CN108350466A - 确定pH的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用作i‑开关pH报告物的核酸分子和复合物，该核酸分子和复合物作为pH报告物具有增加的灵敏度并具有间隔的pH报告能力范围。本公开的一些方面涉及用于确定pH的方法，该方法包括提供核酸复合物，该核酸复合物包含：包含序列CnXCnYCnZCn(SEQ ID NO.6)的第一单链核酸分子，其中C是胞嘧啶；X，Y和Z各自为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一种或多种；并且n大于或等于2；并且其中所述第一单链核酸分子的至少2个胞嘧啶残基是被修饰的；和部分地或全部地与所述第一单链分子互补的第二单链核酸分子，其中第一标签结合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子；并且其中所述第一标签能够产生信号，其中所述信号的强度作为所述核酸复合物的构象的函数而变化；以及测量信号的强度并由所测量的信号确定pH。

Description

确定pH的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年5月19日提交的美国临时专利申请No.62/163,718的优先权，其全部内容通过引用而并入本文中。
技术领域
实施方案一般涉及生物学、医学和生物技术。
背景技术
DNA中的非Watson-Crick碱基配对的可利用性导致发现了几种功能性DNA结构，这些DNA结构已被部署在细胞内(in cellulo)以了解细胞内化学环境。据先前发现，某些DNA序列d(C5T)可以在弱酸性条件下形成特殊的四链体结构，其中通过C·CH+对配对的两条平行双链体以头尾相接的方向互相插入(称为i-基序(i-motif))。其在基于合成DNA的构象开关(例如I-开关(I-switch))环境中用作pH报告物，其中利用FRET将i-基序诱导的构象改变转换为光输出。I-开关已被用于研究活细胞的内吞细胞器中的pH动力学。有证据表明，基于i-基序的构象开关的pH响应区间(regime)可以通过改变片段中的胞嘧啶的数目来调节，因为协同性(cooperativity)与i-基序稳定性直接相关。这种策略的问题是，随着pH诱导的结构转变的中点(pH半)的增加，增加的转变协同性大大地缩窄了整体pH敏感区间。虽然针对较窄pH区间的较好pH分辨率在某些情况下可能是有用的，但是在不增加协同性的情况下改变pH半是远远更有利的。
胞嘧啶半质子化驱动i-基序形成。胞嘧啶N3的pKa为约4.5，因此DNA4i-基序在约pH5.0下达到最大稳定化。这通常获得在5.5<pH<7.0下具有pH报告能力的I-开关。然而，不同的细胞内细胞器保持不同的静息pH，该静息pH从pH4.5(溶酶体)到pH8.0(线粒体)变化，因此，需要设计能够响应整个生理范围的I-开关。
发明内容
本文描述了可用作i-开关pH报告物的核酸分子和复合物，其作为pH报道物具有增加的灵敏度并具有间隔的pH报告能力范围。本公开的多个方面涉及一种确定样品中pH的方法，包括提供核酸复合物，该核酸复合物包含：包含序列CnXCnYCnZCn(SEQ ID NO.6)的第一单链核酸分子，其中C为胞嘧啶；X、Y和Z各自为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一种或多种；并且n大于或等于2；并且其中所述第一单链核酸分子的至少2个胞嘧啶残基是被修饰的；和部分地或全部地与所述第一单链分子互补的第二单链核酸分子，其中第一标签结合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子；并且其中所述第一标签能够产生信号，其中所述信号的强度作为所述核酸复合物的构象的函数而变化；以及测量所述信号的强度，并且由所测量的信号确定所述pH。在一些实施方案中，所述样品是选自细胞、细胞提取物、细胞裂解物、组织、组织提取物、体液、血清、血液和血液制品的生物样品。在一些实施方案中，所述样品是活细胞。在一些实施方案中，所述样品是来自患者的生物样品。
在一些实施方案中，第二标签结合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子；其中所述信号的强度作为以下至少一者的函数而变化：所述第一标签和所述第二标签之间的距离、和所述第一标签和所述第二标签的相对朝向。
在一些实施方案中，当所述pH为由pH4升高至pH5、pH5升高至pH6、pH6升高至pH7和pH7升高至pH8中的至少一者时，所述信号强度改变至少百分之二十。在一些实施方案中，当pH从至少pH4、5、6或7升高至pH 5、6、7或8(或从中可以引出的任何范围)时，所述信号强度改变至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％，或从中可以引出的任何范围。
在某些实施方案中，当本文描述pH范围或值时，该范围包括所述的pH。例如，从4.0至5.0或介于4.0和5.0之间的pH范围包括pH4.0和pH5.0。在其它实施方案中，不包括所述的pH。
在一些实施方案中，通过将所测量的信号与参考值进行比较来确定所述pH。在一些实施方案中，通过将所测量的信号与参考值进行比较来确定所述pH。在一些实施方案中，所述信号值和/或参考值被标准化。在一些实施方案中，该方法还包括创建标准曲线。该标准曲线可以通过测量不同的已知pH值下的信号强度来创建。曲线可以被绘制为信号强度vspH。然后可以通过在图上找到相应的参考值来确定未知pH的信号强度。
在一些实施方案中，所述方法还包括确定或量化靶标，该靶标选自Cl-、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Pb2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+、H+、Na+、K+、F-、Br-、I-、氰化物(CN-)、硝酸根(NO3 -)、亚硝酸根(NO2 -)、一氧化氮(NO)、磷酸根(PO4 3-)、焦磷酸根(P2O7 4-)和活性氧物质。在一些实施方案中，使用基于核酸的传感器来量化或确定所述靶标，该传感器包括：a)感测模块，其包含核酸或肽核酸(PNA)链、和靶标敏感分子；b)标准化模块，其包含与所述核酸或PNA链互补的核酸序列、和靶标不敏感荧光团；和c)靶向模块，其包含与所述标准化模块的所述核酸序列互补的核酸序列，任选地具有适配体。在一些实施方案中，所述方法还包括通过确定靶标不敏感荧光团与靶标敏感荧光团的荧光比来对所述靶标进行量化。在一些实施方案中，所述靶标敏感分子选自包括以下的组：SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓)、MACA(10-甲基吖啶鎓-9-羧酰胺)、MADC(10-甲基吖啶鎓-9-N,N-二甲基羧酰胺)、MAMC(N-甲基吖啶鎓-9-甲基羧酸盐)、DMAC(2,10-二甲基吖啶鎓-9-羧醛)、MAA(N-甲基-9-氨基吖啶鎓)、6-甲氧基N-(4-磺基丁基)喹啉鎓、N-十二烷基-6-甲氧基喹啉鎓碘化物、6-甲基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓溴化物、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓四苯基硼酸盐、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓溴化物、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓碘化物；N，N'-二甲基-9-9'-二吖啶鎓和10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)或其修饰物和衍生物，优选为10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)；所述靶标不敏感荧光团选自包括Alexafluor 568、Alexafluor 594和Alexa 647的组，优选为Alexa 647；并且其中所述靶标敏感分子与所述靶标不敏感荧光团的比是1:1。在一些实施方案中，所述感测模块包含如SEQ ID NO：1所示的序列；所述标准化模块包含如SEQ ID NO：2所示的序列；并且所述靶向模块包含选自包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的组中的序列。
本公开的另一些方面涉及核酸复合物，其包含：包含序列CnXCnYCnZCn(SEQ IDNO.6)的第一单链核酸分子，其中C是胞嘧啶；X，Y和Z各自为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一种或多种；并且n大于或等于2；并且其中核酸分子的至少2个胞嘧啶残基是被修饰的；和部分地或全部地与所述第一单链分子互补的第二单链核酸分子。
在一些实施方案中，第一标签结合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子；并且其中所述第一标签能够产生信号，其中所述信号的强度作为所述核酸复合物的构象的函数而变化。在一些实施方案中，该方法和/或核酸复合物还包含与所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子结合的第二标签；并且其中所述信号的强度作为以下至少一者的函数而变化：所述第一标签和所述第二标签之间的距离、和所述第一标签和所述第二标签的相对朝向。在一些实施方案中，所述第一标签和所述第二标签包含供体和受体对部分。
在一些实施方案中，第一单链核酸分子的至少或恰好2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16或18个(或从中可引出的任何范围)胞嘧啶残基是被修饰的。
在一些实施方案中，X、Y和Z各自为TAA。在一些实施方案中，n为3、4或7。在另一些实施方案中，n至少、至多或恰好为3、4、5、6、7、8或9(或从中可引出的任何范围)。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，所述修饰为甲基、氟基、溴基、羟甲基、甲酰基或乙酰基。在一些实施方案中，用甲基或溴基修饰胞嘧啶。在一些实施方案中，所述修饰位于所述胞嘧啶的5’位置。在一些实施方案中，第一核酸分子中的所有胞嘧啶都用相同的修饰物进行修饰。在一些实施方案中，第一核酸分子中的所有胞嘧啶都用带负电的修饰物进行修饰。在一些实施方案中，第一核酸分子中的所有胞嘧啶都用带正电的修饰物进行修饰。
在一些实施方案中，第一标签和第二标签包含供体和受体对。在一些实施方案中，使用FRET技术来测量所述信号。在一些实施方案中，至少一种标签选自由Atto染料、Alexa染料、染料和BODIPY染料构成的组。在一些实施方案中，所述供体和受体对是FITC和TRITC、Cy3和Cy5、或Alexa-488和Alexa-647。在一些实施方案中，供体和受体对是本文所描述的标签。在一些实施方案中，所述第一标签和所述第二标签包含供体荧光团和受体淬灭剂。
在一些实施方案中，信号和标签是方向依赖性的(各向异性)。这种标签的实例包括Atto染料、BODipy染料、Alexa染料、TMR/TAMRA染料、或Cy染料。
在一些实施方案中，所述核酸复合物还包含基于核酸或PNA的传感器，该传感器包括：a)感测模块，其包含核酸或肽核酸(PNA)链、和靶标敏感分子；其中所述靶标不是[H+]；b)标准化模块，其包含与所述核酸或PNA链互补的核酸序列、和靶标不敏感荧光团；和c)靶向模块，其包含与所述标准化模块的所述核酸序列互补的核酸序列，任选地具有适配体。在一些实施方案中，a)或b)与第一单链核酸分子和/或第二单链核酸分子有效连接。在一些实施方案中，该连接是共价的。
在本文所述的方法和核酸分子和复合物的某些实施方案中，第二核酸链是仅与第一核酸部分互补的核酸链。当所有碱基都能够形成常规的Watson-Crick碱基配对(例如G-C和A-T碱基配对)时，核酸链是完全互补的。当至少一个碱基对不与相对链互补时，核酸链是部分互补的。在一些实施方案中，第二单核酸链包含至少4个非互补的核酸碱基。在一些实施方案中，第二单核酸链包含至少、至多或恰好2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20个(或从中可以引出的任何范围)非互补的核酸碱基。在一些实施方案中，第二核酸链包含8个非互补的核酸碱基。
在一些实施方案中，所述第一单链分子包含序列(Ca)nX(Cb)nY(Cc)nZ(Cd)n(SEQ IDNO.7)，其中Ca、Cb、Cc和Cd等于n个连续的胞嘧啶残基；X、Y和Z为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一个或多个；并且n大于或等于3。在一些实施方案中，Ca、Cb、Cc和Cd各自包含至少一个被修饰的胞嘧啶。在一些实施方案中，Ca、Cb、Cc和Cd各自包含至少、至多或恰好1、2、3、4或5个被修饰的胞嘧啶(或从中可以引出的任何范围)。在一些实施方案中，所述被修饰的胞嘧啶是各Ca、Cb、Cc和Cd中的第一个连续的胞嘧啶或最后一个连续的胞嘧啶。在一些实施方案中，n＝3且所述被修饰的胞嘧啶是各Ca、Cb、Cc和Cd中的第二个连续的胞嘧啶。在一些实施方案中，n＝4且所述被修饰的胞嘧啶是各Ca、Cb、Cc和Cd中的第二个连续的胞嘧啶或第三个连续的胞嘧啶。在一些实施方案中，Cb和Cc各自包含至少两个被修饰的胞嘧啶，并且Ca和Cd各自由未被修饰的胞嘧啶组成。在一些实施方案中，Ca或Cd由被修饰的胞嘧啶残基组成。在一些实施方案中，Ca、Cb、Cc和/或Cd由至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6或7个被修饰的胞嘧啶残基组成(或从中可以引出的任何范围)，或者Ca、Cb、Cc和/或Cd包含至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6或7个被修饰的胞嘧啶残基(或从中可以引出的任何范围)。
本文所述的核酸复合物可用作pH传感器，并且具有高灵敏度(如由D/A比的成倍改变所证明的)，而协同性没有显著改变。在一些实施方案中，该方法还包括由信号强度值计算D/A比。在一些实施方案中，该D/A比是标准化值。在一些实施方案中，该D/A比的倍数改变为至少4.1、5、6、7或7.5。在一些实施方案中，该D/A比的倍数改变为至少或恰好4.5、5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13或14(或从中可以引出的任何范围)。在一些实施方案中，与未被修饰的I-开关相比，协同性改变小于2倍，或者小于1.75倍、1.5倍、1.25倍、1倍、0.75倍、0.5倍、0.25倍、0.2倍、0.1倍，或从中可以引出的任何范围。在一些实施方案中，与未被修饰的I-开关相比，协同性的不同小于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施方案中，D/A比的成倍改变为至少或恰好4.5、5、6、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13或14(或从中可以引出的任何范围)，并且与未被修饰的I-开关相比，协同性改变小于1.75倍、1.5倍、1.25倍、1倍、0.75倍、0.5倍、0.25倍、0.2倍、0.1倍或从中可以引出的任何范围。在一些实施方案中，pH半改变而不显著增加协同性。在一些实施方案中，pH半为至少、至多或恰好5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8或9.0(或从中可以引出的任何范围)。在一些实施方案中，与未被修饰的I-开关相比，pH半至少、至多或恰好有0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、2.9、3.0个pH单位的不同(或从中可以引出的任何范围)。在一些实施方案中，与未被修饰的I-开关相比，pH半至少、至多或恰好有3％、5％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、24％、26％、28％、或30％的不同(或从中可以引出的任何范围)。在一些实施方案中，与未被修饰的I-开关相比，pH半至少、至多或恰好有0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、2.9、3.0个pH单位不同，或至少、至多或恰好有3％、5％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、24％、26％、28％、或30％的不同(或从中可以引出的任何范围)，并且与未被修饰的I-开关相比，协同性改变小于1.75倍、1.5倍、1.25倍、1倍、0.75倍、0.5倍、0.25倍、0.2倍、0.1倍或从中可以引出的任何范围。在一些实施方案中，本文所述的测量值(即，信号强度、pH半、倍数改变或协同性)是标准化值。在本申请的实施例中进一步详述本文所述值的计算。
在本文所述的方法的一些实施方案中，所确定的pH小于5.5或大于7.0。在一些实施方案中，所确定的pH小于或恰好为pH 5.8、pH5.7、pH5.6、pH5.5、pH5.4、pH5.3、pH5.2、pH5.0、pH4.8、pH4.6、pH4.4、pH4.2或pH4.0(或从中可以引出的任何范围)。在一些实施方案中，所确定的pH大于或恰好为pH 6.8、pH6.9、pH7.0、pH7.1、pH7.2、pH7.3、pH7.4、pH7.5、pH7.6、pH7.7、pH7.8、pH8.0、pH8.2、pH8.4、pH8.6、pH8.8、或pH 9.0(或从中可以引出的任何范围)。在一些实施方案中，核酸复合物在pH＝5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.0、4.8、4.6、4.4、4.2或4.0(或从中可以引出的任何范围)下具有pH报告能力。在一些实施方案中，核酸复合物能够确定pH值，该pH值为pH 5.8、pH 5.7、pH 5.6、pH 5.5、pH 5.4、pH 5.3、pH5.2、pH 5.0、pH 4.8、pH 4.6、pH 4.4、pH 4.2或pH 4.0(或从中可以引出的任何范围)。在一些实施方案中，核酸复合物在pH＝6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8或9.0(或从中可以引出的任何范围)下具有pH报告能力。在一些实施方案中，核酸复合物能够确定pH值，该pH值为pH 5.8、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 8.0、pH 8.2、pH 8.4、pH 8.6、pH 8.8或pH 9.0(或从中可以引出的任何范围)。
在一些实施方案中，所述第一单链核酸分子和所述第二单链核酸分子能够在酸性条件下形成i-基序。在一些实施方案中，所述第一核酸链能够形成分子内复合物，该分子内复合物包含在酸性条件下以反平行方向插入的两条以C-HC+碱基配对的平行链双链体。
在一些实施方案中，第一单链核酸分子和/或第二单链核酸分子少于200个核苷酸。在一些实施方案中，第一单链核酸分子和/或第二单链核酸分子的长度小于、至少或恰好为20、30、40、60、80、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900或1000个核苷酸，或从中可以引出的任何范围。
如本文所用，“核酸”、“核苷酸序列”或“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段，以及天然存在的或合成的分子。参照DNA序列的“RNA等价物”由与参照DNA序列相同的线性核苷酸序列组成，不同之处在于：所有出现的含氮碱基胸腺嘧啶被尿嘧啶替代，并且糖骨架由核糖而不是脱氧核糖组成。
在一些实施方案中，所述核酸复合物还包含靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分是核酸序列。在一些实施方案中，所述靶向部分具有同源人工蛋白受体。人工受体可以是(例如)单链可变片段(scFv)、转录因子、锌指蛋白、亮氨酸拉链或DNA结合免疫球蛋白。在一些实施方案中，所述靶向部分编码在与所述第一单链核酸分子和/或所述第二单链核酸分子相同的核酸链上。在一些实施方案中，所述靶向部分选自适配体、靶向人工蛋白受体的双链体结构域、结合阴离子-配体结合受体的核酸序列、和内吞配体。在一些实施方案中，所述靶向部分包含直接地或间接地与所述核酸分子结合的肽。在一些实施方案中，所述靶向部分肽包含融合肽、膜透化肽、亚细胞定位序列、或细胞受体配体中的一种或多种。在一些实施方案中，所述亚细胞定位序列将所述核酸复合物靶向至细胞的其中存在靶蛋白的空间定位的区域。在一些实施方案中，所述亚细胞定位序列将所述核酸复合物靶向至细胞的这样的区域，该区域选自由以下构成的组：胞质溶胶、内质网、线粒体基质、叶绿体腔、中间反式高尔基体层囊、溶酶体腔、内体腔、过氧化物酶体、细胞核、和质膜上的特定空间位置。在一些实施方案中，亚细胞器是直接或间接与质膜交换膜的细胞器。
另一些方面涉及包含本公开的核酸分子或复合物的质粒载体、细胞和组合物。
另一些方面涉及包含以下核酸序列的核酸分子：
5′-CCCTAACCCCTAAC*CC*CTAACC*CC*ATATATATCCTA GAACGACAGACAAACAGTGAGTC-3(SEQ ID NO.8)；
5′-CCC*CTAACC*CCTAACCC*CTAACC*CCATATATATCCT AGAACGACAGACAAACAGTGAGTC-3′(SEQ ID NO.9)；
5′-C*CCCTAACCCC*TAAC*CCCTAACCCC*ATATATATCCT AGAACGACAGACAAACAGTGAGTC-3′(SEQ ID NO.10)；或
5′-C*C*C*C*TAACCCCTAACCCCTAACCCCATATATATCCT AGAACGACAGACAAACAGTGAGTC-3′(SEQ ID NO.11)；
其中C*是被修饰的胞嘧啶。被修饰的胞嘧啶包含本领域已知和/或如本文所述的修饰物。在一些实施方案中，核酸是单链的。在一些实施方案中，如本文所述，核酸与部分互补的第二单链核酸形成复合物。
另一方面涉及包含本文所述的核酸复合物的细胞。
如本文所用，术语“寡核苷酸”与“核酸分子”可互换使用，并且被理解为这样的分子，该分子在主要由相同的单体单元组成的骨架上以规定间隔具有碱基的序列。碱基以这样的方式排列在骨架上，使得碱基可以与核酸形成键，该核酸具有与所述寡核苷酸的碱基互补的碱基序列。最常见的寡核苷酸具有糖磷酸单元的骨架。可以区分在2'位置处不具有羟基的寡脱氧核糖核苷酸和在该位置具有羟基的寡核糖核苷酸。寡核苷酸也可以包括衍生物，其中所述羟基的氢被有机基团(例如烯丙基)取代。寡核苷酸是包含至少两个核苷酸的核酸。
一个核酸序列可以与第二个核酸序列“互补”。如本文所用，术语“互补的”或“互补性”在用于核酸(即，诸如寡核苷酸或靶核酸之类的核苷酸序列)时，是指通过碱基配对规则相联系的序列。对于天然碱基而言，碱基配对规则是由Watson和Crick开发的那些。作为实例，对于序列“T-G-A”，互补序列是“A-C-T”。互补性可以是“部分的”，其中仅核酸的一些碱基根据碱基配对规则相匹配。或者，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交的效率和强度有影响。
如本文所述的寡核苷酸可以能够与具有互补碱基序列的寡核苷酸形成氢键。这些碱基可以包括天然碱基(如A、G、C、T和U)和人造碱基。寡核苷酸可以包括核苷酸置换。例如，可以使用人造碱基或被修饰的碱基来代替天然碱基，使得人造碱基表现出与天然碱基相似的特定相互作用。
与另一核酸互补的寡核苷酸将在合适的条件下(如下所述)与该核酸“杂交”。如本文所用，“杂交”或“进行杂交”是指这样的过程，其中在规定的杂交条件下，寡核苷酸单链通过碱基配对与互补链退火。“特异性杂交”表明两个核酸序列具有高度的互补性。特异性杂交复合物在允许的退火条件下形成，并在任何后续的洗涤步骤后仍保持杂交。在低严格性的条件下结合的“杂交”序列是那些在非严格条件下(室温下的6×SSC/50％甲酰胺)结合并在低严格性的条件(2×SSC、42℃)下洗涤时仍保持结合的序列。在高严格性下进行杂交是指在2×SSC、65℃(其中SSC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.2)下进行洗涤的上述条件。
当在权利要求书和/或说明书中，与术语“包含”一起使用时，词语“一”或“一个”的使用可以表示“一个”，但是其也与“一个或更多”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
可以预期的是，可以相对于本文讨论的任何其他实施方案来实施本文讨论的任何实施方案，反之亦然。此外，可以使用组合物和试剂盒来实现所述的方法。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于对靶标进行量化的基于核酸或PNA的传感器，该靶标选自Cl-、Ca2 +、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Pb2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+、H+、Na+、K+、F-、Br-、I-、氰化物(CN-)、硝酸根(NO3 -)、亚硝酸根(NO2 -)、一氧化氮(NO)、磷酸根(PO4 3-)、焦磷酸根(P2O7 4-)和活性氧物质。在一些实施方案中，本公开涉及包含本文所述的核酸复合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒还包含编码同源人工蛋白受体的质粒。在一些实施方案中，该试剂盒还包含基于核酸的传感器，该传感器包括a)感测模块，其包含肽核酸(PNA)链和靶标敏感分子；b)标准化模块，其包含与所述PNA链互补的核酸序列和靶标不敏感荧光团；和c)靶向模块，其包含与所述标准化模块的核酸序列互补的核酸序列。
本公开的另一些方面涉及一种用于在模型细胞或生物体中筛选候选药物的方法，其包括：将本公开的核酸复合物递送至所述细胞或生物体；使所述细胞或生物体与所述候选药物接触，测量所述信号的强度；以及由所测量的信号确定所述pH。在一些实施方案中，所述样品是选自细胞、细胞提取物、细胞裂解物、组织、组织提取物、体液、血清、血液和血液制品的生物样品。在一些实施方案中，所述样品是活细胞。在一些实施方案中，所述样品是来自患者的生物样品。
另一些方面涉及一种用于检测疾病的严重性、疾病的进展或疾病的存在的方法，所述方法包括：将本公开的核酸复合物转移到样品中；测量所述信号的强度；以及由所测量的信号确定所述pH。
在本文描述的任何方法中的一些实施方案中，所述方法还包括确定或靶向靶标，该靶标选自Cl-、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Pb2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+、H+、Na+、K+、F-、Br-、I-、氰化物(CN-)、硝酸根(NO3 -)、亚硝酸根(NO2 -)、一氧化氮(NO)、磷酸根(PO4 3-)、焦磷酸根(P2O7 4-)和活性氧物质。在一些实施方案中，使用基于核酸的传感器来量化或确定靶标，该传感器包含：a)感测模块，其包含核酸或肽核酸(PNA)链、和靶标敏感分子；b)标准化模块，其包含与所述核酸或PNA链互补的核酸序列、和靶标不敏感荧光团；和c)靶向模块，其包含与所述标准化模块的所述核酸序列互补的核酸序列，任选地具有适配体。在一些实施方案中，所述方法还包括通过确定靶标不敏感荧光团与靶标敏感荧光团的荧光比来对所述靶标进行量化。在一些实施方案中，所述靶标敏感分子选自包括以下的组：SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓)、MACA(10-甲基吖啶鎓-9-羧酰胺)、MADC(10-甲基吖啶鎓-9-N,N-二甲基羧酰胺)、MAMC(N-甲基吖啶鎓-9-甲基羧酸盐)、DMAC(2,10-二甲基吖啶鎓-9-羧醛)、MAA(N-甲基-9-氨基吖啶鎓)、6-甲氧基N-(4-磺基丁基)喹啉鎓、N-十二烷基-6-甲氧基喹啉鎓碘化物、6-甲基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓溴化物、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓四苯基硼酸盐、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓溴化物、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓碘化物；N，N'-二甲基-9-9'-二吖啶鎓和10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)或其修饰物和衍生物，优选为10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)；所述靶标不敏感荧光团选自包括Alexafluor 568、Alexafluor 594和Alexa 647的组，优选为Alexa647；并且其中所述靶标敏感分子与所述靶标不敏感荧光团的比是1:1。在一些实施方案中，所述感测模块包含如SEQ ID NO：1所示的序列；所述标准化模块包含如SEQ ID NO：2所示的序列；并且所述靶向模块包含选自包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的组中的序列。
在一些实施方案中，所述模型细胞或生物体是用于溶酶体贮积病的模型。在一些实施方案中，所述疾病是溶酶体贮积病。
在整个申请中，术语“约”用于表明所述值包括用于确定该值的器件或方法所具有的误差的标准偏差。
在权利要求中所用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出该术语“或”仅指代替代方案，或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指代替代方案的定义和“和/或”。也可以预期的是，使用术语“或”列出的任何内容也可以被明确排除。
如在本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含”(以及包含的任何形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有”(以及具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”、“包括”(以及包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)、或“含有”(以及含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或者开放性的，并且不排除额外的、未列举的元件或方法步骤。
根据下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解的是，尽管指出了本发明的具体实施方案，但是仅通过说明的方式给出了详细描述和具体实例，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和变型对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且用以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A-C.I-开关及其各种变型的工作原理的示意图。(图1A)I-开关的工作原理；(+)示出了供体和受体荧光团。(图1B)在I-开关中形成的i-基序的示意图。指出了胞嘧啶(灰色三角形)和修饰的胞嘧啶(*)的位置。三角形顶点指向3’链末端。(图1C)引入本研究中使用的被修饰的胞嘧啶的I-开关变体。星号(*)表示被修饰的胞嘧啶。各个变体对于被修饰的胞嘧啶仅具有一种类型的修饰物，制备了5-溴胞嘧啶修饰的变体和5-甲基胞嘧啶修饰的变体。
图2A-D.所有I-开关变体的体外表征。(图2A和2B)1X夹持缓冲液(clampingbuffer)中的1μM天然(I4)I-开关、5'-溴胞嘧啶修饰的(Br I-开关)I-开关(图2A)、5'-甲基胞嘧啶修饰的(Me I-开关)I-开关(图2B)在292nm处的标准化椭圆率(Θ)被显示为pH的函数。(c&d)带有双重标签的I-开关组件的供体(D)与FRET受体(A)的比例测量作为pH的函数。1X夹持缓冲液中的50nMBr I-开关(图2C)和Me I-开关(图2D)在520nm和669nm(λex495nm)处的荧光强度的标准化比被显示为pH的函数。所有实验在RT下进行3次，并显示为平均值±平均值的标准误差。图2A-D的数据表示来自I4变体、穿插(■)变体、核心(●)变体、末端(▲)变体和连续(▼)变体的数据。
图3A-B.各种I-开关的pH调节。与天然(I4)开关相比的Br修饰的开关的动态范围(图3A)，以及与天然(I4)开关相比的Me修饰的开关的动态范围(图3B)。
图4.pH半的确定：使用OriginPro 8，使用波尔兹曼分布对各I开关的标准化D/A v/s pH的图进行拟合。样品曲线和用于拟合的公式为：y＝[(A1-A2)/1+e(x–x 0))/dx]+A2；其中：A1＝初始值；A2＝最终值；x0＝曲线的中点(pH半)；并且dx＝时间常数。获得了各I-开关样品的相应的pH半，并记录在表1中。
图5.协同性的确定：使用OriginPro8中的量效(DoseResponse)曲线，通过拟合各I-开关的标准化D/A值v/s pH的图来确定协同性。样品曲线和用于拟合的公式如下：y＝A1+[(A2-A1)/1+10(logx0-x)p]；其中：A1<A2；p>0；底部渐近线：A1＝1；顶部渐近线：A2＝2；中心：logx0；Hill斜率：p＝协同性。获得了相应的协同性值并记录在表1中。
图6.I-开关的基本设计：显示出配对区域(黑线)和被设计为不匹配的三个代表性I-开关(随机选择)的pH感测结构域。第一个是I4的代表，第二个是核心(5’-溴代胞嘧啶修饰的开关，用星号表示)的代表，第三个是末端(5’-甲基胞嘧啶修饰的开关，用星号表示)的代表(SEQ ID NOs.39-44)。
图7A-I.使用CD光谱法对I-开关的体外表征。(图7A-D)对于Br修饰的I-开关，各I-开关在pH 8.5、pH 5.0下的摩尔椭圆率和差异光谱(pH 5.0-pH 8.5)。(图7E-H)对于Me修饰的I-开关，I-开关在pH 8.5、pH 5.0下的CD光谱和差异光谱(pH 5.0-pH 8.5)。(图7I)I4在pH 8.5、pH 5.0下的摩尔椭圆率和差异光谱(pH 5.0-pH 8.5)。
图8A-H.在体外使用荧光光谱法体对I-开关的体外表征。(图8A-D)各种Br修饰的I-开关在pH 5.0和pH 8.5下的荧光光谱(505nm-725nm)。(图8E-H)各种Me修饰的I-开关在pH 5.0和pH 8.5下的荧光光谱(505nm-725nm)。
图9A-B.pH半的确定。示出了对于Br修饰的开关(图9A)和Me修饰的开关(图9B)，使用波尔兹曼曲线拟合的两个随机选择的D/A v/s pH曲线及其相应的参数。
图10A-B.协同性的确定。示出了对于I4 A488/A647(图10A)和I7 A488/A647(图10B)，使用量效曲线拟合的两个随机选择的D/A v/s pH曲线及其相应的参数。
图11A-G.(A)体内和体外的I4LY A488/A647的pH校准曲线，其示出了标准化D/A比vs pH(n＝15个细胞，≥60个内体)。(B)由pH4.0到pH7.5，I4LY A488/A647的D/A比的体外和体内倍数变化。(C)体内和体外的Clensor的校准曲线，其示出了标准化R/G比vs[Cl-](n＝15个细胞，≥50个内体)。(D)由5mM[Cl-]到80mM[Cl-]，Clensor的R/G比的体外和体内倍数变化。(E)在所示的对应于Niemann-Pick C疾病的遗传背景下，使用I4LY A488/A647测量的溶酶体pH(n＝10个蠕虫，≥100个溶酶体)。(E)由从指定遗传背景的蠕虫中提取的相当于400μg总蛋白质的总脂质的TLC分析获得的胆固醇水平。所有情况下的误差线都表明s.e.m。(F)在指定的对应于常染色体隐性骨硬化病的遗传背景下使用Clensor测量的溶酶体氯浓度([Cl-])(n＝10蠕虫，≥100个溶酶体)。
具体实施方式
本文所述的核酸复合物是I-开关，其是经历由质子触发的构象变化的DNA纳米机器。I-开关可以有效地绘制与活细胞内以及存在于活生物体中的细胞内的内体成熟相关的时空pH变化。不同的细胞内细胞器保持不同的静息pH，其从pH4.5(溶酶体)到pH8.0(线粒体)，因此需要设计能够响应整个生理范围的I-开关。本文所述的方法和组合物展示了一类新的被修饰的I-开关，其不仅保持了作为pH报告物的功能性，而且也是非常灵敏的并且具有改进的pH报告能力范围。
I.核酸复合物
A.I-开关
在人类基因组中，例如在端粒和几种致癌基因(例如c-myc)的启动子中发现了富含胞嘧啶的DNA序列。I-开关可以在弱酸性条件下形成特殊的四链体结构(称为i-基序)，其中通过C·CH+配对的两条平行双链体以头尾相接的方向而互相插入。“i-基序”是含有核酸(DNA和/或RNA)的复合物，其特征在于存在富含胞嘧啶的片段或富含胞嘧啶衍生物的片段，并且包括两个平行链双链体，其中的胞嘧啶或其衍生物形成碱基，并且两个双链体彼此反平行关联。一个双链体的胞嘧啶或其衍生物的对插入另一个双链体的胞嘧啶或其衍生物的对。
i-基序的结构不同于通常的DNA双链体的结构，因为碱基配对方案涉及半质子化的胞嘧啶，其导致C·C+碱基对的形成。具体而言，各个对中所含有的胞嘧啶中的一个被质子化。如上所述，i-基序也可以作为由两个双链体的结合而形成的四链体而存在。
复合物可以由寡核苷酸序列合成，该寡核苷酸序列包含由至少两个、至少三个或至少四个连续的胞嘧啶组成的片段。通过调整胞嘧啶的数目以及两条链之间的互补程度，可以调节I开关的响应时间和pH感测范围。当有更多的胞嘧啶提供至i-基序时，基序的稳定性增加。而且，该基序可以通过含有不同数目胞嘧啶的片段的相互作用而形成。此外，富含胞嘧啶的片段可以在胞嘧啶之间包含一个或两个非胞嘧啶碱基。然而，这可能会降低i-基序的稳定性。构成i-基序的胞嘧啶片段可以属于不同的核酸链；然而，它们中的任意两个也可以通过共价键或非共价键而连接在一起。而且，它们中的任意两个可以是单核酸链的一部分，其中通过特定的碱基片段将它们分开。
下表中示出了一些示例性I-开关及其相应的I-基序序列：
B.标签
本文所述的组合物和方法中的寡核苷酸和核酸分子可以包含一个或多个标签。可通过引入可通过一种或多种手段检测的部分来标记核酸分子，所述手段包括但不限于光谱法、光化学法、生物化学法、免疫化学法或化学法检验。将标签与核苷酸或寡核苷酸连接或结合的方法取决于所使用的标签的类型和标签在核苷酸或寡核苷酸上的位置。
如本文所用，“标签”是用于标记核酸的化学或生物化学部分。“标签”包括(例如)荧光剂、化学发光剂、发色剂、淬灭剂、放射性核苷酸、酶、底物、辅因子、抑制剂、纳米颗粒、磁性颗粒和本领域已知的其它部分。标签能够产生可测量的信号，并且可以通过共价键或非共价键与寡核苷酸或核苷酸连接。
在一些实施方案中，核酸分子可以用“荧光染料”或“荧光团”标记。如本文所用，“荧光染料”或“荧光团”是可以被光激发以发射荧光的化学基团。一些荧光团可能被光激发而发射磷光。染料可以包括能够使来自荧光供体染料的荧光信号淬灭的受体染料。可以在本公开的方法中使用的染料包括但不限于下列以下列商品名销售的染料：1,5IAEDANS、1,8-ANS、4-甲基伞形酮、5-羧基-2,7-二氯荧光素、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5-羟基色胺(HAT)、5-ROX(羧基-X-若丹明)、6-羧基罗丹明6G、6-JOE、7-氨基-4-甲基香豆素、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、7-羟基-4-甲基香豆素、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、ABQ、酸性品红、ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)、吖啶橙、吖啶红、吖啶黄、锥虫黄、锥虫黄福尔根SITSA、Alexa Fluor 350TM、Alexa Fluor 430TM、Alexa Fluor 488TM、AlexaFluor 532TM、Alexa Fluor 546TM、Alexa Fluor 568TM、Alexa Fluor594TM、Alexa Fluor633TM、Alexa Fluor 647TM、Alexa Fluor 660TM、Alexa Fluor 680TM、茜素络合酮、茜素红、别藻蓝蛋白(APC)、AMC、AMCA-S、AMCA(氨甲基香豆素)、AMCA-X、氨基放线菌素D、氨基香豆素、氨甲基香豆素(AMCA)、苯胺蓝、Anthrocyl硬脂酸盐、APC(别藻蓝蛋白)、APC-Cy7、APTS、Astrazon亮红4G、Astrazon橙R、Astrazon红6B、Astrazon黄7GLL、阿的平、ATTO-TAGTMCBQCA、ATTO-TAGTMFQ、金胺、Aurophosphine G、Aurophosphine、BAO 9(双氨基苯基恶二唑)、硫酸黄连素、β-内酰胺酶、BFP蓝移GFP(Y66H)、蓝色荧光蛋白、BFP/GFP FRET、Bimane、双苯甲酰胺、双苯酰亚胺(Hoechst)、布兰科福尔FFG、布兰科福尔SV、BOBOTM-1、BOBOTM-3、Bodipy 492/515、Bodipy 493/503、Bodipy 500/510、Bodipy505/515、Bodipy 530/550、Bodipy 542/563、Bodipy 558/568、Bodipy564/570、Bodipy 576/589、Bodipy 581/591、Bodipy 630/650-X、Bodipy650/665-X、Bodipy 665/676、Bodipy FL、Bodipy FL ATP、Bodipy Fl-神经酰胺、Bodipy R6G SE、Bodipy TMR、Bodipy TMR-X结合物、Bodipy TMR-X,SE、Bodipy TR、Bodipy TR ATP、Bodipy TR-X SE、BO-PROTM-1、BO-PROTM-3、亮磺基黄素FF(BrilliantSulphoflavin FF)、钙黄绿素、钙黄绿素蓝、Calcium CrimsonTM、钙绿、钙橙、Calcofluor白、Cascade BlueTM、Cascade黄、儿茶酚胺、CCF2(GeneBlazer)、CFDA、CFP—青色荧光蛋白、CFP/YFP FRET、叶绿素、色霉素A、CL-NERF(比染料,pH)、CMFDA、腔肠素(Coelenterazine)f、腔肠素fcp、腔肠素h、腔肠素hcp、腔肠素ip、腔肠素n、腔肠素O、香豆素鬼笔环肽、C-藻蓝蛋白、CPM甲基香豆素、CTC、CTC甲腊、Cy2TM、Cy3.18、Cy3.5TM、Cy3TM、Cy5.18、Cy5.5TM、Cy5TM、Cy7TM、青色GFP、环状AMP荧光传感器(FiCRhR)、Dabcyl、丹酰、丹酰胺、丹酰尸胺、氮磺酰氯、丹酰DHPE、氮磺酰氟、DAPI、Dapoxyl、Dapoxyl2、Dapoxyl 3、DCFDA、DCFH(二氯二氢荧光素二乙酸酯)、DDAO、DHR(二氢罗丹明123)、Di-4-ANEPPS、Di-8-ANEPPS(非比例)、DiA(4-Di-16-ASP)、二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH)、DiD—亲脂性示踪剂、DiD(DiIC18(5))、DIDS、二氢罗丹明123(DHR)、DiI(DiIC18(3))、二硝基苯酚、DiO(DiOC18(3))、DiR、DiR(DiIC18(7))、DNP、多巴胺、DsRed、DTAF、DY-630-NHS、DY-635-NHS、EBFP、ECFP、EGFP、ELF 97、曙红、赤藓红、赤藓红ITC、溴化乙锭、乙锭同型二聚体-1(EthD-1)、Euchrysin、EukoLight、氯化铕(III)、EYFP、坚牢蓝(Fast Blue)、FDA、Feulgen(副品红碱)、Flazo橙、Fluo-3、Fluo-4、荧光素(FITC)、荧光素二乙酸酯、Fluoro-祖母绿、Fluoro-金(羟二脒替)、Fluor-Ruby、FluorX、FM 1-43TM、FM 4-46、Fura RedTM、Fura RedTm/Fluo-3、Fura-2、Fura-2/BCECF、Genacryl亮红B、Genacryl亮黄10GF、Genacryl粉3G、Genacryl黄5GF、GeneBlazer(CCF2)、GFP(S65T)、GFP红移(rsGFP)、GFP野生型非UV激发(wtGFP)、GFP野生型UV激发(wtGFP)、GFPuv、Gloxalic Acid、颗粒蓝、血卟啉、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、HPTS、羟基香豆素、羟二脒替(FluoroGold)、羟色胺、Indo-1、吲哚二羰菁(DiD)、吲哚三羰菁(DiR)、Intrawhite Cf、JC-1、JO-JO-1、JO-PRO-1、Laurodan、LDS 751(DNA)、LDS 751(RNA)、雷可福PAF、雷可福SF、雷可福WS、丽丝胺罗丹明、丽丝胺罗丹明B、钙黄绿素/乙锭同型二聚体、LOLO-1、LO-PRO-1、荧光黄、Lyso Tracker蓝、Lyso Tracker蓝-白、Lyso Tracker绿、Lyso Tracker红、LysoTracker黄、LysoSensor蓝、LysoSensor绿、LysoSensor黄/蓝、Mag绿、Magdala红(PhloxinB)、Mag-Fura红、Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-Indo-1、镁绿、镁橙、孔雀绿、Marina蓝、Maxilon亮黄素10GFF、Maxilon亮黄素8GFF、Merocyanin、甲氧基香豆素、Mitotracker绿FM、Mitotracker橙、Mitotracker红、Mitramycin、单溴二胺(Monobromobimane)、单溴二胺(mBBr-GSH)、单氯二胺(Monochlorobimane)、MPS(甲基绿派若宁芪)、NBD、NBD胺、Nile Red、NEDTM、Nitrobenzoxadidole、甲肾上腺素、核坚牢红、核黄、Nylosan Brilliant Iavin E8G、Oregon绿、Oregon绿488-X、Oregon GreenTM、Oregon GreenTM488、Oregon GreenTM500、Oregon GreenTM514、Pacific蓝、副品红(Feulgen)、PBFI、PE-Cy5、PE-Cy7、PerCP、PerCP-Cy5.5、PE-TexasRed[Red 613]、根皮红B(苏丹红)、Phorwite AR、Phorwite BKL、PhorwiteRev、Phorwite RPA、膦3R、藻红蛋白B[PE]、藻红蛋白R[PE]、PKH26(Sigma)、PKH67、PMIA、Pontochrome蓝黑、POPO-1、POPO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、樱草素、Procion黄、Propidium碘化物(PI)、PYMPO、Pyrene、派诺宁、派诺宁B、Pyrozal亮黄素7GF、QSY 7、阿的平芥末黄、Red613[PE-TexasRed]、Resorufin、RH 414、Rhod-2、罗丹明、罗丹明110、罗丹明123、罗丹明5GLD、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明B 200、罗丹明B extra、罗丹明BB、罗丹明BG、罗丹明Green、罗丹明Phallicidine、罗丹明鬼笔环肽、罗丹明Red、罗丹明WT、玫瑰红(RoseBengal)、R-藻蓝蛋白、R-藻红蛋白(PE)、RsGFP、S65A、S65C、S65L、S65T、Sapphire GFP、SBFI、5羟色胺(Serotonin)、Sevron亮红2B、Sevron亮红4G、Sevron亮红B、Sevron橙、Sevron黄L、sgBFPTM、sgBFPTM(super glow BFP)、sgGFPTM、sgGFPTM(super glow GFP)、SITS、SITS(樱草素)、SITS(Stilbene Isothiosulphonic Acid)、SNAFL钙黄绿素、SNAFL-1、SNAFL-2、SNARF钙黄绿素、SNARF1、钠绿、SpectrumAqua、SpectrumGreen、SpectrumOrange、SpectrumRed、SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)喹啉鎓)、Stilbene、磺基罗丹明B can C、磺基罗丹明GExtra、SYTO 11、SYTO 12、SYTO 13、SYTO 14、SYTO15、SYTO 16、SYTO 17、SYTO 18、SYTO 20、SYTO 21、SYTO 22、SYTO 23、SYTO 24、SYTO 25、SYTO 40、SYTO 41、SYTO 42、SYTO 43、SYTO44、SYTO 45、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62、SYTO 63、SYTO 64、SYTO 80、SYTO 81、SYTO 82、SYTO 83、SYTO 84、SYTO 85、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、TETTM、四环素、四甲基罗丹明(TRITC)、Texas RedTM、Texas Red-XTM结合物、Thiadicarbocyanine(DiSC3)、噻嗪红R、噻唑橙、Thioflavin 5、Thioflavin S、Thioflavin TCN、Thiolyte、噻唑橙、Tinopol CBS(卡尔科福卢尔白)、TMR、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、TOTO-3、TriColor(PE-Cy5)、TRITC四甲基罗丹明异硫氰酸盐、True Blue、TruRed、Ultralite、Uranine B、UvitexSFC、wt GFP、WW 781、X-罗丹明、XRITC、二甲苯橙、Y66F、Y66H、Y66W、Yellow GFP、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、以及其盐。
荧光染料或荧光团可以包括这样的衍生物，该衍生物被修饰以促进与另一个反应性分子结合。如此，荧光染料或荧光团可以包括胺反应性衍生物，例如荧光团的异硫氰酸酯衍生物和/或琥珀酰亚胺酯衍生物。
所公开的组合物和方法的核酸分子可以用淬灭剂标记。淬灭可以包括动态淬灭(例如，通过FRET)、静态淬灭或这两者。示例性的淬灭剂可以包括Dabcyl。示例性淬灭剂还可以包括暗淬灭剂，其可以包括以商品名“BHQ”销售的黑洞淬灭剂(例如，BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3，Biosearch Technologies公司,Novato,Calif.)。暗淬灭剂还可以包括以商品名“QXLTM”(Anaspec,San Jose,Calif.)出售的淬灭剂。暗淬灭剂还可以包括包含2,4-二硝基苯基的DNP型非荧光团。
在一些情况下，可能有用的是，在两个或更多个寡核苷酸上包含相互作用标签，同时适当地考虑到在核酸分子上保持标签的适当间隔以在I-开关中的构象变化期间允许标签的分开。一种类型的相互作用标签对是淬灭剂-染料对，其可以包括荧光团和淬灭剂。普通技术人员可以选择可淬灭特定荧光团发光的合适的淬灭剂部分。在示例性实施方案中，Dabcyl淬灭剂吸收来自荧光团部分的发射荧光。
在一些实施方案中，可以使用荧光共振能量转移(FRET)或荧光偏振来检测两个标签的接近度。FRET是两个染料分子的电子激发态之间的距离依赖性相互作用，其中激发是从供体分子转移到受体分子而不发射光子。用于FRET的供体/受体染料对的实例是本领域已知的，并且可以包括本文描述的荧光团和淬灭剂，例如荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素(分子探针，Eugene,Oreg.)、EDANS/Dabcyl、荧光素/荧光素(分子探针,Eugene,Oreg.)、BODIPY FL/BODIPY FL(分子探针,Eugene,Oreg.)、BODIPY TMR/ALEXA647、ALEXA-488/ALEXA-647和荧光素/QSY7TM。
可以通过各种技术将标签直接或间接地与核酸分子结合。根据所使用的标签的确切类型，标签可以位于寡核苷酸的5'或3'末端、位于寡核苷酸的核苷酸序列的内部、或者连接到由寡核苷酸延伸并具有各种尺寸和组成的间隔臂上以促进信号相互作用。使用可商购的亚磷酰胺试剂，可以通过受适当保护的亚磷酰胺产生在任一末端或内部含有官能团(例如，硫醇或伯胺)的核酸分子(例如通过形成磷酸酯键将亚磷酰胺染料偶联至5'碱基的5'羟基)。
核酸分子还可以将具有一个或多个巯基、氨基或羟基部分的功能化试剂引入到核酸序列中。例如，通过使用多核苷酸激酶和[γ32P]ATP，可以将5'磷酸基团作为放射性同位素引入从而提供报告基团。可以通过使在合成期间引入的氨基胸苷残基与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来将生物素添加到5'末端。例如，3'末端的标签可以使用多核苷酸末端转移酶来添加所需的部分，例如虫草素、35S-dATP和生物素化的dUTP。
寡核苷酸衍生物也可用作标签。例如，亚乙烯基-dA和亚乙烯基-A是已知的荧光腺嘌呤核苷酸，其可以被引入至报告物。类似地，亚乙烯基-dC是另一种可用于报告物合成中的类似物。在核酸聚合酶在PCR期间延伸引物时，可以通过聚合酶的5'至3'核酸酶活性使含有这种核苷酸衍生物的报告物水解以释放强得多的荧光单核苷酸。
C.将I-开关引入细胞
在一些实施方案中，待测量pH的样品可以是生物样品，例如生物组织或细胞或生物体。该方法适用于测量细胞的特定区域中的pH，该特定区域(例如)为胞质溶胶或细胞器空间，如但不限于内部线粒体基质、高尔基体腔、内质网、叶绿体腔、溶酶体腔、细胞核或内体腔。
可以通过本领域的任何方法容易地将本文所述的核酸分子引入至宿主细胞，例如哺乳动物(任选人)细胞、细菌细胞、寄生虫细胞、酵母细胞或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物手段将核酸转移到宿主细胞中。容易理解的是，核酸分子的引入产生了可以监测细胞内pH的细胞。因此，该方法可用于测量体外培养的细胞中的细胞内pH。也可以容易地将I-开关引入到整个生物体中以测量体内细胞或组织中的pH。例如，可以通过物理、化学或生物手段(例如直接注射)将I-开关转移到生物体。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。参见例如Sambrook等人(分子克隆:实验室手册,冷泉港实验室,纽约，2001)和Ausubel等人(分子生物学现代方法,John Wiley&Sons,纽约,1997)。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、小珠和基于脂质的系统(包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送媒介的一种胶体体系是脂质体(即，人造膜囊泡)。这种系统的制备和使用在本领域中是公知的。
在一些实施方案中，考虑使用脂质配制物将I-开关引入至宿主细胞(体外、离体或体内)。在一些实施方案中，I-开关可以与脂质结合。可以将与脂质结合的I-开关封装在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸这两者相连的连接分子附接至脂质体、包裹在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮体而包含在脂质中、包含胶束或与胶束复合，或以其他方式与脂质结合。脂质、脂质/I-开关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，脂质、脂质/I-开关组合物可以以双层结构、作为胶束、或“塌陷”结构存在。脂质、脂质/I-开关组合物也可以简单地散布在溶液中，从而可能形成在大小或形状上不均匀的聚集体。
脂质体介导的寡核苷酸递送和外源DNA在体外的表达已经非常成功。Wong等人(1980)证明了外源DNA的脂质体介导的递送和表达在培养的鸡胚、HeLa和肝癌细胞中的可行性。Nicolau等人(1987)在静脉注射后在大鼠中成功实现了脂质体介导的基因转移。
在一些实施方案中，所述脂质可以与血凝性病毒(HVJ)相关联。已显示这有助于与细胞膜的融合并促进脂质体封装的DNA进入细胞。在一些实施方案中，脂质可以与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或结合使用。在一些实施方案中，脂质可以与HVJ和HMG-1复合或结合使用。
在一些实施方案中，将一个或多个I-开关连接至将I-开关引导至所需的细胞区室的靶向序列。靶向序列的实例包括但不限于人II型膜锚定蛋白半乳糖基转移酶的氨基末端81个氨基酸(其用于将荧光指示剂蛋白引导至高尔基体)、和细胞色素C氧化酶的亚基IV的前序列的氨基末端12个氨基酸(其用于将荧光pH指示剂蛋白引导至线粒体基质)。可以通过接头序列将细胞色素c氧化酶的亚基IV的前序列的12个氨基酸与pH荧光指示剂蛋白连接。
II.组合传感器
本发明的方法、核酸和核酸复合物可以与另外的基于核酸的传感器(如在WO2015/159122中描述的那些，其通过引用而并入本文中)组合使用。另外的基于核酸的传感器包括(例如)这样的实施方案，其包括：a)感测模块，其包含肽核酸(PNA)链和靶标敏感分子；b)标准化模块，其包含与所述PNA链互补的核酸序列和靶标不敏感荧光团；和c)靶向模块，其包含与所述标准化模块的所述核酸序列互补的核酸序列，任选地具有适配体。
本公开还涉及获得如上所述的基于核酸的传感器的方法，所述方法包括以下步骤：a)通过将靶标敏感分子结合至肽核酸(PNA)链来获得感测模块；b)通过将靶标不敏感荧光团结合至与感测模块的PNA链互补的核酸序列来获得标准化模块；c)获得靶向模块，所述靶向模块包含与所述标准化模块的核酸序列互补的核酸序列，并任选地与适配体结合；和d)将感测模块、标准化模块和靶向模块组合以获得基于核酸的传感器。
本公开还涉及确定和任选地定量样品中的靶标的方法，所述方法包括以下步骤：a)使样品与如上所述的基于核酸的传感器接触并孵育；b)通过确定荧光水平的变化来确定靶标；和c)任选地通过确定靶标不敏感荧光团与靶标敏感分子的荧光比来对靶标进行量化。
在本公开的一个实施方案中，靶向模块包含选自包括DNA、RNA和PNA或其任意组合的组中的核酸序列，优选为DNA和RNA的组合；并且标准化模块包含选自包括DNA、RNA和PNA或其任意组合的组中的核酸序列，优选为DNA。
在本公开的另一实施方案中，所述基于核酸的传感器用于检测靶标，该靶标选自包括以下物质的组：Cl-、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Pb2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+、H+、Na+、K+、F-、Br-、I-、氰化物(CN-)、硝酸根(NO3 -)、亚硝酸根(NO2 -)、一氧化氮(NO)、磷酸根(PO4 3-)、焦磷酸根(P2O7 4-)和活性氧物质。在一些实施方案中，所述基于核酸的传感器用于检测Cl-离子。
在本公开的又另一实施方案中，靶标敏感分子选自包括以下物质的组：SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓)、MACA(10-甲基吖啶鎓-9-羧酰胺)、MADC(10-甲基吖啶鎓-9-N,N-二甲基羧酰胺)、MAMC(N-甲基吖啶鎓-9-甲基羧酸盐)、DMAC(2,10-二甲基吖啶鎓-9-羧醛)、MAA(N-甲基-9-氨基吖啶鎓)、6-甲氧基N-(4-磺基丁基)喹啉鎓、N-十二烷基-6-甲氧基-喹啉鎓碘化物、6-甲基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓溴化物、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓四苯基硼酸盐、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓溴化物、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓碘化物；N，N'-二甲基-9-9'-二吖啶鎓和10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)或其修饰物和衍生物，优选为10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)；所述靶标不敏感荧光团选自包括Alexafluor 568、Alexafluor 594和Alexa647的组，优选为Alexa 647；并且其中所述靶标敏感分子与所述靶标不敏感荧光团的比值是1:1。
在一些实施方案中，所述感测模块包含如SEQ ID NO：1所示的序列；所述标准化模块包含如SEQ ID NO：2所示的序列；并且所述靶向模块包含选自包括SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4的组中的序列。
在一些实施方案中，适配体将传感器靶向细胞中的特定位置并且选自包括DNA、RNA和PNA或其任意组合的组中。在一些实施方案中，适配体是与人转铁蛋白受体特异性结合的RNA适配体；并且RNA适配体包含如SEQ ID NO：5所示的序列。在一些实施方案中，所述样品是生物样品，其选自包括细胞、细胞提取物、细胞裂解物、组织、组织提取物、体液、血清、血液和血液制品的组中。
在一些方面中，本公开的方法可以进一步包括靶向基于核酸的传感器的方法，所述方法包括以下步骤：a)通过如上所述的方法获得基于核酸的传感器；b)将传感器加入细胞中以进行细胞摄取，从而获得具有传感器的细胞；和c)培育步骤b)中获得的细胞，以使基于核酸的传感器追踪细胞内的靶向细胞途径。在一些实施方案中，细胞选自包括原核细胞和真核细胞的组。在一些实施方案中，将基于核酸的传感器的靶向模块设计为使基于核酸的传感器靶向追踪细胞内的细胞途径。
本文所述的分析物传感器还可以与本文所述的方法、组合物和试剂盒中的pH传感器组合使用。在一些方面中，试剂盒还可以包括选自感测模块、靶向模块、标准化模块、基于核酸的传感器、细胞、样品和说明书手册或其任意组合的组中的组件。
本公开的一些方面涉及包括感测模块、标准化模块和靶向模块的基于核酸的传感器。所述传感器用于检测靶离子或分子。传感器可以与全文描述的方法中的pH传感器结合使用。另外，传感器可以有效地连接到本文所述的pH传感器。有效地连接是指将两个分子有效连接在一起的连接，但可能不一定是共价连接，如通过涉及范德华力的两种蛋白的连接。在一些实施方案中，pH传感器和分析物传感器是共价连接的。
在一些实施方案中，感测模块包含肽核酸(PNA)，靶向模块包含DNA或RNA或PNA或其任意组合，标准化模块包含DNA或RNA或PNA或其任意组合。在一些实施方案中，基于核酸的比度量传感器的感测模块是肽核酸(PNA)。该链与靶标敏感分子结合，例如：小的荧光的氯离子敏感分子，如BAC(10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-联吖啶鎓二硝酸盐)。在一些实施方案中，标准化模块是靶标不敏感荧光团，例如：氯离子不敏感荧光团(如Alexa 647)，其结合至与感测模块的PNA互补的DNA序列。此外，靶向模块是与标准化模块的DNA互补的第二DNA序列。在一些实施方案中，标准化模块的序列与感测模块的PNA链的序列共享部分互补性。在一个实施方案中，靶向模块的序列与标准化模块的序列共享部分互补性。
本公开涉及使用基于核酸的荧光比度量传感器来检测本文所述的方法和试剂盒中的靶标。在一些实施方案中，本公开涉及用于离子的基于核酸的荧光比度量传感器。在一些实施方案中，本公开涉及用于分子的基于核酸的荧光比度量传感器。
在一些实施方案中，本公开涉及通过测量细胞内特定位置中的相关离子的浓度而不是测量离子电流来研究任何离子通道的功能和定位的方法。所述传感器还用于在寿命测量模式(lifetime measurement mode)下测量离子浓度，这是不依赖于浓度的。
在一些实施方案中，在靶标的存在下，靶标敏感荧光团的荧光强度降低(碰撞淬灭)。荧光强度的降低是靶标浓度的读出。在一些实施方案中，基于核酸的荧光比度量传感器测量氯离子浓度(Cl-)，并且可以被称为“Clensor”(氯化物传感器)或基于核酸的传感器。
在本公开的一个实施方案中，基于核酸的传感器的传感器模块由SEQ ID NO：1所示的PNA以及靶标敏感分子组成。标准化模块由SEQ ID NO：2所示的DNA和靶标不敏感荧光团组成。靶向模块由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的DNA组成。
在本公开中，PNA或PNA链或PNA序列可互换使用并且具有相同的范围或含义。在本公开中，DNA或DNA链或DNA序列可互换使用并且具有相同的范围或含义。在本公开中，RNA或RNA链或RNA序列可互换使用并且具有相同的范围或含义。
在一些实施方案中，本公开的传感器通过在生理条件下稳定的Watson-Crick碱基配对使其全部三个不同的模块自组装。
在本公开的实施方案中，使用两种类型的靶向模块：A)仅DNA和B)DNA和RNA的组合。仅包含DNA的靶向模块与标准化模块杂交以形成通过阴离子配体结合受体(ALBR)的细胞内靶向所需的dsDNA结构域。使用在靶向模块中与DNA结合使用的RNA序列来实现靶向转铁蛋白途径。
在一些实施方案中，使用DNA链作为标准化模块。在本公开的一个实施方案中，传感器具有由靶向模块和标准化模块的杂交获得的dsDNA部分(最小8bp序列)以用于细胞内靶向。在一个实施方案中，传感器包含d(AT)4序列，并因此靶向至任何表达选择的带scFv标签的蛋白的细胞中的任何给定区室。
本公开仅通过示例的方式提供了用于制备Clensor传感器分子的氯离子浓度测量和序列、荧光团等。本公开的范围不仅限于构成特定传感器分子的特定靶离子/分子、序列或荧光团的组合、或特定靶离子/分子的测量。可以根据对不同靶标敏感分子和靶标不敏感荧光团的需要来改变和结合靶向模块、感测模块或标准化模块中涉及的序列，以制备测量不同分子和离子的浓度的各种传感器分子。
III.靶向基序
本公开的核酸分子和复合物可以包含靶向基序。如本文所使用的“靶向基序”是对某种靶标具有亲和力或由于其化学组成而靶向细胞中特定位置的分子(如核酸、小分子或多肽)。靶向基序可以充当将本公开的核酸复合物靶向至不同亚细胞位置的手段。靶向基序可以是与受体蛋白结合的核酸，受体蛋白可以是在细胞内靶向或结合至细胞内被靶向的蛋白的那些。靶向基序或受体蛋白可以为靶向核酸或蛋白质，例如可内吞的质膜蛋白、具有天然受体的任何蛋白质、通过质膜在细胞内位置之间运输的蛋白质、毒素、病毒和病毒衣壳蛋白、细胞穿透肽、信号序列、细胞内靶向序列、小有机分子、内吞配体和转运蛋白。在一些实施方案中，靶向基序是适配体、靶向人工造蛋白受体的双链体结构域、结合阴离子-配体结合受体的核酸序列或内吞配体。靶向基序也可以是G4核心序列或核酶。
IV.使用I-开关进行细胞或组织中的pH的体内/离体检测
本文公开了用于确定pH的方法，其包括提供核酸复合物，该核酸复合物包含：包含序列CnXCnYCnZCn(SEQ ID NO.6)的第一单链核酸分子，其中C是胞嘧啶；X、Y和Z各自为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一种或多种；并且n大于或等于2；并且其中所述第一单链核酸分子的至少2个胞嘧啶残基是被修饰的；和部分地或全部地与所述第一单链分子互补的第二单链核酸分子，其中第一标签结合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子；并且其中所述第一标签能够产生信号，其中所述信号的强度作为所述核酸复合物的构象的函数而变化；以及测量所述信号的强度并由所测量的信号确定所述pH。本文所述的核酸分子可用作称为I-开关的pH传感器。
本文所述的方法可用于在细胞过程期间实时监测pH变化。在一些实施方案中，所述方法用于监测内吞作用。虽然不希望受理论限制，但是在内吞过程中，在促进货物从受体分离或在介导毒素和病毒的细胞进入方面，酸化起主要作用。通过捕获与活细胞中的内吞作用相关的时空pH变化来显示I-开关表现了细胞内的pH响应。
可以以多种方式(如使用荧光计或荧光显微镜)测量样品中的荧光。通常，来自具有第一波长的激发源的激发辐射穿过激发光学元件。激发光学元件使激发辐射激发样品。作为响应，与样品中的一个或多个I-开关结合的标签发射具有与激发波长不同的波长的辐射。然后，收集光学元件收集来自样品的发射光。该装置可以包括温度控制器，以在样品被扫描时将样品保持在特定的温度。如果需要的话，可以使用多轴平移台来移动保持多个样品的微量滴定板，以便定位待暴露的不同孔。可以通过被适当编程的数字计算机来管理多轴平移台、温度控制器、自动对焦功能以及与成像和数据采集相关的电子元件。计算机也可以将检测过程中收集的数据转换成另一种格式进行显示。
在一些实施方案中，检测包括测量所产生的信号的量值，其中该量值指示细胞或其区域的pH。在一个实施方案中，随着I-开关形成闭合状态(即，随着当pH降低时形成i-基序)，来自受体荧光团的发射增加。类似地，随着I-开关呈现打开状态(即，随着当pH增加时i-基序解离)，来自受体荧光团的发射降低。对于荧光淬灭，随着I-开关形成闭合状态(即，随着当pH降低时形成i-基序)，来自荧光团的发射降低。类似地，随着I-开关形成打开状态(即，随着当pH增加时i-基序解离)，来自荧光团的发射增加。
如本文所用，来自I-开关的信号中的“增加”(或“降低”)是指：与参考样品相比，样品中信号的变化。参考样品可以是对照样品(例如，其中正在检查药物或药剂的作用的未处理细胞群)，或者可以是不同时间点的相同样品，例如，其中正在监测细胞内的pH以跟踪一个或多个细胞过程。
如本文所用，术语“可检测的”是指I-开关的性质，其允许通过检测某pH条件下I开关所具有的活性(例如荧光活性)来确定生物样品的pH。在一些实施方案中，通过将供体/受体(D/A)信号比绘制为标准参考样品中的pH的函数，来使来自I开关的信号标准化。双标签的I-开关上的pH变化改变其闭合状态和开放状态之间的比，由此获得供体和受体强度(D/A)的不同比，这是由于i-基序形成导致闭合状态下的FRET。
在一个实施方案中，可以生成pH校准曲线，从而测试样品可以进行比较和标准化。可以根据美国专利申请No.:20100304370(其通过引用而并入本文)中描述的方法来生成细胞内校准曲线。简而言之，对细胞进行脉冲，洗涤，在给定pH的缓冲液中与离子载体一起孵育，然后温和固定。获得供体和受体FRET图像，并从中获得D/A比。对于细胞内pH校准曲线，将各个pH下的单个细胞或其区域的平均D/A作为pH的函数而作图。可以对测试样品的D/A比与校准曲线进行比较。在本申请的实施例中也描述了相关的方法。
在一些实施方案中，为了检查细胞现象和/或筛选各种化合物的作用，可监测细胞内pH，其中确定在第一时间点，测试样本中来自I-开关的信号水平(例如增加的或降低的信号)，并将其与在稍后时间点获得的在测试样本中观察到的水平进行比较。信号的变化可以反映两个样品之间pH的相对变化。例如，在使用FRET对作为标签的情况下，从一个时间点到另一个时间点的信号的增加可以表明两个时间点之间的pH的增加。同样地，从一点到另一点的信号的降低可以表明pH的降低。可以将信号的绝对水平与已知标准的参考样品或多个参考样品进行比较，以确定样品的精确pH。基于给定组的测量水平与对照水平的相似程度，可以将样品分类或分配至特定的pH值。
如本领域技术人员将理解的那样，在作出这种确定时将存在一定程度的不确定性。因此，可以使用对照组水平的标准偏差来做出概率确定，并且本公开的方法可适用于宽范围的基于概率的确定。因此，(例如但不限于)在一个实施方案中，如果所测量的信号水平落在任意对照组的平均值的2.5个标准偏差内，那么可以将该样品分配给该组。在另一个实施方案中，如果所测量的信号水平落入任意对照组的平均值的2.0个标准偏差内，则可以将该样品分配给该组。在又另一个实施方案中，如果所测量的信号水平落在任意对照组的平均值的1.5个标准偏差之内，则可以将该样品分配给该组。在又另一个实施方案中，如果所测量的信号水平是任意对照组水平的平均值的1.0以下个标准偏差，则可以将该样品分配给该组。因此，该过程允许以各种程度的概率确定具体样品应放置在哪个组中。
统计学方法也可以用于设定临界值，以确定何时可以认为测试样品中的信号强度与参考水平不同或相似。另外，可以使用统计来确定在测试样品的信号强度与参考水平之间观察到的差异或相似性的有效性。在L.D.Fisher & G.vanBelle,生物统计学:健康科学方法学(Wiley-Interscience,NY,1993)中描述了有用的统计分析方法。例如，可以使用非配对双尾t检验来计算置信度(“p”)值，其中如果p值小于或等于0.05，则认为组之间的差异是显著的。
本文所述的核酸复合物可用作pH传感器，并且其各自的pKa可以不同，并且可以利用pKa的差异来选择对于特定应用最合适的I-开关传感器。一般来说，应该使用pKa接近待测样品pH的传感器。例如，pKa可以在样品的1.5pH单位内、1.0pH单位内，或0.5pH单位内。
为了最小化由于细胞移动或聚焦而发生的低荧光测量假象，可以将I-开关的荧光与第二传感器(例如，也存在于所测量的样品中的第二I-开关)的荧光进行比较。第二I-开关应该具有不同于第一I-开关的发射光谱，使得可以区分两个传感器的发射光谱。因为诸如聚焦和细胞移动等实验条件将影响第二传感器以及第一传感器的荧光，所以比较两个传感器的相对荧光可以使荧光标准化。一种方便的比较样品的方法是，计算第一荧光蛋白pH传感器的荧光与第二荧光蛋白pH传感器的荧光的比。
在一些实施方案中，可以使用圆二色光谱法来检测响应于pH变化的I-开关二级结构的变化。当光学活性物质略微不同地吸收左旋和右旋圆偏振光时，观察到圆二色谱(CD)。其用CD光谱偏振仪进行测量。在另一实施方案中，可以通过观察I-开关中的拉曼带变化来检测细胞内pH的变化。在此实施方案中，I-开关含有金纳米颗粒标签和拉曼标签。当使金纳米颗粒靠近拉曼标签时，可以检测拉曼带变化。
在一些实施方案中，使用FLIM来测量i-基序形成时的构象变化。在一些实施方案中，使用各向异性成像来测量构象变化。荧光寿命成像显微镜(FLIM)是这样一种成像技术，该成像技术基于来自荧光样品的荧光的指数衰减率的差异而产生图像。荧光寿命成像显微镜可以用作共聚焦显微镜、双光子激发显微镜和多光子断层摄影术中的成像技术。使用荧光团信号的寿命而不是其强度来在FLIM中创建图像。在一些实施方案中，使用FLIM来获得pH信息，其作为染料的光物理性质之一，其中当核酸复合物由于pH变化而改变构象时，该光物理性质会改变。在一些实施方案中，染料是Atto染料、BODIPY染料、Alexa染料、TMR/TAMRA染料或Cy染料。在Ekta Makhija等人，“使用荧光各向异性成像来探测染色质结构和动力学”CRC手册,成像生物学技术(2014)和文献Levittetal.，“Fluorescence lifetime andpolarization-resolved imaging in cell biology”Current Opinion inBiotechnology,2009,Vol 20，Issue 1，P.28-36(用于各种目的将其通过引用而并入本文中)中进一步描述了各向异性成像和FLIM。
V.疾病检测与监测
本公开的方法、组合物、核酸和试剂盒可以用于疾病的检测、疾病的监测、以及作为药物筛选平台。在一些实施方案中，所述疾病的特征为溶酶体功能障碍疾病。在一些实施方案中，疾病的病理学包括溶酶体功能障碍。
溶酶体功能障碍疾病包括(例如)常染色体隐性骨硬化病、Farber病、Krabbe病(婴儿发病型和迟发型)、法布莱(Fabry)病(α-半乳糖苷酶A)、Schindler病(α-半乳糖苷酶B)、桑霍夫(Sandhoff)氏病(婴儿、少年或成年发病型)、泰-萨(Tay-Sachs)、少年己糖胺酶A缺乏症、慢性己糖胺酶A缺乏症、葡糖脑苷脂、戈谢(Gaucher)病(I型，II型和III型)、溶酶体酸脂肪酶缺乏(早发和迟发)、尼曼-皮克(Niemann-Pick)病(A型和B型)、脑硫脂沉积病(sulfatidosis)、异染性脑白质营养不良(MLD)、鞘脂激活蛋白B缺乏症、多种硫酸酯酶缺乏症、粘多糖贮积症：MPS I Hurler综合症、MPS I S Scheie综合症、MPS I H-S Hurler-Scheie综合症、II型(亨特(Hunter)综合征)、III型(Sanfilippo综合征)、MPS III A(A型)、MPS III B(B型)、MPS III C(C型)、MPS III D(D型)、IV型(Morquio)、MPS IVA(A型)、MPSIVB(B型)、VI型(Maroteaux-Lamy综合征)、VII型Sly综合征、IX型(透明质酸酶缺乏症)；粘多糖症(Mucolipidosis)：I型(涎酸贮积症)、II型(I-细胞病)、III型(假胡尔勒氏(Pseudo-Hurler)多种营养不良/磷酸转移酶缺乏症)、IV型(Mucolipidin 1缺陷)；尼曼-皮克病(C型和D型)、神经元蜡样脂褐质沉积症：1型Santavuori-Haltia病/婴儿NCL(CLN1PPT1)、2型Jansky-Bielschowsky病/晚期婴儿NCL(CLN2/LINCL TPP1)、3型Batten-Spielmeyer-Vogt病/少年型NCL(CLN3)、4型Kufs病/成人NCL(CLN4)、5型Finnish变体/晚期婴儿(CLN5)、6型晚期婴儿型变体(CLN6)、Type 7CLN7、8型北方癫痫(CLN8)、8型土耳其晚期婴儿(CLN8)、9型德国/塞尔维亚晚期婴儿(未知)、10型先天性组织蛋白酶D缺乏症(CTSD)；沃尔曼(Wolman)病、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、岩藻糖苷病贮积症、溶酶体转运疾病、胱氨酸贮积症、致密性成骨不全症、salla病/唾液酸贮积病、婴儿游离唾液酸贮积病(ISSD)、糖原贮积病、II型庞佩氏(Pompe)病、IIIb型Danon病和胆固醇酯贮积病。在一些实施方案中，所述疾病是常染色体隐性骨硬化病。在一些实施方案中，所述疾病是尼曼-皮克C病。
VI.试剂盒
所描述的用于方法的材料和组件可以适合用于制备试剂盒。因此，本公开提供了检测试剂盒，其对确定样品、细胞或其区域中的分析物的pH和/或存在、缺乏或浓度是有用的。具体而言，所述技术包括用于测量样品中一种或多种细胞的pH或分析物的试剂盒。例如，试剂盒可以包含如本文所述的核酸复合物。
在一些实施方案中，可以通过使用预包装的诊断试剂盒来进行本文所述的方法，所述诊断试剂盒包含进行本技术的任何方法的必需试剂。例如，这样的试剂盒将包括用于测量细胞或其区域的pH的检测试剂。在这样的试剂盒的一个实施方案中，检测试剂是本公开的核酸复合物。寡核苷酸易于合成并且在各种制剂中是长时间稳定的，特别是当将寡核苷酸冻干或以其他方式干燥成粉末形式时。在这种形式中，寡核苷酸容易复原以供本领域技术人员使用。想要使用试剂盒的本领域技术人员可以容易地确定和获得使用该试剂盒所需的其它试剂和消耗品。试剂盒还可以包括在本技术的方法中有用的缓冲液。试剂盒可以包括使用试剂和解释结果的说明书。
在一些实施方案中，该技术提供了一种试剂盒，其包含包装在一个或多个小瓶中用作对照的至少一种样品(例如，pH标准)。可以将试剂盒的各个组件封装在单独的容器中，并且所有不同的容器、以及进行试验和解释使用试剂盒进行试验的结果的说明书可以在单个包装内。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于测量样品中的pH和/或分析物的器件。在一些实施方案中，该器件用于测量细胞培养物或完整透明生物体(例如，秀丽隐杆线虫(C.elegans))中的pH和/或分析物。
VII.实施例
为了说明各种实施方案而给出了以下实施例，并且以下实施例并不意味着以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易理解，本发明非常适于实现所述目的并获得所提及的结果和优点，以及本文固有的那些目的、结果和优点。本发明的实施例以及本文所述的方法目前是优选实施方案的代表，是示例性的，并且并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的变化以及由权利要求的范围限定的本发明的精神内所包括的其他用途。
实施例1：一系列超灵敏的基于DNA的荧光PH敏感纳米器件的合理设计
本文描述了一种用来调节基于DNA的构象开关(称为I-开关)的pH灵敏度的合理设计，以产生一系列pH值横跨4.5到8.0的荧光pH敏感纳米器件。这种新型I-开关家族是迄今为止在文献中最灵敏的pH传感器，其显示出前所未有的成倍改变，覆盖了整个已知的生理pH范围。
DNA中的非Watson-Crick碱基配对的可利用性导致发现了几种功能性DNA结构，这些DNA结构已被部署在细胞内以了解细胞内化学环境(Y.Krishnan and M.Bathe,Trendsin Cell Biol.,2012,22,624-633和Y.Krishnan and F.C.Simmel,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,3124–3156)。在人类基因组中(如在端粒中和在几种致癌基因(例如，c-myc)的启动子中)发现了富含胞嘧啶的DNA序列(T.A.Brooks,S.Kendrick andL.M.Hurley,FEBS Journal,2010,277,3459-3469and T.Simonsson,M.Pribylova和M.Vorlickova,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2000,278,158-166)。在1993年，Gueron和合作者发现DNA序列d(C5T)可以在弱酸性条件下形成特殊的四链体结构(称为i-基序)，其中通过C·CH+对配对的两条平行双链体以头尾相接的方向而互相插入(K.Gehring,J.L.Leroy and M.Gueron,Nature 1993,363,561-565和T.E.Malliavin,J.Gau,K.Snoussiand J.L.Leroy,Biophy.Journal,2003,84,3838-3847)。其在基于合成DNA的构象开关环境中(D.Liu和S.Balasubramanian,Angew.Chem.Int.Ed.2003,42,5734–5736；A.Idili,A.Vallée-Bélisle和F.Ricci,J.Am.Chem.Soc.2014,136,5836-5839)用作pH报告物(Y.Chen,S.H.Lee and C.Mao,Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,5335–5338；Z.Liu；C.Mao,Chem.Commun.,2014,50,8239-8241；和D.Liu,A.Bruckbauer,C.Abell,S.Balasubramanian,D.J.Kang,D.Klenerman和D.Zhou,J.Am.Chem.Soc.,2006,128,2067-2071)，所述基于合成DNA的构象开关例如I-开关，其中利用FRET将i基序诱导的构象改变转换成光输出(H.Meng,Y.Yang,Y.Chen,Y.Zhou,Y.Liu,X.Chen,H.Ma,Z.Tang,D.Liu和L.Jiang,Chem.Commun.,2009,2293–2295)。Modi等人使用I-开关来研究活细胞的内吞细胞器中的pH动力学(S.Modi,C.Nizak,S.Surana,S.Halder和Y.Krishnan,Nat.Nanotechol.,2013,8,459；S.Modi,M.G.Swetha,D.Goswami,G.D.Gupta,S.Mayor and Y.Krishnan,Nat.Nanotechol.,4,325-330；以及S.Surana,J.M.Bhat,S.P.Koushikaand Y.Krishnan,Nat.Commun.,2011,2,1-7)。有证据表明，基于i-基序的构象开关的pH响应区间可以通过改变片段中的胞嘧啶的数目来调节(J.L.Mergny,L.Lacroix,X.Han,J.L.Leroy and C.Hélène,J.Am.Chem.Soc.,1995,117,8887-8898；S.Modi,S.Halder,C.Nizakand Y.Krishnan,Nanoscale,2014,6,1144-1152；以及I.V.Nesterova and E.E.Nesterova,J.Am.Chem.Soc.,2014,136,8843-8846)，因为协同性与i-基序稳定性直接相关(E.M.Moodyand P.C.Bevilacqua,J.Am.Chem.Soc.,2003,125,16285-16293；以及P.Buceka,R.Gargallob and A.Kudrev,Analytica Chimica Acta,2010,683,69–77)。这种策略的问题是，随着pH诱导的结构转变的中点(pH半)的增加，增加的转变协同性大大地缩窄了整体pH敏感区间。虽然针对较窄pH区间的较好pH分辨率在某些情况下可能是有用的，但是在不增加协同性的情况下改变pH半是远远更有利的。本实施例描述了这样的一种策略，在保持胞嘧啶的数目恒定(n＝4，I4)的同时改变I-开关的pH敏感区间，而不改变pH诱导的转变的协同性。
胞嘧啶半质子化驱动i-基序形成。胞嘧啶N3的pKa为约4.5，因此DNA4i-基序在约pH5.0下达到最大稳定化(J.L.Leroy,M.Gueron,J.L.Mergny and C.Hélène,NucleicAcids Res.,1994,22,1600-1606)。这通常获得在5.5<pH<7.0下具有pH报告能力的I-开关。然而，不同的细胞内细胞器保持不同的静息pH，该静息pH从pH4.5(溶酶体)到pH8.0(线粒体)变化，因此，需要设计能够响应整个生理范围的I-开关。据假设，引入化学修饰的胞嘧啶(N.K.SharmaandK.N.Ganesh,Chem.Commun.,2005,4330–4332；B.Datta,M.E.Bier,S.RoyandB.A.Armitage,j.Am.Chem.Soc.,2005,127,4199-4207；A.PasternakandJ.Wengel,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2011,21,752–755；A.Pasternak andJ.Wengel,Org.Biomol.Chem.,2011,9,3591–3597；以及P.Perlkov,K.K.Karlsen,E.B.Pedersen and J.Wengel,Chembiochem.,2014,15,146-156)，该胞嘧啶具有较低或较高pKa，如5'-溴胞嘧啶(pKa～2.5)或5'-甲基胞嘧啶(pKa～9.1)(T.Kulikowski andD.Shugar,Acta Biochem.Polonica,1979,26,145-160)，可以通过改变结构转变的pH半而不改变协同性来相应地调节I-开关响应。申请人观察到I4中的完全溴化或完全甲基化的胞嘧啶在室温下不能形成i-基序。因此，I4在特定位置处掺杂有胞嘧啶修饰，同时保持每个I-开关的被修饰的胞嘧啶的总数恒定(N＝4)，以查看这是否可以改变结构转变的pH半。新的I-开关家族引入了一段pH敏感的、具有4个富C的片段(C4TAA)3C4(SEQ ID NO.15)，其在中性或碱性pH下与部分互补的富含G的链(TTTGTTATGTGTTATGTGTTAT)(SEQ ID NO.16)形成错配的双链体，其中T表示错配。在这种I-开关设计中，富含C的片段携带(图1A)供体荧光团(Alexa488)，并且错配的双链体将受体荧光团(Alexa 647)置于相距很远的位置。在酸性pH下，错配的双链体随着富含C的链形成i-基序而扭曲(fraying)，使两种荧光团形成可以通过荧光光谱法监测的高FRET构象。完美的双链体结构域(黑色)含有重组抗体的结合位点，从而可以进行靶向。图1B和C仅示出I-开关的I-基序结构域，其中仅胞嘧啶残基表示为三角形，该三角形的顶点指向链的3'末端。灰色三角形表示未被修饰的胞嘧啶，而星号(*)表示在被修饰的I-开关中分别掺入5'-溴胞嘧啶(Br I-开关，红色三角形)或5'-甲基胞嘧啶(Me I-开关，蓝色三角形)的位点。图1C示出了四类被修饰的I-开关，它们根据在I-开关的i-基序结构域中的相对位置而分类。第一类(核心)在位于所得i-基序核心的3、9、17、23位置处掺入带有两个全溴或两个全甲基修饰的Cm-H+-Cm碱基对，其原因是这可能会影响用于i-基序形成的成核事件。第二类(末端)在1、11、15、25位置处的末端Cm-H+-Cm碱基对处掺入带有两个全溴或两个全甲基的修饰，其原因是这可以调节i-基序的扭曲，并从而调节稳定性，从而可能改变pH响应区间(N.Kumar,M.Petersen and S.Maiti,Chem.Commun.,2009,1532–1534)。在核心和末端设计中，i-基序在相邻的堆叠(stack)上具有两个被修饰的Cm-H+-Cm碱基对。因此，申请人试图通过在未被修饰的C-H+-C碱基对之间穿插两个被修饰的Cm-H+-Cm碱基对来不同地调节pH响应性。因此，申请人在位置15、17、23、25处引入了修饰以产生图1C中所示的穿插变体。所有这些变体具有拓扑结构不同的带有两个全溴或全甲基修饰的Cm-H+-Cm碱基对。然后，申请人试图通过仅修饰参与C-H+-C碱基对的胞嘧啶中的一个，而不是通过掺入四个半修饰的Cm-H+-C碱基对来调节pH半。申请人通过在位于5'末端的位置1、2、3、4处的四个连续的胞嘧啶上引入修饰(连续)来实现这一点。
首先，通过监测在pH 5.0和pH 8.5之间、在220nm-320nm下圆二色(CD)光谱的差异，证实了在本研究中使用的所有I-开关变体在酸性pH下形成i-基序(图7)。pH5.0和pH8.5的差异光谱示出了以292nm附近为中心的正带和以260nm附近为中心的负带(R.Z.Jin,K.J.Breslauer,R.A.Jones和B.L.Gaffney,Science,1990,250,543-546)。这种类型的光谱归因于C-H+-C碱基对的形成(E.L.Edwards,M.H.Patrick,R.L.Ratliff和D.M.Gray,Biochemistry,1990,29,828-836)，其为i-基序结构的特征(H.Kanehara,M.Mizuguchi,K.Tajima,K.Kanaori,and K.Makino,Biochemistry,1997,36,1790-1797以及M.Kaushik,N.Suehl and L.A.Marky,Biochemistry,2007,126,154-164)。在不同的pH下使用CD光谱仪证实了新的I-开关(Br I-开关和Me I-开关)的pH依赖性结构转变(图2A和2B)。将摩尔椭圆率的变化归一化为0到1，并绘制为292nm处的pH的函数，其中已知最大吸收的是C-H+-C碱基对。随着pH增加，由i-基序结构向双链DNA的结构转变发生，因此，由于反映pH诱导变性的C-H+-C碱基对的减少，导致了292nm处的正带呈S形(sigmoidally)减少。不同的Br修饰的开关(即，穿插、核心、末端和连续)分别在pH6.6、pH7.3、pH6.2和pH6.8处示出了结构转变的pH半，不同的Me修饰的开关(即，穿插、核心、末端和连续)分别在pH6.8、pH7.0、pH6.9和pH 7.0处示出了pH半，I4在pH6.5处示出了pH半。来自天然I4的修饰开关的pH半的这种改变(pH6.5)表明了含有被修饰的胞嘧啶的I-开关的可能的pH调节。值得注意的是，虽然pH半的变化幅度相当小，但是已知这种pH半的变化对于捕获整个pH敏感区间并不是高度敏感的，并且仅用作i-基序稳定性可通过这种方法调节的正指示剂(M.M.Dailey,M.C.Miller,P.J.Bates,A.N.Lane和J.O.Trent,Nucleic Acids Res.2010,38,4877-4888)。为了研究这些被修饰的I-开关的实际pH响应和性能，申请人继续使用如图1所示的携带供体和受体荧光团的I-开关变体，通过荧光共振能量转移(FRET)来研究pH诱导的转变。
在碱性pH下，标签通过错配双链体而保持相隔很远，示出低FRET和高D/A值，而在酸性pH下，i-基序结构域缩短了这两个荧光团之间的距离，示出高FRET和因此低的D/A值。在495nm下激发双重标记的I-开关变体(所需pH的1X夹持缓冲液，120mM KCl、5mM NaCl，20mM HEPES、1mM CaCl2和1mM MgCl2)，并收集505nm至725nm的发射光谱。用来自Alexa 488的在520nm处的发射强度(D)除以来自Alexa 647的在669nm处的发射强度(A)，以获得各种pH下的D/A比，然后将其标准化至pH 4.0，并绘制为pH的函数(图2C和2D)。这给出了给定的I-开关变体的特征pH响应区间和pH敏感性。D/A比的变化是由于FRET而引起的Alexa 488强度下降和Alexa 647强度增加(图8)的结果，其产生了特征S形曲线。I4 488/647和I7 488/647的pH半分别为pH 6.1和pH 7.3，Br I-开关变体(即穿插、核心、末端和连续)示出了由于FRET的pH半值分别为pH 6.6、pH 5.6、pH 6.3和pH 6.8。Me I-开关变体(即穿插、核心、末端和连续)示出了分别对应于6.8、7.1、6.9和6.7的pH半值(表1，图8)。如所预期的，相对于未被修饰的I4，使用Br I-开关变体，我们观察到pH半向更酸的范围移动，而使用Me I-开关变体，pH半转向更碱的范围。重要地是，与I4 A488/A647相比，Br-修饰的开关和I-修饰的开关的协同性保持恒定(表1)。
对照Me-I4核心示出pH半为7.1，敏感区间为pH 6.2-7.5，I7 A488/A647的pH半为7.0，由于其高协同性而示出非常窄的动态范围(pH 7.0-pH7.5)，因此表明此设计策略成功。作为结果，新的I-开关家族可以探测与I4中所见的相同的pH宽度，同时覆盖了与I7中所见的不同的pH区间(图3)。还观察到，在改变I-开关的动态范围方面，末端变体具有最大的所期望的效果。此外，该研究表明，可以通过碱基修饰来调节I-开关，以实现更宽的和不同的动态范围而不损害协同性和稳定性。
总之，本实施例描述了I-开关家族的特征，通过使用更偏向酸性范围的5'-溴胞嘧啶(pKa～2.5)和更偏向碱性范围的5'-甲基胞嘧啶(pKa～9.1)成功地调节了该I-开关家族的pH响应区间，而不由于改变协同性而损害动态范围。重要地是，Br I-开关和Me I-开关在D/A比上示出极高的倍数变化。D/A比的倍数变化是pH报告物的灵敏度的指标，其中倍数变化越高，灵敏度越高并且所报告的pH的分辨率越高。有趣地是，由本发明的I-开关家族所示出的如此显著的倍数变化在基于任何分子骨架的任何已知的参比pH传感器中是前所未有的。被修饰的开关相对于未被修改的I开关(即，I4 A488/A647开关和I7 A488/A647开关(表1))的D/A比的倍数变化的增加使得能够在宽范围的pH下测量pH，并且分辨率甚至比限制在狭窄pH区间的高协同性的I-开关(如I7 A488/A647)更好。而且，该实施例首次描述了在室温下在碱性pH(pH>7.1)下形成了I-基序。
以下描述本实施例中使用的材料和方法。
从Sigma-Aldrich(印度)获得所有未被标记的寡核苷酸，从IBA-GmbH(德国)获得标记的寡核苷酸作为使用高效液相色谱(HPLC)纯化并冻干的寡核苷酸。将寡核苷酸溶于Milli-Q水中以制备200μM储备液，将其分装并在-20℃下保存。根据荧光标记的寡核苷酸的纯度，在使用之前对荧光标记的寡核苷酸进行乙醇沉淀以除去任何污染的荧光团。
I-开关样品制备：通过在含有100mM KCl的20mM磷酸钾缓冲液(pH 5.5)中以等摩尔比混合5μM的In和Incomp以制备I-开关样品。将样品加热至90℃保持5分钟，以5℃/15分钟冷却至室温(RT)，并在4℃下平衡过夜。在实验之前，将储备溶液在合适的具有所需pH的1×夹持缓冲液(120mM KCl，5mM NaCl，20mM HEPES，1mM CaCl2和1mM MgCl2)中稀释。
圆二色光谱法研究：在配有温度控制器的JASCO J-815分光光度计(JASCO，USA)上进行所有圆二色普(CD)实验。在实验之前，在所需pH的1×夹持缓冲液(120mM KCl、5mMNaCl、20mM HEPES、1mM CaCl2和1mM MgCl2)中将I-开关样品稀释至1μM，并在室温下平衡60分钟。在含有400μL、1μM的样品的1cm石英比色杯中获得光谱。以1nm带宽、100nm/秒的扫描速度和0.25秒的响应时间记录从320nm至220nm的CD光谱。获得3次连续扫描的平均值，并从仅对应于缓冲液的基线中扣除。记录在不同pH值下的292nm处的CD信号，并通过将闭合状态下的CD信号作为Ymax、将打开状态下的CD作为Ymin、并在OriginPro 8(OriginLabs,USA)中使用公式[Y-Ymin]/[Ymax-Ymin]而归一化至0至1。将来自两个独立实验的在292nm处的CD信号的均值和它们的均值的标准误差对各个pH值作图，以获得各个I-开关样品的归一化椭圆率(Θ)v/s pH曲线。pH5.0下的CD光谱示出在286nm至288nm之间的峰和在248nm至251nm附近的负峰，这证实了不同I-开关的i-基序的形成。pH5.0和pH8.5的差异CD光谱示出了在292nm附近的正峰，这是i-基序的特征。
荧光光谱研究：对于荧光测量，使用所需pH的1×夹持缓冲液(120mM KCl，5mMNaCl，20mM HEPES，1mM CaCl2和1mMMgCl2)将荧光标记的I-开关样品稀释至50nM。在RT下将所有样品涡旋并平衡60分钟。在路径长度为1cm的荧光比色杯中进行实验，该荧光比色杯含有400μL不同pH的各样品。在FluoroMax-4(Horiba Jobin Yvon，USA)中在495nm下激发样品，并且收集505nm至725nm的发射光谱。然后，用在520nm下的发射(供体，D)除以在669nm下的发射(受体FRET，A)以获得各pH值下的D/A比。然后，将在不同pH点下的D/A比标准化至pH4.0下的D/A。通过将在520nm处的供体强度(D)与669nm处的受体强度(A)的标准化比绘制为pH的函数，来获得体外pH校准曲线。对于各pH值，绘制来自三次独立实验的D/A的均值和它们的均值的标准误差。
pH半的确定：在OriginPro 8中使用波尔兹曼分布拟合各个I-开关的标准化D/A v/s pH的曲线图。样品曲线和用于拟合的公式为：y＝[(A1-A2)/1+e(x–x 0))/dx]+A2；其中：A1＝初始值；A2＝最终值；x0＝曲线的中点(pH半)；dx＝时间常数(图4)。获得了各个I-开关样品的相应pH半并将其记录在表1中。
协同性的确定：在OriginPro 8中通过使用量效曲线拟合各个I-开关的标准化D/A值v/s pH曲线图来确定协同性。样品曲线和用于拟合的公式如下：y＝A1+[(A2-A1)/1+10(logx0-x)p]其中：A1<A2；p>0；底部渐近线：A1＝1；顶部渐近线：A2＝2；中心：log x0；Hill斜率：p＝协同性(图5)。获得了相应的协同性值并将其记录在表1中。
本研究中使用的寡核苷酸及其相应的命名法。当I-开关样品不带有碱基修饰和荧光标签时，将引入pH响应片段Cn-Cn-Cn-Cn的I-开关样品称为In(n＝4或7)。因此，I4是通过将毫摩尔比为1:1的I4和I4comp混合而形成的，I7::I7和I4comp，穿插::穿插和I4comp，核心::核心和I4comp，末端::末端和I4comp，连续::连续和I4comp。用于荧光研究的荧光标记I-开关组件在下标中指出了各荧光团，两条链以摩尔比为1:1混合，其中，例如I4 A488/A647是由摩尔比为1:1的I4 A488和I4 A647comp混合形成的，I7 A488/A647::I7 A488和I4 A647comp。通过将摩尔比为1:1的两条标记的链(例如分别使用5'Alexa 488标记的序列和I4 A647comp)混合来制备用于荧光研究的被修饰的I-开关，双重标记的穿插变体由5'Alexa 488标记的穿插链和I4 A647comp形成，核心::5'Alexa 488标记的核心链和I4 A647comp，末端::5'Alexa 488标记的末端链和I4 A647comp，连续::5'Alexa 488标记的连续链和I4 A647comp。
使用CD光谱法进行各种被修饰的I-开关的体外表征：使用CD光谱法表征I-开关的体外折叠。在pH 5.0下获得的CD光谱示出了i-基序的特征：以285-288nm为中心的正带和以248-251nm为中心的负带。然而，在pH8.5下，相同的组件示出了这样的CD谱，其中正带和负带分别移位至275-277nm和242-246nm。在pH5.0和pH8.5下，DNA组件的差异谱图给出了这样的迹线，该迹线示出了以292nm为中心的正带和以260nm为中心的负带(图7A-7H)，这与DNA4i-基序的CD标志性特征一致。1这种类型的光谱归因于C-CH+碱基对的形成，这是i-基序结构的特征。2在不同的pH值下使用CD光谱法确认了DNA I-开关(Br修饰的开关和Me修饰的开关)的pH依赖性结构转变。
由于胞嘧啶残基的半质子化而导致DNA i-基序形成。胞嘧啶的N3的pKa为约4.5，这使其可以在酸性pH(约5.5)下形成i-基序。为了调节基于i-基序的I-开关的pH感测特性，用5'-溴胞嘧啶(pKa为约2.5)或5'-甲基胞嘧啶(pKa为约9.1)替换特定的胞嘧啶残基。通过测量作为pH的函数的CD信号的变化来研究组件的pH曲线图。随着pH的增加，发生了从封闭的i-基序结构向双链体结构的结构转变，因此C-CH+碱基的数目减少，导致CD信号的相应减少。不同的Br修饰的开关(即穿插、核心、末端的和连续)分别在pH 6.6、pH 7.3、pH 6.2和pH6.8处示出了结构转变的pH半。另一方面，不同的Me修饰的开关分别示出了pH6.0、pH7.0、pH6.9和pH7.0下的pH半，而I4示出了pH6.5下的pH半。来自天然I4的被修饰的开关的pH半的这种改变清楚地表明：调节了由于修饰的胞嘧啶而导致的i-基序形成的pH区间。作为pH的函数的292nm处的CD信号的曲线产生了表示pH依赖性结构转变的反向S形曲线。这清楚地证明了I-开关的pH灵敏度的可调性。
使用荧光光谱法进行I-开关的体外表征：所有I-开关都包含四个富含C的片段，其中各个片段又包含四个胞嘧啶残基，(C4TAA)3C4与互补的富含G的链进行碱基配对以形成错配双链体。在I-开关的设计中，在中性和碱性pH下，富含C的链和富含G的链都形成错配双链体，从而使供体荧光团(Alexa 488)和受体荧光团(Alexa 647)保持距离，该距离对FRET不是最佳的。在酸性pH下，错配双链体解离，使富含C的链折叠成i-基序，使两个荧光团紧密接近，从而使FRET可行。使用pH依赖性荧光测量来监测这种结构转变。如先前所述使双重标记的I-开关进行组装，然后在所需pH的1×夹持缓冲液中稀释至50nM。然后在495nm下激发样品，并获得505nm到725nm的发射光谱。然后，用520nm(供体)处的发射除以669nm处的发射(FRET受体)以获得D/A。然后，将D/A比标准化为pH 4.0下的D/A，并获得了标准化的D/A v/spH的曲线。随着溶液酸度增加，pH 5.0和pH 8.5下的发射光谱清楚地示出了供体发射强度的降低以及FRET受体强度的相应增加(图8A-8H)。
I-开关的pH半的确定：使用玻尔兹曼曲线拟合各个I-开关的标准化D/A v/s pH曲线。该拟合是使用以下公式获得的：y＝[(A1-A2)/1+e(x–x0))/dx]+A2；其中：A1＝初始值；A2＝最终值；x0＝曲线的中点(pH半)，dx＝时间常数。由因子x0给出的值给出了所有开关的pH半的值。在图9A-9B中指出了两个代表性的实例。
被修饰的I-开关的协同性的确定：使用量效曲线拟合各I-开关所获得的标准化D/A v/s pH曲线。该拟合是使用以下公式获得的：y＝A1+[(A2-A1)/1+10(logx0-x)p]；其中：A1<A2；p>0；底部渐近线：A1＝1；顶部渐近线：A2＝2；中心：log x0；其中Hill斜率：p＝协同性(图10)。
实施例2：组合pH和氯化物传感器
A.本发明的pH传感器I4LY(Br修饰的开关-末端)准确地测量整个透明生物体(如，秀丽隐杆线虫)的溶酶体的pH值。
使用文献(Surana,S.,et al.，2011.An autonomous DNA nanomachine mapsspatiotemporal pH changes in a multicellular living organism.NatureCommunications 2,P.340)中描述的方案以及以下材料和方法来标记秀丽隐杆线虫(Celegans)的体腔细胞的溶酶体。较旧版本的I-开关仅可以捕获pH的大的变化-例如从早期内体到晚期内体到溶酶体的变化。这些较旧版本的I-开关的精确度不足以捕获围绕给定pH范围发生的微小的pH变化(如在正常细胞器和功能障碍细胞器之间观察到的)，尤其是在更酸的区间内。现在，用最新描述的溴-I-开关(如I4LY)，所覆盖的pH区间处于更酸的区间，并且提高的D/A的倍数变化允许准确测量溶酶体中pH的微小变化。
B.在秀丽隐杆线虫的溶酶体中，使用基于DNA的氯化物传感器(Clensor)，使用该方案来测量其他离子，如氯化物。
本发明人使用先前描述的DNA-氯化物传感器(Clensor)来测量秀丽隐杆线虫的溶酶体中的氯化物，该DNA-氯化物传感器已首次被用于测量在所培养的细胞的溶酶体中的氯化物。由于修改了成像条件(参见例如下面的材料和方法)，以使得可以在整个活的生物体(如秀丽隐杆线虫)中完成成像，所以这不是细胞中的成像过程的直接外推法。因此，这是活生物体中的氯化物的首次测量。图11C和图11D显示：从不同氯化物浓度的缓冲液中的体外溶液到体内(秀丽隐杆线虫中的体腔细胞溶酶体)，Clensor在这些成像条件下的性能得到了定量保留。
C.证明了体内溶酶体pH水平示出与溶酶体失调严重程度的一对一关联。
图11E示出了在野生型秀丽隐杆线虫的溶酶体中获得的pH值和在以缺陷的pH为特征的溶酶体贮积症(尼曼-皮克C病)突变体中获得的pH值。尼曼·皮克C病的特征是胆固醇积累导致过早死亡，受影响的个体通常在青春期或更早时期死亡。在人类中，最常见的突变基因是NPC1和NPC2。溶酶体负责将来自胞外环境的胆固醇浓缩并将其分配到胞质溶胶和ER膜。在溶酶体环境中，NPC2结合胆固醇并将其转移至膜结合的NPC1。作为氧化型胆固醇蛋白发挥功能的OSBPL5从细胞质侧与溶酶体膜可逆地结合。NPC1将其结合的胆固醇转移到OSBPL5以进行分配。秀丽隐杆线虫具有NPC1的两个同源物(ncr1和ncr2)、NPC2的一个同源物(heh1)和OSBPL5的一个同源物(obr3)。敲减ncr1、heh1和obr3导致溶酶体显著的碱化(图11E)。然而，敲减ncr2显示没有这样的碱化，从而表明ncr1是与尼曼-皮克C表型功能性相关的唯一同源物。此外，heh1、ncr1和obr3突变体显示了胆固醇积累(图11F)和过早致死性(未示出)，这是这种疾病的拟表型。当不相关的氧化型胆固醇结合蛋白(如obr2)被敲除时，其没有显示出pH变化和胆固醇积累。这表明由I4LY指示的pH水平定量测量了体内的溶酶体功能障碍。
D.证明了体内溶酶体氯化物水平显示与溶酶体失调严重程度一对一关联。
图11E示出了在野生型秀丽隐杆线虫的溶酶体中获得的pH值和在以缺陷的氯化物为特征的溶酶体失调(常染色体隐性骨硬化症，ARO)突变体中获得的pH值。ARO的特征在于过度致密的骨头，其是由于骨降解细胞(称为破骨细胞)中的功能失调的溶酶体所致的。在人类中，最常见的突变基因是TCIRG-1(～53％)、CLCN7(～15％)、OSTM1(～6％)和SNX10(～4％)。TCIRG-1是使溶酶体酸化的质子泵。通过氯化物通道CLCN7及其辅助因子OSTM1，这些质子被交换为氯化物。SNX10是一种负责将溶酶体转运到细胞膜的SNARE蛋白，在细胞膜处，SNX10起到产生“皱褶边界”的作用，这是破骨细胞的特征。秀丽隐杆线虫具有TCIRG-1(unc32)、CLCN7(clh6)、SNX10(snx3)和OSTM1(ostm1)的同源物。敲减clh6和ostm1导致溶酶体氯化物的急剧下降(图1F)。接下来，氯化物在unc32的两个不同突变体(即，unc32f(其示出unc32(亚等位基因)的轻微损伤)或unc32c(unc32的非功能性突变体))中同等。有趣的是，氯化物水平在unc32c中受到更剧烈的影响，而在亚等位基因unom32f中受到中度影响。重要的是，在突变体snx3中，没有看到氯化物的变化。此处，重要的是要注意，snx3参与溶酶体转运以产生功能性破骨细胞，而不是产生特定的溶酶体腔环境。因此，在这些突变体中，虽然溶酶体可以是功能性的，但破骨细胞由于缺乏皱褶边界而是无功能的。因此，snx3突变体中的氯化物值是正常的。作为另一对照，敲减作为质膜氯通道的clh4没有示出这样的氯化物减少，表明clh6是与引起ARO的基因功能性相关的通道。这表明由I4LY指示的氯化物水平定量测量了体内的溶酶体功能障碍。
E.材料和方法
材料。所有荧光标记的寡核苷酸均经过HPLC纯化，并从IBA-GmBh(德国)和IDT(Coralville，IA，USA)获得。未标记的寡核苷酸购自IDT(Coralville，IA，USA)。使用分析级试剂(Applied USA)，在NovaTGA树脂(Novabiochem，德国)上使用标准固相Fmoc化学合成肽核酸(PNA)寡聚物P，通过反相HPLC(Shimadzu，日本)纯化该肽核酸(PNA)寡聚物P并在-20℃下储存直至进一步使用。
从Sigma(USA)获得牛血清白蛋白(66kDalton)、尼日利亚菌素、缬氨霉素、莫能菌素、氯化物离子载体I、IPTG和胆固醇。除非另有说明，所有其他试剂均购自Sigma-Aldrich(USA)。根据先前公开的方案，BSA是马来酰化的。(参考)从Invitrogen(U.S.A.)购得Trizol。
样品制备。使用乙醇对所有的寡核苷酸进行沉淀，并用UV吸光度对其进行定量。对于I-开关(I4cLY(也称为I4LY)A488/A647-Br修饰的“末端”I4-开关)样品制备，在包含100mM KCl的20mM磷酸钾缓冲液(pH5.5)中以等摩尔比混合5μMI4和I4'。将得到的溶液加热至90℃保持5分钟，以5℃/15分钟冷却至室温，并在4℃下平衡过夜。在退火的7天内稀释并使用样品。如上所述，在10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中以等摩尔比混合D1、D2和P并且进行退火，使用最终浓度为10μM的HPLC纯化的寡核苷酸和PNA寡聚体类似地制备Clensor样品。在使用之前，使用0.22μm盘式过滤器(Millipore，德国)过滤所有缓冲储备溶液。
秀丽隐杆线虫方法和种系。遵照标准方法来保持秀丽隐杆线虫。所使用的野生型种系是来自Bristol的秀丽隐杆线虫分离种系(种系N2)。本研究所使用的由线虫遗传中心(CGC)提供的种系是heh-1(ok603)、clh-6(ok791)、unc-32(f131)、unc-32(e189)、ppk-3(n2835)、gba-3(gk3287)、ppt-1(gk139)、cln-3.2(gk41)I、cln-3.3(gk118)和cln-3.1(pk479)。本研究中所使用的也由CGC提供的转基因种系是arIs37[pmyo-3::ssGFP](在体壁肌肉中表达ssGFP的转基因种系，其在假体腔中分泌并被体腔细胞(coelomocytes)内吞)和pwIs50[lmp-1::GFP+Cb-unc-119(+)](表达带GFP标签的溶酶体标记物LMP-1的转基因种系)。使用以下部分中描述的基于Ahringer文库的RNAi方法来敲减不能得到相应突变体的基因。
RNAi实验。将表达针对相关基因的dsRNA的细菌(来自Ahringer RNAi文库)喂给蠕虫，并且在F1后代(ref)的一天大的成虫中进行测量。通过探测候选基因的mRNA水来平证实RNA敲减，并通过RT-PCR检测。简而言之，使用Trizol-氯仿方法分离总RNA；使用oligo-dT引物将2.5μg总RNA转化为cDNA。使用5μLRT反应物来准备使用基因特异性引物的PCR。使用肌动蛋白mRNA作为对照。在1.5％琼脂糖-TAE凝胶上分离PCR产物。所使用的RNAi克隆是：L4440空载体对照、ncr-1(克隆F02E8.6，Ahringer文库)、ncr-2(克隆F09G8.4，Ahringer文库)、obr-3(克隆ZK1086.1，Ahringer文库)、obr-2(克隆F14H8.1，Ahringer文库)、(ostm1_名称)(克隆F42A8.3，Ahringer文库)、snx-3(克隆W06D4.5，Ahringer文库)、manba(克隆C33G3.4，Ahringer文库)、aman(克隆F55D10.1，Ahringer文库)、sul-3(克隆C54D2.4，Ahringer文库)、gba-3(克隆F11E6.1，Ahringer文库)和asm1(克隆B0252.2，Ahringer文库)。
体腔细胞标记实验。用I4cLY A647和ClensorA647进行体腔细胞标记和竞争实验。对于微注射，使用1X Medium 1(150mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2，20mM HEPES，pH7.2)将样品稀释至100nM。使用装备有40X、0.6NA物镜的Olympus IX53Simple InvertedMicroscope(美国Olympus公司,森特瓦利,PA)和微注射装置(Narishige，日本)，在一日龄野生型雌雄同体的假体腔背侧(恰好与外阴相对)进行注射。将注射的蠕虫置于2.0％琼脂糖垫上，并在M9缓冲液中使用40mM叠氮化钠进行麻醉。在所有情况下，在22℃下孵育1小时后检测标记。
共定位实验。使用1X Medium 1将I4cLY A647或ClensorA647样品稀释至500nM，并注射到10arIs37[pmyo-3::ssGFP]雌雄同体中。在Leica TCS SP5II STED激光扫描共聚焦显微镜(Leica Microsystems,Inc.,布法罗格罗夫,IL)上使用用于488nm激发的氩离子激光器和用于633nm激发的He-Ne激光器(具有一组适合于各荧光团的二向色激发和发射滤光器)对孵育1小时后的经标记的体腔细胞的数量进行成像和定量。在GFP/Alexa 488/BAC通道和Alexa 647通道之间测量了串扰和渗漏，并且发现该串扰和渗漏可以忽略不计。
体外荧光测量。在FluoroMax-4扫描分光荧光计(Horiba Scientific,Edison,NJ,USA)上测量荧光光谱。对于pH测量，对于所有体外荧光实验，在所需pH的1X pH夹持缓冲液中将I4cLY A488/A647稀释至50nM。将所有样品涡旋并在室温下平衡30分钟。在488nm下激发样品并且收集505nm-750nm之间的发射。通过将520nm下的供体发射强度(D)与669nm下的受体强度(A)的比(对于A488/A647)绘制为pH的函数来获得校准曲线。对于各pH值，绘制来自三个独立实验的D/A的均值和其SEM。
对于氯化物测量，使用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)将10μMClensor储备液稀释至终浓度为200nM，并在室温下温育30分钟，然后进行实验。分别在435nm(对于BAC)和650nm(对于Alexa647)下激发样品来获得BAC和Alexa 647的发射光谱。分别在495-550nm和650-700nm之间收集BAC和Alexa 647的发射光谱。为了研究Clensor的氯化物敏感性，通过向400μL的样品中加入微升分装的1M NaCl储备液来达到5mM至100mM之间的最终氯化物浓度。将BAC在505nm下的发射强度(G)标准化为Alexa 647在670nm下的发射强度(R)。由两个特定[Cl-]值下的R/G值的比计算R/G比的倍数变化。
体内测量。用I4cLY A488/A647进行pH夹持和测量实验。对于微注射，使用1X Medium 1将I-开关样品稀释至500nM。将蠕虫在22℃下孵育1小时，然后浸入含有100μM尼日利亚菌素和100μM莫能菌素的不同pH的夹持缓冲液(120mM KCl、5mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、20mM HEPES)中。为了便于缓冲液进入体内，使用微注射针在身体的三个区域处对表皮进行穿孔。在夹持缓冲液中孵育75分钟后，使用宽视场显微镜对体腔细胞进行成像。对各个pH值进行了三个独立的测量，每次测量为10个蠕虫。使用Clensor进行氯化物夹持和测量。用2μM的Clensor注射蠕虫并在22℃下孵育2小时。为了获得氯化物校准曲线，之后将蠕虫在室温下浸入合适的氯化物夹持缓冲液中45分钟，该夹持缓冲液含有特定浓度的氯化物、100μM尼日利亚菌素、100μM缬氨霉素、100μM莫能菌素和10μM氯化物离子载体I。通过以不同的比例混合1X+ve氯化物缓冲液(120mM KCl、20mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、20mM HEPES,pH,7.2)和1X-ve氯化物缓冲液(120mM KNO3、20mM NaNO3、1mM Ca(NO3)2、1mM Mg(NO3)2、20mMHEPES,pH 7.2)来制备含有不同氯化物浓度的氯化物校准缓冲液。
对于实时pH或氯化物测量，分别用I4cLY A488/A647或Clensor注射10只雌雄同体，并在22℃下孵育1小时。然后对蠕虫进行麻醉，并在用于pH测量的宽视场倒置显微镜和用于氯化物测量的共聚焦显微镜上进行成像。
显微镜检查。在IX83研究倒置显微镜(美国Olympus公司,森特瓦利,PA,USA)上，使用60X、1.42NA、相差油浸物镜(PLAPON,美国Olympus公司,森特瓦利,PA,USA)和Delta 512EMCCD照相机(Photometrics,USA)进行宽视场显微镜检查。使用适用于所使用的荧光团的Metamorph Premier Ver 7.8.12.0(Molecular Devices，LLC，USA)控制滤光轮、快门和CCD照相机。在相同的采集设置下获取同一天的图像。在相，所有图像都采取扣除邻无细胞区域的背景的平均强度。在供体(D)和受体(A)通道中测量各内体中的平均强度。使用480/20带通激发滤光器、520/40带通发射滤光器和89016-ET-FITC/Cy3/Cy5二向色滤光器获得Alexa 488通道图像(D)。使用640/30带通激发滤光器、705/72带通发射滤光器和89016-ET-FITC/Cy3/Cy5二向色滤光器获得Alexa 647通道图像(A)。使用480/20带通激发滤光器、705/72带通发射滤光器和89016-ET-FITC/Cy3/Cy5二向色滤光器获得FRET通道图像。在供体和受体通道中测量各内体中的平均强度。从这些读数中获得供体强度与受体强度的比(D/A)。通过计算各像素的D/A比来生成伪色图像。用配备有63X、1.4NA、油浸物镜的Leica TCS SP5II STED激光扫描共聚焦显微镜(Leica Microsystems，Inc.，布法罗格罗夫，IL，USA)捕获共聚焦图像。使用用于488nm激发的氩离子激光激发Alexa 488，使用用于633nm激发的He-Ne激光激发Alexa 647，使用用于458nm激发的氩离子激光(具有一组适合于不同荧光团的二向色、激发和发射滤光器)激发BAC。
图像分析。用ImageJ ver 1.49(NIH，USA)分析图像。对于pH测量，使用ImageJ将Alexa 488图像和Alexa 647图像重叠，并选择示出共定位的内体以用于进一步分析。在供体(D)和FRET(A)通道中测量各内体中的强度，并记录在从中获得各内体的D/A比的OriginPro Sr2b9.2.272(OriginLab Corporation,Northampton,MA,USA)文件中。根据细胞内校准曲线将各分布的平均D/A转换成pH。数据表示为平均pH值±该平均值的标准误差。类似地分析pH夹持实验的数据。
对于氯化物测量，在ImageJ的ROI插件中确定并标记各Alexa647(R)图像中的含有溶酶体的细胞区域。在回顾(recall)ROI的BAC(G)图像中确定了相同的区域，并在必要时对色差进行了适当的校正因子。在扣除背景之后，测量各内体的强度并记录在Origin文件中。通过用R图像中的给定内体的强度除以G图像中的相应强度，从这些值中获得R强度与G强度的比(R/G)。对于给定的实验，根据细胞内校准曲线，通过将分布的平均R/G值转换为[Cl-]值来确定细胞器群体的平均[Cl-]。数据表示为该平均[Cl-]值的平均值±该平均值的标准误差。类似地分析了氯化物夹持实验的数据。
通过对与GFP/YFP共定位的Alexa 647的阳性斑点的数目进行计数并将其表示为皮尔森(Pearson)相关系数来确定GFP/YFP和Alexa 647的共定位。
体腔细胞中的溶酶体标记。在pwIs50[lmp-1::GFP+Cb-unc-119(+)]的10个蠕虫中完成I-开关和Clensor的时间绘图。简而言之，用500nM的I4cLY A647或ClensorA647注射蠕虫，在22℃下孵育1小时，然后使用Leica TCS SP5II STED激光扫描共聚焦显微镜(LeicaMicrosystems，Inc.，布法罗格罗夫，IL，USA)进行成像。通过对与GFP阳性斑点共定位的Alexa647阳性斑点的数目进行计数并将其表达为Alexa 647阳性斑点的总数的百分比来确定GFP和I4cLY A647或ClensorA647的共定位。为了确认给定的遗传背景中的溶酶体标记，对pwIs50[lmp-1::GFP+Cb-unc-119(+)]的相关突变体或RNAi敲减体进行相同程序。
胆固醇提取和薄层色谱法。将L4蠕虫置于含有表达针对所选择的基因的特异性dsRNA的OP50或细菌的平板上。允许妊娠蠕虫在新的平板上产卵，并在24小时后将该妊娠蠕虫移除。允许F1后代生长至成虫阶段。然后，将来自三个这样的平板的年轻成虫洗掉，在离心管中以1000×g离心30秒，并用蠕虫洗涤缓冲液(1×PBS)洗涤四次。将蠕虫沉淀物重悬于400μL洗涤缓冲液中。取出100μL蠕虫悬浮液，以提取总的可溶性蛋白质。使用Bradford检验测量各100μL样品中的总的可溶性蛋白质的量。如用于给定遗传背景的Bradford检验所估计的，从相当于400μg总的可溶性蛋白质的300μL样品中取出特定体积的蠕虫悬浮液。然后，将该体积中的蠕虫旋转下来，并基本上按照公开的方案进行脂质提取。简而言之，通过超声处理(Sonic Dismembrator，Fisher Scientific，USA)在冰上对蠕虫沉淀物进行均质化，并加入1mL冷溶液I(CHCl3:CH3OH:HCOOH＝10:10:1)。对管进行剧烈涡旋。然后，加入1.5mL冷溶液II(CHCl3:CH3OH:H2O＝10：10：2)。对管再次进行剧烈涡旋并在-20℃下储存过夜以允许充分提取。从CHCl3层中提取总脂质，并在(Buchi，纽卡斯尔，DE，USA)中使溶液完全蒸发。然后，将干燥的总脂质重新溶解在二氯甲烷中，并将1μL负载于硅胶TLC板(Fluka)上。将TLC参照胆固醇一起负载，并在25％乙酸乙酯/己烷的溶剂系统中运行。在TLC板干燥后，将TLC浸入无水乙醇溶液中的10％w/v磷钼酸中并加热至110℃。在凝胶doc系统(GelDoc-Ite Imaging Systems，UVP，USA)上对TLC进行成像，并在ImageJver1.49(NIH，USA)上对其进行定量。
前面的描述被认为仅仅是对本发明的原理的说明。此外，由于许多修改和变化对本领域技术人员来说将是容易想到的，所以不希望将本发明限制于如上所述的确切构造和过程。相应地，所有合适的修改和等同物都可以落入由所附权利要求限定的本发明的范围内。当在本说明书和所附权利要求书中使用术语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包含(include)”、“包含(including)”和“包含(includes)”时，这些术语旨在明确所述特征、整体、组件或步骤的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整体、组件、步骤或其组合。
参考文献
以下参考文献通过引用而具体地并入本文中，这些参考文献为本文中阐述的那些补充提供示例性程序或其他细节。
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印度专利申请1471/CHE/2011
印度专利申请3252/CHE/2011
SEQUENCE LISTING
<110> 亚穆纳·克里希南
萨赫利·哈尔德
<120> 确定pH的方法和组合物
<130> ARCD.P0588WO
<140> 未知
<141> 2016-05-18
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<223> 带赖氨酸标签
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<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> A, T, G或缺失
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> C或缺失
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> C或缺失
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> C或缺失
<400> 7
cccncccncc cnccc 15
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> 修饰的C
<400> 8
ccctaacccc taacccctaa ccccatatat atcctagaac gacagacaaa cagtgagtc 59
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 修饰的C
<400> 9
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 修饰的C
<400> 10
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 修饰的C
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 修饰的C
<400> 11
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 12
cccctaaccc ctaaccccta acccc 25
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 13
ccccccctaa ccccccctaa ccccccctaa ccccccc 37
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 14
ccctaaccct aaccctaacc c 21
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 15
cccctaaccc ctaaccccta acccc 25
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 16
tttgttatgt gttatgtgtt at 22
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 17
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 18
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 18
ccccccctaa ccccccctaa ccccccctaa cccccccata tatatcctag aacgacagac 60
aaacagtgag tc 72
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 19
gactcactgt ttgtctgtcg ttctaggata tatattttgt tatgtgttat gtgttat 57
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Alexa 488标记的
<400> 20
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 21
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Alexa 488标记的
<400> 21
ccccccctaa ccccccctaa ccccccctaa cccccccata tatatcctag aacgacagac 60
aaacagtgag tc 72
<210> 22
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> T标记有Alexa 647
<400> 22
gactcactgt ttgtctgtcg ttctaggata tatattttgt tatgtgttat gtgttat 57
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<400> 23
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<400> 24
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 5-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 5-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5-溴胞嘧啶
<400> 25
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 5-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 5-溴胞嘧啶
<400> 26
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Alexa 488标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<400> 27
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Alexa 488标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<400> 28
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Alexa 488标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<400> 29
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 30
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Alexa 488标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 5'-溴胞嘧啶
<400> 30
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 31
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<400> 31
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<400> 32
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<400> 33
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<400> 34
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Alexa 488标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<400> 35
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 36
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Akexa 488标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<400> 36
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 37
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Alexa 488标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<400> 37
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 38
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Alexa 488标记的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<400> 38
cccctaaccc ctaaccccta accccatata tatcctagaa cgacagacaa acagtgagtc 60
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 39
cccctaaccc ctaaccccta accccatat 29
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 40
tattttgtta tgtgttagtg ttat 24
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 41
cccctaaccc ctaaccccta accccatat 29
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 42
tattttgtta tgtgttagtg ttat 24
<210> 43
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 43
cccctaaccc ctaaccccta accccatat 29
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成引物
<400> 44
tattttgtta tgtgttagtg ttat 24

Claims (102)

1.一种确定样品中pH的方法，包括：
a)提供核酸复合物，其包含
i)包含序列CnXCnYCnZCn(SEQ ID NO.6)的第一单链核酸分子，其中C为胞嘧啶；X、Y和Z各自为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一种或多种；并且n大于或等于2；并且其中所述第一单链核酸分子的至少2个胞嘧啶残基是被修饰的；和
ii)部分地或全部地与所述第一单链分子互补的第二单链核酸分子，其中第一标签结合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子；并且其中所述第一标签能够产生信号，其中所述信号的强度作为所述核酸复合物的构象的函数而变化；以及
b)测量所述信号的强度，并且由所测量的信号确定所述pH。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是选自细胞、细胞提取物、细胞裂解物、组织、组织提取物、体液、血清、血液和血液制品的生物样品。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品是活细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品是来自患者的生物样品。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，还包含与所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子结合的第二标签；并且其中所述信号的强度作为以下至少一者的函数而变化：所述第一标签与所述第二标签之间的距离、和所述第一标签与所述第二标签的相对朝向。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一标签和所述第二标签包含供体和受体对。
7.根据权利要求6所述的方法，其中使用FRET技术来测量所述信号。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中当所述pH为由pH4升高至pH5、由pH5升高至pH6、由pH6升高至pH7和由pH7升高至pH8中的至少一者时，所述信号强度改变至少百分之二十。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中通过将所述所测量的信号与参考值进行比较来确定所述pH。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述信号值和/或参考值被标准化。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第二单核酸链包含至少4个非互补的核酸碱基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第二单核酸链包含8个非互补的核酸碱基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中X、Y和Z各自为TAA。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中n为3、4或7。
15.根据权利要求14所述的方法，其中n为4。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述修饰选自甲基、氟基、溴基、羟甲基、甲酰基或乙酰基中的一种或多种。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述修饰是甲基或溴基。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述修饰位于所述胞嘧啶的5’位置。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述第一单链分子包含序列(Ca)nX(Cb)nY(Cc)nZ(Cd)n(SEQ ID NO.7)，其中Ca、Cb、Cc和Cd等于n个连续的胞嘧啶残基；X、Y和Z为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一种或多种；并且n大于或等于3。
20.根据权利要求19所述的方法，其中Ca、Cb、Cc和Cd各自包含至少一个被修饰的胞嘧啶。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述被修饰的胞嘧啶是各Ca、Cb、Cc和Cd中的第一个连续的胞嘧啶或最后一个连续的胞嘧啶。
22.根据权利要求20所述的方法，其中n＝3，并且所述被修饰的胞嘧啶是各Ca、Cb、Cc和Cd中的第二个连续的胞嘧啶。
23.根据权利要求20所述的方法，其中n＝4，并且所述被修饰的胞嘧啶是各Ca、Cb、Cc和Cd中的第二个连续的胞嘧啶或第三个连续的胞嘧啶。
24.根据权利要求19的方法，其中Cb和Cc各自包含至少两个被修饰的胞嘧啶，并且Ca和Cd各自由未被修饰的胞嘧啶组成。
25.根据权利要求19的方法，其中Ca或Cd由被修饰的胞嘧啶残基组成。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述第一单链核酸分子和所述第二单链核酸分子能够在酸性条件下形成i-基序。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述第一核酸链能够形成分子内复合物，该分子内复合物包含两条在酸性条件下以反平行方向插入的以C—HC+碱基配对的平行链双链体。
28.根据权利要求6至27中任一项所述的方法，其中至少一种标签选自由Atto染料、Alexa染料、染料和BODIPY染料构成的组。
29.根据权利要求6至27中任一项所述的方法，其中所述供体和受体对是FITC和TRITC、Cy3和Cy5、或Alexa-488和Alexa-647。
30.根据权利要求5至29中任一项所述的方法，其中所述第一标签和所述第二标签包含供体荧光团和受体淬灭剂。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述核酸复合物还包含靶向部分。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述靶向部分是核酸序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述靶向部分具有同源人工蛋白受体。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述靶向部分编码在与所述第一单链核酸分子和/或所述第二单链核酸分子相同的核酸链上。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述靶向部分选自适配体、靶向人工蛋白受体的双链体结构域、结合阴离子-配体结合受体的核酸序列、和内吞配体。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述靶向部分包含直接地或间接地与所述核酸分子结合的肽。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述靶向部分肽包含融合肽、膜透化肽、亚细胞定位序列或细胞受体配体中的一种或多种。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述亚细胞定位序列将所述核酸复合物靶向至细胞的其中存在靶蛋白的空间定位的区域。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述亚细胞定位序列将所述核酸复合物靶向至所述细胞的这样的区域，该区域选自由以下构成的组：胞质溶胶、内质网、线粒体基质、叶绿体腔、中间反式高尔基体层囊、溶酶体腔、内体腔、过氧化物酶体、细胞核、和质膜上的特定空间位置。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述第一单链核酸分子和/或所述第二单链核酸分子小于200个核苷酸。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所确定的pH小于pH 5.5。
42.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所确定的pH大于pH7.0。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对靶标进行量化，该靶标选自Cl-、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Pb2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+、H+、Na+、K+、F-、Br-、I-、氰化物(CN-)、硝酸根(NO3 -)、亚硝酸根(NO2 -)、一氧化氮(NO)、磷酸根(PO4 3-)、焦磷酸根(P2O7 4-)和活性氧物质。
44.根据权利要求43所述的方法，其中使用基于核酸的传感器对所述靶标进行量化，所述传感器包括：a)感测模块，其包含核酸或肽核酸(PNA)链和靶标敏感分子；b)标准化模块，其包含与所述核酸或PNA链互补的核酸序列、和靶标不敏感荧光团；和c)靶向模块，其包含与所述标准化模块的所述核酸序列互补的核酸序列，任选地具有适配体。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述方法还包括通过确定靶标不敏感荧光团与靶标敏感荧光团的荧光比来对所述靶标进行量化。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中所述靶标敏感分子选自包括以下物质的组：SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓)、MACA(10-甲基吖啶鎓-9-羧酰胺)、MADC(10-甲基吖啶鎓-9-N,N-二甲基羧酰胺)、MAMC(N-甲基吖啶鎓-9-甲基羧酸盐)、DMAC(2,10-二甲基吖啶鎓-9-羧醛)、MAA(N-甲基-9-氨基吖啶鎓)、6-甲氧基N-(4-磺基丁基)喹啉鎓、N-十二烷基-6-甲氧基-喹啉鎓碘化物、6-甲基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓溴化物、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓四苯基硼酸盐、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓溴化物、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓碘化物；N，N'-二甲基-9-9'-二吖啶鎓和10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)或其修饰物和衍生物，优选为10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)；所述靶标不敏感荧光团选自包括Alexafluor 568、Alexafluor 594和Alexa 647的组，优选为Alexa 647；并且其中所述靶标敏感分子与所述靶标不敏感荧光团的比是1:1。
47.根据权利要求43至46中任一项所述的方法，其中所述感测模块包含如SEQ ID NO：1所示的序列；所述标准化模块包含如SEQ ID NO：2所示的序列；并且所述靶向模块包含选自包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的组中的序列。
48.一种核酸复合物，其包含：
包含序列CnXCnYCnZCn(SEQ ID NO.6)的第一单链核酸分子，其中C是胞嘧啶；X、Y和Z各自为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一种或多种；并且n大于或等于2；并且其中核酸分子的至少2个胞嘧啶残基是被修饰的；和
部分地或全部地与所述第一单链分子互补的第二单链核酸分子。
49.根据权利要求48所述的核酸复合物，其中第一标签结合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子；并且其中所述第一标签能够产生信号，其中所述信号的强度作为所述核酸复合物的构象的函数而变化。
50.根据权利要求48或49所述的核酸复合物，还包含与所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子结合的第二标签；并且其中所述信号的强度作为以下至少一者的函数而变化：所述第一标签和所述第二标签之间的距离、和所述第一标签和所述第二标签的相对朝向。
51.根据权利要求50所述的核酸复合物，其中所述第一标签和所述第二标签包含供体和受体对部分。
52.根据权利要求48至49中任一项所述的核酸复合物，其中X、Y和Z各自为TAA。
53.根据权利要求48至52中任一项所述的核酸复合物，其中n为3、4或7。
54.根据权利要求53所述的核酸复合物，其中n为4。
55.根据权利要求48至54中任一项所述的核酸复合物，其中所述修饰选自甲基、氟基、溴基、羟甲基、甲酰基或乙酰基中的一种或多种。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述修饰是甲基或溴基。
57.根据权利要求48至56中任一项所述的方法，其中所述修饰位于所述胞嘧啶的5’位置。
58.根据权利要求48至53或55至57中任一项所述的核酸复合物，其中所述第一单链核酸分子包含序列(Ca)nX(Cb)nY(Cc)nZ(Cd)n(SEQ ID NO.7)，其中Ca、Cb、Cc和Cd等于n个连续的胞嘧啶残基；X、Y和Z各自为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一种或多种；并且n大于或等于3。
59.根据权利要求58所述的核酸复合物，其中Ca、Cb、Cc和Cd各自包含至少一个被修饰的胞嘧啶。
60.根据权利要求59所述的核酸复合物，其中所述被修饰的胞嘧啶是各Ca、Cb、Cc和Cd中的第一个连续的胞嘧啶或最后一个连续的胞嘧啶。
61.根据权利要求59所述的核酸复合物，其中n＝3，并且所述被修饰的胞嘧啶是各Ca、Cb、Cc和Cd中的第二个连续的胞嘧啶。
62.根据权利要求59所述的核酸复合物，其中n＝4，并且所述被修饰的胞嘧啶是各Ca、Cb、Cc和Cd中的第二个连续的胞嘧啶或第三个连续的胞嘧啶。
63.根据权利要求59所述的核酸复合物，其中Cb和Cc各自包含至少两个被修饰的胞嘧啶，并且Ca和Cd各自由未被修饰的胞嘧啶组成。
64.根据权利要求59所述的核酸复合物，其中Ca或Cd由被修饰的胞嘧啶残基组成。
65.根据权利要求48至64中任一项所述的核酸复合物，其中所述第一核酸链形成分子内复合物，该分子内复合物包含两条在酸性条件下以反平行方向插入的以C—HC+碱基配对的平行链双链体。
66.根据权利要求48至65中任一项所述的核酸复合物，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链在碱性pH条件下是部分碱基配对的。
67.根据权利要求49至66中任一项所述的核酸复合物，其中至少一种标签选自由Atto染料、Alexa染料、染料和BODIPY染料构成的组。
68.根据权利要求51至66中任一项所述的核酸复合物，其中所述供体和受体对是FITC和TRITC、Cy3和Cy5或Alexa-488和Alexa-647。
69.根据权利要求51至66中任一项所述的核酸复合物，其中所述第一标签和所述第二标签包含供体荧光团和受体淬灭剂。
70.根据权利要求48至68中任一项所述的核酸复合物，其中所述核酸复合物还包含靶向部分。
71.根据权利要求70所述的核酸复合物，其中所述靶向部分是核酸序列。
72.根据权利要求71所述的核酸复合物，其中所述靶向部分具有同源人工蛋白受体。
73.根据权利要求71所述的核酸复合物，其中所述靶向部分编码在所述第一单链核酸分子和/或所述第二单链核酸分子上。
74.根据权利要求70或71所述的核酸复合物，其中所述靶向部分选自适配体、靶向人工蛋白受体的双链体结构域、结合阴离子-配体结合受体的核酸序列、和内吞配体。
75.根据权利要求70所述的核酸复合物，其中所述靶向部分包含直接地或间接地与所述核酸分子结合的肽。
76.根据权利要求75所述的核酸复合物，其中所述靶向部分肽包含融合肽、膜透化肽、亚细胞定位序列或细胞受体配体中的一种或多种。
77.根据权利要求76所述的核酸复合物，其中所述亚细胞定位序列将所述核酸复合物靶向至细胞的其中存在靶蛋白的空间定位的区域。
78.根据权利要求76所述的核酸复合物，其中所述亚细胞定位序列将所述核酸复合物靶向至所述细胞的这样的区域，该区域选自由以下构成的组：胞质溶胶、内质网、线粒体基质、叶绿体腔、中间反式高尔基体层囊、溶酶体腔、内体腔、过氧化物酶体、细胞核、和质膜上的特定空间位置。
79.根据权利要求48至78中任一项所述的核酸复合物，其中所述第一核酸链和/或所述第二核酸链少于200个核苷酸。
80.根据权利要求48至79中任一项所述的核酸复合物，其中所述核酸复合物还包含基于核酸或PNA的传感器，该传感器包括：a)感测模块，其包含核酸或肽核酸(PNA)链、和靶标敏感分子；其中所述靶标不是[H+]；b)标准化模块，其包含与所述核酸或PNA链互补的核酸序列和靶标不敏感荧光团；和c)靶向模块，其包含与所述标准化模块的所述核酸序列互补的核酸序列，任选地具有适配体。
81.根据权利要求80所述的核酸复合物，其中a)或b)与所述第一单链核酸分子和/或所述第二单链核酸分子有效连接。
82.一种核酸分子，其包含以下核酸序列：
5’-CCCTAACCCCTAAC*CC*CTAACC*CC*ATATATATCCTAGAACGACAGACAAACAGTGAGTC-3(SEQID NO.8)；
5’-CCC*CTAACC*CCTAACCC*CTAACC*CCATATATATCCTAGAACGACAGACAAACAGTGAGTC-3’(SEQ ID NO.9)；
5’-C*CCCTAACCCC*TAAC*CCCTAACCCC*ATATATATCCTAGAACGACAGACAAACAGTGAGTC-3’(SEQ ID NO.10)；或
5’-C*C*C*C*TAACCCCTAACCCCTAACCCCATATATATCCTAGAACGACAGACAAACAGTGAGTC-3’(SEQ ID NO.11)；
其中C*是被修饰的胞嘧啶。
83.根据权利要求82所述的核酸，其中用甲基、氟基、溴基、羟甲基、甲酰基或乙酰基来修饰所述胞嘧啶。
84.根据权利要求83所述的核酸，其中用甲基或溴基来修饰所述胞嘧啶。
85.根据权利要求83或84所述的核酸，其中所述修饰位于所述胞嘧啶的5’位置。
86.一种细胞，其包含根据权利要求48至85中任一项所述的核酸复合物。
87.一种试剂盒，其包含根据权利要求48至81中任一项所述的核酸复合物或根据权利要求82至85中任一项所述的核酸。
88.根据权利要求87所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含编码同源人工蛋白受体的质粒。
89.根据权利要求87或88所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于对靶标进行量化的基于核酸或PNA的传感器，该靶标选自Cl-、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Pb2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+、H+、Na+、K+、F-、Br-、I-、氰化物(CN-)、硝酸根(NO3 -)、亚硝酸根(NO2 -)、一氧化氮(NO)、磷酸根(PO4 3-)、焦磷酸根(P2O7 4-)和活性氧物质。
90.一种确定细胞中pH的方法，包括：
a)向所述细胞提供核酸复合物，其包含
i)包含序列CnXCnYCnZCn(SEQ ID NO.6)的第一单链核酸分子，其中C是胞嘧啶；X、Y和Z各自为腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤或其组合中的一种或多种；并且n大于或等于2；并且其中所述第一单链核酸分子的至少2个胞嘧啶残基是被修饰的；和
ii)部分地或全部地与所述第一单链分子互补的第二单链核酸分子，其中第一标签结合至所述第一单链核酸分子或所述第二单链核酸分子；并且其中所述第一标签能够产生信号，其中所述信号的强度作为所述核酸复合物的构象的函数而变化；以及
b)测量所述信号的强度并由所测量的信号确定所述pH，其中所确定的pH小于pH 5.5或大于pH 7.0。
91.一种用于在模型细胞或生物体中筛选候选药物的方法，包括：将根据权利要求48至81中任一项所述的核酸复合物递送至所述细胞；使所述细胞与所述候选药物接触，测量所述信号的强度；以及由所测量的信号确定所述pH。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述样品是选自细胞、细胞提取物、细胞裂解物、组织、组织提取物、体液、血清、血液和血液制品的生物样品。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述样品是活细胞。
94.根据权利要求92所述的方法，其中所述样品是来自患者的生物样品。
95.一种用于检测疾病的严重性、疾病的进展或疾病的存在的方法，所述方法包括：将根据权利要求48至81中任一项所述的核酸复合物转移到样品中；测量所述信号的强度；以及由所测量的信号确定所述pH。
96.根据权利要求91至95中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对靶标进行量化，该靶标选自Cl-、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Pb2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+、H+、Na+、K+、F-、Br-、I-、氰化物(CN-)、硝酸根(NO3 -)、亚硝酸根(NO2 -)、一氧化氮(NO)、磷酸根(PO4 3-)、焦磷酸根(P2O7 4-)和活性氧物质。
97.根据权利要求96所述的方法，其中使用基于核酸或PNA的传感器对所述靶标进行量化，该传感器包含：a)感测模块，其包含核酸或肽核酸(PNA)链、和靶标敏感分子；b)标准化模块，其包含与所述核酸或PNA链互补的核酸序列、和靶标不敏感荧光团；和c)靶向模块，其包含与所述标准化模块的所述核酸序列互补的核酸序列，任选地具有适配体。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述方法还包括通过确定靶标不敏感荧光团与靶标敏感荧光团的荧光比来对所述靶标进行量化。
99.根据权利要求97或98所述的方法，其中所述靶标敏感分子选自包括以下物质的组：SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓)、MACA(10-甲基吖啶鎓-9-羧酰胺)、MADC(10-甲基吖啶鎓-9-N,N-二甲基羧酰胺)、MAMC(N-甲基吖啶鎓-9-甲基羧酸盐)、DMAC(2,10-二甲基吖啶鎓-9-羧醛)、MAA(N-甲基-9-氨基吖啶鎓)、6-甲氧基N-(4-磺基丁基)喹啉鎓、N-十二烷基-6-甲氧基喹啉鎓碘化物、6-甲基-N-(3-磺基丙基)喹啉鎓、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓溴化物、6-甲氧基-N-(8-辛酸)喹啉鎓四苯基硼酸盐、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓溴化物、6-甲基-N-(甲基)喹啉鎓碘化物；N，N'-二甲基-9-9'-二吖啶鎓和10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)或其修饰物和衍生物，优选为10,10'-双[3-羧丙基]-9,9'-二吖啶鎓二硝酸盐(BAC)；所述靶标不敏感荧光团选自包括Alexafluor 568、Alexafluor 594和Alexa 647的组，优选为Alexa 647；并且其中所述靶标敏感分子与所述靶标不敏感荧光团的比是1:1。
100.根据权利要求96至99中任一项所述的方法，其中所述感测模块包含如SEQ ID NO：1所示的序列；所述标准化模块包含如SEQ ID NO：2所示的序列；并且所述靶向模块包含选自包括SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的组中的序列。
101.根据权利要求91至94或96至100中任一项所述的方法，其中所述模型细胞或生物体是用于溶酶体贮积病的模型。
102.根据权利要求92至100中任一项所述的方法，其中所述疾病是溶酶体贮积病。
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