CN108267570A - 一种预储存试剂微珠的多孔板及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种预储存试剂微珠的反应筛选多孔板及其制备和使用方法，所述的多孔板包括：多孔板的容器中充满第一种液体，并在其底部预先引入一个负载试剂的微珠。负载试剂的微珠可以是固态微球、微液滴或两者的任意组合。所述的第一种液体与负载试剂的微珠不互溶。所述多孔板封膜保存，用户使用时无需配制和添加筛选试剂。该预存储试剂微珠可以大大减少试剂和样品的消耗量，试剂微珠方便与后续引入微量样品的混合反应，可以将常规筛选反应的体积降低2至3个数量级，可广泛应用于蛋白质结晶筛选、药物互作筛选、微生物耐药筛查、培养条件筛选、阵列PCR、单细胞分析等领域。
Description
技术领域
本发明涉及高通量分析和筛选技术领域，具体涉及一种基于预储存试剂的微体积反应筛选多孔板。
技术背景
组合化学、生物学、临床检验、药物学的反应筛查和大规模样品分析分选，大多需要手工配制试剂，耗费大量试剂和耗材，操作过程中产生的误差大。针对这一瓶颈，而发展起来的预先加入试剂的多孔板，避免了用户手工配制大量试剂的溶液操作，使用方便，保证了试剂量的精度，具有重要意义。然而，现有的预先存储试剂的多孔板，大多数为干燥存储，试剂消耗量较大，成本居高不下，进行筛选反应需要的样品体积大，存储的试剂容易发生变质，多孔板之间容易发生交叉污染。本发明创新的提出用油相包裹的微珠试剂，试剂可以以液态或固态微珠的形式长期保存，配合自动化微量加样技术，我们可以将反应体系缩小至纳升级别，成本低廉，在诸如药敏测试、多位点PCR筛查、细胞药物互作筛查、蛋白结晶筛选等应用领域具有广阔的推广使用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于微体积反应筛选的预先储存试剂的多孔板，在多孔板中，预先在每个孔中以负载试剂微珠的形式引入反应筛选试剂，同时添加保护防挥发和交叉污染的油性液体，以长时间稳定存储。这一预先存储试剂多孔板在使用时，配合自动化微量加液技术，即可完成普通多孔板上的微体积反应筛选实验。这一预先存储试剂的多孔板，使用方便，试剂消耗量小，可以将常规筛选反应的体积降低2至3个数量级，可长时间稳定保存，有效防止了试剂的氧化变质和交叉污染。在蛋白质结晶筛选、药物互作筛选、微生物耐药筛查、培养条件筛选、阵列PCR、单细胞分析等领域具有广阔的应用前景。
本发明提供一种以微珠形式预储存试剂的多孔板，包括：a)提供预先储存试剂的多孔板，所述多孔板的每个容器中充满第一种液体；b)所述多孔板的孔内预先引入一个试剂微珠，试剂微珠与所述第一种液体不互溶；c)所述多孔板可以是开口容器，也可以是封口容器。
进一步的，所述的第一种液体包含以下特征：1).比重小于试剂微珠；是油性液体或者与所述步骤c)中与第二种液体互不相溶的液体。进一步的，所述的油性液体包括矿物油、液态烷烃、酯类、硅油、烷烯烃或饱和烃类半液态混合物等与水相互不相溶且比重小于水的液体。
进一步的，所述的烷烯烃或饱和烃类半液态混合物指其状态在常温时介于固体及液体之间，熔点在4摄氏度及以上，包括固体石蜡、凡士林。
进一步的，所述的试剂微珠，微珠包括固态微球、液滴或两者的组合，不参与多孔板使用时进行的反应。
进一步的，所述的固态微球包括玻璃微珠，聚合物微球，多孔微球，凝胶微球，磁性微球。
进一步的，所述的试剂微珠，试剂是多孔板使用时参与反应的物质。
优选的，所述的试剂微珠体积范围为1纳升至5微升。
进一步的，所述的多孔板包括96孔、384孔、1536孔板及单个离心管、八联管、PCR管，孔板底部包含平底、圆形、锥形及以上任意组合。
本发明同时提供了一种简单可行的制备预存储试剂微珠多孔板的方法，其特征在于，所述的筛选试剂水溶液可通过常规微升体积液体操控技术批量添加到多孔板上，通过低温低压挥发处理除去水分，使试剂保留在固态微球、难挥发溶剂或高分子水溶性物质中，实现利用常规方法难以操控的微体积负载试剂微珠的制备。
进一步的，所述的多孔板制备方法包括：a)在多孔板中加入含表面活性剂的第二种液体；b)通过移液装置在多孔板的容器的第二种液体中加入试剂以及微珠；c)离心使试剂以及微珠沉降于容器底部，使两者接触；d)试剂在低温低压处理使试剂中的水分以及第二种液体挥发，干燥后的试剂结合在微珠上；e)在多孔板中加入第一种液体；f)为多孔板封膜，得到纳升体积的预存储试剂微珠多孔板。
进一步的，所述的第二种液体，其特征在于，所述的液体具有挥发性，为油性液体或者是与试剂微珠互不相溶的液体，包括石油醚、环己烷、环戊烷、异戊烷、正庚烷等。
进一步的，所述的预存储试剂微珠多孔板的制备方法，所述的低温范围为-80至50摄氏度，所述低压指真空度达到0.5至0.05。
本发明同时提供了预储试剂微珠多孔板的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：a)揭去多孔板封膜；b)过微量移液装置在多孔板的容器的第一种液体中加入样品或第二种试剂微液滴；c)将多孔板置于离心机中离心，使预存储试剂微珠与样品液滴沉降于容器底部，与试剂微珠混合反应；d)重复b)-c)步骤，加入第二种试剂或样品液滴进行多步反应筛选。
附图说明
为了更清楚地说明本发明中提出的预储存试剂的多孔板的构成、制备和使用方法，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1.预存储试剂微珠多孔板的制备方法示意图。
图2.基于预存储试剂微珠的微体积反应筛选方法示意图。
图3.基于预存储固态微球的多孔板反应实验结果显微图像。
图4.基于预存储微液滴的多孔板反应实验结果显微图像。
图5.适用于预存储微液滴多孔板的构型示意图。
具体实施方法
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1，为预存储试剂微珠多孔板的制备方法示意图。采用的多孔板为96孔PCR板，图示中展示了96孔板的一排，共8个容器；Ⅰ～Ⅷ指筛选试剂稀释水溶液，其稀释倍率为40倍；八通道移液器(1)；移液试剂稀释液(2)；含0.01％Span80的石油醚(3)；水相挥发之后的负载试剂微珠(4)；矿物油(5)。预存储试剂微珠多孔板的制备方法，具体步骤如下：
a)在96孔板的每个孔内预先加入100微升石油醚(含0.01％Span80)，多孔板置于4℃恒温金属浴上；
b)通过八通移液器(1-10微升移液量)，批量吸取待筛选试剂的40倍稀释液5μL，稀释液中含0.3％PEG400，添加到预装石油醚的384孔板上；
c)离心使待筛选试剂沉降于96孔板底部；
d)将孔板放入真空干燥箱，设定温度为37℃，真空度为0.08，低温低压处理3小时，使石油醚以及试剂中的水分充分挥发，而Span80保留，同时筛选试剂在难挥发的PEG400微滴中，微滴的体积缩小到约15-20纳升；
e)在多孔板中加入100微升矿物油；
f)在多孔板上封塑封膜，预存储试剂微珠多孔板制备完成。
在使用多孔板使，采用专利所述的方法(基于微液滴的数字核酸扩增定量分析方法及系统,杜文斌；徐鹏.中国专利,授权号:ZL 20140655309.4,2014)加入230纳升样品液滴，并离心与预存储的试剂微珠融合，最终反应体积约为250纳升。以上方法利用了水和PEG400具有不同的沸点，石油醚和Span80具有不同的沸点。通过低温低压得到了负载试剂微珠的方便制备。多孔板的制备可采用常规微升级移液工作站自动高效的完成。按以上方法得到的预存储试剂多孔板，可使反应筛选的试剂消耗量大大降低。
实施例2
其他条件同实施例1，e)步骤改为加入100微升含6％凡士林的矿物油(室温为液体)。这一预存储试剂多孔板在4℃保存时，覆盖微珠的保护层为凝固态。多孔板内的微珠的位置固定，保存和运输过程中，能够耐受意外的震动翻转等而不会发生变化。在使用多孔板时，多孔板需要恢复到室温，使油相融化之后再进行微量样品加注操作。
实施例3
如图2所示，为本申请实施例1提供的基于预储存试剂微珠的多孔板的微体积筛选方法流程示意图。所述的预储存试剂微珠的多孔板包括：封口容器的封膜(1)、多孔板(2)、第一种液体(3)，以及负载试剂微珠(4)。所采用的多孔板的容器具有V形的底部，使微珠或样品微滴汇聚于V形中心位置实现融合，有利于反应筛选的进行。采用的第一种液体为矿物油。使用的步骤包括：
a)揭去封膜(1)；
b)按已公开专利(中国专利，申请号：201410655191.5)所述微液滴生成方法，通过微量移液装置(5)在多孔板的容器的第一种液体(3)中加入试剂或样品液滴(6)；
c)离心使样品液滴(6)沉降于容器V形底部，与预存储试剂微珠发生混合，在一定条件下完成筛选反应。
如图3所示，为本发明实施例1的实验结果显微成像图。采用体式显微镜，观察其中一个微孔。在加入样品之前，可以看到V形容器底部含有一个透明的试剂微珠，直径为200微米的玻璃微球，微球表面吸附氯化铁；中间图片展示加入50纳升的纯水液滴，使预存储的氯化铁试剂溶解；右边图片展示加入50纳升的硫氰化钾水溶液，氯化铁与硫氰化钾发生络合反应，产生红色的硫氰化铁溶液，液滴的颜色变红色。采用在玻璃微球表面干燥存储氯化铁，避免了溶液氯化铁的变质，使试剂在多孔板内能够长期稳定存储。图中所示比例尺为200微米。
实施例4
如图4所示，为本发明实施例2提供的基于预存储试剂微珠的多孔板的筛选效果图。采用了平底的聚苯乙烯材质的透明多孔板，以方便对液滴进行观察；采用的第一种液体为矿物油。
这一多孔板的使用步骤如下：
a)预先在多孔板容器中引入50纳升的氯化铁溶液微滴(试剂)；
b)通过微量加样装置，向容器内矿物油中加入50纳升硫氰化钾水溶液(样品)；
c)离心使氯化铁与硫氰化钾微滴混合，得到100nL的混合液滴，反应产生红色的硫氰化铁。
实施例5
如图5，为底部不同构型的多孔板。其中，a)为锥形底部带有圆柱形微坑，试剂微珠存储于中心微坑内。利用细长的微坑，可利用酶标仪，进行实现基于吸收光度法或荧光法的检测，有利于提高检测的灵敏度；b)为带微小平面的锥形底，有利于落入微坑的液滴汇集在坑底部微珠液滴的吸附锚定，方便对微液滴反应进行成像观察；c)、d)、e)、f)为市面上现有的孔板底部构型，依次为圆型底、平底、U型底、V型底。
Claims (12)
1.一种预储试剂微珠的反应筛选多孔板，其特征在于，包括：在多孔板的每个单位容器中充满第一种液体和一个负载试剂微珠，所述的第一种液体的比重小于负载试剂微珠；所述的负载试剂的微珠体积范围为1纳升至5微升。
2.根据权利要求1所述的多孔板，其特征在于，所述的第一种液体是油性液体或者是与试剂微珠互不相溶的液体，其包括矿物油、液态烷烃、酯类、硅油、烷烯烃或饱和烃类半液态混合物等与水相互不相溶且比重小于水的液体。
3.根据权利要求2所述的多孔板，其特征在于，所述的烷烯烃或饱和烃类半液态混合物指其状态在常温时介于固体及液体之间，熔点在4摄氏度及以上，包括固体石蜡、凡士林。
4.根据权利要求1所述的多孔板，其特征在于，所述的试剂微珠包含水、固态微球、难挥发水相溶剂或高分子水溶性物质中任意一种或一种以上的组合，用于固定反应筛选试剂。
5.根据权利要求4所述的多孔板，其特征在于，所述的难挥发水相溶剂或高分子水溶性物质的混合物，包括但不限于聚乙二醇、甘油、羟甲基纤维素、可溶性淀粉、低聚果糖、阿拉伯胶、二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰三胺(HMPA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等。
6.根据权利要求4所述的多孔板，其特征在于，所述的固态微球包括聚合物微球、二氧化硅微球、多孔微球、凝胶微球、磁性微球；所述的微球直径为50-1000微米。
7.根据权利要求1所述的多孔板，其特征在于，所述的多孔板包括96孔、384孔、1536孔板及八联管、PCR管等，其底部包含平底、圆形、U形、锥形，或这些形状的组合。
8.一种预存储试剂微珠多孔板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)在多孔板中加入含表面活性剂的第二种液体；
b)通过移液装置在多孔板的容器的第二种液体中加入试剂以及微珠；
c)离心使试剂以及微珠沉降于容器底部，使两者接触；
d)试剂在低温低压处理使试剂中的水分以及第二种液体挥发，干燥后的试剂结合在微珠上；
e)在多孔板中加入第一种液体，表面活性剂溶于第一种液体；
f)为多孔板封膜，得到纳升体积的预存储试剂微珠多孔板。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的第一种液体含一种或多种表面活性剂，所述的表面活性剂包括Span20、Span40、Span60、Span80、Tween85、聚甘油脂肪酸酯、烷基叔胺盐、双硬脂酸乙酯基羟乙基甲基硫酸甲酯铵、三硬脂酸乙酯基羟乙基甲基硫酸甲酯铵、鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷、油酸二乙醇酰胺的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的第二种液体具有挥发性，为油性液体或者是与试剂微珠互不相溶的液体，包括石油醚、环己烷、环戊烷、异戊烷、正庚烷等。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的低温范围为-80至50摄氏度，所述的低压范围指真空度达到0.5至0.05。
12.一种预储试剂微珠多孔板的使用方法，其特征在于，包括：
a)揭去多孔板封膜；
b)通过微量移液装置在多孔板的容器的第一种液体中加入样品或第二种试剂微液滴；
c)将多孔板置于离心机中离心，使预存储试剂微珠与样品液滴沉降于容器底部，与试剂微珠混合反应；
d)重复b)-c)步骤，加入第二种试剂或样品液滴进行多步反应筛选。
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