧光标记多巴胺神经元)设定为1，结合参见图1，线虫表现为正常态。
待秀丽隐杆线虫生长至刚进入成虫期时，于虫液中加入酒精溶液，使酒精溶液体积终浓度为1％-5％，干预24h。此时检测秀丽隐杆线虫，线虫的头部摆动频率为10-40次/30s，吞咽运动为10-40次/30s，线虫体内酒精浓度为30-50ng/μg蛋白，运动轨迹呈现出不协调的正弦波长且有拖尾现象，线虫体内总抗氧化能力和氧自由基(ROS)水平相对于正常态线虫的增强，此时的线虫表现出醉酒状态。
实施例2玛咖水提取物在酒精引起的运动障碍中的应用
玛咖水提取物的制备：取干制的玛咖，粉碎成粉，用水以1g:10ml的料液比利用水浸提法反复浸提两次，过滤，合并两次滤液；然后转至旋转真空浓缩机中进行滤液浓缩，将浓缩液置于玻璃皿中密封，于-80℃冷冻至少2h，最后快速取出，冷冻干燥成粉。
玛咖水提取物的加药方式：将玛咖水提取物粉末用水完全溶解，并通过0.22微米的过滤膜除菌，然后以5-30mg/ml的体积终浓度加入到上述醉酒模型中，干预24h。
设置空白组(虫液+水)、对照组(虫液+酒精溶液)、药物组(虫液+酒精溶液+药液)，检测野生型秀丽隐杆线虫的头部摆动频率、吞咽运动、线虫内部酒精浓度，α-突触核蛋白的表达情况及多巴胺神经元表达量(分别采用NL5901和BZ555转基因虫株的荧光强度表示，在荧光显微镜下，对荧光标记了的α-突触核蛋白及多巴胺神经元进行可视化表达)。其中：
空白组：见实施例1中第1段的描述。
对照组：见实施例1中第2段的描述。此时，α-突触核蛋白平均荧光强度是空白组荧光强度的210-320％，并出现异常聚集，多巴胺神经元平均荧光强度是空白组荧光强度的18-43％，胞体有萎缩甚至消失的情况，结合参见图2。对照组呈现出由于体内酒精的积累，抑制了线虫的基本运动性能，且多巴胺神经元开始有进行性退变的特征。
药物组：是将玛咖水提取物按前述的加药方式加入到对照组的醉酒模型中，干预24h。分别检测玛咖水提取物水溶液的体积终浓度为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml时，野生型秀丽隐杆线虫的头部摆动频率、吞咽运动、线虫内部酒精浓度，α-突触核蛋白的表达情况及多巴胺神经元表达量。结果如下：
5mg/ml玛咖药物组的秀丽隐杆线虫头部摆动频率为80次/30s、吞咽运动为75次/30s、线虫内部酒精浓度为20ng/μg蛋白，线虫α-突触核蛋白平均荧光强度是空白组荧光强度的115％，荧光表达的区域较空白组有所增加，表面α-突触核蛋白表达增强并有少量聚集情况。多巴胺神经元平均荧光强度是空白组荧光强度的96％，神经元局部仅有少量损失，但荧光强度较对照组有所增强。参见图3。表明：5mg/ml玛咖药物组的线虫能有效缓解由于酒精引起的运动障碍，且对与运动相关的多巴胺神经元有保护作用，能减轻多巴胺神经元的神经性损伤。
10mg/ml玛咖药物组的线虫头部摆动频率为90次/30s、吞咽运动为80次/30s、线虫内部酒精浓度为15ng/μg蛋白，线虫α-突触核蛋白平均荧光强度是空白组荧光强度的136％，荧光表达的区域较空白组有所增加，表面α-突触核蛋白表达增强并有少量聚集情况。多巴胺神经元平均荧光强度是空白组荧光强度的92％，神经元局部损失减少，头部三对神经元大部分表达荧光。参见图4。10mg/ml玛咖药物组的线虫能有效缓解由于酒精引起的运动障碍，且对与运动相关的多巴胺神经元有保护作用，能减轻多巴胺神经元的神经性损伤。
15mg/ml玛咖药物组的线虫头部摆动频率为75次/30s、吞咽运动为70次/30s、线虫内部酒精浓度为25ng/μg蛋白，线虫α-突触核蛋白平均荧光强度是空白组荧光强度的147％，荧光表达的区域较空白组有所增加，表面α-突触核蛋白表达增强并有聚集情况。多巴胺神经元平均荧光强度是空白组荧光强度的74％，神经元局部有部分损失，表现为胞体大小不一，且部分胞体荧光强度较弱，参见图5。15mg/ml玛咖药物组的线虫能具有缓解由于酒精引起的运动障碍的作用，虽然对与运动相关的多巴胺神经元的保护作用没有明显增强，但还是具有保护作用。
20mg/ml玛咖药物组的线虫头部摆动频率为40次/30s、吞咽运动为45次/30s、线虫内部酒精浓度为32ng/μg蛋白，线虫α-突触核蛋白平均荧光强度是空白组荧光强度的215％，荧光表达的区域较空白组有增加，表面α-突触核蛋白表达增强并有聚集情况。多巴胺神经元平均荧光强度是空白组荧光强度的45％，神经元局部出现萎缩甚至消失，尤其是头部靠前的两个神经元不表达荧光，轮廓较模糊，参见图6。20mg/ml玛咖药物组的线虫不能缓解由于酒精引起的运动障碍，且不能有效保护与运动相关的多巴胺神经元。
30mg/ml玛咖药物组的线虫头部摆动频率为36次/30s、吞咽运动为28次/30s、线虫内部酒精浓度为40ng/μg蛋白，线虫α-突触核蛋白平均荧光强度是空白组荧光强度的283％，荧光表达的区域较空白组有所增加，表面α-突触核蛋白表达增强并有聚集情况。多巴胺神经元平均荧光强度是空白组荧光强度的40％，神经元局部出现萎缩甚至消失，头部大部分神经元都有不表达荧光的情况，轮廓较模糊，参见图7。30mg/ml玛咖药物组的线虫不能缓解由于酒精引起的运动障碍，且无法维持与运动相关的多巴胺神经元的正常形态。
经检测，低浓度药物组(5-15mg/ml)的线虫头部摆动频率为40-90次/30s、吞咽运动为40-80次/30s、线虫内部酒精浓度为10-30ng/μg蛋白，低浓度药物组线虫α-突触核蛋白平均荧光强度提高了115-147％，较少有聚集情况，多巴胺神经元平均荧光强度是空白组荧光强度的74-96％，轮廓较清晰。而高浓度药物组(20-30mg/ml)的线虫头部摆动频率为30-60次/30s、吞咽运动为30-70次/30s，线虫体内酒精浓度为20-40ng/μg蛋白，高浓度药物组线虫α-突触核蛋白平均荧光强度是空白组荧光强度的148-209％，聚集现象略微有所减少，多巴胺神经元平均荧光强度是空白组荧光强度的49-73％，胞体有萎缩情况。表明，低浓度药物组能有效缓解由于酒精引起的运动障碍，且对与运动相关的多巴胺神经元有保护作用，能减轻多巴胺神经元的神经性损伤。而高浓度药物组对由于酒精引起的运动障碍及神经元损伤，无法恢复至正常水平。
文中提及的秀丽隐杆线虫的各项检测指标的检测方法：
(1)线虫运动的测定方法：
秀丽隐杆线虫的同期化与基础培养根据参考文献(Maintenance of C.elegans)中的方法进行。用于试验的线虫采用液体培养，酒精干预时的终浓度控制在2000±100条/mL。同期化后的线虫生长至L4期，完成幼虫阶段最后一次蜕皮进入成虫期时，加入浓度为0.6mM的FUDR溶液，并使其终浓度为0.12mM，以抑制线虫产卵及卵的孵出。12h后，将其进行分组且试验组加入不同浓度的玛咖水提取物，使其终浓度为5-30mg/ml，空白组加入与试验组等体积的无菌水，对照组加入与试验组等体积的3％酒精溶液。每组设3个平行。在20℃下轻微震荡培养24h后将各组虫液分别吸取20μl于NGM空白板上(每个板上线虫数量为40条左右)，20℃放置5min后，体视显微镜下记录30s内每条线虫头部的摆动次数及咽部吞咽次数。
(2)线虫体内酒精浓度的测定方法
线虫体内酒精浓度的测定，参照参考文献(Alaimo J T,Davis S J,Song S S,etal.Ethanol Metabolism and Osmolarity Modify Behavioral Responses to Ethanolin C.elegans[J].Alcoholism Clinical&Experimental Research,2012,36(11):1840-1850.)采用气相色谱法，并加以改进。
线虫在干预结束后，转移至离心管中，于冷冻离心机中4℃，2000转下，离心2min，去除培养液。用预冷M9缓冲液快速清洗虫体两遍，去除虫体上的OP50菌液及其他杂质，然后用冷的无菌水清洗一遍。最后弃去上清后，用冷的无菌水将各组线虫定容至1mL，并用封口膜将离心管封口处理，防止气体挥发。再将封口后的离心管置于超声波清洗机中，冰水浴环境下进行超声破碎，直至无完整虫体，破碎完全。破碎后置于冷冻离心机中4℃，12000转，离心10分钟，提取线虫体内的酒精溶液，上清液即为提取液。
乙醇标曲体积终浓度为0.0005％、0.001％、0.002％、0.003％、0.004％，在乙醇标曲及线虫提取液中加入正丁醇作为内标，使内标体积终浓度为0.002％。标曲及线虫样品经0.22微米过滤膜过滤处理，待上机检测。
(3)α-突触核蛋白、多巴胺神经元形态观察及其测定方法
测定方法参考文献(李嘉.丙烯酰胺暴露诱发秀丽线虫运动行为障碍及其神经毒性作用[D].华东师范大学,2015.)，线虫在干预结束后，将各组线虫转移至离心管中，用M9缓冲液清洗线虫虫体3遍，弃去培养液及虫体身上附着的OP50。然后分别挑取各组线虫于滴有2％琼脂糖的洁净载玻片上，并用100mM NaN3将线虫固定在琼脂糖上，盖上盖玻片。将麻醉后的线虫置于荧光显微镜下观察并拍照。利用荧光强度分析软件进行监测和分析α-突触核蛋白、多巴胺神经元的定量表达情况。

Claims (2)

1.玛咖水提取物在缓解酒精引起的运动障碍中的应用，其中，该应用是指减轻多巴胺神经元损伤。
2.玛咖水提取物在制备缓解酒精引起的运动障碍药物中的应用。
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