CN108350390A - 具有特定三酰甘油分布的卡诺拉油组合物 - Google Patents

Abstract

本申请涉及包含三酰甘油(TAG)的卡诺拉油，其中所述油中总TAG的11‑16％包含一个饱和脂肪酸和两个不饱和脂肪酸，且其中总TAG的82‑88％包含三个不饱和脂肪酸，且其中总TAG的81‑91％包含至少一个油酸，并且其中总TAG的7‑12％包含至少一个亚麻酸。在一些实施方案中，油具有3.5‑5.5％(如3.5‑4.5％或3.5‑4.0％)的低饱和脂肪酸含量。

Description

具有特定三酰甘油分布的卡诺拉油组合物

相关申请

本申请要求2015年7月31日提交的美国临时专利申请号62/199,724的优先权，其整体援引加入本文。

技术领域

本申请涉及具有特定三酰甘油(TAG)分布的卡诺拉(canola)油，这样的油的用途，以及生产其的芸苔属(Brassica)植物。

背景技术

典型商品型卡诺拉油的脂肪酸含量为约6-8％总饱和脂肪酸、约55-65％油酸、约22-30％亚油酸和约7-10％亚麻酸。降低卡诺拉油的饱和脂肪酸和亚麻酸含量可能对某些应用有帮助。例如，消费者可能更喜欢饱和脂肪酸水平降低的油，而例如α-亚麻酸(ALA)在烹饪和储存过程中不稳定且易氧化，这反而造成油的异味。例如在WO 2011/075716，WO2011/150028和WO 2015/077661中描述了通过对芸苔属植物的遗传操作来控制卡诺拉油中的油酸、亚麻酸和饱和脂肪酸的水平的在先尝试，其援引加入本文。

在芸苔属种子中发现的大部分脂肪酸归入三酰甘油。因此，为提供具有对消费者用途有利特性的卡诺拉油，控制卡诺拉油中三酰甘油的分布也可能是有益的。

发明简述

本申请涉及具有特定三酰甘油(TAG)分布的卡诺拉油。TAG是包含一个甘油部分和三个脂肪酸部分的分子。在一些实施方案中，油具有TAG分布，使得油中总TAG的11-16％(如11-13％)包含一个饱和脂肪酸和两个不饱和脂肪酸，且其中总TAG的82-88％包含三个不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，总TAG的81-91％包含至少一个油酸，并且其中总TAG的7-12％包含至少一个亚麻酸。在一些这样的实施方案中，没有可检测的包含两个或三个饱和脂肪酸的TAG。

在一些实施方案中，卡诺拉油进一步包含62-74％的油酸和2.5-5％的亚麻酸。在一些实施方案中，油包含3.5％至5.5％的饱和脂肪酸，如3.5％至4.5％或3.5％至4.0％。在一些实施方案中，油包含不超过1％的甾醇，如不超过0.5％或不超过0.4％。在一些实施方案中，油包含不超过0.5％的反式脂肪酸。在一些实施方案中，油包含不超过0.1％的生育酚或不超过0.15％的生育酚。

在一些实施方案中，总TAG的3-5％包含两个油酸和一个棕榈酸(称为POO)。在一些实施方案中，总TAG的1-2％包含两个油酸和一个硬脂酸(称为SOO)。在一些实施方案中，总TAG的1-3％包含三个亚油酸(称为LLL)。在一些实施方案中，总TAG的10-13％包含一个油酸和两个亚油酸(称为OLL)。

在一些实施方案中，油包含磷脂并且还具有特定饱和磷脂(PL)分布，饱和PL的水平可以与在更高饱和度脂肪或野生型油中发现的相似。在一些实施方案中，在油的磷脂酰胆碱部分中发现的10-13％的脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些实施方案中，在磷脂酰乙醇胺部分中发现的24-31％的脂肪酸是饱和的。在一些实施方案中，在磷脂酰肌醇部分中发现的17-30％的脂肪酸是饱和的。

在一些实施方案中，油已经脱胶、精炼、漂白、脱蜡和/或除臭。在一些实施方案中，油已乳化或结晶，如用以产生半固态，例如用于制备人造黄油或起酥油。

在一些实施方案中，油从包含一个或多个突变等位基因的芸苔属植物系产生，所述等位基因诸如以下的一个或多个：(a)脂肪酰基-酰基载体蛋白硫酯酶A2(FATA2)基因座处的突变等位基因，其中所述突变等位基因导致产生相对于相应野生型多肽具有降低的硫酯酶活性的FATA2多肽，(b)WO2015/077661(援引加入本文)中描述的染色体N01数量性状基因座1(QTL1)等位基因处和/或染色体N19数量性状基因座2(QTL2)等位基因处的突变，(c)脂肪酰基-酰基载体蛋白硫酯酶B(FATB)基因座处的突变等位基因，诸如在FATB1、FATB2、FATB3和FATB4基因座处的突变等位基因的任意组合，其中一个或多个突变等位基因导致产生相对于相应野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽，(d)在δ-12脂肪酸脱饱和酶(FAD2)基因座处的突变等位基因，和(e)在δ-15脂肪酸脱饱和酶(FAD3)基因座处(诸如在FAD3A、FAD3B、FAD3D和FAD3F的任意组合处)的突变等位基因。

在一些实施方案中，本文所述的卡诺拉油可以从为03LC.034、Salomon和mIMC201繁育系的杂交种的芸苔属植物产生(实施例1中所述)。在一些这样的实施方案中，植物为：(i)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB1和FATB4的突变等位基因纯合，(ii)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2以及FATB1、2、3和4每一个的突变等位基因纯合，或(iii)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2以及FATB3和4的突变等位基因纯合，且FATB2的突变等位基因杂合。在其它实施方案中，本文所述的卡诺拉油可以为从07RFS43.001、Salomon和IMC201繁育系的杂交种的芸苔属植物产生，其中植物为：(i)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB1和FATB4的突变等位基因纯合，(ii)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB3和FATB4的突变等位基因纯合，或(iii)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2以及FATB1、3和4每一个的突变等位基因纯合。

在一些实施方案中，从中产生油的芸苔属植物不是Salomon(ATCC保藏号PTA-11453)、IMC201、1764、15.24、Skechers或WO 2011/075716和WO 2015/077661(援引加入本文)中描述的杂交系中的任何植物。

在一些实施方案中，芸苔属植物是耐除草剂的。在一些实施方案中，芸苔属植物是非转基因的，或不含除草剂耐受转基因之外的转基因。在一些实施方案中，芸苔属植物具有的产量超过自由授粉的春季卡诺拉品种(如46A65或Q2)产量至少10％，如10-15％、10-20％、15-20％、10-25％、15-25％、20-25％或10-35％。在一些实施方案中，芸苔属植物是具有其最高产量亲本植物系产量20％以内，如15％以内，如10％以内，如5％以内变化的产量的杂交种。

本发明还包括使用上述油制备食品组合物如人造黄油或起酥油的方法以及从上述油制备的食品组合物。

本发明还包括产生上述油的芸苔属植物，和这样的植物的部分如种子，以及这样的植物的子代。本发明还包括由这样的芸苔属植物产生上述油的方法，例如，包括压榨植物的种子以从种壳中分离油，并通过己烷提取从压榨的种子中提取油，并将分离的油与提取的油部分组合。另外，可选的步骤包括对油进行脱胶、精炼、漂白、脱蜡和/或除臭。

应该理解前面的总体描述和下面的更详细的描述都仅是示例性和解释性的，并不限制权利要求。

附图简述

图1显示用于开发在本申请实施例中测试的繁育系和样品的繁育方案。如图中所示，左边的浅色阴影框显示mIMC201谱系；右边的深色阴影框显示Salomon谱系，中间无阴影框显示Salomon和mIMC201谱系，MAS代表标记辅助选择。(进一步的描述见实施例1。)

具体实施方案描述

定义

除非另有定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数形式应包括复数形式，且复数形式应包括单数形式。特定术语的定义可能包含在本部分内，也可能包含在下面的文字部分。

在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意为“和/或”。在多项从属权利要求的上下文中，“或”的使用仅择一引用回多于一个在前的独立或从属权利要求。除非另有说明，术语“包括”具有与“包括，但不限于”相同的含义，术语“包括(includes)”具有与“包括(includes)，但不限于”相同的含义，并且术语“包括(including)”具有与“包括(including)，但不限于”相同的含义。类似地，术语“如”具有与术语“如，但不限于”相同的含义。此外，如“元素”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的元素和组分以及包含多于一个亚单元的元素和组分，除非另有特别说明。

“脂肪酸”是指包含烃链和末端羧酸基团的分子。如本发明所用，脂肪酸的羧酸基团可以被修饰或酯化，例如当脂肪酸被并入甘油酯或磷脂或被连接到另一分子如乙酰-CoA(例如COOR，其中R是指，例如，碳原子)时发生的。或者，羧酸基团可以是游离脂肪酸或盐形式(即COO^-或COOH)。

“饱和的”脂肪酸是在烃链中不含有任何碳-碳双键的脂肪酸。“不饱和”脂肪酸含有一个或多个碳-碳双键。“多不饱和”脂肪酸含有多于一个这样的碳-碳双键，而“单不饱和”脂肪酸只含有一个碳-碳双键。碳-碳双键可以是表示为“顺式”和“反式”的两种立体构型之一。天然不饱和脂肪酸通常为“顺式”形式。可以通过不饱和脂肪酸的部分氢化产生的“反式”形式的脂肪酸可能对健康有潜在危害。

本发明描述的植物和油中发现的脂肪酸可以并入到各种甘油酯中。术语“三酰甘油”、“甘油三酯”和“TAG”在本发明中可互换使用，是指包含在其三个羟基的每一个上被脂肪酸酯化的甘油的分子，并且因此包含三个脂肪酸。术语“二酰甘油”、“甘油二酯”和“DAG”是指包含仅在其三个可用羟基的两个上被脂肪酸酯化的甘油的分子，使得其仅含有两个脂肪酸。同样，术语“甘油单酯”是指仅在其三个可用羟基的一个上被脂肪酸修饰的甘油，使得其仅包含一个脂肪酸。

本发明中描述的植物和油中发现的脂肪酸也可以并入到本发明中缩写为“PL”的各种“磷脂”中。磷脂是包括甘油二酯、磷酸酯基团和其它分子(如胆碱(“磷脂酰胆碱”；本发明中缩写为“PC”)、乙醇胺(“磷脂酰乙醇胺”；本发明中缩写为“PE”)、丝氨酸(“磷脂酰丝氨酸”；本发明缩写为“PS”)或肌醇(“磷脂酰肌醇”；本发明缩写为“PI”))的分子。磷脂，例如，是细胞膜的重要组分。

植物和油中的脂肪酸也可以“游离脂肪酸”形式存在，这意味着脂肪酸(COO^-或COOH)基团未在末端羧酸基团上酯化或以其它形式共价修饰。

本文所述的脂肪酸包括下表中列出的那些以及本发明使用的缩写和结构式。根据下面的表1，命名规范包括脂肪酸链中的碳数(例如C16、C18等)，然后是冒号，随后是链中碳-碳双键的数目，即0为不包含双键的饱和脂肪酸，或1、2、3等为包含一个、两个或三个双键的不饱和脂肪酸。

表1：脂肪酸命名法

脂肪酸名称(缩写)	式
		月桂酸(La)	C12:0
豆蔻酸(M)	C14:0
		棕榈酸(P)	C16:0
棕榈油酸(Po)	C16:1
		硬脂酸(S)	C18:0
油酸(O)	C18:1
		亚油酸(L)	C18:2
亚麻酸(Ln)	C18:3
		花生酸(A)	C20:0
巨头鲸鱼酸(G)	C20:1
		山嵛酸(G)	C22:0
芥子酸(E)	C22:1
		木蜡酸(Li)	C24:0

本发明可以以百分数的形式提供特定脂肪酸类型或TAG或PL类型的水平。除非另有特别指出，否则如实验所计算的，这样的百分数分别是基于油中总脂肪酸，TAG或PL的重量百分数。因此，例如，如果提供特定脂肪酸种类或类别的百分数，例如油酸，则这是基于在油中检测到的总脂肪酸的w/w百分数。同样，如果提供特定TAG种类或类别的百分数，则这是基于在油中检测到的总TAG的w/w百分数。

如本发明所用的术语“甾醇”是指包含类固醇醇基的分子，即在A环的3-位具有羟基的类固醇环结构。实例包括胆固醇、菜油固醇、谷固醇和豆固醇。如果本发明提供特定甾醇百分数，除非另外特别指出，否则这是基于如实验计算的油重量的w/w百分数。

如本发明所用的术语“生育酚”统指α、β、γ和δ-生育酚。如果本发明提供了特定生育酚百分数，除非另外特别指出，否则这是基于如实验计算的油重量的w/w百分数。

如本发明所用的术语“卡诺拉油”是指来源于芸苔属植物的种子或其它部分的油。在一些实施方案中，油还可以以各种方式来化学处理或精炼，例如通过脱胶、精炼、漂白、脱蜡和/或除臭。

如本发明所用，提及芸苔属“植物”包括植物及其子代，如其F₁、F₂、F₃、F₄和后代植物。芸苔属植物可以包括例如甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)和白菜型油菜(B.rapa)品种。如本发明所使用的，“系”或“繁育系”是在至少一种性状上个体之间显示几乎没有或没有遗传变异(如特定基因突变或特定组基因突变)的植物组。这样的系可以由几代自花授粉和选择建立，或通过使用组织或细胞培养技术从单亲无性繁殖建立。“品种”是指用于商业生产的系，包括杂交种和自由授粉的品种。

“等位基因”是指特定基因座处的基因的一种或多种替代形式。

卡诺拉油

几种类型的卡诺拉油目前可商购获得，其含有，例如，不同量的油酸(58-82％)、亚油酸(8-24％)和亚麻酸(1.5-11％)，例如，以及<2％的芥子酸，并且有6-8％的饱和脂肪酸含量。

本申请涉及具有特定TAG分布的卡诺拉油。在一些实施方案中，油具有TAG分布，使得油中总TAG的11-16％(如11-13％)包含一个饱和脂肪酸和两个不饱和脂肪酸，且其中总TAG的82-88％包含三个不饱和脂肪酸。这两类TAG的百分数是基于确定油的总TAG含量并将其标准化至100％的重量与重量(w/w)百分数。在一些这样的实施方案中，没有可检测的包含两个或三个饱和脂肪酸的TAG。在一些实施方案中，总TAG的81-91％包含至少一个油酸，且其中总TAG的7-12％包含至少一个亚麻酸。这样的百分数可以通过测定油中发现的每个TAG种类的水平(例如通过如本发明实施例中描述的色谱法)，将百分数标准化至100％，然后相加含有一个、两个或三个油酸残基的每个TAG种类百分数获得。例如，可以将具有三个油酸的TAG种类(本发明基于表1中所示的缩写称为OOO)的百分数与具有一个油酸和两个亚油酸的TAG种类(本发明称为OLL)的百分数，与具有一个或两个油酸的所有其它TAG种类的百分数等加在一起。类似地，为了确定总TAG中给定类型的脂肪酸的百分数，可以将含该脂肪酸的每个TAG种类的百分数加起来。

在一些实施方案中，总TAG的3-5％包含两个油酸和一个棕榈酸(称为POO)。在一些实施方案中，总TAG的1-2％包含两个油酸和一个硬脂酸(称为SOO)。在一些实施方案中，总TAG的1-3.3％包含三个亚油酸(称为LLL)，如2.5-5％或3.6-5％。在一些实施方案中，总TAG的9-14％包含一个油酸和两个亚油酸(称为OLL)，如10-14％或10-13％。在一些实施方案中，总TAG的2-5％包含一个油酸，一个亚麻酸和一个亚油酸(称为OLnL)，如2.5-5％或3.6-5％。这些百分数可以通过确定油中每个TAG种类的量来获得(例如使用如以下实施例中所述的色谱法设置)。一旦确定了油中每种可检测TAG的量，将结果标准化至100％，每个TAG种类以百分数给出。这样的实验不能区分其中单个脂肪酸位于甘油的sn1、sn2和sn3位置的TAG种类。因此，OLnL表示的TAG种类的量是OLnL、OLLn、LOLn、LLnO、LnLO和LnOL的量的总和，例如，其中每个O、L和Ln脂肪酸部分在甘油上每个sn1、sn2和sn3位置。

在一些实施方案中，卡诺拉油进一步包含62-74％的油酸和2.5-5％的亚麻酸。在一些实施方案中，油包含3.5％至5.5％的饱和脂肪酸，如3.5％至4.5％或3.5％至4.0％。这样的百分数可以通过如下面的实施例所示的油的脂肪酸分析得到。在一些实施方案中，油包含不超过1％的甾醇，如不超过0.5％或不超过0.4％。在一些实施方案中，油包含不超过0.5％的反式脂肪酸。在一些实施方案中，油包含不超过0.1％的生育酚或不超过0.15％的生育酚。如以下实施例所示，这些是基于油或油脂质总重量的重量百分数。

在一些实施方案中，油包含磷脂并且还具有特定的饱和磷脂(PL)分布，饱和PL的水平可以与在更高饱和度脂肪或野生型油中发现的相似。在一些实施方案中，在油的磷脂酰胆碱部分中发现的10-13％的脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些实施方案中，在磷脂酰乙醇胺部分中发现的24-31％的脂肪酸是饱和的。在一些实施方案中，在磷脂酰肌醇部分中发现的17-30％的脂肪酸是饱和的。不同磷脂部分中脂肪酸的百分数可以如下面的实施例所示测定。

在一些实施方案中，油已经例如通过下述方法脱胶、精炼、漂白、脱蜡和/或除臭。在一些实施方案中，油已经乳化或结晶，如用以产生半固体状态，例如用于制备人造黄油或起酥油。

具有突变等位基因的芸苔属植物及其制备

在一些实施方案中，卡诺拉油可以由具有特定突变等位基因的芸苔属植物产生。可以使用一种或多种诱变剂将基因突变引入种子或可再生植物组织群内。合适的诱变剂包括，例如甲磺酸乙酯(EMS)、甲基N-亚硝基胍(MNNG)、溴化乙锭、双环氧丁烷、电离辐射、x射线、紫外线和本领域已知的其它诱变剂。在一些实施方案中，可以使用诱变剂的组合(如EMS和MNNG)诱导突变。可以筛选经处理的群体或该群体的后代中由于突变导致的降低的活性，如降低的硫酯酶活性。

突变可以在基因的任何部分，包括编码序列、内含子序列和调控元件，其使得到的基因产物无功能或有降低的活性。示例性的突变类型包括例如核苷酸的插入或缺失，以及野生型编码序列中的转换或颠换。这样的突变可导致氨基酸的缺失或插入，以及相应基因产物中的保守或非保守氨基酸取代。在一些情况下，突变是无义突变，其导致终止密码子(TGA、TAA或TAG)的引入和截短多肽的产生。在一些情况下，突变是剪接位点突变，其改变或消除了前mRNA序列的正确剪接，导致与野生型不同的氨基酸序列的蛋白质。例如，在RNA剪接过程中可能会跳过一个或多个外显子，从而导致蛋白质缺少由跳过的外显子编码的氨基酸。或者，通过不正确的剪接可以改变阅读框，可以保留一个或多个内含子，可以产生替代的剪接供体或受体，或者可以在替代位置开始剪接，或者可以产生可选的多腺苷酸化信号。在一些情况下，引入多于一个突变或多于一种类型的突变。

编码序列中氨基酸的插入、缺失或取代可例如破坏所得基因产物的基本α-螺旋或β折叠片层区域的构象。氨基酸插入、缺失或取代也可破坏结合，改变底物特异性或破坏对基因产物活性重要的催化位点。取代突变可能是保守的或非保守的。非保守氨基酸取代可以用不同类别的氨基酸取代一类氨基酸(例如用非极性氨基酸或相反电荷的氨基酸取代极性或带电荷的氨基酸)。因此，非保守取代的实例包括碱性氨基酸取代非极性氨基酸，或极性氨基酸取代酸性氨基酸，或碱性氨基酸取代酸性氨基酸，或反之。非保守取代可能使基因产物的电荷或疏水性发生实质性改变。即使氨基酸的一般极性没有改变，例如用丙氨酸残基取代异亮氨酸，甲硫氨酸或苯丙氨酸残基，非保守氨基酸取代也可以使残基侧链的大部分发生实质性改变。因此，非保守氨基酸取代的另外实例包括用大体积氨基酸如甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸取代小氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或丝氨酸，或反之。相比之下，保守性取代将氨基酸替换为具有相似大小，极性和电荷的其它氨基酸。

在一些实施方案中，本文所述的生产卡诺拉油的芸苔属植物为“非转基因的”，这意为其是不使用重组DNA技术获得的。相反，“转基因”是其遗传物质已经使用重组DNA技术改变的生物体。

本文所述的生产卡诺拉油的芸苔属植物可以被修饰和/或选择以展示除草剂耐受性状。可以通过用寻求耐受性的除草剂选择或通过使用重组DNA技术来引入该性状。因此，本发明描述的植物可显示对一种或多种除草剂如咪唑啉酮、麦草畏、环己二酮、磺酰脲、草甘膦、草胺膦(flufosinate)、苯氧基丙酸、膦丝菌素、三嗪和苯甲腈的耐受性。在一些实施方案中，植物可能已经通过转基因重组DNA技术就其除草剂耐受性状进行了修饰。因此，在一些实施方案中，除了那些携带除草剂耐受性状的基因外，植物可以不含转基因。

示例性的芸苔属基因突变

在一些实施方案中，本文所述的生产卡诺拉油的芸苔属植物可具有某些基因突变。在一些实施方案中，植物可具有降低的硫酯酶活性，如降低的脂肪酰基-ACP硫酯酶A2(FATA2)活性，和/或可具有降低的脂肪酰基-ACP硫酯酶B(FATB)活性。脂肪酰基-ACP硫酯酶水解叶绿体中的酰基-ACP以从ACP中释放新合成的脂肪酸，有效地将其从质体中的进一步链延伸中去除。然后游离脂肪酸可以离开质体，与辅酶A(CoA)结合并进入内质网(ER)的Kennedy通路用于三酰甘油(TAG)的生物合成。FATA家族成员优选对18:0和16:0-ACP具有较低活性的油酰(C18:1)ACP底物，而FATB家族的成员主要水解长度在8和18个碳之间的饱和酰基-ACP。参见Jones等,Plant Cell 7:359-371(1995)；Ginalski和Rhchlewski,NucleicAcids Res.31:3291-3292(2003)；以及Voelker T in Genetic Engineering(Setlow,JK,Ed.)Vol.18,pp.111-133,Plenum Publishing Corp.,New York(2003)。

通过修饰内源fatA2或fatB等位基因可以实现FATA2或FATB的活性降低，包括不存在可检测的活性。内源等位基因可以通过例如诱变(如用上述方法)来修饰，或通过使用同源重组来用含有一个或多个突变(例如，使用定点诱变产生)的变体取代内源植物基因来修饰。参见，例如，Townsend等,Nature 459:442-445(2009)；Tovkach等,Plant J.,57:747-757(2009)；和Lloyd等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:2232-2237(2005)。在一些实施方案中，例如，可以使用用于脂肪酰基-ACP水解的试验在植物提取物中评估降低的硫酯酶活性。参见，例如，Bonaventure等，Plant Cell 15：1020-1033(2003)；和Eccleston和Ohlrogge，Plant Cell 10：613-622(1998)。

在一些实施方案中，芸苔属植物含有FATA2基因座处的突变等位基因，其中突变等位基因导致产生相对于相应野生型FATA2多肽具有降低的硫酯酶活性的FATA2多肽。例如，突变等位基因可以包括编码具有在螺旋/4链片层(4HBT)结构域(也称为热狗结构域)内非保守取代或影响催化活性或底物特异性残基非保守取代的FATA2多肽的核酸。例如，芸苔属植物可含有突变等位基因，其包含编码在多肽对应于FATA2多肽残基242-277(按基于与GenBank登录号NP_193041.1，蛋白质；GenBank登录号NM_117374，mRNA所示拟南芥(Arabidopsis thaliana)FATA2多肽的比对编号)的区域中有取代的FATA2b多肽的核酸。参见SEQ ID NO：12-13。FATA2的这个区域在拟南芥属(Arabidopsis)和芸苔属中高度保守。此外，该区域中的许多残基在FATA和FATB之间是保守的，包括259位的天冬氨酸、263位的天冬酰胺、265位的组氨酸、266位的缬氨酸、268位的天冬酰胺和271位的酪氨酸(按基于与SEQID NO：13的比对编号)。263位的天冬酰胺和265位的组氨酸是催化三联体的一部分，256位的精氨酸参与确定底物特异性。也参见Mayer和Shanklin,BMC Plant Biology 7:1-11(2007)。SEQ ID NO：14显示了由外显子2-6编码并且对应于SEQ ID NO：13所示拟南芥(A.thaliana)序列残基121至343的芸苔属FATA2b多肽的预测氨基酸序列。例如，FATA2多肽可以在对应于拟南芥属FATA2多肽的255位的位置(即，SEQ ID NO：12的位置14，或SEQ IDNO：14的位置135)处具有亮氨酸残基取代脯氨酸。在甘蓝型油菜序列中对应于拟南芥属255位的脯氨酸在甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghumbicolor)、籼稻(Oryza sativa Indica)(大米)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycinemax)、麻疯树属(Jatropha)(树种类)、红花(Carthamus tinctorius)、萼距花(Cupheahookeriana)、鸢尾(Iris tectorum)、紫苏(Perilla frutescens)、向日葵(Helianthusannuus)、山竹子(Garcinia mangostana)、北美云杉(Picea sitchensis)、小立碗藓立碗亚种(Physcomitrella patens subsp.Patens)、非洲油棕(Elaeis guineensis)、葡萄(Vitisvinifera)、美洲油棕(Elaeis oleifera)、油茶(Camellia oleifera)、花生(Arachishypogaea)、辣椒(Capsicum annuum)、萼距花(Cuphea hookeriana)、毛果杨(Populustrichocarpa)和藏榄(Diploknema butyracea)间保守。

在一些实施方案中，FATA2基因座处的突变等位基因包含与SEQ ID NO：11或SEQID NO：15所示的核苷酸序列具有至少90％(例如至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％)序列同一性的核苷酸序列(序列同一性测定在下面描述)。SEQ ID NO：11和15所示的核苷酸序列是来自甘蓝型油菜系15.24的fatA2b基因的代表性核苷酸序列。

在一些实施方案中，芸苔属植物在FATB基因座处含有突变等位基因，其中突变等位基因导致产生相对于相应野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽。在一些实施方案中，芸苔属植物在两个或更多个不同的FATB基因座处含有突变等位基因。在一些实施方案中，芸苔属植物在三个不同的FATB基因座处含有突变等位基因或在四个不同的FATB基因座处含有突变等位基因。甘蓝型油菜包含6种不同的FATB异构型(即，在不同基因座的不同形式的FATB多肽)，其在本发明中被称为异构型1-6。SEQ ID NO：5-10分别显示了编码甘蓝型油菜FATB异构型1-6的核苷酸序列。如通过ClustalW算法所测量，SEQ ID NO：5-10所示的核苷酸序列具有82％至95％的序列同一性。

例如，芸苔属植物可以在编码FATB异构型1、异构型2、异构型3、异构型4、异构型5或异构型6的核苷酸序列中具有突变。在一些实施方案中，植物可以在编码异构型1和2；1和3；1和4；1和5；1和6；2和3；2和4；2和5；2和6；3和4；3和5；3和6；4和5；4和6；5和6；1、2和3；1、2和4；1、2和5；1、2和6；2、3和4；2、3和5；2、3和6；3、4和5；3、5和6；4、5和6；1、2、3和4；1、2、3和5；1、2、3和6；1、2、4和6；1、3、4和5；1、3、4和6；1、4、5和6；2、3、4和5；2、3、4和6；或3、4、5和6的核苷酸序列中具有突变。在一些实施方案中，芸苔属植物可以在编码FATB异构型1、2和3；1、2和4；2、3和4；或1、2、3和4的核苷酸序列中具有突变。在一些实施方案中，突变导致缺失FATB多肽的4HBT结构域或其一部分。FATB多肽通常含有串联重复的4HBT结构域，其中N末端4HBT结构域含有影响底物特异性的残基(例如两个保守的甲硫氨酸、保守的赖氨酸、保守的缬氨酸和保守的丝氨酸)，而C末端4HBT结构域含有影响催化活性(例如，保守的天冬酰胺、保守的组氨酸和保守的半胱氨酸的催化三联体)和底物特异性(例如保守的色氨酸)的残基。参见Mayer和Shanklin,J.Biol.Chem.280:3621-3627(2005)。在一些实施方案中，突变导致4HBT结构域中的残基或影响底物特异性的残基的非保守取代。在一些实施方案中，突变为剪接位点突变。在一些实施方案中，突变是其中引入了提前终止密码子(TGA、TAA或TAG)的无义突变，这导致产生截短的多肽。

SEQ ID NO：1-4列出了分别编码异构型1-4，并含有导致截短FATB多肽的示例性无义突变的核苷酸序列。SEQ ID NO：1是在154位具有突变的异构型1的核苷酸序列，其将密码子从CAG改变为TAG。SEQ ID NO：2是在695位具有突变的异构型2的核苷酸序列，其将密码子从CAG改变为TAG。SEQ ID NO：3是在276位具有突变的异构型3的核苷酸序列，其将密码子从TGG改变为TGA。SEQ ID NO：4是在336位具有突变的异构型4的核苷酸序列，其将密码子从TGG改变为TGA。

两个或更多个不同的突变FATB等位基因可以通过在突变系之间进行遗传杂交而在植物中组合。例如，具有编码异构型1的FATB基因座处突变等位基因的植物可以与具有编码异构型2的FATB基因座处突变等位基因的第二植物杂交或交配。种植杂交产生的种子并将所得植物自交以获得子代种子。可以筛选这些子代种子以鉴定携带两个突变等位基因的那些种子。在一些实施方案中，经多代(例如2-5代)选择子代以获得具有两个不同的FATB基因座处突变等位基因的植物。类似地，具有两个或更多个不同FATB异构型处突变等位基因的植物可以与具有两个或更多个不同FATB等位基因处突变等位基因的第二植物杂交，并可以筛选子代种子以鉴定携带四个或更多个不同FATB基因座处突变等位基因的那些种子。同样，可以多代选择子代以获得期望的植物。

在一些实施方案中，植物可包含FATA2基因座处的突变等位基因以及1、2、3或4个不同FATB基因座处的突变等位基因。例如，具有FATA2基因座处突变等位基因的植物可与具有两个或更多个不同FATB基因座处突变等位基因的第二植物杂交或交配。种植杂交产生的种子并将所得植物自交以获得子代种子。可以筛选这些子代种子以鉴定携带突变FATA2和FATB等位基因的那些种子。可经多代(例如2-5代)选择子代以获得具有FATA2基因座处突变等位基因和两个或更多个不同FATB基因座处突变等位基因的植物。具有FATA2b基因座处突变等位基因和三个或四个不同FATB基因座处的突变等位基因的植物可能具有低的总饱和脂肪酸含量，其在不同的生长条件下稳定，即，在生长季期间较少受到由于较热或较冷温度变化的影响。由于FATB和FATA2酶相对于C16:0和C18:0分别不同的底物特征，具有FATA2和一个或多个FATB基因座处突变的植物可以显示出种子油中C16:0和C18:0两者量的显着降低。

在一些实施方案中，本文所述的生产卡诺拉油的芸苔属植物可以在PCT公开WO2015/077661(其援引加入本文)描述的称为N01的QTL1和N19的QTL2的一个或两个基因座处包含修饰的等位基因。WO 2015/077661中描述了这些修饰的等位基因和鉴定它们的方法。已经发现QTL1(N1)和QTL2(N19)修饰的等位基因与降低的饱和脂肪酸含量相关。在一些实施方案中，植物可以具有QTL1和QTL2两个基因座处以及FATA2和/或FATB基因座处的突变。

在一些实施方案中，本文所述的生产卡诺拉油的芸苔属植物可具有降低的脂肪酸脱饱和酶活性。例如，在一些实施方案中，植物可以在控制脂肪酸脱饱和酶活性的基因座处(如fad2和/或fad3)包括突变等位基因。在一些实施方案中，植物可以在FATA2和FATB基因座中的一个或两个处以及在控制脂肪酸脱饱和酶活性的基因座(如fad2和/或fad3)处具有突变等位基因。在一些实施方案中，植物可以在FATA2和FATB基因座中的一个或两个处和在N01的QTL1和N19的QTL2中的一个或两个处以及在控制脂肪酸脱饱和酶活性的基因座(如fad2和/或fad3)处具有突变等位基因。

fad3基因编码参与亚油酸至α-亚麻酸的酶促转化的δ-15脱饱和酶蛋白质(也称为FAD3)。有几种FAD3异构型，称为FAD3A、FAD3B、FAD3C、FAD3D、FAD3E和FAD3F，分别由fad3A、fad3B、fad3C、fad3D、fad3E、fad3F基因座编码。Yadav等,Plant Pbysiol.,103:467-476(1993)，WO 93/11245和Arondel等,Science,258:1353-1355(1992)中公开了高等植物fad3基因的序列。与相应的对照植物相比，可以从植物中亚麻酸(产物)的水平降低以及在一些情况下，亚油酸(底物)的水平升高来推断FAD3活性降低，包括不存在可检测的活性。

在一些实施方案中，植物可以包含fad3A或fad3B基因座处修饰的等位基因，其中修饰的等位基因导致产生相对于相应的野生型多肽具有降低的脱饱和酶活性的FAD3A和/或FAD3B多肽。在一些实施方案中，亲本含有来自IMC02的fad3A和/或fad3B突变，其赋予低亚麻酸表型。IMC02在fad3A和fad3B基因中均含有突变，并以登录号PTA-6221保藏于ATCC。在一些实施方案中，fad3A突变体可包含a)编码具有275位处半胱氨酸取代精氨酸的FAD3A多肽的核酸，和b)编码截短的FAD3A多肽的核酸。在一些实施方案中，fad3B突变体可以包含a)在外显子-内含子剪接位点识别序列中具有突变的核酸，和b)编码截短的FAD3B多肽的核酸。

在一些实施方案中，植物可以在fad3D和/或fad3E基因座处包含修饰的等位基因，其中修饰的等位基因导致产生相对于相应野生型多肽具有降低的脱饱和酶活性的FAD3D和/或FAD3E多肽。fad3E修饰的等位基因可以包括编码截短的FAD3E多肽的核酸，编码具有影响底物特异性的残基非保守取代的FAD3E多肽的核酸，或编码具有影响催化活性的残基非保守取代的FAD3E多肽的核酸。在一些实施方案中，fad3E修饰的等位基因在剪接供体位点中包含突变。修饰的fad3E等位基因可以包括与SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。fad3D修饰的等位基因可以包括编码截短的FAD3D多肽的核酸，具有外显子或其部分缺失的核酸(例如，核酸的外显子1内缺失)。在一些实施方案中，fad3D修饰的等位基因包括与SEQ ID NO：17所示的核酸序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，植物可以包括fad3E和fad3D修饰的等位基因。

在一些实施方案中，植物可以包含δ-12脂肪酸脱饱和酶(FAD2)基因座处的修饰的等位基因。WO 98/56239中公开了来自甘蓝型油菜的野生型fad2基因(称为D型和F型)的序列。合适的fad2突变的非限制性实例包括在fad2D基因内的核苷酸316处的G至A突变，其导致HECGH模体中赖氨酸残基取代谷氨酸。在IMC129系中发现了这样的突变，其已经以登录号40811保藏在ATCC。另一种合适的fad2突变可以是fad2F基因的核苷酸515处的T至A突变，其导致KYLNNP模体中组氨酸残基取代亮氨酸(FAD2F多肽的氨基酸172)。在品种Q508中发现了这样的突变。参见美国专利号6,342,658。fad2突变的另一个实例是fad2F基因的核苷酸908处的G至A突变，其导致FAD2F多肽的DRDYGILNKV氨基酸303中谷氨酸取代甘氨酸。在Q4275系中发现了这样的突变，其已经以登录号97569保藏在ATCC。参见美国专利号6,342,658。合适的fad2突变的另一个实例可以是fad2F基因的核苷酸1001(从ATG编号)处的C至T突变，其导致异亮氨酸取代苏氨酸(FAD2F多肽的氨基酸334)。在高油酸系Q7415中发现了这样的突变。

尽管在一些实施方案中，芸苔属植物可以包含FAD3或FAD2中的突变，但是在其它实施方案中，植物不包含FAD3或FAD2突变。

确定序列同一性百分数并比较基因和蛋白质序列

如本文所用，术语“序列同一性”是指任何给定的核酸序列与目标核酸序列之间的相似性程度。相似性程度表示为序列同一性百分数。通过确定所比对核酸序列中匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以所比对核苷酸的总数目，再乘以100来计算序列同一性百分数。匹配位置是指在所比对核酸序列的相同位置发生有相同核苷酸的位置。也可以确定任何氨基酸序列的序列同一性百分数。为了确定序列同一性百分数，使用来自独立运行版本的BLASTZ(包含BLASTN 2.0.14版和BLASTP 2.0.14版)的BLAST 2 Sequences(Bl2seq)程序，将目标核酸或氨基酸序列与所鉴定的核酸或氨基酸序列进行比较。该独立运行版本的BLASTZ可以从例如美国政府的国家生物技术信息中心网站(万维网“ncbi”点“nlm”点“nih”点“gov”)获得。解释如何使用Bl2seq程序的说明可以在BLASTZ附带的自述文件中找到。

Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为了比较两个核酸序列，将选项设置如下：-i设置为包含待比较的第一核酸序列的文件(例如，C:\seql.txt)；-j设置为包含待比较的第二核酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；-p设置为blastn；-o设置为任何期望的文件名(例如，C:\output.txt)；-q设置为-1；-r设置为2；且所有其它选项都保持其默认设置。下列命令会生成包含两个序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-pblastn-o c:\output.txt-q-1-r 2。如果目标序列与所鉴定序列的任何部分有同源性，则指定的输出文件会将那些同源性区域显示为比对序列。如果目标序列与所鉴定序列的任何部分没有同源性，则指定的输出文件不会显示比对序列。

一旦比对，则通过计数来自与所鉴定序列的序列比对显示的目标序列的以任何匹配位置开始并以任何其它匹配位置终止的连续核苷酸的数目来确定长度。匹配的位置是在目标和所鉴定的序列中都显示相同的核苷酸的任何位置。由于空位不是核苷酸，因此不计数目标序列中出现的空位。类似地，由于目标序列核苷酸被计数，而不是所鉴定序列的核苷酸，所以在所鉴定的序列中显示的空位不被计数。

通过计数该长度上的匹配位置的数目并将该数目除以长度，然后将所得值乘以100来确定特定长度上的同一性百分数。例如，如果(i)500碱基的核酸目标序列与对象核酸序列比较，(ii)B12seq程序显示来自与对象序列区域比对的目标序列的200个碱基，其中该200个碱基区域的第一个和最后一个碱基匹配，和(iii)在该200个比对的碱基上匹配的数目是180，则500个碱基的核酸目标序列包含200个长度和在该长度上90％(即180/200×100＝90)的序列同一性。

应该理解的是，在单个核酸目标序列内与所鉴定序列比对的不同区域可以各自具有其各自的同一性百分数。应注意的是，同一性百分数值四舍五入到最接近的十分之一处。例如，78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入为78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入为78.2。还要注意的是，长度值会始终为整数。

杂交芸苔属品种的制备

杂交芸苔属品种可以通过防止雌性亲本植物(即，种子亲本)的自花授粉，允许来自雄性亲本植物的花粉授粉给这样的雌性亲本植物，并且允许在雌性植物上形成F₁杂交种种子来生产。雌性植物的自花授粉可以通过在花发育的早期阶段将花去雄来防止。或者，可以使用雄性不育的形式防止雌性亲本植物的花粉形成。例如，雄性不育可以是细胞质雄性不育(CMS)，核雄性不育，其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成的分子雄性不育，或由自不相容性产生。含有CMS的雌性亲本植物特别有用。CMS可以是例如ogu(Ogura)、nap、pol、tour或mur型。对Ogura型CMS的描述参见例如，Pellan-Delourme和Renard,1987,Proc.7^thInt.Rapeseed Conf.,Poznan,Poland,p.199-203和Pellan-Delourme和Renard,1988,Genome 30:234-238。对nap，pol，tour和mur型CMS的描述参见Riungu和McVetty,2003,Can.J.Plant Sci.,83:261-269。

在雌性亲本植物是CMS的实施方案中，雄性亲本植物通常含有育性恢复基因以确保F₁杂交种可育。例如，当雌性亲本含有Ogura型CMS时，使用含有可克服Ogura型CMS的育性恢复基因的雄性亲本。这样的育性恢复基因的非限制性实例包括Kosena型育性恢复基因(美国专利号5,644,066)和Ogura育性恢复基因(美国专利号6,229,072和6,392,127)。在其中雌性亲本是CMS的其它实施方案中，可以使用不含育性恢复的雄性亲本。由这样的亲本产生的F₁杂交种是雄性不育的。雄性不育杂交种种子可与雄性可育种子种植在一起，为所得雄性不育植物提供结实(seed-set)用的花粉。

本发明所述的方法可以用于形成单交(single-cross)芸苔属F₁杂交种。在这样的实施方案中，亲本植物可以作为基本同质的邻接种群生长以促进从雄性亲本植物到雌性亲本植物的天然异花授粉。通过常规手段选择性收获在雌性亲本植物上形成的F₁种子。也可以大量种植两种亲本植物，并收获在雌性亲本上形成的F₁杂交种种子和在雄性亲本上形成的种子的混合物，作为自花授粉的结果。或者，可以进行三交(three-way crosses)，其中使用单交F₁杂交种作为雌性亲本，并与满足第一次杂交雌性亲本的脂肪酸参数的不同的雄性亲本杂交。在这里，假设大量种植，植物油的总体油酸含量可以比单交杂交种降低；但鉴于两亲本在进行第二次杂交时的良好农艺性状，种子产量会进一步提高。作为另一种选择，可以建立双交(double-cross)杂交种，其中两个不同单交的F₁子代是自交的。自交不亲和性可特别有利于防止形成双交杂交种时雌性亲本的自花授粉。

本发明描述的杂交种可具有良好的农学性质并表现出杂交种优势，其导致种子产量超过用于形成F₁杂交种的任一亲本。例如，产量可以比任一或两个亲本的产量高至少10％(例如，10％至20％，10％至15％，15％至20％或25％至35％)。在一些实施方案中，产量超过自由授粉的春季卡诺拉品种的产量，如46A65(Pioneer)或Q2(University ofAlberta)。例如，产量可以比自由授粉品种的产量高至少10％(例如，10％至15％或15％至20％)。

本发明描述的杂交种可以产生具有非常低水平芥子油苷的种子(在水分含量为8.5％时<30μmol/克脱脂粉)。特别是，杂交种可以产生具有<20μmol芥子油苷/克脱脂粉的种子。如此，在一些实施方案中，杂交种可以并入赋予低芥子油苷水平的突变。参见例如美国专利号5,866,762。芥子油苷水平可根据已知技术测定，包括高效液相色谱法(HPLC)，如ISO 9167-1:1992(E)中所述，用于定量总的完整芥子油苷，以及气-液色谱法用于定量提取和纯化脱硫芥子油苷的三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物。用于测定芥子油苷水平的HPLC和TMS方法分析脱脂或无油粉。

在本发明的一些实施方案中，本发明所述用于生产卡诺拉油的芸苔属植物是通过将具有特定基因突变的亲本芸苔属繁育系与在突变基因基因座处为野生型的其它芸苔属系进行杂交并选择携带基因突变的子代来获得。例如，在一些实施方案中，有N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB、FAD3和FAD2的一个或多个中的突变的芸苔属系可以与在那些基因座上是野生型，但可能例如具有其它期望性状(如提高的产量和/或除草剂耐受性)的系杂交一次或多次。可以使用标记选择这样杂交的子代，其一方面保留允许期望的三酰甘油分布的突变，而另一方面保留除草剂耐受性突变或其它有帮助的性状。例如，在一些实施方案中，可以使用标记来选择保留N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB、FAD3和FAD2的一个或多个中的突变的杂交。在一些实施方案中，可以使用标记来选择保留N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB、FAD3和FAD2的一个或多个中的突变以及赋予除草剂耐受性突变的杂交。

在一些实施方案中，具有N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB、FAD3和FAD2的一个或多个中的突变的系可以与一个或多个高产芸苔属系，包括还具有除草剂耐受性的高产芸苔属系(如Cargill杂交种V12卡诺拉系的亲本系03LC.034和07RF543.001)杂交。在一些实施方案中，初始杂交可以与所选择的保留N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB、FAD3和FAD2的一个或多个中的突变并且任选地还保留引起或与除草剂耐受性和高产量相关的突变的高产芸苔系及子代回交一次或多次。

在一些实施方案中，得到的杂交种植物繁育系具有的产量比一个或两个亲本繁育系的产量高至少10％，如10％至15％、10％至20％、10％至25％、10％至35％、15％至20％、15％至25％、20％至25％或25％至35％。在一些实施方案中，杂交种植物繁育系具有的产量比产量最高的亲本系高至少10％，如10％至15％、10％至20％、10％至25％、10％至35％、15％至20％、15％-25％、20％-25％或25％-35％。在一些实施方案中，产量超过自由授粉春季卡诺拉品种(如46A65(Pioneer)或Q2(University of Alberta))的产量。例如，在这样的实施方案中，产量可以比自由授粉品种(如46A65(Pioneer)或Q2(University ofAlberta))的产量高至少10％，如10％至15％、10％至20％或15％至20％。

在本申请的上下文中，“产量”可以以每面积谷物重量为单位进行测量，例如以千克每平方米或千克每公顷或蒲式耳每英亩。

在本申请的上下文中，可以进行两个卡诺拉系或品种的产量比较，使得可以影响生长的参数如日光、温度、土壤条件、水分、肥料和虫害控制，杂草控制以及播种率和深度受到控制。例如，为了比较不同植物系的产量，可以使用标准随机化和重复方法(即随机完全区组设计)在相同的田间，温室或生长室内种植，生长和收获每个系或品种，因此每个基因型可以经历每类生长条件下存在的不可控变化范围。为了确定产量，在种子成熟时，可以将田收割，使收割的植物干燥，之后可以用联合收割机收获收割的植物，并测定谷物重量。

在一些实施方案中，植物可以是具有N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB、FAD3和FAD2的一个或多个中的突变的系与一个或多个高产芸苔属系，包括还具有除草剂耐受性的高产芸苔属系(如Cargill杂交种V12卡诺拉系的亲本系03LC.034和07RF543.001)之间的杂交种。例如，这样的杂交种系及其子代，还包括回交种，所具有的产量可以从高产芸苔属亲本系的产量变化不超过20％，不超过15％，不超过10％，或不超过5％。

油的制备

油可以例如由芸苔属种子制备。例如，种子可以被制成薄片并热处理，然后通过螺旋压榨机或类似装置以释放油。可以通过使粗油通过具有开槽线排水顶部的沉降槽以去除颗粒来澄清压榨操作产生的粗油。油随后可以通过板框式过滤器以去除剩余的细颗粒，得到澄清的油。压榨饼也可以用市售正己烷提取以提取额外的油。从提取过程中回收的卡诺拉油可以与来自螺旋压榨操作的澄清的油合并，得到混合的粗油。

还可以处理油以除去磷脂、金属盐、胶和游离脂肪酸。例如，可以使用脱胶程序来去除与油共同提取的磷脂。磷脂经储存可能与油分离，形成污泥，因此可能期望将其除去。可能的脱胶程序包括使用水沉淀磷脂，使用水/酸混合物，或使用酸和氢氧化钠水溶液的混合物来皂化磷脂和其它杂质如游离脂肪酸。

油，如脱胶的油还可以如在碱精炼过程中精炼。例如，在碱精炼过程中，可以使油与如0.05-0.1％的磷酸接触并剧烈混合，然后是与约12％的氢氧化钠水溶液接触，这可以中和游离脂肪酸以及任何剩余的磷酸并沉淀剩余的磷脂。由此产生包括磷脂、中和的游离脂肪酸和金属盐的含水皂相，其随后可通过离心除去。

油还可以被漂白。例如，漂白可以用来去除可能会氧化油或使其产生不期望的绿色的叶绿素化合物。在一些情况下，漂白和精炼可以在物理精炼的过程中同时进行，其中磷酸和碱处理与暴露于漂白粘土以吸附叶绿素合并。

在一些情况下，油还可以脱蜡，即除去蜡质物质。由于蜡质物质倾向于在室温下沉淀，而其它油组分保持液态，所以该过程可以帮助油在储存时保持透明。

油还可以被除臭，例如，以从种子中去除使油产生不期望的气味和味道的物质。例如，油可以被蒸汽蒸馏以去除相对易挥发的化合物。

对于一些用途，油还可以被乳化或结晶成半固体形式，如用以产生人造黄油或起酥油。

与野生型植物相比，在一些实施方案中本发明所述的油可以具有提高的氧化稳定性。根据AOCS官方方法Cd 12b-92(1993年修订)，可使用例如氧化稳定性指数仪(例如来自Omnion，Inc.，Rockland，MA)测量氧化稳定性。氧化稳定性通常以“AOM”小时表示。

卡诺拉油食品组合物和用途

本发明还提供油用于制备食品组合物和相关食品组合物的用途。例如，速溶油(instant oil)可以用于替代或减少各种食品中饱和脂肪酸和氢化油(例如部分氢化油)的量，使得食品中饱和脂肪酸和反式脂肪酸的水平降低。特别地，油可用于替代或减少加工或包装食品中的饱和脂肪和部分氢化油的量，加工或包装食品包括烘焙产品如饼干、松饼、甜甜圈、糕点(如烤面包机糕点)、馅饼馅、馅饼皮、比萨外皮、糖霜、面包、饼干和蛋糕、早餐谷物、早餐棒、布丁和薄脆饼干。

例如，本发明所述的油可用于生产夹心饼干，其在饼干和/或奶油填充物中含有减少的饱和脂肪酸，并且不含部分氢化油或部分氢化油水平降低。例如，除了卡诺拉油之外，这样的饼干组合物还可以包括面粉、甜味剂(例如糖、糖蜜、蜂蜜、高果糖玉米糖浆、人造甜味剂如三氯蔗糖、糖精、阿斯巴甜或乙酰磺胺酸钾及其的组合)、蛋、盐、调味剂(例如巧克力、香草或柠檬)、膨松剂(例如碳酸氢钠或其它烘焙酸，如一水合磷酸一钙、硫酸铝钠、酸式焦磷酸钠、磷酸铝钠、磷酸二钙、葡聚糖-δ内酯或酒石酸氢钾或其组合)和任选存在的乳化剂(例如脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯、脂肪酸的丙二醇单酯和二酯、脂肪酸的甘油-乳糖酯、乙氧基化或琥珀酰化的甘油单酯和甘油二酯、卵磷脂、二乙酰酒石酸酯或甘油单酯和甘油二酯、甘油蔗糖酯及其组合)。除了卡诺拉油之外，奶油填充物组合物还可以包括甜味剂(例如糖粉、砂糖、蜂蜜、高果糖玉米糖浆、人造甜味剂或其组合)、调味剂(例如香草、巧克力或柠檬)、盐和任选存在的乳化剂。

由于多不饱和含量，本文所述的卡诺拉油还可用于油炸应用，在一些实施方案中，多不饱和含量足够低使其具有改善的用于油炸的氧化稳定性，但又足够高以赋予被炸食品期望的油炸风味。例如，卡诺拉油可用于生产油炸食品，如小吃片(例如玉米或薯片)、炸薯条或其它速食食品。

本文所述的油还可以用于配制食品(例如谷物或小吃，如薄脆饼干)的喷涂层。在一些实施例中，喷涂层可以包括其它植物油，例如葵花油、棉籽油、玉米油或大豆油。喷涂层还可以包括抗氧化剂和/或调味剂。

本发明所述的油还可以用于制备调味品、蛋黄酱和酱汁以提供产品总饱和脂肪含量的降低。低饱和油可用作基础油来生成结构化脂肪溶液，如微波爆米花固体脂肪或卡诺拉黄油制剂。

会在下面的实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求所述的本发明的范围。

实施例

实施例1.芸苔属植物的制备和基因型

用于种子生产和随后的油分析的近交甘蓝型油菜系使用标记辅助繁育程序开发。将繁育系Salomon-05(ATCC登录号PTA-11453)和mIMC201的突变等位基因渐渗入高产低亚麻酸(C18:3)繁育系03LC.034和07RF543.001。03LC.034和07RF543.001是在加拿大注册的杂交品种V12-1的亲本。Salomon-05繁育系突变等位基因的开发和表征描述于PCT公开WO2011/075716的实施例8中。mIMC201脂肪酰基-ACP硫酯酶B(FATB)异构型中突变等位基因的开发和表征描述于WO 2011/075716的实施例4、5和6中。

将低饱和突变等位基因繁育到03LC.034和07RF543.001中以理解这些等位基因在除了其被发现的那些(即Salmon和mIMC201)以外的遗传背景中的影响。已经证明，等位基因的表型效应可以随着其被转移到在整个基因组基因座处携带可选等位基因的新遗传背景中而变化(L.Lecomte等,Theoretical and Applied Genetics,Vol.109,No.3,658-668(2004).)。也起始渐渗以了解这些低饱和等位基因和得到的低饱和表型对农艺性状的影响。先前的研究已经表明，总饱和脂肪的减少可导致较差的植物性状(Bonaventure,ThePlant Cell Vol.15,No.4,1020-1033(2003)；Cardinal等,Crop Science,Vol.47No.1,304-310(2008).)。

先前在PCT公开WO 2015/077661中描述的染色体N01和N19上的两个数量性状基因座(QTL)(下文中称为‘QTL等位基因’)，WO 2011/075716中描述的FATA2突变和在WO 2011/075716中描述的FATB突变等位基因相关的分子标记被用于辅助回交繁育程序以将这些基因座渐渗入03LC.034和07RF543.001(以下称为轮回亲本RP)。Salomon-05和mIMC201与轮回亲本杂交(见图1)。得到的F1s与轮回亲本回交两至三次(图1中的1-7代)。Salomon回交系自花授粉(9代，图1)，随后通过标记辅助选择以产生QTL等位基因和FATA2突变等位基因纯合的BC3S2种子(11代，图1)。为了合并突变等位基因，在Salomon系和mIMC201系之间进行杂交(8代，图1)。在另一代回交(10代，图1)之后，将植物自花授粉一代(12代，图1)，然后通过标记辅助选择以产生QTL等位基因，FATA2突变等位基因和FATB突变等位基因各种组合纯合的BC3S2种子(13代，图1)。最终，将表2中所述的BC3S2选择用于室中种植以产生用于以下实施例3-5的分析中的种子。

表2中列出的植物对于列出的每个突变等位基因是纯合的，除了H07/L07植物，其对于FATB2是杂合的，但对于其它列出的突变等位基因是纯合的。

表2：实验样品、谱系和基因型

实施例2.植物生长条件和油样品制备

使来自实施例1表2的植物在高(H)或低(L)温度条件下生长，收集种子用于分析。在H(高)温度室中，植物在20℃的日间温度和17℃的夜间温度下生长；对于L(低)温度室，日间温度为15℃，夜间温度为12℃。

具体而言，将种子种植于四英寸塑料盆中Premier Pro-Mix BX盆栽土壤里(Premier Horticulture,Quebec,Canada)。将种植的种子在20℃日间(16小时光照)和17℃夜晚(8小时黑暗)下，Conviron ATC60受控环境生长室中浇水并发芽(受控环境，Winnipeg,MB)。每个基因型在两个单独的生长室的每个中随机化并重复10次。在开始开花时，将一个室降低到15℃日间温度和12℃夜间温度的昼夜温度循环(低温处理，L)，而另一个室保持在20℃日间和17℃夜间的原始种植温度。植物每周浇水5次，使用20:20:20(NPK)液体肥料以150ppm比率双周施肥。将植物单独装袋以确保自花授粉和种子的遗传纯度。在生理成熟时收获种子。使用基于PCR的试验分析所有植物以确定突变等位基因的存在。

为了制备用于分析脂肪酸含量、三酰甘油分布、各种脂质类别含量和磷脂分布的样品，将约7-20g种子置于压榨室(Carver laboratory press C型)中，并压榨5分钟。将压榨的油从样品收集容器转移到琥珀小瓶中。将压榨的种子(粉)立即转移到250ml锥形瓶中，并以1:2.5的压榨的种子/正己烷比例与正己烷混合。将样品加盖并置于振荡器(TriadScientific Multi-Wrist Shaker)中，设置为在室温(例如23℃)下1小时“缓慢”的。1小时后，通过Whatman#4滤纸过滤振荡的粉混合物。合并重复瓶中的滤液，使用设定在60℃和100rpm的旋转蒸发器(Rotovapor 215，Buchi)蒸发己烷。然后合并压榨的和己烷提取的油，每个种子样品产生约3-6g油。大约1g的每个油样品被用于进一步分析程序。

实施例3.脂肪酸和三酰甘油分布分析

每个样品的总体脂质和脂肪酸组成显示在下表3a和3b中。对照样品加灰色阴影。在这些表中，TAG、DAG和MAG分别代表甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯，FFA代表游离脂肪酸，“toco”代表生育酚，和“T”代表反式脂肪酸。“Totalsats”为总饱和脂肪酸而“totaltrans”为总反式脂肪酸。

下表4显示了包含1、2或3个饱和脂肪酸(标记为“总Monosats”、“总Disats”和“总Trisats”的列)的三酰甘油(TAG)的重量百分数，包含3个不饱和脂肪酸的TAG的量“总triunsats”标准化为总TAG100％重量百分数。下表5a和5b显示了每种可检测的TAG种类的重量百分数，有上表1中给出的该种类中存在的脂肪酸缩写。显示由基因野生型芸苔属株系产生的油的行在以下两个表中都以灰色显示。注意，每个列出的TAG种类是其各异构体的总和。换言之，该方法不区分包含相同三个脂肪酸组但是其中在甘油上的不同位置(即SN₁、SN₂和SN₃位置)上发现不同脂肪酸的TAG种类。因此，例如，下表5b中的缩写“POO”包括具有一个P和两个O脂肪酸的所有TAG，而无论这些脂肪酸各自位于甘油上的哪个位置。

通过与蒸发光散射检测器(ELSD)系统(Waters Corporation)偶联的反相超高效液相色谱(Waters Corporation)，使用串联的Eclipse Plus C18RRHD2.1x 150mm，1.8微米柱(P/N959759-902，Agilent)和Eclipse Plus C18RRHD2.1×100mm，1.8微米柱(P/N 959758-902，Agilent)检测油样品中的三酰甘油。柱温保持在55℃,流动相A：甲醇和B：50:50丙酮：乙酸乙酯，流速0.5mL/分钟。

使用纯化的TAG LaLaLa、MMM、LLL、POP、SPS、SSS和OOO以及DAG 1,3-二棕榈酸甘油酯(PP)来开发校正曲线(分别地，Nu-Chek Prep，Inc.，Elysian，MN，USA，产品号T-130，T-140，T-250，T160，T225，Indofine Chemical Co.，Inc.，Hillsborough，NJ，USA，产品号34-1611和34-1810，Nu-Chek Prep号D-152)。使用C39TAG(Nu-Chek Prep号T-135)作为内标(IS)。

每个TAG种类的量基于该种类已知保留时间来测定。定量是基于多级校正曲线，其使用适当的TAG作为外标并使用油中不存在的TAG作为IS产生内标响应因子。

表4.TAG分析

ND表示没有检测到

表5a.特定TAG种类的重量百分数

ND意为没有检测到

表5b.另外的TAG种类的重量百分数

ND意为没有检测到

实施例4.油的总脂质含量

还通过具有火焰离子化检测的气相色谱(GC/FID)分析油样品的总脂质类别，结果在下表6中显示为基于总油样品脂质重量的未标准化的w/w百分数。

每类化合物(例如生育酚、甾醇等)的定量使用有合适标准品(例如a-生育酚、胆固醇等)的多级校正曲线。由于高度不饱和化合物在从GC柱洗脱所需的温度下的热分解，该分析中可能低估了TAG和DAG的量。样品量约为10毫克。硬脂酸十七烷酯(HDS)内标(IS)以1mg使用。样品用含有1％三甲基氯硅烷和吡啶的N,O,-双-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)甲硅烷基化。通过与火焰离子化检测器(FID)偶联的有非极性柱固定相(15m x0.25mm x 0.10mm df，DB^TM-5HT)的冷柱头(cool on-column，COC)气相色谱(GC)来分析三甲基硅烷(TMS)醚。温度程序为110℃(0.2min)以30℃/分钟至140℃，以10℃/分钟至340℃(13.8min)。氢气是载气，并且在恒流模式下在110℃的入口压力为6.7psi。检测器温度是370℃。FID空气流量为450mL/min，FID氢气流量为40mL/min，而补充气流量为40mL/min。

在下表6中，FFA代表游离脂肪酸，MAG代表甘油单酯，DAG/PL代表甘油二酯和磷脂，TAG代表甘油三酯，并且Toco代表生育酚。ND表示未检测到。有野生型基因型的对照样品加阴影。

表6.油的脂质组成(以非标准化百分数)

实施例5.磷脂分布分析

磷脂富集：将油样品溶解在3.0mL己烷中并施加到预调节的基于锆的固相提取(SPE)柱上。12in Hg下施加真空通过吸附剂将样品抽吸。然后用每种4mL的己烷，异丙醇和甲醇洗SPE柱。磷脂用两份1.5mL等份的含有5％氢氧化铵的甲醇洗脱。将洗脱液蒸发至干燥，并在3mL 3:1(v/v)己烷：异丙醇中重构。保留800μL重构洗脱液用于HPLC分析以使得能定量磷脂类别。

磷脂种类的分离：通过预调节的氨丙基固相提取柱抽吸剩余的约2.2mL的重构洗脱液。磷脂类别依次用下列溶剂洗脱：2:1的乙腈：2-丙醇(PC)；甲醇(PE)；4:1的异丙醇：甲醇中3M HCl(PS)；2:1的氯仿：有0.3％发烟HCl的甲醇(PI)。将洗脱液蒸发至干燥并储存直至进一步分析。

磷脂种类的定量：使用有折射率检测的Agilent Technologies HPLC柱进行定量。将洗脱液注射到150cm长的氨丙基柱上。使用52.5:47.5(v/v)的乙腈：甲醇作为流动相，以1.0mL/min的流速进行分离。使用溶于乙腈中的磷脂标准品(PC、PE、PI、PS、PA)来为每种磷脂类别创建校正曲线。在每种情况下，2.5数量级的相关系数>0.975。校正曲线在分析样品时每天运行。

FAME分析样品制备：将样品在0.75mL 3:1的己烷：甲醇中重构。向每个样品中加入1.0mL的1N甲醇KOH。将样品充分混合并置于60摄氏度的水浴中90秒。90秒后，将样品从水浴中取出并加入4.0mL饱和氯化钠。向每个样品中加入0.75mL异辛烷。样品充分混合，然后短暂离心。将顶层转移到gc小瓶中并在2摄氏度保存以待分析。

FAME分析的仪器条件：

柱：Agilent DB-23，5.0m x 180μm x 0.20μm

烘箱温度曲线：以2.5度/min 200℃至260℃

载气：氢气

注射：1μL注射体积，分流，40:1

检测：FID，检测器温度250℃

表7显示了磷脂分析的结果。在下表中，PC代表磷脂酰胆碱，PE代表磷脂酰乙醇胺，PI代表磷脂酰肌醇。每个PC，PE和PI部分中的“％SAT PL”是每个PC，PE和PI部分中发现的总脂肪酸中饱和脂肪酸的百分数。还提供用于比较的是油样品中饱和脂肪酸的重量百分数。具有野生型基因型的样品加灰色阴影。

表7显示，尽管实验样品具有比对照低的总饱和脂肪酸含量，但对照和实验样品中每个PL部分中发现的饱和脂肪酸的百分数大致相同。由于磷脂是细胞膜的关键组分，这些数据表明饱和脂肪酸含量可以显著降低，而不损坏植物种子中细胞膜的结构。

表7.磷脂分析结果

序列表

下面的表格提供本申请文本中提及的序列：

Claims (30)

1.包含三酰甘油(TAG)的卡诺拉油，其中所述油中总TAG的11-16％包含一个饱和脂肪酸和两个不饱和脂肪酸，且其中总TAG的82-88％包含三个不饱和脂肪酸，且其中总TAG的81-91％包含至少一个油酸，并且其中总TAG的7-12％包含至少一个亚麻酸。

2.权利要求1的卡诺拉油，其中所述油包含3.5％至5.5％的饱和脂肪酸，如3.5％至4.5％的饱和脂肪酸，如3.5％至4.0％的饱和脂肪酸。

3.权利要求1或2的卡诺拉油，其中所述油包含62-74％的油酸和2.5-5.0％的亚麻酸。

4.权利要求1-3中任一项的卡诺拉油，其中所述油中总TAG的11-13％包含一个饱和脂肪酸和两个不饱和脂肪酸。

5.权利要求1-4中任一项的卡诺拉油，其中所述油不含有可检测水平的包含两个或三个饱和脂肪酸的TAG。

6.权利要求1-5中任一项的卡诺拉油，其中所述油包含不超过1％的甾醇，如不超过0.5％或不超过0.4％。

7.权利要求1-6中任一项的卡诺拉油，其中所述油包含不超过0.5％的反式脂肪酸。

8.权利要求1-7中任一项的卡诺拉油，其中所述油包含不超过0.1％的生育酚，或不超过0.15％的生育酚。

9.权利要求1-8中任一项的卡诺拉油，其中总TAG的3-5％包含两个油酸和一个棕榈酸。

10.权利要求1-9中任一项的卡诺拉油，其中总TAG的1-2％包含两个油酸和一个硬脂酸。

11.权利要求1-10中任一项的卡诺拉油，其中总TAG的1-3％包含三个亚油酸。

12.权利要求1-11中任一项的卡诺拉油，其中总TAG的10-14％包含一个油酸和两个亚油酸。

13.权利要求1-12中任一项的卡诺拉油，其中所述油包含包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇的磷脂，并且其中在磷脂酰胆碱中发现的10-13％的脂肪酸是饱和的，在磷脂酰乙醇胺中发现的24-31％的脂肪酸是饱和的，和/或在磷脂酰肌醇中发现的17-30％的磷脂是饱和的。

14.权利要求1-13中任一项的卡诺拉油，其中所述油已经脱胶，经过碱或物理精炼、漂白、除臭和/或脱蜡。

15.权利要求1-14中任一项的卡诺拉油，其中所述油已经乳化或结晶，如用以产生半固态。

16.权利要求1-15中任一项的卡诺拉油，其中所述油从包含脂肪酰基-酰基载体蛋白硫酯酶A2(FATA2)基因座处突变等位基因的芸苔属(Brassica)植物的种子制备，其中所述突变等位基因导致产生相对于相应野生型FATA2多肽具有降低的硫酯酶活性的FATA2多肽。

17.权利要求16的卡诺拉油，其中所述芸苔属植物还包含染色体N01数量性状基因座1(QTL1)等位基因处的突变和/或染色体N19QTL2等位基因处的突变。

18.权利要求16或17的卡诺拉油，其中所述芸苔属植物还包含脂肪酰基-酰基载体蛋白硫酯酶B(FATB)基因座处如在FATB1、FATB2、FATB3和FATB4基因座的任意组合处的突变等位基因，其中一个或多个所述突变等位基因导致产生相对于相应野生型FATB多肽具有降低的硫酯酶活性的FATB多肽。

19.权利要求16-18中任一项的卡诺拉油，其中所述芸苔属植物还包含FAD2基因座处的突变等位基因。

20.权利要求16-19中任一项的卡诺拉油，其中所述芸苔属植物还包含FAD3基因座处如FAD3A、FAD3B、FAD3D或FAD3F基因座处的突变等位基因。

21.权利要求16-20中任一项的卡诺拉油，其中所述芸苔属植物是耐除草剂的。

22.权利要求16-21中任一项的卡诺拉油，其中所述芸苔属植物是非转基因的，或不含除草剂耐受转基因之外的转基因。

23.权利要求16-22中任一项的卡诺拉油，其中所述芸苔属植物产量超过自由授粉的春季卡诺拉品种如46A65或Q2产量至少10％，如10-15％、10-20％、15-20％、10-25％、15-25％、20-25％或10-35％。

24.权利要求16-23中任一项的卡诺拉油，其中所述芸苔属植物是具有其最高产量亲本植物系产量20％以内，如15％以内，如10％以内，如5％以内变化的产量的杂交种。

25.产生权利要求1-15中任一项的油的芸苔属植物。

26.产生权利要求1-15中任一项的油的芸苔属植物，其中所述植物为：

(a)03LC.034、Salomon和mIMC201繁育系的杂交种，其中所述植物为：

(i)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB1和FATB4的突变等位基因纯合，

(ii)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2以及FATB1、2、3和4每一个的突变等位基因纯合，或

(iii)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2以及FATB3和4的突变等位基因纯合，且FATB2的突变等位基因杂合；

或者是

(b)07RFS43.001、Salomon和IMC201繁育系的杂交种，其中所述植物为：

(i)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB1和FATB4的突变等位基因纯合，

(ii)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2、FATB3和FATB4的突变等位基因纯合，或

(iii)N01的QTL1、N19的QTL2、FATA2以及FATB1、3和4每一个的突变等位基因纯合。

27.权利要求25或26的芸苔属植物的种子。

28.从权利要求27的芸苔属种子产生权利要求1-24中任一项的油的方法，其包括：

-压榨芸苔属植物产生的种子并从压榨的种子中分离油；

-从压榨的种子中己烷提取油；和

-将从压榨的种子分离的油与从压榨的种子己烷提取的油组合以形成混合的油；并进一步

-任选地对油进行脱胶、精炼、漂白、除臭和/或脱蜡。

29.食品组合物，如从权利要求1-15中任一项的油制备的人造黄油或起酥油组合物。

30.使用权利要求1-15中任一项的油来制备权利要求29的食品组合物的方法。