CN108350038A - 用作整合脂质双层的纳米孔的蛋白质变体及其方法 - Google Patents

Abstract

本公开的主题涉及可以引入脂质膜以形成导电孔并且可以提供用于本文所述的其它用途的工程化T3或T4病毒DNA包装马达连接子蛋白。

Description

用作整合脂质双层的纳米孔的蛋白质变体及其方法

政府利益

本公开的主题是在由国家卫生研究院授予的R01EB012135号基金的政府支持下作出的。政府对本发明具有一定的权利。

相关申请

本专利申请要求2015年9月18日提交的美国专利申请号62/220,545的权益，其内容通过引证以其全整体并入本文。

技术领域

本公开的主题涉及可以引入脂质膜以形成导电孔并且可以提供用于本文描述的其它用途的工程化的T3和/或T4病毒DNA包装的马达连接子蛋白。

背景技术

DNA易位马达(translocation motor)在所有生物系统中普遍存在(1-6)。在复制期间，双链DNA(dsDNA)病毒的基因组包装到被称为前头(prohead)的预先形成的蛋白中至与晶体DNA类似的密度(7)。该过程从熵的角度是不利的并且需要强力的包装马达以完成该任务。许多dsDNA噬菌体和疱疹病毒中的包装马达的组分包括被称为连接子或门顶点(protal vertex)的蛋白质通道。其位于衣壳和ATP酶环之间。pRNA是基因组DNA包装所需的噬菌体phi29中的独特组分(8，9)。结构研究显示来自疱疹病毒和不同的有尾噬菌体，如phi29、SPPI、T4和T3的连接子享有类似的锥形十二聚体结构(图1)，即使它们的一级序列没有显示同源性。连接子蛋白在基因组包装和释放过程中起重要作用。在病毒组装期间，连接子起到马达ATP酶的对接点和dsDNA转运的管道的作用。在DNA包装后，连接子则用作尾部组分的结合位点以完成病毒粒子组装。当噬菌体开始感染时，DNA通过同轴的连接子和尾部通道释放到宿主细胞中。

近期研究表明噬菌体phi29的DNA易位酶使用“通过单向阀的循环”(10-12)而不是旋转(13)来包装DNA，而T4使用“扭转压缩”机制(14，15)。由于通道像单向阀一样作用，明显的问题是如果通道是单向向内的阀，则在感染过程中dsDNA如何释放。上述研究揭示了未能解释的现象，在DNA酶消化后，在phi29和T3中，包装中间体或不完全包装的DNA总是显示出三条主带(16，17)。之前的研究已表明在DNA包装和释放过程中，连接子进行构象变化。例如，研究之一显示由DNA、pRNA或二价金属离子引起phi29连接子的构象变化，如通过圆二色谱和内源色氨酸荧光的淬灭所显示(18，19)。低温EM还显示出游离的体外连接子和感染性病毒粒子中的连接子的构象变化(20)。然而，这些研究都没有显示出在单分子水平上构象变化。

纳米孔技术是具有用于多种应用，包括检测小分子、大分子、分子结合、蛋白折叠和DNA测序的潜力的新兴领域(21-28)。已将再工程化的phi29 gp10连接子插入脂质双层，其显示出可以经受各种溶液条件，包括pH 2-12，和0.1-3M NaCl或KCl的离子强度的高度稳健的性质(29，30)。连接子通道向脂质膜的插入导致了电流均匀的步进增加，并且通道在正和负电压下显示出相等的电导(29)。通过在通道内部或末端引入适当的探针，可以基于电流特征检测超低浓度的单种化学品或单种抗体(31，32)。通道允许dsDNA易位(10，11，29，33-36)并且能够区别具有适当修饰的ss-DNA和RNA(34)。此外，phi29连接子通道在DNA包装中显示出具有阀门机制的对dsDNA易位的单向通行性质(10，11)和电压引起的通道门控(gating)(35)。对噬菌体T3、T4、SPPI和Phi29的DNA易位酶常见的通道构象变化的发现支持了单向流入通道在DNA释放过程期间被转换为流出通道的观察。

发明内容

在研究了本文档中所提供的信息之后，对本领域普通技术人员显而易见的，本公开的主题满足了上述需求中的一些或全部。

本发明内容描述了本公开的主题的一些实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变化和更换。本发明内容仅是多种实施方式的示例。提及给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这种实施方式通常可以在具有或不具有所提及的特征的情况下存在；同样地，那些特征可以应用于本公开的主题的其它实施方式，无论其是否在本发明内容中列出。为了避免过度重复，本发明内容没有列出或表明这些特征的所有可能组合。

在一些实施方式中，本公开的主题提供了编码T3或T4病毒连接子多肽变体的工程化核酸分子。在一些实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸序列包含SEQ ID NO：1的序列。在一些实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO：4具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸序列包含SEQ ID NO：3的序列。

在本发明所提供的主题的一些实施方式中，还提供了工程化的T3或T4病毒连接子多肽变体。在一些实施方式中，多肽变体包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，病毒连接子多肽变体包含与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，病毒连接子多肽变体包含具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列的氨基酸序列。在一些实施方式中，病毒连接子多肽变体包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列。

在本公开的主题的一些实施方式中，还提供了含有人工导电通道的电压门控的膜复合物。在一些实施方式中，膜包含膜层和分离的DNA包装马达连接子蛋白，其引入膜层以形成当跨膜施加电势时，通过其可以发生导电的孔。在一些实施方式中，DNA包装马达连接子蛋白包含病毒DNA包装马达连接蛋白多肽亚基的均十二聚体。在一些实施方式中，亚基包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，病毒DNA包装马达连接子蛋白多肽亚基包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，病毒DNA包装马达连接子蛋白多肽亚基包含SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4阐述的序列。

权利要求9的膜，其中病毒DNA包装马达连接子蛋白多肽亚基由包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸分子编码。在一些实施方式中，亚基还包含亲和/对齐域。在一些实施方式中，亲和/对齐域包含以下多肽：(i)Strep-11标签序列WSHPQRFEK；(ii)3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续组氨酸残基的聚组氨酸多肽；(iii)3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续精氨酸残基的聚精氨酸多肽；(iv)序列YGRKKRRQRR所示的HIV Tat多肽，和(v)序列DRATPY所示的肽标签。在一些实施方式中，当施加电势时，膜通过孔易位双链DNA。在一些实施方式中，当施加电势时，在含导电通道的膜中以电压门控发生导电。在一些实施方式中，施加的电势大于约100mV。在一些实施方式中，电势大于约125mV、大于约150mV、大于约175mV、大于约200mV、大于约225mV、大于约250mV、大于约275mV、大于约300mV。在一些实施方式中，施加的电势小于约-100mV。在一些实施方式中，所施加的电势小于约-125mV、小于约-150mV、小于约-175mV、小于约-200mV、小于约-225mV、小于约-250mV、小于约-275mV、小于约-300mV。在一些实施方式中，膜层包含脂质层。在一些实施方式中，脂质层包含两亲性脂质。脂质层的非限制性实例包括平面膜层和脂质体。在一些实施方式中，两亲性脂质包含磷脂，并且脂质层包含脂质双层。在一些实施方式中，脂质体包括(但不限于)多层脂质体和单层脂质体。在一些实施方式中，引入的病毒DNA包装马达连接子蛋白在膜层中是可移动的。

在一些实施方式中，本公开的主题提供了使用如本文所公开的含有导电通道的膜感应分子的方法。方法包括将分子与包含膜层并在其中引入了一个或多个分离的病毒DNA包装马达连接子蛋白的含导电通道膜接触，施加电势，和检测电流变化，其中电流变化是不连续的3步变化。在一些实施方式中，不连续的3步电流变化为每步约33％、约66％和99％的减少。在一些实施方式中，电势大于约100mV。在一些实施方式中，电势小于约-100mV。在一些实施方式中，分子为多肽。在一些实施方式中，分子为核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子为双链核酸分子。在一些实施方式中，本公开的主题还提供了使用本文公开的含导电通道的膜的DNA测序的方法。

附图说明

在所附权利要求中详细阐述了本发明的特征。通过参考阐述其中使用了本发明原理的说明性实施方式的以下详细说明以及附图，将获得对本发明的特征和优势的更好地理解。附图最初以彩色公开，其以其全部内容通过引证并入(Wang,S.et al,Three-stepchannel conformational changes common to DNA packaging motors of bacterialviruses T3,T4,SPPI,and Phi29,Virology.2016 May 12.pii:S0042-6822(16)30073-3.doi:10.1016/j.virol.2016.04.015)。本申请的黑白附图对应于所发表的彩色附图。

图1显示了结构T4和T3连接子通道。由于不可获得T3和T4的晶体结构，绘制了示意图。

图2包括显示考马斯亮蓝染色的10％SDS-PAGE的图像，显示了T4(60kDa)和T3(59kDa)连接子通道的单个亚基的分子量差异。

图3A显示了代表性电流描绘线，其示出T4连接子通道向平面脂质膜中的插入。施加的电压：50mV；导电缓冲液：1M KCl，5mM HEPES，pH 7.8。

图3B显示了代表性电流描绘线，其示出T3连接子通道向平面脂质膜中的插入。施加的电压：50mV；导电缓冲液：1M KCl，5mM HEPES，pH 7.8。

图4A显示了柱状图数据，其示出T4连接子通道的电导分布。施加的电压：50mV；导电缓冲液：1M KCl，5mM HEPES，pH 7.8。电导值报告为来自三个独立实验的平均值±标准偏差。

图4B显示了柱状图数据，其示出T3连接子通道的电导分布。施加的电压：50mV；导电缓冲液：1M KCl，5mM HEPES，pH 7.8。电导值报告为来自三个独立实验的平均值±标准偏差。

图5显示了T4(一个通道)和T3(三个通道)连接子在渐升电势(-50mV至50mV；2.2mv/s)下的电流-电压描绘线。导电缓冲液：1M KCl，5mM HEPES，pH 7.8。

图6显示了在正跨膜电压下与T4和T3连接子通道的构象变化相关的三步门控。

图7显示了在负跨膜电压下与T4和T3连接子通道的构象变化相关的三步门控。

图8A显示了Phi29门通道结构的俯视图、侧视图和单个亚基。

图8B显示了SPPI门通道结构的俯视图、侧视图和单个亚基。

图8C显示了T4门通道结构的俯视图、侧视图和单个亚基。

图9A给出了代表性电流描绘线，其示出phi29门通道向平面脂质膜中的插入。

图9B给出了代表性电流描绘线，其示出SPPI门通道向平面脂质膜中的插入。

图9C给出了代表性电流描绘线，其示出T4门通道向平面脂质膜中的插入。

图9D给出了代表性电流描绘线，其示出T3门通道向平面脂质膜中的插入。

图9E给出了柱状图，其示出phi29门通道的电导分布。

图9F给出了柱状图，其示出SPPI门通道的电导分布。

图9G给出了柱状图，其示出T4门通道的电导分布。

图9H给出了柱状图，其示出T3门通道的电导分布。

图9I显示了phi29(单个通道)门在渐升电势(-50mV至+50mV；2.2mv/s)下的电流-电压描绘线。

图9J显示了SPPI(两个通道)门在渐升电势(-50mV至+50mV；2.2mv/s)下的电流-电压描绘线。

图9K显示了T4(一个通道)门在渐升电势(-50mV至+50mV；2.2mv/s)下的电流-电压描绘线。

图9L显示了T3(三个通道)门在渐升电势(-50mV至+50mV；2.2mv/s)下的电流-电压描绘线。

图10A显示了在正跨膜电压下与phi29门通道的构象变化相关的三步门控。

图10B显示了在正跨膜电压下与SPPI门通道的构象变化相关的三步门控。

图10C显示了在正跨膜电压下与T4门通道的构象变化相关的三步门控。

图10D显示了在正跨膜电压下与T3门通道的构象变化相关的三步门控。

图10E显示了在负跨膜电压下与phi29门通道的构象变化相关的三步门控。

图10F显示了在负跨膜电压下与SPPI门通道的构象变化相关的三步门控。

图10G显示了在负跨膜电压下与T4门通道的构象变化相关的三步门控。

图10H显示了在负跨膜电压下与T3门通道的构象变化相关的三步门控。

图11是考马斯亮蓝染色的10％SDS-PAGE，其示出phi29(36kDa)、SPPI(56kDa)、T4(60kDa)和T3(59kDa)门通道的单个亚基的分子量差异。

图12显示了T4 gp20连接子通道的单个通道插入。

图13显示了T4 gp-20连接子通道的多个插入。

图14显示了T4连接子的TAT肽易位。

图15显示了T4连接子肽易位。

图16显示了肽通过T4 gp20的易位。

图17显示了肽通过T3连接子的易位。

图18显示了通过T3连接子的肽易位的阻断。

图19显示了通过T3连接子的肽易位的单向通行。

序列表说明

SEQ ID NO：1是本公开的主题中使用的T3突变体连接子序列的核酸序列。

SEQ ID NO：2是本公开的主题中使用的T3突变体连接子序列的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是本公开的主题中使用的T4 gp-20突变体连接子序列的核酸序列。

SEQ ID NO：4是本公开的主题中使用的T4 gp-20突变体连接子序列的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明公开在下文中包括部分1(其包括上述的引言、图1-8、图13-27的描述以及序列表的描述)和部分2(其包括上述图9-12的描述)。

部分1

在本文档中阐述了本公开的主题的一个或多个实施方式的详细信息。在研究本文档所提供的信息之后，对本文档中描述的实施方式和其它实施方式的修改对于本领域普通技术人员是显而易见的。本文档中所提供的信息，特别是描述的示例性实施方式的具体细节主要出于清楚理解而提供，并且不应从其中理解出不必要的限制。在矛盾的情况下，将以本文档的说明书(包括定义)为准。

在一些实施方式中，本公开的主题包括编码T3或T4连接子多肽变体的核酸分子。T3或T4连接子多肽变体包含分别与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的序列具有至少90、91、92、93、94、95、96、97或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸分子编码T3或T4连接子多肽变体，其包含分别在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，核酸分子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的序列。

可以将核酸或多肽序列与另一序列比较，并在其序列同一性百分比方面描述。在计算序列同一性百分比时，对齐两条序列并确定两条序列之间的核苷酸或氨基酸残基的相同匹配的数目。将相同匹配的数目除以对齐区域的长度(即，对齐的核苷酸或氨基酸残基的数目)并乘以100以获得序列同一性百分比值。应理解，对齐区域的长度可以是一条或两条序列的一部分，上至最短序列的全长大小。应理解，单个序列可以与其它序列不同地对齐，因此可以在每个对齐区域上具有不同的序列同一性百分比值。应注意，同一性百分比值通常四舍五入至最接近的整数。

使用Altschul等人(1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)描述的，如引入在万维网上在ncbi.nlm.nih.gov中可获得的BLAST(基本局部比对搜索工具)程序的算法来执行两条或更多条序列的比对以确定序列同一性百分比。使用Altschul等人的算法，可以进行BLAST搜索以确定第一核酸与对齐的任何其它序列或其部分之间的序列同一性百分比。BLASTN是用于对齐和比较核酸序列之间的同一性的程序，而BLASTP是用于对齐和比较氨基酸序列之间的同一性的程序。当使用BLAST程序计算本文所公开的序列(例如，SEQ ID NO：1-4)和另一序列之间的同一性百分比时，使用相应程序的默认参数。

表1

保守氨基酸取代

通过已知方法进行修饰，包括取代、插入或删除。举例来说，通过编码蛋白质的DNA中的核苷酸的位点特异性突变进行修饰，由此产生编码该修饰的DNA，然后在重组细胞培养中表达DNA。在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行取代突变的技术是熟知的。

在一些实施方式中，本公开的主题还包括含导电通道的膜，其包含(a)膜层；和(b)引入膜层以形成当跨膜施加电势时，通过其可以发生导电的孔的T3和/或T4连接子多肽变体，其中T3和/或T4连接子多肽变体选自本文所公开的那些。

本文描述的实施方式在多种分子分析背景中具有用途，包括(例如)用于生物医学、临床、工业、化学、制药、环境、法医、国家安全、毒理学和其它目的的化学和生物化学分析物的敏感检测和表征，包括可能期望分析物(例如，优选地，以溶液提供的可溶性分析物)的快速、特异性和精确的敏感检测和/或表征的任何情况。明确考虑了其中本公开的组合物和方法用于DNA测序的实施方式，包括dsDNA测序、高通量DNA测序、基因组学、SNP检测、分子诊断及其它DNA测序应用以及多肽检测和鉴别。其它用途包括国际专利申请公开号WO2010/062697中的那些，其通过引证以其全部内容并入本文。

因此，示例性分析物包括核酸，如DNA和RNA(包括dsDNA和dsRNA)，包括其用于检测和鉴定这些核酸中的单核苷酸多态性(SNP)和/或突变，和/或核酸序列测定。可以使用本文描述的组合物和方法检测和/或鉴定的其它示例性分析物包括多肽及其它生物聚合物(例如，蛋白质、糖蛋白、肽、糖肽、寡糖、多糖、脂质、糖脂、磷脂等)及其它生物分子(例如，可溶性介体、辅因子、维生素、生物活性脂质、代谢产物等)、药物及其它药学和药理学试剂，包括天然和合成的化合物，食品和化妆品试剂，如调味剂、气味剂、防腐剂、抗氧化剂、抗微生物剂、稳定剂、载体、赋形剂、改性剂等，天然和合成的毒素、染料及其它化合物。

因此并且在某些实施方式中，可以使用期望检测和/或表征的任何分析物，其中从本文的公开中认识到分析物优选地可溶于溶剂，溶剂不损害其中引入T3和/或T4连接子多肽变体以形成当跨膜施加电势时，可以通过其发生导电的孔的特定膜层的完整性。因此，分析物的选择可以随所使用的特定膜层的组成而变化，因此其可以影响溶剂选择。本领域技术人员熟悉用于选择与任何特定组成的膜层相容的溶剂的标准。在优选的实施方式中，膜层包含磷脂双层，并且其中提供分析物的溶剂包括水性溶剂，例如包含水的溶剂。

在含导电通道的膜的一些实施方式中，膜层包含脂质层。在进一步的实施方式中，脂质层包含两亲性脂质，其在某些其它实施方式中包含磷脂，并且脂质层包含脂质双层。在某些其它实施方式中，脂质层选自平面膜层和脂质体。在某些实施方式中，脂质体选自多层脂质体和单层脂质体。在某些其它实施方式中，引入的T3和/或T4连接子多肽变体在膜层中是可移动的。在某些其它实施方式中，当施加电势时，含导电通道的膜能够使双链DNA通过孔易位。在某些其它实施方式中，当施加电势时，含导电通道的膜能够使多肽通过孔易位。在某些实施方式中，当施加电势时，在无电压门控的情况下发生导电。在一些实施方式中，编码如本文所公开的T3或T4病毒连接子多肽变体的工程化核酸分子可以组装为T3或T4DNA包装马达连接子蛋白，并且将T3和T4马达连接子引入脂质膜层。在T3或T4病毒连接子多肽的更严重的突变中，T3或T4马达连接子的结构不能在脂质膜层中组装成正确的形式。

在一些实施方式中，T3和/或T4连接子多肽变体包含可检测标记。在一些实施方式中，可检测标记选自由比色指示剂、GCMS标签化合物、荧光指示剂、冷光指示剂、磷光指示剂、辐射指示剂、染料、酶、酶的底物、能量转移分子、量子点、金属颗粒和亲和标记组成的组。

尽管认为本文所使用的术语是本领域普通技术人员熟知的，但是描述了某些定义以有利于解释本公开的主题。

除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学名词的含义与本发明所属领域中技术人员通常理解的含义相同。

除非另外说明，否则所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站以及在本文全部公开中所提及的其它公开材料通过引证以其全部内容并入本文。

在提及URL或其它此类标识符或地址时，应理解这些标识符可以改变，并且因特网上的特定信息可以随时变化，但是可以通过搜索因特网找到等价的信息。对其的参考证明了这种信息的可获得性和公开传播。

如本文所使用的，除非另外说明，任何保护基团、氨基酸和其它化合物的缩写符合它们的常用用法、公认缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会的规定(参见Biochem.(1972)11(9):1726-1732)。

尽管与本文的那些相似或等同的任何方法、装置和材料可以用于本公开的主题的实践或测试，但是本文描述了代表性的方法、装置和材料。

在某些情况下，本文所公开的核苷酸和多肽包括在公众可获得的数据库中，如和SWISSPROT。包括序列的信息以及与包含在这些公众可获得的数据库中的这些核苷酸和多肽有关的其它信息明确通过引证并入本文。除非另外说明或是显而易见的，否则对这些公众可获得的数据库的提及是对截止到本发明申请提交日期时的数据库最新版本的提及。

本发明申请可以“包括”(开放式)本发明的组分以及本文描述的其它成分或要素或“基本由它们组成”。如本文所使用的，“包括”是开放式的，并且表示所列举的要素或其结构或功能的等价物加上未列举的任何其它要素。除非上下文中另有所示，否则术语“具有”和“包含”也应被视为开放式的。

根据长期以来的专利法惯例，当在本发明申请，包括权利要求中使用时，术语“一个”、“一种”和“该”是指“一个或多个”。因此，例如，对“细胞”的提及包括多个这些细胞等。

除非另有说明，在说明书和权利要求中使用的表示成分的量、性质，如反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在本说明书和权利要求中描述的数值参数是近似值，其可以根据通过本公开的主题设法获得的所期望的性质而变化。

如本文所使用的，当涉及数值或质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，术语“约”在一些实施方式中表示涵盖了指定量的±20％的变化，在一些实施方式中±10％，在一些实施方式中±5％，在一些实施方式中±1％，在一些实施方式中±0.5％，并且在一些实施方式中±0.1％，照此这些变化对于实施所公开的方法是适合的。

如本文所使用的，范围可以表示为“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。还应理解存在一些本文所公开的值，并且除了该值本身外，每个值也在本文中作为“约”该具体值公开。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解还公开了两个具体单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15,则还公开了11、12、13和14。

如本文所使用的，“可选的”或“可选地”表示随后描述的事件或情况的会发生或不会发生，并且该描述包括其中所述事件或情况发生的情况以及其不发生的情况。例如，可选地变体部分表示该部分是变体或非变体。

尽管与本文的那些相似或等同的任何方法、装置和材料可以用于本公开的主题的实践或测试，但是现将描述代表性方法、装置和材料。

通过以下具体但非限制性实施例进一步说明了本公开的主题。以下实施例可以包括代表在与本发明有关的开发和实验过程中的不同时间收集的数据的数据汇编。

本公开的主题涉及工程化的DNA包装马达蛋白连接子及使用其的方法。更具体地，本公开的主题涉及用于DNA易位及其它应用的，可以引入脂质膜以形成导电孔的工程化DNA包装马达蛋白连接子。

本公开的主题包括选自T3和T4连接子通道蛋白的分离的含导电通道的膜，通道蛋白相对于野生型包含一个或多个氨基酸突变和/或缺失和/或插入。

本公开的主题还包括膜，其包括脂质双层膜，和引入膜层以形成当跨膜施加电势时通过其可以发生导电的孔的分离的DNA包装马达连接子蛋白。在一些实施方式中，在含导电通道的膜中，DNA包装马达连接子蛋白为T3和/或T4连接子通道蛋白。在一些实施方式中，T3和/或T4连接子通道蛋白相对于野生型包含一个或多个氨基酸突变和/或缺失和/或插入。

在一些实施方式中，T3和/或T4连接子通道蛋白包含病毒DNA包装马达连接蛋白多肽亚基的均十二聚体。在一些实施方式中，均十二聚体的亚基包含亲和/对齐域。在一些实施方式中，亲和/对齐域包含以下多肽：(i)Strep-11标签，(ii)3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续组氨酸残基的聚组氨酸多肽，(iii)3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续精氨酸残基的聚精氨酸多肽，(iv)序列YGRKKRRQRR的HIV Tat多肽，或(v)序列DRATPY的肽标签。

在一些实施方式中，病毒DNA包装马达连接子蛋白多肽的均十二聚体的每个亚基包含T4 DNA包装马达连接子蛋白多肽的全部的或跨膜孔形成部分的多肽。在具体的实施方式中，每个亚基包含SEQ ID NO：4的多肽。在具体的实施方式中，每个亚基包含SEQ ID NO：3的多肽。在一些实施方式中，当施加电势时，膜能够使双链DNA通过孔易位。

在本公开的主题的一些实施方式中，还提供了制备含导电通道的膜的方法。方法包括以下步骤：(a)通过将包含两亲性脂质和有机溶剂的第一溶液与固体基底接触，并基本除去溶剂，在固体基底上制备干燥的两亲性脂质；和(b)在包含水性溶剂、渗透剂和能够自组装成均十二聚体病毒DNA包装马达连接子蛋白的多个分离的病毒DNA包装马达连接子蛋白亚基多肽的第二溶液中将干燥的两亲性脂质再悬浮，以获得包含脂质双层的膜，在其中在足以使所述连接子蛋白形成当跨膜施加电势时通过其可以发生导电的孔的条件和时间下引入病毒DNA包装马达连接子蛋白，并由此制备含导电通道的膜。

更进一步，在一些实施方式中，本公开的主题提供了在含导电通道的膜的一侧浓缩核酸分子的方法。

方法包括以下步骤：(a)通过包括以下的方法制备含导电通道的膜：(i)从包含两亲性脂质和至少一种溶剂的混合物中基本除去溶剂以获得干燥的两亲性脂质；和(ii)在包含水性溶剂、渗透剂和能够自组装成均十二聚体病毒DNA包装马达连接子蛋白的多个分离的病毒DNA包装马达连接子蛋白亚基多肽的第二溶液中将干燥的两亲性脂质再悬浮，以获得包含脂质双层的膜，在其中在足以使所述连接子蛋白形成当跨膜施加电势时通过其可以发生导电的孔的条件和时间下引入病毒DNA包装马达连接子蛋白，并由此制备含导电通道的膜；和(b)在足以使核酸通过连接子蛋白的孔电泳易位的条件和时间下，使(a)的含导电通道的膜与一个或多个核酸分子接触并跨膜施加电势，并由此在含导电通道的膜的一侧浓缩核酸分子。

通过以下具体但非限制性实施例进一步说明了本公开的主题。以下实施例中的一些是预示性的，尽管在实施例中提及并包含了数值、结果和/或数据。

实施例

DNA易位酶，细胞、细菌和病毒中的一类生物马达，对于细胞过程如DNA复制、DNA修复、同源重组、细胞有丝分裂、细菌二分裂、霍利迪连结体(Holliday junction)分析、病毒基因组包装、RNA转录和核孔转运是必不可少的。双链DNA病毒的DNA易位酶的通道允许病毒基因组DNA在病毒成熟期间进入蛋白前衣壳并在宿主感染期间离开。最近表明噬菌体phi29的DNA易位酶使用“通过单向阀循环”，而T4使用“扭力压缩”的机制。这提出了如果通道作用为单向内的阀，则在感染期间如何释放dsDNA的问题。此处我们报道了对于噬菌体T3和T4的DNA易位酶常见的门通道的三步构象变化的发现。这些马达的所有通道实行三个不连续步骤的门控，其中每个步骤导致每步通道尺寸减小33％，如通过单通道电生理学测定所揭示的。这些发现得出结论，门控的三个步骤是由于通道构象变化的三个步骤导致，这与由量化的DNA包装中间体所产生的三个主要条带的先前出版物一致。这支持以下推测：DNA包装过程期间的单向流入通道在DNA释放过程期间被转换为流出通道。该发现将导致在不旋转的情况下，使用循环机制由马达轻微扭转dsDNA。

材料和方法

材料和试剂

磷脂、1,2-二植烷酰基-sn甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)(Avanti Polar Lipids)、正癸烷(Fisher)、氯仿(TEDIA)按供应商的说明使用。如果没有指明，所有其它试剂均来自Sigma。脂质A：5％(wt/vol)DPhPC在己烷中。脂质B：20％(wt/vol)DPhPC在癸烷中。His结合缓冲液：15％甘油、0.5M NaCl、5mM咪唑、10mM ATP、50mM Tris-Cl、pH 8.0。His清洗缓冲液：15％甘油、500mM NaCl、5mM咪唑、10mM ATP、50mM Tris-Cl、pH 8.0。His洗脱缓冲液：15％甘油、500mM NaCl、500mM咪唑、50mM ATP、50mM Tris-Cl、pH 8.0。

T3和T4连接子的表达和纯化

合成编码T3连接子蛋白的基因gp8(Genescript)，然后将其单独克隆至pET3c载体中Ndel和BamHl之间。将6×His标签插入C末端用于纯化。将内含gp8的质粒pET3c单独转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，并将单个菌落在10mL Luria-Bertani培养基(LB)中在37℃下培养过夜。然后，将培养的细菌转移到1L新鲜LB培养基中。当OD600达到0.5-0.6时，将0.5mM IPTG加入至培养基以诱导蛋白质表达。培养3小时后，通过在6000×rpm下离心15分钟收集细胞，将颗粒用His结合缓冲液再悬浮。通过传送通过弗氏压碎器(French press)裂解细菌，在12000×rpm下离心20分钟后收集透明上清液并加载至树脂柱。在从树脂柱清洗几轮后，用His洗脱缓冲液洗脱T3连接子蛋白。

从T4基因组扩增编码连接子蛋白的T4 gp20基因，并在NdeI位点和BamHI位点将其克隆至pET3c载体(Keyclone)。还在C-末端引入6×His-标签用于纯化。由于其疏水性，T4连接子易于聚集。由先前的出版物(38)修改表达和纯化程序。将内含gp20的质粒pET3c转化至大肠杆菌HMS 174(DE3)，并将单个菌落在10mL LB培养基中在37℃下培养过夜。然后，将培养的细菌转移至1L新鲜LB培养基并培养至OD达到0.5-0.6。然后，加入0.5mM终浓度的IPTG以诱导T4连接子表达，并将培养物变为18℃并继续过夜。通过在6000×rpm下离心15min收获细胞，并将其在His结合缓冲液中再悬浮。通过传送通过弗氏压碎器裂解细菌。在12000×rpm下离心20分钟后收集细胞颗粒，并用含有1％N-月桂酰肌氨酸的His结合缓冲液再悬浮20min。在12000×rpm下离心1小时后收集上清液，并加载至树脂柱，在几轮清洗后洗脱。通过10％SDS-PAGE凝胶验证所有最终蛋白产物。

含有连接子的脂质囊泡的制备

按照先前发表的程序(29，37)，制备所有连接子/脂质体复合物。简要地，将0.5ml的氯仿中的1mg/ml DPhPC加入至圆底烧瓶，并使用旋转蒸发器(Buchi)在真空下蒸发氯仿。将干燥的脂质膜用含有250mM蔗糖的0.5ml连接子蛋白溶液补水。通过将脂质溶液挤出通过400nm聚碳酸酯膜过滤器(Avanti Polar Lipids)获得单层脂质囊泡。

连接子插入到平面脂质双层中

先前已报道了用连接子重组的脂质体向脂质双层的插入(29，37)。简要地，使用具有200μm孔的薄特氟隆隔板将双层脂质膜(BLM)室分成顺式和反式隔室。用己烷中的5％(wt/vol)DPhPC预涂孔。使顺式和反式隔室充满导电缓冲液，1M KCl、5mM HEPES，pH 7.8。然后使用正癸烷中的20％(wt/vol)DPhPC形成脂质双层。在确认形成脂质双层后，将连接子/脂质体复合物加入至顺式隔室以与平面脂质双层融合，从而形成膜包埋的纳米孔。

电生理学测量

使用插入两个隔室的一对Ag/AgCl电极测量跨BLM的电流描绘线。使用连接至BLM工作站(Warner Instruments)或Axon DigiData 1440A模拟数字转换器(AxonInstruments)的Axopatch 200B膜片钳放大器记录电流描绘线。报告的所有电压为反式隔室的那些。以5kHz或1KHz的频率低带通过滤数据，并以2KHz的采样频率采集。使用PClamp9.1软件(Axon Instruments)收集数据，并使用软件Origin Pro 8.0用于数据分析。

结果

连接子的克隆、表达和纯化

将6×His标签插入T4和T3连接子通道的C-末端以帮助纯化。在连接子和His标签之间引入6×氨基酸甘氨酸接头以提供末端灵活性。由于其疏水性，T4连接子显示出强聚集倾向。因此，将1％N-月桂酰肌氨酸表面活性剂加入至纯化缓冲液以溶解蛋白质(38)。纯化至均一后，在10％SDS-PAGE上测试蛋白质。T4和T3连接子的单个蛋白质亚基分别对应于60kDa和59kDa的预测分子量(图2)。

EM研究显示T4连接子作为十二聚体环存在，其轮廓尺寸为14nm长和7nm宽，并且通道内部直径为约～3nm(43)；然而，目前没有可获得的晶体结构。一些研究显示T3连接子蛋白作为12和13个亚基的混合群体存在。这两种寡聚物状态的百分比在每个培育生长中是不同的，表明连接子蛋白的组装取决于表达条件及其它因素(44-46)。EM研究显示T3连接子的三维结构为：外径14.9nm；高度8.5nm；内部开放通道平均3.7nm(44)。

将连接子通道插入脂质膜用于使用使用电导测量确定通道尺寸

为了将T4和T3连接子引入平面脂质双层，我们采用了两步程序：连接子在脂质体中的重组，随后将蛋白脂质体融合至平面脂质双层以形成膜包埋的连接子，如先前描述的(29)。以固定电压测量每个通道插入的电流跳跃以确定T3和T4连接子通道的通道尺寸(图3A，图3B)。使用相同的缓冲液，1M KCl、5mM HEPES，pH 7.8，在50mV施加的电势下进行实验。T4的通道电导(得出自测量的电流跳跃与施加的电压的比值)确定为4.52±0.33nS、4.10±0.22nS和3.03±0.37nS(图4A)。T3电导分布表现为两个峰值：2.65±0.31nS和3.90±0.38nS(图4B)。

在扫描电压(-50mV至50mV；2.2mv/s)下，T4和T3连接子通道均显示出线性的电流-电压(I-V)关系而无电压门控现象(图5A，图5B)。当施加100mV时，T4和T3连接子通道保持稳定，未显示出电压门控。

连接子通道的三步门控

当施加更高电压(>100mV)时，在全部4个连接子通道中观察到通道的构象变化的三个不连续步骤。通道的构象变化反映于第一、第二和第三步电流分别减小33％、66％和99％(图6A，图6B)。在施加170mV和150mV正电压时，观察到T4和T3连接子通道的三个不连续步骤的门控(图6A，图6B)。在-175mV和-125mV的负电压下，观察到了类似的现象(图7A，图7B)。这些是门控的通道所需的最小电压。

通道门控和量化DNA包装或释放之间步骤的比较

使用不同方法的病毒DNA包装或释放的先前研究通过分析不同噬菌体中不完全包装的DNA的长度显示了DNA的量化包装(16，17)。这种量化的DNA包装现象已是长久以来的难题。在本发明中，我们尝试将先前无法解释的量化包装数据与我们对构象变化的新发现相联系。

讨论

通过循环机构而不旋转，dsDNA噬菌体的所有连接子通道显示出左旋通道壁以有利于dsDNA易位至预组装的蛋白质壳体时的单向通行(11，47-49)。这提出了如果通道是单向向内的阀，则如何释放dsDNA进入感染细胞的问题。先前已报道了通道的构象变化(20，35)。例如，已表明通过DNA、pRNA或二价金属离子引起phi29连接子的构象变化，如通过圆二色谱和内源色氨酸荧光淬灭所显示的(18，19)。在我们当前的研究中，观察到了T4和T3连接子的三步构象变化。这种构象变化允许在DNA包装完成后左旋连接子向相反的构型的转化，从而有利于DNA单向释放到宿主细胞中用于感染。在Phi29晶体结构中，连接子亚基显示出左旋30°扭转(49，50)。低温EM还显示出游离的体外连接子和DNA填充的病毒粒子中的连接子之间的构象差异(20)。据报导当视作刚性体时，连接子晶体结构不符合低温EM密度图中的连接子，如由低至0.55的相关系数所示。手动调节后，相关系数改善至0.70，导致连接子向连接子轴旋转10°(20)。还在其它噬菌体系统中报道了连接子的构象变化(41，51-55)。发现在DNA填充的衣壳中N末端外部区域经历了显著的构象改变(20)。推断通过Phi29 DNA及其结构性蛋白质之间的相互作用促进了连接子核亚基的角旋转和重构(20)。由于dsDNA与连接子通道壁之间的结合和对齐(47，48，50，56，57)以及内部较宽的C末端区域相对稳定的性质，当从C末端向N末端观察时，外部较窄的N末端区域中显著的构象改变可以导致dsDNA的顺时针旋转。如以上证明的(20)，如果N末端外部区域的改变比内部C末端区域更显著，则在沿连接子通道循环期间将发生DNA的左向旋转。这与所观察到的相对于连接子C末端每个核苷酸1.5°的顺时针旋转一致(13)。另外，据报道每个核苷酸的DNA旋转频率随衣壳的填充而增加，这与通道的构象变化向着包装过程的结束而加速的观察结果一致(35)。由于dsDNA与连接子通道壁对齐，并且当DNA包装或释放接近完成时，将采取最终构象，因此这是合理的。

电导通常是通道的最窄收缩的反映(29)，但是其它因素，如圆柱区的长度可以有影响(58)。在对MspA的一项早期研究中，野生型的电导为约4.9nS，而将三个氨基酸D改变为N后，电导降低了2-3倍(59)。另一种可能变化是由于T4连接子的寡聚状态，导致了具有较宽电导分布的非均一群体。尽管据信T4连接子仅作为十二聚体以生物学活性状态存在(60)，但是已报道在异位表达和组装后，不同噬菌体的连接子的化学计量在11聚体至14聚体变化(46，61-64)。一些研究显示T3连接子蛋白作为12和13个亚基的混合群体存在。这两种寡聚物状态的百分比在每个培育生长中是不同的，表明连接子蛋白的组装取决于表达条件及其它因素(44-46)。据报道在特定部分，如隧道环(tunnel loop)的螺旋α6和冠状区(crownregion)中发生的构象变化可以是不同的寡聚状态的原因(41)。

结论

T3和T4的马达通道显示出由通道构象变化导致的不连续的三步电压门控。门控的三个步骤与如先前所报道的量化DNA包装的三个主要步骤一致，表明DNA包装过程期间的单向流入通道在宿主感染期间转换为用于DNA释放的流出通道。

最后，为了进一步解释本发明的特征、益处和优势，此处附上附录A，其由此参考并入本文。

在整个本文档中，提及了多个参考文献。所有这些参考文献通过引证并入本文，包括以下列表中列出的参考文献：

部分2

摘要

dsDNA噬菌体的DNA包装马达含有头-尾连接子，其具有在组装期间用于基因组进入，在宿主感染期间用于基因组离开的通道。近期报道噬菌体phi29的DNA包装马达使用“单向循环”机理用于DNA包装。这提出了如果通道作用为单向向内的阀，则在感染期间如何释放出dsDNA的问题。在本文中，我们报道了对于噬菌体T3、T4、SPPI和phi29的DNA易位马达常见的门通道的三步构象变化。这些马达的通道实行不连续的门控的三个步骤，如通过电生理学测定所揭示的。认为DNA进入过程期间发生了三步通道构象变化，导致了释放期间为DNA反向运动做准备的结构转变。

简介

DNA易位马达在生物系统中普遍存在(Guo et al.,2016)。在复制期间，双链DNA(dsDNA)病毒的基因组包装到被称为前衣壳的预先形成的蛋白质壳体中。该过程需要强力的ATP驱动的包装马达。在多种病毒中，马达包括一对DNA包装蛋白，较小的辅助亚基通常是与dsDNA接触的蛋白寡聚物，而较大的是ATP酶蛋白(Guo et al.,1987)。在多种dsDNA噬菌体和疱疹病毒中，马达对接在称为门(portal)或连接子的结构上。结构研究显示疱疹病毒和多种有尾噬菌体，如phi29、SPPI、T4和T3中的门享有类似的圆锥形十二聚体结构(图8)，即使它们的一级序列不显示出任何明显的同源性。

在噬菌体phi29中，门由组装成截锥形结构的12个蛋白质亚基组成，其宽端和窄端的直径分别为13.8nm和6.6nm。最窄收缩处的内部通道为3.6nm(41)。在SPPI中，组装的通道为13聚体结构，并且最窄部分的直径为2.77nm(图8)(42，43)。T4门作为长14nm，宽7nm的十二聚体环存在，并且内部通道直径为～3nm(Sun et al.，Nat.Commum.6 7548)。T3门为12和13个亚基的混合物，取决于蛋白表达条件及其它因素。对于内部通道，T3门的12聚体形式为14.9nm宽，8nm高和直径3.7nm(46)。

门在基因组包装和释放过程中起重要作用。在组装期间，其起到马达ATP酶的对接点和dsDNA进入的管道的作用。在DNA包装后，门用作尾部部分的结合位点以完成病毒粒子组装。当噬菌体开始感染时，通过门和尾部通道的同轴通道将DNA释放到宿主细胞中。在噬菌体SPPI中，在其与DNA相互作用期间，门蛋白经历了协同的结构构象变化(Chaban etal.,2015)。近期使用膜包埋的phi29门连接子所获得的结果表明dsDNA仅在一个方向上移动，即从外部较窄的末端至内部较宽的末端，这称为“单向通行”(Jing et al.,2010)。来自ATP酶研究与单分子研究结合的生物学数据得出以下结论，噬菌体phi29的DNA易位是通过“推动通过单向阀”(Zhang et al.,2012)或“单向循环机制”(Schwartz et al.,2013；Guo,2014；De-Donatis et al.,2014)发生以包装DNA。“推动”的含义与表示压缩机构的T4中的发现一致(Ray et al.,2010；Dixit et al.,2012；Harvey,2015)。由于通道作用为单向阀，出现了明显的问题：如果通道是单向向内的阀，则在感染过程中dsDNA如何释放？早期研究表明在各个DNA包装和释放过程中，门进行构象变化。例如，在phi29门中，构象变化是由DNA、pRNA或二价金属离子可诱导的(Geng et al.,2013；Urbaneja et al.,1994；Tolleyet al.,2008)。还报道phi29 DNA包装马达的通道环在包装接近结束时起到重要功能以保留DNA(Grimes et al.,2011)。低温EM成象还显示与体外游离的连接子相比，感染性病毒粒子中的连接子出现构象变化(Tang et al.,2008)。然而，这些研究都没有在单分子水平显示构象变化。

由于其应用的多面性，基于纳米孔的单分子检测已吸引了大量关注。实例包括化学品、核苷酸、药物和对映异构体的小分子以及较大的聚合物，如PEG、多肽、RNA和DNA的检测。一种新型应用为phi29门向人工膜中的插入以用作稳固的纳米孔(Wendell,2009)用于单分子检测(Haque et al.,2012)和疾病诊断(Wang et al.,2013)。phi29门通道在DNA包装过程中显示出电压诱导的通道门控以及dsDNA易位的单向通行(Geng et al.,2011；Jinget al.,2010；Fang et al.,2012)。据报道配体与连接子C末端的相互作用导致了phi29连接子通道的构象变化，产生已作为疾病诊断的非常灵敏的方法用于检测单个抗体的改变的电信号(Wang et al.,2013)。在此处我们报道了通道中不连续的构象变化在噬菌体T3、T4、SPPI和phi29中是常见的。这些观察结果支持单向流入通道被转换为流出通道以准备用于DNA释放的观点(Hu et al.,2013)。

材料和方法

材料和试剂

磷脂、1,2-二植烷酰基-sn甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)(Avanti Polar Lipids)、正癸烷(Fisher)、氯仿(TEDIA)按供应商的指示使用。如未指明，其它试剂均购自Sigma。His结合缓冲液：15％甘油、0.5M NaCl、5mM咪唑、10mM ATP、50mM Tris-Cl、pH 8.0。His清洗缓冲液：15％甘油、500mM NaCl、50mM咪唑、10mM ATP、50mM Tris-HCl、pH 8.0。His洗脱缓冲液：15％甘油、5000mM NaCl、500mM咪唑、50mM ATP、50mM Tris-Cl、pH 8.0。

phi29、SPPI、T3和T4门的表达和纯化

phi29门的表达和纯化遵循先前报道的程序(Haque et al.,2013a；Wendell etal.,2009)。合成编码SPPI门蛋白gp6的基因6和编码T3门蛋白gp8的基因8(Genescript)，然后分别克隆至pET3c载体中Ndel和BamHI位点之间。在C末端插入6×His-标签用于纯化。将内含基因6或基因8的所得质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)，并将单个菌落在10mLLuria-Bertani(LB)培养基中在37℃下培养过夜。将培养物转移到1L新鲜LB培养基中，并在OD₆₀₀达到0.5-0.6之后，加入0.5mM IPTG以诱导蛋白表达。3小时后，通过在6000×rpm下离心15min收集细胞并将颗粒在His结合缓冲液中再悬浮。通过传送通过弗氏压碎器裂解细菌，并在12000×rpm下离心20分钟后收集透明上清液，然后加载至树脂柱。在清洗几轮后，用His洗脱缓冲液从树脂柱洗脱SPPI或T3门。

从T4基因组扩增编码T4门蛋白gp20的基因20，并将其克隆至pET3c的Ndel和BamHI位点处(keyclone)。在C末端引入6×His-标签用于纯化。由于其疏水性，T4门具有易于聚集的倾向。因此，修改了蛋白表达和纯化方法(Quinten et al.,2012)。将内含基因20的质粒pET3c转化至大肠杆菌HMS 174(DE3)，并将单个菌落在10mL LB培养基中在37℃下培养过夜。将培养物转移到1L新鲜LB培养基中并培养至OD₆₀₀达到0.5-0.6。然后，加入IPTG(0.5mM最终浓度)以诱导T4门蛋白表达。将培养物转移至18℃并继续培养过夜。通过在6000×rpm下离心15min收获细胞，并将其在His结合缓冲液中再悬浮。通过传送通过弗氏压碎器裂解细菌。在12000×rpm下离心20分钟后收集细胞颗粒，并在含有1％N-月桂酰肌氨酸的His结合缓冲液中再悬浮20min。在12000×rpm下离心1小时后收集上清液，并加载至树脂柱，在几轮清洗后洗脱。通过10％SDS-PAGE凝胶验证所有最终蛋白产物的纯度。

含有phi29、SPPI、T3和T4门的脂质体的制备

按照我们报道的程序制备所有门/脂质体复合物(Wendell et al.,2009；Haqueet al.,2013a)。简要地，将0.5mL的氯仿中的1mg/mL DPhPC加入至圆底烧瓶，并使用旋转蒸发器(Buchi)在真空下蒸发氯仿。将干燥的脂质膜用含有250mM蔗糖的0.5mL的门蛋白溶液补水。通过将脂质混悬液挤出通过400nm聚碳酸酯膜过滤器(Avanti Polar Lipids)获得单层脂质囊泡。

门插入到平面脂质双层

先前已报道了将门连接子插入脂质双层的程序(Cai et al.,2008；Haque etal.,2013a；Wendell et al.,2009)。简要地，使用具有200μm的孔的薄特氟隆隔板将双层脂质膜(BLM)室分成顺式和反式隔室。用5％(wt/vol)DPhPC在己烷中的溶液预涂孔。使顺式和反式隔室内充满导电缓冲液，1M KCl、5mM HEPES，pH 7.8。然后使用20％(wt/vol)DPhPC在正癸烷中的溶液形成平面脂质双层。在确认形成脂质双层后，将门/脂质体复合物加入至顺式隔室以与平面脂质双层融合，从而形成膜包埋的纳米孔。

电生理学测量

随机纳米孔感应技术基于经典的库尔特计数器的原理或“电阻脉冲(resistive-pulse)”技术(Coulter,1953)。门位于电化学室中，其被分成两个充满导电缓冲液的隔室。在施加的电压下，通过门通道的离子将产生皮安培(pA)尺度的电流(Haque et al.,2013b)。当带电分子穿过通道时，由于离子由孔的体积排阻，将产生瞬时电流阻断。可以单独或组合使用多种参数进行检测，如事件停留时间、电流幅度和电流阻断的独特电学特征。

使用插入两个隔室的一对Ag/AgCl电极测量跨BLM的电流描绘线。使用Axopatch200B膜片钳放大器结合BLM工作站(Warner Instruments)或Axon DigiData 1440A模拟数字转换器(Axon Instruments)记录电流描绘线。报告的所有电压为反式隔室的电压。以5kHz或1KHz的频率低带通过滤数据，并以2-20KHz的采样频率采集。使用PClamp 9.1软件(Axon Instruments)采集数据，并使用Origin Pro 8.0用于数据分析。

结果

phi29、SPPI、T4和T3的门的克隆、表达和纯化

按照先前用于纯化phi29门的策略(Cai et al.,2008；Haque et al.,2013a；Wendell et al.,2009)，在门编码序列和6×His标签之间引入6×甘氨酸接头以提供末端灵活性。SPPI和T3门两者在大肠杆菌细胞质中可溶。由于其疏水性，T4门显示出强聚集倾向。因此，将1％N-月桂酰肌氨酸表面活性剂加入至纯化缓冲液以溶解蛋白质(Quinten etal.,2012)。纯化至均一后，通过10％SDS-PAGE分析蛋白质。phi29、SPPI、T4和T3门的单个蛋白质亚基分别对应于它们预测的大小36kDa、56kDa、60kDa和59kDa(图11)。

门通道插入脂质膜用于使用电导测定确定通道尺寸。

为了将phi29、SPPI、T4和T3门蛋白引入平面脂质双层，我们采用了先前描述的两步程序(Wendell et al.,2009)：将门在脂质体中重组，随后将蛋白/脂质体与平面脂质双层融合以形成膜包埋的门通道。使用1M KCl、5mM HEPES，pH 7.8导电缓冲液和50mV施加电势进行实验。每个电流跳跃代表一个通道至脂质双层的插入。由于门/脂质体与平面脂质双层的融合是随机事件，因此独立的插入事件之间的时间是不同的。图9A-D提供了四种噬菌体的门的代表性结果。phi29、SPPI和T4的通道电导(来源于所测量的电流跳跃与施加电压的比值)分别测定为4.52±0.33nS、4.10±0.22nS和3.03±0.37nS(图9E-G)。T3的电导分布表现为两个峰值：2.65±0.31nS和3.90±0.38nS(图9H)。电导值对应于phi29、SPPI、T3和T4门通道各自的孔尺寸(图9A-D)。

在扫描电压(-50mV至+50mV；2.2mv/s)下，phi29、SPPI、T4和T3门通道均显示出线性的电流-电压(I-V)关系而无电压门控(图2I-L)。当施加100mV时，phi29、T4和T3门通道保持稳定，但是SPPI门通道开始门控(数据未显示)。另外，与正电势相比，在负电压下，SPPI门通道具有更强的关闭门控的倾向(数据未显示)。

phi29、SPPI、T4和T3门通道的三步门控

当施加更高电压(>100mV)时，在全部4个门通道中观察到通道构象变化的三个不连续步骤。构象变化反映为第一、第二和第三步骤的电流分别减少33％、66％和99％(图10A-11H)。分别在+150mV、+150mV、+170mV和+150mV的施加的正电压下观察到phi29、SPPI、T4和T3门通道的三个不连续步骤的门控(图10A-D)。在-125mV、-100mV、-175mV和-125mV的负电压下，分别对4个门观察到了类似的现象(图10E-H)。这些是通道门控所需的最小电压。

讨论

从噬菌体的过表达基因组装的门复合物的多态性已报道了多年。尽管认为T4和SPPI门作为十二聚体以其生物学活性状态存在，但是据报道不同噬菌体中过表达的门基因产物的化学计量由11聚体至14聚体变化(Cingolani et al.,2002；Dube et al.,1993；Trus et al.,2004；Camacho et al.,2003；Tsuprun et al.,1994)。一些研究显示T3门结构为12和13个亚基的混合群体(Valpuesta et al.,2000)。phi29、SPPI、T4和T3门不同的电导分布可能表示这些门复合物中的多种寡聚状态。这由在T3电导分布中所观察到的两个主峰表示(图9H)。

已表明dsDNA噬菌体的所有门通道显示出左旋通道壁构型以有利于dsDNA通过循环机构在无旋转的情况下至前衣壳的单向通行(Jing et al.,2010；Zhao et al.,2013；Schwartz et al.,2013；De-Donatis et al.,2014)。单向阀机构与SPPI中基因组门控的发现一致，尽管这些作者提出的门控机构是基于DNA包装完成后而不是易位期间的通道结构分析(Chaban et al.,2015)。“推动通过单向阀”机构的发现(Guo et al.,2016；Zhang etal.,2012)提出了如果通道仅允许dsDNA以一个方向易位，则感染期间如何释放dsDNA的问题。我们认为在dsDNA易位期间，dsDNA与通道壁以及临近门的前衣壳组分的相互作用将引发门的构象变化。因此，有利于dsDNA在一个方向上前进的左旋门通道将在三个步骤中转换至中性或右旋构型以有利于DNA包装完成之后的DNA释放(De-Donatis et al.,2014)。

如以上对包装的dsDNA的释放所提出的，先前已提出了门蛋白的这种构象变化(Tang et al.,2008；Geng et al.,2011；Guo et al.,2005)。已在SPPI中报道(Orlova etal.,2003)并在T4中推测(Sun et al.,2015)了门的门控关闭。此外，据报导在与DNA相互作用期间SPPI门经历了其中心通道的结构成分的协同重构。据报道结构重排和门控关闭与蛋白质-蛋白质以及蛋白质-DNA相互作用有关，并且已提出了用于通道减小和门控关闭的隔板样机构(Chaban et al.,2015)。可以认为随不连续步骤的变化与照相机镜头所显示的不连续f制光圈类似，如f4.5、f8、f16、f32。然而，当将游离连接子与DNA填充的病毒粒子中的连接子的结构相比较时，提出的隔板难以与表示连接子结构的右旋旋转的数据一致(Tanget al.,2008)。T3、T4、SPPI和phi29中常见的不连续三步构象变化的发现表明了所有门的普遍性质。有可能的是三个门控步骤还可以对应于T3中观察到的部分基因组释放的量化步骤(Serwer et al.,2014)，以及phi29中观察到的部分包装中间体(Bjornsti et al.,1983)。

结论

T3、SPPI、T4和phi29的马达通道均显示出由通道构象变化所产生的电压门控的三个不连续步骤。结果表明DNA包装过程期间的单向流入通道在宿主感染期间被转换为准备用于DNA释放的流出通道。

附录A

以下序列表对应于以上段落0058-0061中描述的序列表的简要说明。

序列表

T3突变体连接子序列

加下划线的是进行突变的位点

SEQ ID NO：1：DNA序列

SEQ ID NO：2：蛋白质序列

T4GP-20突变体连接子序列

加下划线的是进行突变的位点。

SEQ ID NO：3：DNA序列

SEQ ID NO：4：蛋白质序列

附录B

本附录B中的参考文献编号对应于部分1(和图1-8、12-19)中的参考文献编号。

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65.International Patent Application Publication No.WO 2010/062697

附录C

本附录C中的参考文献对应于部分2(和图8-11)中的阐述参考文献编号。

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附录D

本附录D包括与图8-11有关的其它信息。

图8：phi29、SPPI和T4门通道的结构。phi29(A)；SPPI(B)和T4(C)门蛋白的俯视图、侧视图和单个亚基。Phi29 gp10 PDB：1FOU；SPPI gp6 PDB：2JES；T4 gp20 PDB：3JA7。

图9：代表性电流描绘线，显示了phi29(A)、SPPI(B)、T4(C)和T3(D)门通道向平面脂质膜的插入。施加的电压：+50mV。显示phi29(E)、SPPI(F)、T3(G)和T4(H)门通道的电导分布的柱状图。施加的电压：+50mV。phi29(单一通道)(I)、SPPI(两个通道)(J)、T4(一个通道)(K)和T3(三个通道)(L)门在渐升电势(-50mV至+50mV；2.2mv/s)下的电流-电压描绘线。导电缓冲液：1M KCl，5mM HEPES，pH 7.8。

图10：与在正跨膜电压下phi210(A)、SPPI(B)、T4(C)和T3(D)门通道的构象变化有关的三步门控。与在负跨膜电压下phi29(E)、SPPI(F)、T4(G)和T3(H)门通道的构象变化有关的三步门控。

图11：考马斯亮蓝染色的10％SDS-PAGE，显示了phi29(36kDa)、SPPI(56kDa)、T4(60kDa)和T3(59kDa)门通道的单个亚基的分子量差异。

Claims (32)

1.一种编码T3或T4病毒连接子多肽变体的工程化核酸分子，其中，所述多肽包含与SEQID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4至少99％序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述多肽包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的核酸分子，包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列。

5.一种工程化T3或T4病毒连接子多肽变体，其中，所述多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQID NO：4的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的病毒连接子多肽变体，其中，所述多肽包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求5所述的病毒连接子多肽变体，其中，所述多肽包含具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列的氨基酸序列。

8.根据权利要求5所述的病毒连接子多肽变体，包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列。

9.一种含有人工导电通道的电压门控膜复合物，包含：

膜层；和

引入所述膜层以形成当跨膜施加电势时，通过其可以发生导电的孔的分离的DNA包装马达连接子蛋白，其中所述DNA包装马达连接子蛋白包含病毒DNA包装马达连接蛋白多肽亚基的均十二聚体，并且其中所述亚基包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少95％的同一性的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的膜，其中，所述病毒DNA包装马达连接子蛋白多肽亚基包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4具有至少99％同一性的氨基酸序列。

11.根据权利要求9所述的膜，其中，所述病毒DNA包装马达连接子蛋白多肽亚基包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4。

12.根据权利要求9所述的膜，其中，所述病毒DNA包装马达连接子蛋白多肽亚基由包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸分子编码。

13.根据权利要求9所述的膜，所述亚基进一步包含亲和/对齐域。

14.根据权利要求9所述的膜，其中，所述亲和/对齐域包含以下多肽：

(i)Strep-11标签序列WSHPQRFEK

(ii)3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续组氨酸残基的聚组氨酸多肽，

(iii)3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续精氨酸残基的聚精氨酸多肽，

(iv)序列YGRKKRRQRR的HIV Tat多肽，和

(v)序列DRATPY的肽标签。

15.根据权利要求9所述的膜，其中，当施加电势时，所述膜使双链DNA通过所述孔易位。

16.根据权利要求15所述的膜，其中，当施加电势时，在含有导电通道的膜中以电压门控发生导电。

17.根据权利要求15所述的膜，其中，施加的所述电势大于约100mV。

18.根据权利要求15所述的膜，其中，施加的所述电势小于约-100mV。

19.根据权利要求15所述的膜，其中，所述膜层包含脂质层。

20.根据权利要求19所述的膜，其中，所述脂质层包含两亲性脂质。

21.根据权利要求19所述的膜，其中，所述脂质层选自由平面膜层和脂质体组成的组。

22.根据权利要求20所述的膜，其中，所述两亲性脂质包含磷脂并且所述脂质层包含脂质双层。

23.根据权利要求21所述的膜，其中，所述脂质体选自由多层脂质体和单层脂质体组成的组。

24.根据权利要求15所述的膜，其中，引入的所述病毒DNA包装马达连接子蛋白在所述膜层中是可移动的。

25.一种使用权利要求9-22中任一项所述的含有导电通道的膜感应分子的方法，包括

将所述分子与含有导电通道的膜接触，所述含有导电通道的膜包含膜层以及在其中引入的一个或多个分离的病毒DNA包装马达连接子蛋白，

施加电势，

检测电流变化，其中所述电流变化为不连续的3步变化。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述不连续的3步电流变化为每步中约33％、约66％和99％的减少。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述电势大于约100mV。

28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述电势小于约-100mV。

29.根据权利要求25所述的方法，其中，所述分子为多肽。

30.根据权利要求25所述的方法，其中，所述分子为核酸分子。

31.根据权利要求25所述的方法，其中，所述核酸分子为双链核酸分子。

32.一种使用权利要求9-22中任一项所述的含有导电通道的膜DNA测序的方法。