CN108350509B - 生物标记组成物，诊断用试剂盒及提供信息方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有序列号1或序列号2的碱基序列作为有效成分的核甘酸，包含所述组成物的诊断用试剂盒及包含检测F.prausnitzii的亚种(F06)步骤的异位性皮肤炎诊断用信息提供方法。利用本发明，可有效判别F.prausnitzii的亚种(F06)是否存在，特别地，因为在异位性皮肤炎发病之前可简单准确地诊断出发病可能性，对异位性皮肤炎发生前后个体都能有效地利用。

Description

生物标记组成物，诊断用试剂盒及提供信息方法

技术领域

本发明涉一种以序列号1或序列号2的碱基序列作为有效成分的生物标记组成物，包含所述组成物的诊断用试剂盒以及包含识别所述序列号1或序列号2碱基序列步骤的提供信息方法。

发明背景

异位性皮肤炎(Atopic dermatitis；AD)为在世界范围发病率愈来愈增加的疾病之一，是慢性炎症性皮肤疾病。异位性皮肤炎初次发作于幼儿期或童年期，是复发性炎症皮肤疾病，往往伴随瘙痒症﹑皮肤干燥症﹑湿疹。

异位性皮肤炎的症状随着患者年龄的增长发生变化，而病变部位伴随瘙痒症。在幼儿期初，其症状发生于耳光﹑胳膊﹑头部，也发生于身躯﹑胳膊﹑腿部。在幼儿晚期，其症状还会以耳垂﹑胳膊﹑腿部为主发生。

根据美国发表的统计资料，达25％的小儿和达2～3％的成人因异位性皮肤炎而遭受着痛苦。但是，异位性皮肤炎的发病原因还未明。虽然不能明确地说明其发病原因，异位性皮肤炎的发病率以产业化国家为中心增加，可知主要发病原因是由环境性因素和遗传性因素引起的。

虽不存在诊断异位性皮肤炎的特定检查，但在实行找出诊断异位性皮肤炎的恶化原因的检查。为了找出作为异位性皮肤炎发病原因的变应原而进行的检查有皮肤单子检查，血清内特意免疫血球素E检查﹑口内食物诱发检查﹑细菌培养检查等。

虽然异位性皮肤炎的直接原因与发病过程还未明，患者的皮肤损伤主要是因为TH2型免疫应答过敏反应于一般抗原，过度生产引起炎症的细胞因子而引起的。此时，皮肤的微型生物群落被单纯化，金黄色酿脓葡萄球菌数增加等带有特征性的问题的发生被观察到了。同时，有一项报告称肠内特定细菌与异位性皮肤炎有一定关系。

即使这些研究结果纷纷出炉，作为异位性皮肤炎发生根本原因尚未查明。因此，查出生物学上的异位性皮肤炎发病原因，诊察是否患有异位性皮肤炎发病是在本技术领域内至关重要的技术性课题。

发明内容

技术课题

本发明的目的在于提供一种包含序列号1或序列号2的碱基序列作为有效成分的碱基序列。

具体地，本发明的目的是提供检测F.prausnitzii亚种(F06)的生物标记组成物。

进一步具体地，本发明的目的是提供诊断用生物标记组成物。

此外，本发明的目的是提供具有与序列号1或序列号2 97％以上相同碱基序列作为有效成分的生物标记组成物。

本发明的另外一项目的在于提供作为有效成分包含序列号1或序列号2的碱基序列的一种诊断用试剂盒。

进一步具体地，检测出包含F.prausnitzii亚种(F06)的生物标记组成物的诊断用试剂盒，进一步具体的，是提供包含异位性皮肤炎诊断用生物标记组成物的诊断用试剂盒。

此外，本发明的目的是提供包含具有与序列号1或序列号2 97％以上相同碱基序列作为有效成分的生物标记组成物的诊断用试剂盒。

本发明的另外一项目的在于提供提供信息方法，其方法包括一下步骤：提供已分离核酸样本；识别包含所述序列号1或序列号2的碱基序列。

具体地，提供一种信息提供方法，识别包含所述序列号1或序列号2的碱基序列的步骤，包含提供检测F.prausnitzii亚种(F06)的步骤。

进一步具体地，提供一种信息提供方法，识别包含所述序列号1或序列号2的碱基序列的步骤是用于诊断异位性皮肤炎。

此外，本发明的目的是提供一种信息提供方法，包含所述序列号1或序列号2的碱基序列，是具有与序列1或序列2 97％以上序列相同性的碱基序列。

技术方案

下面将参照附件上的示图详细说明一些实施列，各示图上相同的参照符号意味着相同的结构。

下面将说明的实施列能被变更，如下所说的实施列目的不在于限定实施形态。因此，应理解这些实施列还包含变更的实施列，等同物乃至可替代物。

在实施列所用的词语并没有限定实施列的目的，而只是为了说明特定的实施列用的。从上下文看，单数的表达如没有明确的不同用处，还包含复数语义。在此说明书中，“包含”，或“具有”等词语用于指明在记载于说明书上的特征﹑数字﹑步骤﹑动作﹑构成因素或其组合的概念，不应被理解为用于提前排除一个或一个以上的其他特征或数字﹑步骤﹑动作﹑构成因素或其组合的概念或附加可能性。

如没有另外定义，在此用到的所有词语，包括技术性或科学性词语，在实施列所述技术领域中具有通常知识者通常理解的语义相同。像词典上有定义的一般用词语的语义应被解释为与有关技术文理上所具有的语义相同的语义。如在本专利申请没有明确的定义，不应被解释为过于形式化的语义。

并且，在说明参照附件上的示图时，与示图符号无关，对相同的构成因素应赋予相同的参照符号，并在此重复的说明应省略。在说明实施列时，如有关揭示技术的具体说明被判断为可能混淆实施列的主旨，应省略该具体说明。

下面将说明在本说明书所用的词语。

在本说明书中“生物标记”是指可以利用DNA﹑RNA﹑代谢产物等物质得知体内变化的指标。

在本说明书中的“基因组”是指包含人体本身具有的所有遗传信息的基因集合体。“微生物组”，又称第二基因组是指在体内共存微生物的遗传信息总和。特别地，“肠道内基因组”是指在体内，特别是在肠道内的微生物遗传信息总和。最近有报告称，在人体内的各种微生物对体内代谢﹑体内调整﹑消化能力或各种疾病产生影响，并因环境变化而导致的基因变形等对人体上所有功能产生影响。从而，肠道内基因组越来越受关注。

在本说明书中的“诊断”是指对个体状态或结果的进行的预测或诊断，个体的状态或结果，进行或个体受特定治疗时的反应预测。本发明的实施时如没有另行安排，应采用所属技术领域技术范围内的免疫学﹑生物化学﹑分子生物学﹑微生物学﹑细胞生物学﹑基因组以及重组DNA的通常技术。在本发明中，“个体”﹑“患者”或“对象体”不仅包括人类，还包括其他哺乳动物。

在本说明书的示图上记载的“AD”是指异位性皮肤炎(Atopic Dermatitis)，“SCFA”是指短链脂肪酸(short chain fatty acid)，“OTU”是指操作分类单位(Operational taxonomic units)，“GalNAc”是指n-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)，“KO”是指Kyoto大学的关于基因和基因组的数据库KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)Orthology。

根据本发明的一种状态，为达到上述目的，将提供序列号1或序列号2的碱基序列作为有效成分的生物标记组成物。

以序列号1或序列号2的碱基序列作为有效成分的生物标记组成物，可从具有疾病或有疑个体查出包含序列号1或序列号2的各种疾病的存否。

序列号1或序列号2的碱基序列如下(参照图4a-d)

序列号1-AGAGATGAGGAGCTTGCTCTTCAAATC

序列号2-ACGGCTCGGCATCGAGCAGAGGGAAAAGGAGTGAT

参照图4b，F06 V1领域的碱基序列不限于序列号1，而在碱基位置9可具有G或A，在碱基位置13可具有C或T，在碱基位置24可具有A或G。即position9(G,A),position13(C,T),position24(A,G)。同时，参照图4b，F06 V2领域碱基序列不限于序列号2，而在碱基位置3可具有G或A，在碱基位置5可具有C或G，在碱基位置16可具有G或C，在碱基位置20可具有A或G，在碱基位置32可具有T或C，在碱基位置33可具有G或A即position3(G,A),position5(C,G),position16(G,C),position20(A,G),position32(T,C),position33(G,A)。

根据本发明的一个实施例，生物标记组成物为检测F.prausnitzii的亚种(F06)的生物标记组成物。

序列号1或序列号2的碱基序列，是微生物组中检测出F.prausnitzii亚种(F06)的生物标记组成物。与F.prausnitzii的亚种F06有关联性的疾病，不管疾病的类型，可利用上述生物标记组成物。

根据本发明的其他一个实施例，生物标记物为异位性皮肤炎诊断用生物标记物。

表示序列号1或序列号2的碱基序列的V1-V2序列为基础时，可观察到异位性皮肤炎微生物组中有所增长(参照图3a-c)。特别是，F06数量在异位性皮肤炎中增加是在所有年龄层共同出现的表现，而在1岁以下年龄群表现地尤为突出。可知，F.prausnitzii的亚种(F06)在干涉于异位性皮肤炎的发生。由此可见，该发明物适合用于诊断异位性皮肤炎，但假如诊断对象为表现出序列号1或序列号2碱基序列的疾病，并不限于用在异位性皮肤炎。

根据本发明的另一种状态，生物标记组成物为以具有与序列号1或序列号2 97％以上相同的碱基序列作为有效成分的生物标记物。

实际上，在韩国人身上序列号1的碱基位置9,13,24及序列号2的碱基位置3,5,16,20,32,33的碱基中已发现多样性。因此，序列号1的碱基序列9,13,24及序列号2的碱基序列3,5,16,20,32,33的碱基分别可以被多样地代替。更准确地说，序列号1或序列号2分别具备全体序列97％以上相同的碱基序列时可以被代替。具体地，在序列号1中，碱基位置9中的G可被代替为A，碱基位置13中的C可被代替为T，碱基位置24中的A可被代替为G。并且，在序列号2中，碱基位置3中的G可被代替为A，碱基位置5中的C可被代替为G，碱基位置16中的G可被代替为C，碱基位置20中的A可被代替为G，碱基位置32中的T可被代替为C，碱基位置33中的G可被代替为A。就是说，生物标记组成物为以具有序列号1或序列号2 97％以上相同的碱基序列作为有效成分的生物标记组成物。通常地，细菌16SrRNA基因的齐次多样性的范围为97％以上。

根据本发明的另一种状态，提供包含序列号1或序列号2的碱基序列作为有效成分包含生物标记组成物的诊断用试剂盒。

当提供从个体已分离核酸样本时，提供诊断序列号1或序列号2的碱基序列作为有效成分包含的生物标记组成物的诊断用试剂盒。进一步准确地，提供用于诊断异位性皮肤炎的诊断用试剂盒。同时，诊断用试剂盒如与F.prausnitzii的亚种(F06)有关，与疾病的种类无关皆可利用。并且，虽然被确认为适用于诊断异位性皮肤炎，可被用于诊断显示序列号1或序列号2的疾病，不限于诊断异位性皮肤炎。

同时，提供包含序列号1或序列号2的碱基序列作为有效成分包含生物标记组成物的诊断用试剂盒。

根据本发明的另一种状态，提供提供信息方法，其方法包括一下步骤：提供已分离核酸样本；识别包含所述序列号1或序列号2的碱基序列。

提供从个体已分离的核酸样本后，通过识别包含序列号1或序列号2的碱基序列，可提供对多种疾病的早期诊断及为以后诊断所需要的有效信息。更准确地说，可提供为诊断异位性皮肤炎所需要的有效信息。

根据本发明的一个实施例，提供一种信息提供方法，识别包含所述序列号1或序列号2的碱基序列的步骤，包含提供检测F.prausnitzii亚种(F06)的步骤。

当提供从个体已分离核酸样本时，可提供通过识别包含所述序列号1或序列号2的碱基序列检测出F.prausnitzii亚种(F06)的提供信息方法。特别地，可提供用于与所述细菌有关异位性皮肤炎的提供信息方法。

根据本发明的一个实施例，提供一种信息提供方法，包含所述序列号1或序列号2的碱基序列，是具有与序列1或序列2 97％以上序列相同性的碱基序列。

实际上，在韩国人当中，序列号1的碱基位置9、13、24及序列号2的碱基位置3、5、16、20、32、33碱基中发现了多样性。因此，序列号1的碱基序列9、13、24及序列号2的碱基位置9、13、24及序列号2的碱基位置3、5、16、20、32、33碱基可被多样地代替。进一步准确地，序列号1或序列号2分别具有97％以上的相同的序列时可被代替。具体地，序列号1的碱基位置9的G可被代替为A，碱基位置13的C可被代替为T，碱基位置5的C可被代替为G，碱基位置16的G可被代替为C，碱基位置20的A可被代替为G，碱基位置32可被代替为C，碱基位置33的G可被代替为A。即，生物标记组成物包含以具有序列号1或序列号2 97％以上相同的碱基序列作为有效成分的生物标记组成物。通常地，细菌16SrRNA基因的齐次多样性的范围为97％以上。

发明效果

本发明中，以序列号1或序列号的碱基序列作为有效成分包含的生物标记组成物，包含所述组成物的诊断用试剂盒，预计被有效地利用于诊断和治疗在全球范围内发病率较高的异位性皮肤炎。

利用本发明，可有效判断具有特定碱基序列的F.prausnitzii亚种(F06)的存否。特别地，异位性皮肤炎发生之前可简单精确地诊断发病的可能性。从而，本发明可以相当有效地在异位性皮肤炎发生的前后时期对个体使用。

附图简要说明

图1a是示出肠道内微生物组的α-多样性简况的图；图1b是示出肠道内微生物组的β-多样性简况的图；图1c是示出肠道型分析的图；图1d是示出Ruminococcus,Parabacteroides,Faecalibacterium,Escherichia/Shigella相对丰度(％)的图。

图2a是示出RFE-SVM分析结果的柱状图；图2b是示出具有TOP筛选OTUs的细菌分化枝的图表。

图3a是示出用于筛选可区分异位性皮肤炎患者与非患者的操作分类单位(Operational taxonomic unit,OUT)的F.prausnitzii OTUs的系统树；图3b是示出OTU丰度的；图3c是示出F06的丰度的。

图4a是示出F.prausnitzii菌株中16SrRNA基因内的V1-V2领域的；图4b是示出F06V1的共同序列；图4c是示出F06 454的整个分析；图4d是示出V1序列的相对丰度。

图5a是示出在AD基因组发生显著变化的热图(heat map)；图5b是示出作为5个F.prausnitzii之strain的A2-165,M21/2,L2-6,S3L/3,KLE1255的基因序列。

图6a是示出实验群和对照群SCFAs分析的图表；图6b是在F.prausnitzii菌株中，对丁酰-CoA：乙酸盐CoA-trancferase基因催化剂的活性进行比较的；

图7是示出与F.prausnitzii功能障碍有关的AD提案模型的。

图8a是示出在菌株中的共同及特定基因的维恩图(Venn diagram)，图8b是示出针对各个基因群进行的依诺米那(illumina)分析结果的。

具体实施方式

下面将以本发明的实施例为基础详细解释。

但，下述实施例仅为本发明的举例子，本发明的内容并不局限于下述实施例。

本发明的发明者推断出肠道内的一些特定细菌与异位性皮肤炎具有关联性，长期研究了肠道内细菌与异位性皮肤炎的关联性。为证明这种关联性，90名异位性皮肤炎患者(试验群)与42名非异位性皮肤炎患者(对照群)参与了此研究，总共分析了132名的肠道内微生物群集的16SrRNA基因及宏基因组。人类肠道微生物组项目中的参考遗传数据与KEGG直系同源数据库被利用于分析宏基因组。异位性皮肤炎患者通过SCORAD系统已预先被评价了疾病严重程度，对照群仅由之前未患过异位性皮肤炎的人组成。实验群和对照群在提交粪便样本前6个月以内，未暴露于抗生素。本实验的实验群由高丽大学安岩医院提供，Ethics Committee批准了本研究。从实验群与对照群获得了约5g的粪便样本，把DNA分离之前在-80℃保管。粪便样本的短链脂肪酸(SCFAs；Short-chain fatty acids)利用气相色谱质谱仪(gas chromatographic mass spectrometer)进行比较分析。

实施例1：DNA分离

样本为砂浆和研钵(mortar与pestle),在液态氮被粉碎，已粉碎的400mg样本分别放入于四个微量离心管(microcentrifuge tube)。在各离心管分别存放着直径为0.1mm的氧化锆/二氧化矽粉末(silica bead)(BioSpec产品,Bartlesville,OK,USA)在内的500μl溶液，提取缓冲剂500μl(200mM Tris[pH8.0],200mM NaCl,20mM EDTA)，20％SDS的210μl及苯酚；氯仿；异戊醇混合物(25:24:1,pH7.9)。

样本在高温用珠磨器(Bead beater)粉碎了2.5分钟，细菌皮的破坏致使细菌成分往外流出。DNA利用苯酚(phenol)/氯仿(chlroroform)/异戊醇(isoamyl alcohol)(25:24:1.ph7.9)从上层液分离，此时DNA与异丙基一起沉淀。把DNA小球(pellet)晾干后，在TE缓冲剂(10mM Tris[pH8.0],1mMEDTA)进行溶解，使其浓度调整为100ng/μl。

实施例2：16S rRNA基因V1-V2区域碱基序列的分析

以16SrRNA基因V1-V2区域为标的PCR反应，在一些DNA样本分别进行。DNA样本分别包含模板DNA(templateDNA)100ng，HotStarPCRbuffer(德国凯杰社(Qiagen),Germantown,MD,USA)5μl，HotStarTaqDNApolymerase(德国凯杰社)1U和正向引物0.4μmol/l及反向引物0.4μmol/l及包含反应混合物25μl。正向引物(forward primer)

由454钛适配剂A(454Titanium adapter A)(下划线的核苷酸),unique8-base barcode(表示为8Ns),linker(二核苷酸TC),通用的细菌引物8F(universal bacterial primer 8F)组成。反向引物(Reverse primer)

由454钛适配剂B(Titanium adapter B)(下划线),unique 8-basebarcode(Ns),linker(CA),大范围的细菌引物338R(斜体)组成。

DNA用15分钟在95℃被放大，接下来依次用30秒在95℃，用30秒在52℃34cycle，用1分钟在72℃被放大，最后因延长用5分钟在72℃被放大。PCR生产物通过使用QIAquick PCR纯化试剂盒(德国凯杰社)获得。扩增子(amplicon)通过使用PicoGreen化验(PicoGreenAssay)定量，在TE缓冲剂稀释为1X 10⁹molecules/μl。为用于454FLX钛焦磷酸测序(454FLXTitanium pyrosequencing)，以同量的产物构造了测序库(sequencing library)。

实施例3：454测序读取分析

用管道QIIME对贴着条形码标签的16S rRNA基因V1-V2地域序列读(V1-V2regionsequence reads)进行分析后，在5’或3’末端不存在序列或有1个以上不确定碱基序列的都排除了。之后，除去所有的引物序列，还把大小不到250bp的修剪序列(trimmed sequence)也排除掉了。剩余序列以序列相似性(sequence similarity)为基准，利用CD-HIT分类为操作分类单位(OTUs)，并以0.5％信心指数(confidence score)为基准，利用RDP分级机进行了系统分类。嵌合体序列(Chimera sequence)用管道QIIME的嵌合体杀手(ChimeraSlayer)和冲破片(BlastFragment)被除去。为知晓肠道内微生物(microbiota)的α-多样性(α-diversity)计算了香农指数(Shannon index)，且用于分析β-多样性的无重负UniFrac(unweighted UniFrac)或Bray-Curtis距离度量(Bray-Curtis distance metrics)用QIMME脚本(QIMME scripts)做成。

肠道型(Enterotype)的分析，使用了以詹森-香农多样性算法做成的基因级距离模型(genus-level distance matrix)，并利用PAM群集算法(partitioning aroundmedoids clustering algorithm)进行。为得出肠道型群集的最佳数字，算出了calinski-Harabasz指数(Calinski-Harabasz index)(参照图1a-d)。

454测序读用CD-HIT分析OUT或格外地利用埃斯普利特(ESPRIT)做出不依赖于分类群的OTU(taxon-independent OTU)，进行分析。上述OUT做的OTU丰度矩阵(OTUabundance matrix)，以RFE-SVM(recursive feature elimination support vectormachine)作为用具，为找出在异位性皮肤炎患者与非患者中特征最突出的OUT时使用到。至少在30％的样本中不存在的OUT为降低噪声级，从数据中被排除在外。利用已选定，具有特征性的OTU set，以缺一交叉验证(leave-one-out cross-validation)的方式测量出了区分异位性皮肤炎微生物组(AD-microbiota)的预测精度(prediction accuracy)。

实施例4：整个基因测序与序列分析

利用Illumina HiSeq2000(Illumina HiSeq2000)从8个样本(实验群和对照群各4个)得到了整个基因测序(whole-genome sequence)。通过构建由约400bp的片块组成的DNA库(DNA library)，得到了101bp的双末端读取(paired-end reads)。

利用CLC基因组的工作台(CLC Genomic Workbench)分析了序列。低质量读以如下标准排除：质量度(quality score)不到0.05的所有序列﹑具有两个以上不确定碱基序列的序列﹑比15bp短的序列。宏基因组(Metagenome)的功能分析是用HUMAnNv0.99进行的。所有Bacteroides和Faecalibacterium genome(bfg,bhl,bsa,bxy,bdo,bdh,bacc,fpr，及fpl)包含在KEGG直系同源(KO)数据库v54内用于分析。Illumina读取(Illumina reads)用USEARCHv8.0转译源序列搜索(translated BLAST search)至KO数据库。结果用HUMAnN整理，对实验群和对照群平均化的直系同源进行比较。

实施例5：5个F.prausnitzii菌株的泛基因组分析

5个F.prausnitzii基因组序列从人类肠道微生物组项目(HMP)网站

(http://www.hmpdacc.org/)被下载后，进行了泛基因组比较分析。从各菌株得到的编码序列(coding sequence,CDS)用BLASTP进行了比较后，以氨基酸相似性和70％以上的搭配领域为基准用判别式直接同源方式整理下来了。CDS以le-5的BLASTP hit e-valuecutoff of 1e-5为基准，用KO数据库整理下来了。

Illumina HiSeq2000的整个宏基因组读用CLC基因组工作台映射到5个F.prausnitzii基因组。总共有10.14％的Illumina读取映射到F.prausnitzii基因组中了。

实施例6：样本内SCFA测量

样本与液态氮用砂浆和研钵粉碎后，约0.1g移放到2ml的微量離心管，将装样本的管道里装内部标准(60μl的0.25mmol/l 4-甲基颉草酸)测量SCFAs。将样本用20μl的33％氯化氢(HCl)进行酸处理后，加上乙醚(diethyl ether)涡流了10分钟。对乙醚层(diethylether)进行离心分离后移装到新管道。将与此相同的过程反复一遍，从两个提取物混合了乙醚相。将60μl的提取物与20μl的N-叔丁基-二甲基氯硅烷-N-甲基三氟乙酰胺(N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide)在气相色谱法自动取样液瓶(gaschromatography autosampler vial)的玻璃衬管里搅拌后，在高温放置两个小时。最后，对已制备的上述样本进行了气相色谱法重量分析。D-乳酸(D-lactate)及L-乳酸(L-lactate)的比例用Megazyme酶试剂盒(Megazyme,Ireland)算得。

冻结样本(0.1g)在0.1M三乙醇胺缓冲剂(pH 9.15)1ml熔化，在4℃用10分钟离心分离为14,000。将上层液沉淀成6.1N三氯乙酸(最后pH为10％)后在4℃用10分钟的时间离心分离为4500g。已沉淀的上层液用于测量乳酸水平。

实施例7：催化剂活性分析

为了比较5个F.prausnitzii菌株(FP2_20620 for strain L2-6,FAEPRAA2165_01575 for strain A2-165,HMPREF9436_00973 for strain KLE1255,FPR_29560 forstrain SL3/3 and FAEPRAM212_02812 for strain M21/2)中丁酰CoA:醋酸盐CoA-转移酶基因的催化剂活性，利用启动子探针质粒载体pLKC481在各基因的催化剂构造了lacZYfusion，把质粒结构物(plasmid construct)移到Escherichia coli DN5α中了。拥有相异pLKC481构成物的E.coli菌株，在LB(broth)培育至对数中期(mid-log phase)(OD600＝0.7)后，在冰盘上放置了20分钟。每样样本各取2ml，得到丸剂后再放到Z缓冲剂中。表示催化剂活性度的β-半乳糖苷酶活性(β-galactosidase activity)以O-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactoside)作为剂材测量，用以下数式算出了米勒单位(Millerunit)。

1000x(OD420–1.75xOD550)/(孵化时间[min]x容量[ml]x OD600)

下面，以例图为基础具体说明本发明。

图1a是示出肠道内微生物组的α-多样性简况的图；图1b是示出肠道内微生物组的β-多样性简况的图；图1c是示出肠道型分析的图；图1d是示出Ruminococcus,Parabacteroides,Faecalibacterium,Escherichia/Shigella相对丰度(％)的图。

从90名实验群和43名对照群的样本分离了肠微生物组的DNA，通过放大16S rRNA基因的V1-V2部分，以454技术分析了碱基序列。排除low quality sequence后，序列Read的平均测序深度(sequencing depth)为6,604。在异位性皮肤炎患者与非患者的微生物组，在微生物α-多样性(α-diversity)方面未发现很大的差距(参考图1a图表)。在微生物β-多样性(β-diversity)方面也未发现很大的差距(参考图1b图表)。微生物组，能以主要细菌集群作为基础指定为特定肠道型。132个微生物组被区分为两个中的一个肠道型即区分为Bacteroides或Prevotella type，但异位性皮肤炎没有偏于一边(参考图1c图表)。综上所述，对于异位性皮肤炎，微生物组的变化总的来说不显著。但是，把特定细菌以年龄分类的集群，在实验群和对照群之间出现了具有意义的差距(参考图1b图表)。曾经有一项研究报告过，在异位性皮肤病患者身上出现属肠内细菌(Enterobacteriaceae)的细菌增加和乳酸菌、双歧杆菌(Lactobacillus,Bifidobacterium等细菌的减少，在本实验没有出现这种趋向。通过之前的研究被报告为与异位性皮肤病有关联性的细菌中,可能包含的菌是在不健康的肠内环境随机地增加成长的，与异位性皮肤炎并无直接关系。与异位性皮肤炎有关的细菌中，有些可能具有直接病原性，有些可能从被损伤的肠道环境获得对成长的有利影响。对于异位性皮肤炎起到重要作用的病原性细菌，可能以特定细菌聚集的形态存在，也有可能在所有的异位性皮肤炎环境有所增加。相反，简单地能应用疾病环境的细菌可能包含多种形态。这些细菌可能在整体上看来在从异位性环境中有所增加，但也有在个别样本不存在的可能性。考虑到这一格局，在异位性皮肤炎微生物组中增加的大部分细菌(参照例图1a-d图表)是能利用异位性皮肤炎环境的可能性高。即使在异位性皮肤炎原因菌存在于其中，可能因数量少，湮没于其它更多的细菌中很难区分开来。

图2a是示出RFE-SVM分析结果的柱状图；图2b是示出具有TOP筛选OTUs的细菌分化枝的图表，图3a是示出用于筛选可区分异位性皮肤炎患者与非患者的操作分类单位(Operational taxonomic unit,OUT)的F.prausnitzii OTUs的系统树；图3b是示出OTU丰度的；图3c是示出F06的丰度的。

为了筛选区分异位性皮肤炎患者与非患者的顶级筛选OUT(top discriminatoryOUT),进行了RFE-SVM分析。在此分析中，使用了以分类独立型阶层分类(taxonomy-independent hierachical classification)为基础的ESPRIT制订的OUT(以属于普通种的0.03distance level制订)。在整个数据中，任意筛选的一半数据为筛选具有特征的OUT，使用为RFE-SVM分析训练组合(training set)，剩余一半数据使用于测试该OUT的异位性皮肤炎区分能力。在区分能力方面，该OUT的准确率为88.14％，高于任意筛选OUT的79.92％(参考图2a)。在顶级筛选OUT中的多数属于几个分化枝(clad)，并这些对所有年龄群是具有共同性的(参考图2b)。尤其是，F.prausnitzii在异位性皮肤炎微生物组中有剧增的表现(参考图1d图表)。F.prausnitzii虽存在生理学上相异的两种系统型(phylotype),目前都归类于F.prausnitzii。

有关异位性皮肤炎的F.prausnitzii亚种

F.prausnitzii在异位性皮肤炎微生物组中有突出表现，从这一事实可以推论出它是在RFE-SVM模型中最重要的种之一，也是在人类肠内基因组中存在最多的种之一，对人体生理活动具有重要的作用。同时，因为F.prausnitzii属于单种，能较容易地进行分化枝(clad)构成研究。与异位性皮肤炎的关联性研究，比整体中对特定亚种更具有关联性的可能作为前提进行了研究。被提为F.prausnitzii的ESPRIT OTU在系统树(phylogenetictree)一共出现为7个分化枝。因该系统树仅以V1-V2序列作为基础，当各分化枝适用16SrRNA基因序列时被分离的可能性更大。在此分化枝(clad)中，确认到F06对异位性皮肤炎在微生物组中的剧增(参考图3a-c)。F06在异位性皮肤炎微生物组中的增加是在整个年龄群共同出现的现象，在1岁以下年龄群表现地尤为突出(参考图3a-c)。因为异位性皮肤炎在1岁之前起作最频繁，上述结果表明F.prausnitzii亚种对异位性皮肤炎有干涉。

图4a是示出F.prausnitzii菌株中16SrRNA基因内的V1-V2领域的；图4b是示出F06V1的共同序列；图4c是示出F06 454的整个分析；图4d是示出V1序列的相对丰度。

作为F.prausnitzii5个菌株的A2-165,M21/2,L2-6,S3L/3,KLE1255的基因体通过HMP(Human microbiome project)成为序列。其中，L2-6菌株与其它4个菌株比较，具有非常独特的V1-V2领域，尤其是V1领域。并和F06搭配地很适当(参考图4a-d)。虽V1-V2领域只不过是6SrRNA基因中的一部分。接近于完美的搭配表明L2-6和F06的关系非常紧密。用BLASTP对F.prausnitzii5个菌株的15，825个预测蛋白质序列相互比较后，排除重复的基因，结果表明在F.prausnitzii中总共有7，253个基因。为比较肠内微生物组与F.prausnitziipangenome,从样本筛选8个(实验群和对照群各4个)后，利用Illumina平台(IlluminaHiSeq 2000 platform)对比进行整体基因组霰弹枪定序法(whole genome shotgunsequencing),得到了每个样本平均552Mb的序列。这8个样本是以相近的高含量F.prausnitzii比例为准被选拔的(19-36％)。把Illumina读取(Illumina reads)映射到F.prausnitzii pangenome时大多数(87.4％)L2-6特定基因比对照群的分析对异位性皮肤炎搭配地更适当(参考图8a-b)。相反，A2-165和KLE1255特定基因对一般人搭配地更适当。综上所述，可知属于F06的细菌除L2-6的V1-V2外，在基因组上也有紧密的关系。

异位性皮肤炎微生物组的代谢功能变化

异位性皮肤炎微生物组的代谢变化，通过将Illumina读取(Illumina reads)在和F.prausnitzii泛基因组和KO数据库映射的方式得以确认。因在宏基因组中的F.prausnitzii含量高，F.prausnitzii pangenome Approach泛基因组方法具有效率。F.prausnitzii泛基因组仅由5个菌株组成，被证明在克罗恩病(Crohon disease)萎缩的A2-165和在本研究中被证明与异位性皮肤炎具有相关性的L2-6等，生物学上重要的两个菌株包含在内是很重要的一点。为了解释映射结果，F.prausnitzii泛基因组用KO数据库进行了分析，并在异位性皮肤炎实验群和对照群中找出匹配读取(matching reads)数不同的(P<0.05)KO。据统计，泛基因组的1,332KO中，有415KO对异位性皮肤炎实验群和对照群之间有显著的差距。其中，在实验群中的122KO和对照群中的293KO有增加(参考图5a-b)。

在异位性皮肤炎的微生物组中增加的KO，是为对应氧化应激(oxidative stress；peroxiredoxin,DMSO reductase,and sufBC operon等)的代谢功能，并作为多种途径的过渡金属输送体(transition metal transporters；Fe,Ni,Zn,and Mn等)及粘蛋白的主要组成物GalNAc的输送和分解功能(参考图5a-b)。相反，在异位性皮肤炎减少的基因，是各种氨基酸(amino ac ids)，核苷酸(nucleotides)，肽聚糖(peptidoglycan)，辅因子(cofactors)的生物合成基因(参考图5a-b)。受损的肠道环境是从绿豆芽流出来的氨基酸，辅因子，辅酶等一般营养素一起，作为粘蛋白成分的GalNAc等特殊营养物质有可能有所增加。一般营养素的增加有可能导致在微生物组中的生物合成基因的减少，像GalNAc一样的特殊营养成分的增加也有可能导致能够利用这些物质的营养缺陷型(auxotrophicspecialists)或致病有机体(pathobionts)的选择性增加。这种场内环境可能在促使肠上皮的顺上，形成周期，并加快肠道基因组的失调。在F.prausnitzii的5个菌株中只有L2-6拥有利用GalNAc的基因群集(参考图5a-b)。

在KO数据库映射Illumina读取(Illumina reads)的第二个方法，总共5,832KO中，有122KO在异位性皮肤炎实验群的宏基因组和一般对照群的宏基因组中的表现有区别。异位性皮肤炎，对照群宏基因组中分别增加了56KO。虽然KO分析比F.prausnitzii泛基因组分析结果度低，因为包含F.prausnitzii外的宏观基因组，是具有价值的结果。和F.prausnitzii泛基因组分析一样，KO分析表明异位性皮肤炎宏基因组中的金属输送提，利用GalNAc，氧化应激对应功能的增加，氨基酸，核甘酸，辅因子生物合成功能的减少。但是，像利用L-fucose(L-fuculokinase and L-fucose isomerase)相关的基因一样，新的基因也有所增加。L-fucose从粘蛋白糖蛋白(mucin glycoprotein)放出，与GalNAc一起用为像多形拟杆菌一样对肠内细菌重要的营养成分。并且，新地发现了谷胱甘肽S-转移酶群(glutathione S-transferase family),葡萄糖-6-磷酸盐1-脱氢酶(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase),谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase),乙醛酸盐(glyoxylate)和二羧酸代谢(dicarboxylate metabolism)有关基因的增加。谷胱甘肽(Glutathione)为半胱氨酸和谷氨酸盐的三肽使细菌耐得住在炎症级联反应(inflammatory cascades)过程中发生的氧自由基和由氮代谢物(nitrogen metabolites)引发的氧化应激(oxidative stress)，保持抗生性(homeostasis)。根据有一项报告，谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione-S-transferase)使还原的谷胱甘肽和过氧化酯类(peroxidized lipids)等内因性化合物结合(conjugated)后，引向解读过程。在E.coli，葡萄糖-6-磷酸盐1-脱氢酶数值(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase level)在氧化激应下提升，引起了磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate)抗生性因素的增加。作为抗氧化物质，谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase在E.coliO157:H7和酿酒酵母起着重要的作用。并且，乙醛酸盐(glyoxylate)和去羧基产物代谢(dicaboxylate metabolism)干涉抗氧化过程(antioxidation process)。总之，这些基因的风度模式是进一步证明异位性皮肤炎患者的肠上皮具有许多因炎症导致的组织损伤(参考图5a-b)。

因判断多种营养缺陷体(auxotroph)和致病有机体(pathobiont)在异位性皮肤炎微生物组织有所增加，观察了这些所包含的PTS系统的GalNAc-特异IIA成分基因(agaF,K02744)的多样性，结果这些基因以多种形态存在。在多种粘蛋白，利用者的增加表明异位性皮肤炎的肠道环境除了L2-6型细菌外，还繁殖多种营养缺陷型和致病有机体(pathobiont)，并还可以看作这与异位性皮肤炎的进行和慢性化有关。

图6a是示出实验群和对照群SCFAs分析的图表；图6b是在F.prausnitzii菌株中，对丁酰-CoA：乙酸盐CoA-trancferase基因催化剂的活性进行比较的。

F.prausnitzii F06亚种的增加及丁酸盐和丙酸盐的减少

在肠道微生物组中SCFAs的生产具有很大的健康利处。为观察异位性皮肤炎实验群和对照群微生物组建SCFAs的生产量差距，实施了气相色谱(gaschromatographic-massspectrometric)分析(参考图6a-b)虽然作为主要SCFAs的乙酸盐﹑丙酸盐﹑丁酸盐﹑D和L-乳酸中F.prausnitzii的总量相差不大，选拔在F06 OTU level中差距大的实验群和对照群进行配对后做了比较(参考图6a-b)。因为这些样本的F.prausnitzii量比Eubacteriumrectale,Eubacterium hallii,Rosburia等其他SCFAs生产的细菌总和要高得多，其他菌的微小影响可以忽略，而能解释其受到F.prausnitzii的影响。对已配对的12对进行比较分析结果表明，F06水平低的样本比F06水平高的样本丁酸盐(butyrate)和丙酸盐(propionate)量高(参考图6a-b)。在此SCFAs中，量差大的原因因为显示了实验群和对照群间的肠道环境十分相反，是很重要的数据。除了异位性皮肤炎外，如年龄等区别对SCFAs的简况无太大的影响。可知，F06 level是对这一结果最为重要的因素。

因为与F06包层有关的L2-6菌株和其他四个菌株都具有相同的丁酸盐(butyrate)生物合成途径，为了了解途径表现上有无区别，调查了关键酶丁酰CoA及醋酸盐CoA-转移酶(key enzyme butyryl CoA:acetate CoA-transferase)的基因。在菌株上该基因催化剂进行合成，并在启动子探针型载体(promoter-probe vector)lacZ reporter前部克隆(clone)后，在E.coli对基因表现(gene expression)做了比较(参考图6a-b)。虽未在F.prausnitzii做比较，但因为都在相同的条件做比较，能对催化剂强度进行对比。最终结果表明，A2-165菌株的催化剂比L2-6和其它菌株强得多(参考图6a-b)。实际上，这种结果与发布A2-165和L2-6菌株的生产率差距的论文结果一致。这些结果显示，样本中的丁酸盐水平由F.prausnitzii亚种构成决定。因此，对于异位性皮肤炎而言，可看作是F.prausnitzii的失调(dysbiosis)使像其它A2-165型细菌一样高丁酸盐生产商(high butyrateproducer)萎缩，最终导致降低丁酸盐生产率(butyrate production)的结果。

图7示出与F.prausnitzii功能障碍有关的AD提案模型。

在人类的肠内微生物中，属于优势种的F.prausnitzii被视为通过生产SCFAs对肠道内起到好作用的细菌。特别是，丁酸盐具有抗炎功能，并用于肠上皮的直接能源。F.prausnitzii水平的减少与克罗恩病(Crohn disease)相关。研究表明，F.prausnitzii亚种间的平衡，尤其是L2-6和A2-165型细菌之间的变化对SCFAs的生产率起到影响。异位性皮肤炎宏基因组中增加了如GalNAc和L-fucose等粘蛋白的构成因素和可能从已受损的肠上皮细胞流出来的利用各种营养物质的基因(参考图5a-b)。这表明，肠上皮细胞中炎症的增加，从广义上属于“leakey肠道综合症”。如果上述的肠上皮损伤由F.prausnitzii的失调或其他原因引发，将会促使F.prausnitzii失调的同时，也促使各种营养缺陷型(auxotroph)和致病有机体(pathobiont)成长。最后，将形成F.prausnitzii的失调和肠上皮细胞炎症失调(dysregulation)之间的反馈环路。

如上所述，虽然实施例通过限定的实施例和例图说明，在所属领域具有通常知识者能对上述材料进行各种修正及变形。比如，即使发生所述技术与上述说明不同的顺序实行的情况、所述构成因素与上述说明不同形态被结合或组合的情况，其他构成要素或等同物对置或代替，也可能达成适当的结果。

因此，其他实行方法，其他实施例及与权利要求范围相等的，也属于下述权力要求范围内。

Claims (7)

1.一种以序列号1或序列号2的碱基序列作为有效成分的生物标记组成物，其中，所述的组成物检测F.prausnitzii的亚种F06。

2.根据权利要求1所述的生物标记组成物，其中，所述的生物标记组成物用于诊断异位性皮肤炎。

3.根据权利要求1所述的生物标记组成物，其中，

在所述序列1中，碱基位置9的G被替换为A，碱基位置13的C被替换为T，和/或碱基位置24的A被替换为G；和/或

在所述序列2中，碱基位置3的G被替换为A，碱基位置5的C被替换为G，碱基位置16的G被替换为C，碱基位置20的A被替换为G，碱基位置32的T被替换为C，和/或碱基位置33的G被替换为A。

4.一种诊断用试剂盒，其包含权利要求1至3中任何一项的组成物。

5.用于检测序列号1或序列号2的碱基序列的试剂在制备用于诊断异位性皮肤炎的试剂盒中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述试剂盒用于检测F.prausnitzii的亚种F06。

7.根据权利要求5所述的用途，其中，

在所述序列1中，碱基位置9的G被替换为A，碱基位置13的C被替换为T，和/或碱基位置24的A被替换为G；和/或

在所述序列2中，碱基位置3的G被替换为A，碱基位置5的C被替换为G，碱基位置16的G被替换为C，碱基位置20的A被替换为G，碱基位置32的T被替换为C，和/或碱基位置33的G被替换为A。

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