CN108250294A - 改变抗体对抗原的亲和性的方法及该亲和性被改变的抗体 - Google Patents

改变抗体对抗原的亲和性的方法及该亲和性被改变的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及控制抗体对于抗原的亲和性的方法、对于抗原的亲和性发生改变的抗体及其制造方法。本发明旨在提供控制抗体对于抗原的亲和性的技术及对于抗原的亲和性发生改变的抗体。本发明根据基于互补性决定区域(CDR)的氨基酸序列的CDR的电特性，通过将抗体中的根据Chothia法定义的框架区域3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代而解决了上述的课题。

Description

改变抗体对抗原的亲和性的方法及该亲和性被改变的抗体
【技术领域】
本发明涉及控制抗体对于抗原的亲和性的方法。另外，本发明涉及对于抗原的亲和性发生改变的抗体及其制造方法。
【背景技术】
以往已知通过向抗体的氨基酸序列导入变异，使该抗体对于抗原的亲和性改变的技术。例如，在专利文献1中记载了向抗体的互补性决定区域(CDR)的氨基酸序列导入变异而降低该抗体对于抗原的亲和性的方法。
也已知不向CDR导入、而向处于可变区域的框架区域的氨基酸序列导入变异而改变对于抗原的亲和性。例如，在非专利文献1及专利文献2中记载了将位于与肌钙蛋白I结合的单链抗体(scFv)的框架区域3的第60、第63、第65及第67位的氨基酸残基用作为碱性氨基酸的赖氨酸或精氨酸残基取代。肌钙蛋白I是荷电氨基酸的含量多的抗原。在非专利文献1及专利文献2中，首先，制作识别pI是3.57的酸性表位的单链抗体及识别pI是11.45的碱性表位的单链抗体。在非专利文献1及专利文献2中记载了，利用由向这些单链抗体导入碱性氨基酸残基而发生的电引力可提高对肌钙蛋白I的亲和性。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】美国专利申请公开第2012/0329995号说明书
【专利文献2】国际公开第2013/084371号单行本
【非专利文献】
【非专利文献1】Fukunaga A及Tsumoto K,Improving the affinity of anantibody for its antigen via long-range electrostatic interactions,ProteinEng.Des.Sel.vol.26,no.12,p.773-780,2013
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
在非专利文献1及专利文献2中，从增加抗体抗原反应中的结合速度常数的观点来看，向抗肌钙蛋白I抗体的框架区域3(FR3)导入如上述一样的变异而使对肌钙蛋白I的亲和性提高。但是，在这些文献中未记载，抗肌钙蛋白I抗体以外的抗体也可由相同的方法改变对抗原的亲和性。
另外，非专利文献1及专利文献2仅记载了提高对抗原的亲和性。一方面，当以抗体作为试剂利用时，不仅是对抗原的亲和性提高的抗体，有时也需要亲和性降低的抗体。例如，可将对于抗原的亲和性降低的抗体作为抗原抗体反应的适合的对照使用。从而，期望建立控制抗体对于抗原的亲和性的技术。
【解决课题的技术方案】
本发明人发现，如果将抗体的FR3的氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代，则可根据抗体的种类，提高或降低对于抗原的亲和性。进而，发现这样的亲和性的变化的差与基于CDR中所含的荷电氨基酸残基的数确定的CDR的电特性关联，由此完成本发明。
从而，本发明提供控制抗体对于抗原的亲和性的方法。在此方法中，在基于CDR的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷的抗体中，将根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代。
另外，本发明提供对于抗原的亲和性发生改变的抗体的制造方法。此方法包括：在基于CDR的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷的抗体中，将根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代的工序，及回收在取代工序中得到的抗体的工序。
再者，本发明提供对于抗原的亲和性发生改变的抗体。在此抗体中，基于CDR的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷，在未改变的抗体中的根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基被荷电氨基酸残基取代。
【发明效果】
由本发明提供对于抗原的亲和性发生改变的抗体。
【附图说明】
【图1A】是显示在野生型的抗胰岛素抗体及其变异型和抗原(胰岛素)的相互作用中的解离常数的坐标图。
【图1B】是显示在野生型的抗甲状腺刺激激素受体(TSHR)抗体及其变异型和抗原(TSHR)的相互作用中的解离常数的坐标图。
【图2A】是显示野生型的抗胰岛素抗体及其变异型、以及抗原(胰岛素)的表面电荷分布的图。
【图2B】是显示野生型的抗TSHR抗体及其变异型、以及抗原(TSHR)的表面电荷分布的图。
【图3】是显示将野生型的抗胰岛素抗体及其变异型的热稳定性用示差扫描热量计(DSC)测定之时的解析峰的坐标图。
【图4】是显示在野生型的抗溶菌酶抗体及其变异型和抗原(溶菌酶)的相互作用中的解离常数的坐标图。
【图5】是显示在野生型的抗B型肝炎表面抗原(HBsAg)抗体及其变异型和抗原(HBsAg)的相互作用中的解离常数的坐标图。
【实施方式】
【用于实施发明的形态】
[1.控制抗体对于抗原的亲和性的方法]
在本实施方式的控制抗体对于抗原的亲和性的方法(以下，也称为“控制方法”)中，基于CDR的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷的抗体成为控制对抗原的亲和性的对象。本实施方式的控制方法在有这样的电特性的抗体中，通过将根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代而使控制该抗体对于抗原的亲和性变得可能。其中，“控制亲和性”是指使抗体对于抗原的亲和性提高及使抗体对于抗原的亲和性降低的两方。从而，本实施方式的控制方法也可解释为改变抗体对抗原的亲和性的方法。
也将在本实施方式的控制方法中成为控制对抗原的亲和性的对象的原本的抗体称为“未改变的抗体”。在本说明书中，将在未改变的抗体中的根据Chothia法定义的FR3的氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代也称为“导入变异”。这样的取代也称为“变异的导入”或简称为“变异”。另外，将向未改变的抗体导入变异而得到的抗体也称为“亲和性受控制的抗体”。
在本实施方式中，由变异的导入改变未改变的抗体的表面电荷分布而对于抗原的亲和性受控制。即，亲和性受控制的抗体与未改变的抗体比较，对于抗原的亲和性提高或降低。在本实施方式中，亲和性受控制的抗体对于抗原的亲和性可为由抗原抗体反应中的动力学参数评价，也可为由ELISA法等的免疫学测定法评价。作为动力学参数，可举出结合速度常数(kon)、解离速度常数(koff)及解离常数(KD)，优选为KD。在抗原抗体反应中的动力学参数可由表面等离子体共振(SPR)技术取得。
由本实施方式的控制方法而抗体对抗原的亲和性提高时，例如，在抗原抗体反应中的KD的值是未改变的抗体的约1/2、约1/5、约1/10、约1/20、约1/50、约1/100或约1/1000。一方面，当抗体对于抗原的亲和性降低时，在抗原抗体反应中的KD的值是未改变的抗体的约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或约1000倍。
在本实施方式中，未改变的抗体也可为识别任何抗原的抗体。在优选的本实施方式中，未改变的抗体是编码轻链及重链的可变区域的基因的碱基序列公知的或能确认该碱基序列的抗体。具体而言，是在公知的数据库中公开了抗体基因的碱基序列的抗体，或者可得到产生该抗体的杂交瘤的抗体。作为这样的数据库，例如可举出由National Center forBiotechnology Information(NCBI)提供的GeneBank等。另外，抗体的类可为IgG、IgA、IgM、IgD及IgE之任何，但优选为IgG。
在本实施方式中，未改变的抗体只要是有含导入变异的FR3的可变区域，就也可处于抗体片段的形态。另外，亲和性受控制的抗体只要是有含导入有变异的FR3的可变区域，就也可处于抗体片段的形态。作为这样的抗体片段，例如，可举出Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、单链抗体(scFv)等。在它们之中，也特别优选Fab片段。
CDR在抗体的轻链及重链的各自的可变区域各存在3个，构成抗体的抗原结合部位。3个CDR从抗体链的氨基末端起数称为CDR1、CDR2及CDR3。由于CDR与抗体的特异性相关，在本实施方式中，亲和性受控制的抗体优选在CDR上无变异。即，亲和性受控制的抗体的CDR的氨基酸序列优选与未改变的抗体的CDR的氨基酸序列相同。
框架区域(FR)是指存在于抗体的轻链及重链的各自的可变区域的CDR以外的区域。FR发挥连接3个CDR的支架的作用，贡献于CDR的结构稳定性。因此，FR的氨基酸序列在相同的种(species)的抗体间高度保守。FR3是指作为FR之一而在CDR2和CDR3之间的区域。
在现有技术中已知用于定义CDR的边界及长度的对CDR的氨基酸残基付编号的方法(以下，也称为“编号法”)。作为这样的编号法，例如Chothia法(Chothia C.及Lesk AM.,Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins.,J MolBiol.,vol.196,p.901-917,1987)、Kabat法(Kabat EA.等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest.,NIH publication No.91-3242)、IMGT法(Lefranc MP.,IMGTUnique Numbering for the Variable(V),Constant(C),and Groove(G)Domains of IG,TR,MH,IgSF,and MhSF.,Cold Spring Harb Protoc.2011(6):633-642,2011)、Honergger法(Honegger A.等,Yet Another Numbering Scheme for Immunoglobulin VariableDomains：An Automatic Modeling and Analysis Tool.,J Mol Biol.,vol.309,p.657-670,2001)、ABM法、Contact法等是公知的。对CDR的氨基酸残基付编号，则变得对作为CDR以外的区域的FR也付编号。在本实施方式中，CDR及FR3的边界及长度虽根据Chothia法定义，但也可根据其他编号法定义。
在Chothia法中，轻链FR3被定义为由第53～90位的氨基酸残基构成的区域，重链FR3被定义为由第56～95位的氨基酸残基构成的区域。其中，为了比较，根据Chothia法及其他编号法定义时的轻链及重链的FR3的编号(FR3的始点及终点的氨基酸残基的位置)示于表1及2。再者，表中的Vernier区残基是指FR中所含的氨基酸残基之中，贡献于CDR的结构稳定性的氨基酸残基。在表1及2中，还显示根据各编号法定义的FR3中的Vernier区残基的位置。另外，在表1中还显示根据各编号法定义的、在实施例1中向轻链的FR3导入变异的位置。
【表1】
编号法 轻链FR3 Vernier区残基 在实施例1中向轻链的FR3导入变异的位置
Chothia 53～90 64、66、68、69、71 63、65、67、70、72
Kabat 57～88 64、66、68、69、71 63、65、67、70、72
IMGT 66～104 78、80、84、85、87 77、79、83、86、88
Honergger 78～108 80、82、84、87、89 79、81、83、88、90
ABM 57～88 64、66、68、69、71 63、65、67、70、72
Contact 56～88 64、66、68、69、71 63、65、67、70、72
【表2】
编号法 重链FR3 Vernier区残基
Chothia 56～98 67、69、71、73、78、93、94
Kabat 66～94 67、69、71、73、78、93、94
IMGT 66～104 76、78、80、82、87
Honergger 78～108 78、80、82、84、89、107、108
ABM 59～94 67、69、71、73、78、93、94
Contact 59～92 67、69、71、73、78
在本实施方式中，也可向未改变的抗体中的根据Chothia法定义的FR3(以下，也简称为“FR3”)的任何的氨基酸残基导入至少3个变异。优选为，向FR3中的处于向分子内部折叠而不露出到表面的氨基酸残基(以下，也称为“非露出残基”)之外的区域的氨基酸残基导入至少3个变异。由于即使向非露出残基导入变异，也预计不影响表面电荷，从而优选从要导入变异的位置排除非露出残基。FR3中的处于非露出残基之外的区域的氨基酸残基，具体而言，是指轻链的FR3的第53～81位的氨基酸残基，重链的FR3的第56～88位的氨基酸残基。
更优选为，向FR3中的处于非露出残基及Vernier区残基之外的区域的氨基酸残基导入至少3个变异。如上所述，这是由于Vernier区残基贡献于CDR的结构稳定性。FR3中的处于非露出残基及Vernier区残基之外的区域的氨基酸残基，具体而言，是指轻链的FR3的第53～63、65、67、70及72～81位的氨基酸残基，重链的FR3的第56～66、68、70、72、74～77及79～88位的氨基酸残基。
特别是，更优选为，在FR3中的处于非露出残基及Vernier区残基之外的区域的氨基酸残基之中，向侧链朝向分子表面的氨基酸残基导入至少3个变异。通过侧链朝向分子表面的氨基酸残基被荷电氨基酸残基取代，对表面电荷的贡献变得更大。在FR3中的侧链朝向分子表面的氨基酸残基是指轻链的FR3的第53、54、56、57、60、63、65、67、70、72、74、76、77及79～81位的氨基酸残基，重链的FR3的第56、57、59、61、62、64～66、68、70、72、74、75、77、79、81、83、84及86～88位的氨基酸残基。
在本实施方式中，也可向轻链的FR3及重链的FR3的任一者导入至少3个变异。从抗体的热稳定性的观点来看，优选向轻链的FR3导入至少3个变异。当轻链及重链的两方的FR3有变异时，优选向轻链的FR3导入至少3个变异，并且向重链的FR3导入至少3个变异。
在本实施方式中，导入FR3的变异的数的上限不特别限定，优选为16个氨基酸以下。即，亲和性受控制的抗体的FR3中的变异的数，具体而言，是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个。
如上所述，在本实施方式的控制方法中，通过向未改变的抗体导入变异而改变表面电荷分布而对于抗原的亲和性发生改变。从而，至少3个变异优选全部是用有相同的电荷的荷电氨基酸残基取代。即，至少3个变异优选全部是用酸性氨基酸残基取代或用碱性氨基酸残基取代。
荷电氨基酸残基是指天冬氨酸残基、谷氨酸残基、赖氨酸残基、精氨酸残基及组氨酸残基。酸性氨基酸残基是指天冬氨酸残基及谷氨酸残基。碱性氨基酸残基是指赖氨酸残基、精氨酸残基及组氨酸残基。在本实施方式中，作为当作变异导入FR3的碱性氨基酸残基，优选赖氨酸残基及精氨酸残基。
在本实施方式中，导入未改变的抗体的至少3个变异也可为将FR3的中性氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代的变异。中性氨基酸残基是指丙氨酸残基、天冬酰胺残基、异亮氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酰胺残基、半胱氨酸残基、苏氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基、苯丙氨酸残基、脯氨酸残基、缬氨酸残基、甲硫氨酸残基、亮氨酸残基及色氨酸残基。
如上所述，在本实施方式中，基于CDR的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷的抗体成为控制对抗原的亲和性的对象。在本说明书中，CDR的电特性是本发明人独自定义的指标，基于CDR的氨基酸序列中的荷电氨基酸残基的数而确定。具体而言，CDR的电特性由下述的式(I)确定。
X＝[CDR的氨基酸序列中的碱性氨基酸残基的数]-[CDR的氨基酸序列中的酸性氨基酸残基的数]…(I)
(式中，
当X是-1、0或1时，CDR的电特性是中性，
当X是2以上时，CDR的电特性是正电荷，
当X是-2以下时，CDR的电特性是负电荷)
CDR的电特性优选基于轻链及重链的两方的CDR的氨基酸序列而确定。此时，在式(I)中的CDR的氨基酸序列是指轻链的CDR1、CDR2及CDR3和重链的CDR1、CDR2及CDR3的全部氨基酸序列。在本实施方式中，在基于轻链及重链的两方的CDR的氨基酸序列而确定的电特性是中性或负电荷的抗体中，优选将轻链的FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代。
CDR的电特性也可各自对于轻链CDR及重链CDR而确定。即，当确定轻链CDR的电特性时，在式(I)中的CDR的氨基酸序列是指轻链的CDR1、CDR2及CDR3的全部氨基酸序列。另外，当确定重链CDR的电特性时，在式(I)中的CDR的氨基酸序列是指重链的CDR1、CDR2及CDR3的全部氨基酸序列。在本实施方式中，在轻链CDR的电特性是中性或负电荷的抗体中，优选将轻链的FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代。
CDR的氨基酸序列可从公开抗体基因的序列的公共的数据库得到。或者，当有产生未改变的抗体的杂交瘤时，CDR的氨基酸序列可通过由公知的方法从该杂交瘤取得编码重链及轻链的核酸，对该核酸的碱基序列进行测序而得到。
CDR的电特性因抗体而不同。例如，如后述的实施例3所示，在野生型(即未改变)的抗胰岛素抗体的轻链CDR中，碱性氨基酸残基(精氨酸)有1个，不存在酸性氨基酸残基。从而，野生型的抗胰岛素抗体的CDR的电特性被定义为中性(X＝1)。另外，在野生型的抗TSHR抗体的轻链CDR中，酸性氨基酸残基(天冬氨酸)有5个，不存在碱性氨基酸残基。从而，野生型的抗TSHR抗体的CDR的电特性被定义为负电荷(X＝-5)。
在CDR的电特性是中性的未改变的抗体中，通过将FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，含抗体的抗原结合部位的宽的范围的表面电荷变成负。另外，在CDR的电特性是中性的未改变的抗体中，通过将FR3的至少3个氨基酸残基用碱性氨基酸残基取代，含抗体的抗原结合部位的宽的范围的表面电荷变成正。由这样的表面电荷的变化，抗体和抗原结合时发生静电相互作用(引力或斥力)。即，在CDR的电特性是中性的未改变的抗体中，通过将FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，可使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低。另外，在CDR的电特性是中性的未改变的抗体中，通过将FR3的至少3个氨基酸残基用碱性氨基酸残基取代，可使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比提高。
在CDR的电特性是负电荷的抗体中，通过将FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，含抗体的抗原结合部位的宽的范围的表面电荷变成负。由这样的表面电荷的变化，抗体和抗原结合时发生静电相互作用(斥力)。即，在CDR的电特性是负电荷的未改变的抗体中，通过将FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，可使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低。
在本实施方式中，由DNA重组技术及其他分子生物学技术等的公知的方法，可向未改变的抗体的FR3导入变异。例如，当有产生未改变的抗体的杂交瘤时，如后述的实施例1所示，使用从该杂交瘤提取的RNA，由逆转录反应及RACE(cDNA末端的快速扩增)法各自合成编码轻链的多核苷酸及编码重链的多核苷酸。通过将这些多核苷酸使用用于向FR3的至少3个氨基酸残基导入变异的引物而由PCR法进行扩增，取得向FR3导入变异的编码轻链的多核苷酸及编码重链的多核苷酸。通过使得到的多核苷酸整合到现有技术中公知的表达用载体，取得含编码亲和性受控制的抗体的多核苷酸的表达载体。其中，编码轻链的多核苷酸及编码重链的多核苷酸可整合到1种表达载体，也可个别地整合到2种表达载体。表达载体的种类不特别限定，可为哺乳动物细胞用表达载体，也可为大肠杆菌用表达载体。通过将得到的表达载体转导或转染到适当的宿主细胞(例如，哺乳动物细胞或大肠杆菌)中，可得到亲和性受控制的抗体。
当得到作为单链抗体(scFv)的亲和性受控制的抗体时，例如，如专利文献2所示，使用从上述的杂交瘤提取的RNA而由逆转录反应及PCR法各自合成编码轻链可变区域的多核苷酸及编码重链可变区域的多核苷酸即可。将这些多核苷酸由重叠延伸PCR法等连接而取得编码未改变的scFv的多核苷酸。通过将得到的多核苷酸使用用于向FR3的至少3个氨基酸残基导入变异的引物而由PCR法进行扩增，取得编码向FR3导入变异的scFv的多核苷酸。通过使得到的多核苷酸整合到现有技术中公知的表达载体，取得含编码处于scFv的形态的亲和性受控制的抗体的多核苷酸的表达载体。通过将得到的表达载体转导或转染到适当的宿主细胞中，可得到处于scFv的形态的亲和性受控制的抗体。
再者，当无产生识别目标抗原的抗体的杂交瘤时，例如由Kohler及Milstein,Nature,vol.256,p.495-497,1975中记载的方法等的公知的方法制作产生抗体的杂交瘤即可。或者，也可使用从用目标抗原免疫的小鼠等的动物的脾脏取得的RNA。当使用从脾脏取得的RNA时，例如，如非专利文献1所示，也可从得到的编码未改变的Fab的多核苷酸之中由噬菌体展示法等选择有期望的亲和性的编码未改变的Fab的多核苷酸。
[2.对于抗原的亲和性发生改变的抗体的制造方法]
在本发明的范围中，也含对于抗原的亲和性发生改变的抗体的制造方法(以下，也称为“制造方法”)。在本实施方式的制造方法中，首先，在基于CDR的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷的抗体中，进行将根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代的工序。
在本实施方式的制造方法中，FR3的氨基酸残基被取代的上述的抗体与本实施方式的控制方法中的未改变的抗体相同。以下，将在本实施方式的制造方法中成为改变对抗原的亲和性的对象的原本的抗体也称为“未改变的抗体”。CDR的电特性的详细内容与对于本实施方式的控制方法所述的相同。抗体的CDR的电特性可由上述的式(I)确定。另外，根据Chothia法定义的FR3与对于本实施方式的控制方法所述的相同，如表1及2所示。
在本实施方式的制造方法中，由氨基酸残基的取代改变抗体的表面电荷分布而可取得改变对于抗原的亲和性的抗体。即，上述的取代工序是指在CDR的电特性是中性或负电荷的抗体中，将根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代而改变对抗体的抗原的亲和性的工序。例如，上述的取代工序也可为在CDR的电特性是中性的抗体中，将根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低的工序。另外，上述的取代工序也可为在CDR的电特性是中性的抗体中，将根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基用碱性氨基酸残基取代，使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比提高的工序。或者，上述的取代工序也可为在CDR的电特性是负电荷的抗体中，将根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低的工序。
在本实施方式中，在基于轻链及重链的两方的CDR的氨基酸序列而确定的电特性是中性或负电荷的抗体中，优选将轻链的FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代。另外，在轻链CDR的电特性是中性或负电荷的抗体中，优选将轻链的FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代。
氨基酸残基的取代可由DNA重组技术及其他分子生物学技术等的公知的方法进行。例如，当有产生CDR的电特性是中性或负电荷的抗体的杂交瘤时，与对于本实施方式的控制方法所述的同样，可取得含编码对于抗原的亲和性发生改变的抗体的多核苷酸的表达载体。进而，将得到的表达载体转导或转染到适当的宿主细胞中而可取得表达上述抗体的宿主细胞。
接下来，在本实施方式的制造方法中，回收在上述的取代工序中得到的抗体。例如，将表达对于抗原的亲和性发生改变的抗体的宿主细胞溶解于含适当的增溶剂的溶液而在该溶液中使抗体游离。当上述的宿主细胞在培养基中分泌对于抗原的亲和性发生改变的抗体时，回收培养上清。游离的抗体可由亲和性层析法等的现有技术中公知的方法回收。例如，当制造的抗体是IgG时，可由使用蛋白A或G的亲和性层析法回收。根据需要，也可将回收的抗体由凝胶过滤等的现有技术中公知的方法纯化。
制作的抗体对于抗原的亲和性可为由抗原抗体反应中的动力学参数评价，也可为由ELISA法等的免疫学测定法评价。在对于抗原的亲和性提高的抗体中，例如，在抗原抗体反应中的KD的值，与原本的抗体比较，是约1/2、约1/5、约1/10、约1/20、约1/50、约1/100或约1/1000。在对于抗原的亲和性降低的抗体中，在抗原抗体反应中的KD的值，与原本的抗体比较，是约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或约1000倍。
[3.对于抗原的亲和性发生改变的抗体]
在本发明的范围中，也含对于抗原的亲和性发生改变的抗体(以下，也称为“改变的抗体”)。本实施方式的改变的抗体的特征在于，基于CDR的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷。CDR的电特性的详细内容与对于本实施方式的控制方法所述的相同。改变的抗体的CDR的电特性可由上述的式(I)确定。
在本实施方式的改变的抗体中，在未改变的抗体中的根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基被荷电氨基酸残基取代。即，本实施方式的改变的抗体与未改变的抗体的氨基酸序列比较，在根据Chothia法定义的FR3中，至少有3个由用荷电氨基酸残基的取代的变异。再者，本实施方式的改变的抗体与上述的“亲和性受控制的抗体”相同。另外，根据Chothia法定义的FR3与对于本实施方式的控制方法所述的相同，如表1及2所示。
其中，未改变的抗体是指对于抗原的亲和性发生改变之前的抗体。即，未改变的抗体是改变的抗体的原本的抗体，根据Chothia法定义的FR3的氨基酸残基未被荷电氨基酸残基取代。再者，此未改变的抗体相当于在本实施方式的控制方法中的成为控制对抗原的亲和性的对象的原本的抗体。在本实施方式中，未改变的抗体有电特性是中性或负电荷的CDR。
在本实施方式的改变的抗体中，由变异的导入改变抗体的表面电荷分布。即，改变的抗体与未改变的抗体比较，对于抗原的亲和性提高或降低。在本实施方式中，改变的抗体对于抗原的亲和性可由抗原抗体反应中的动力学参数评价，也可由ELISA法等的免疫学测定法评价。动力学参数的种类及取得与对于本实施方式的控制方法所述的相同。
在对于抗原的亲和性提高的改变的抗体中，例如，在抗原抗体反应中的KD的值是未改变的抗体的约1/2、约1/5、约1/10、约1/20、约1/50、约1/100或约1/1000。在对于抗原的亲和性降低的改变的抗体中，例如，在抗原抗体反应中的KD的值是未改变的抗体的约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或约1000倍。
改变的抗体也可为识别任何的抗原的抗体。另外，抗体的类可为IgG、IgA、IgM、IgD及IgE的任一者，优选为IgG。本实施方式的改变的抗体只要是有含导入有变异的FR3的可变区域，就也可处于抗体片段的形态。抗体片段的种类与对于本实施方式的控制方法所述的相同。
本实施方式的改变的抗体优选在CDR上无变异。即，改变的抗体的CDR的氨基酸序列优选与未改变的抗体的CDR的氨基酸序列相同。
在本实施方式的改变的抗体中，也可将至少3个变异导入未改变的抗体中的根据Chothia法定义的FR3的任何的氨基酸残基。优选为，至少3个变异被导入FR3中的处于非露出残基之外的区域的氨基酸残基。FR3中的处于非露出残基之外的区域的氨基酸残基与对于本实施方式的控制方法所述的相同。
更优选为，至少3个变异被导入FR3中的处于非露出残基及Vernier区残基之外的区域的氨基酸残基。FR3中的处于非露出残基及Vernier区残基之外的区域的氨基酸残基与对于本实施方式的控制方法所述的相同。
特别是，更优选为，在FR3中的处于非露出残基及Vernier区残基之外的区域的氨基酸残基之中，至少3个变异被导入侧链朝向分子表面的氨基酸残基。在FR3中的侧链朝向分子表面的氨基酸残基与对于本实施方式的控制方法所述的相同。
在本实施方式中，至少3个氨基酸残基的变异虽可被导入轻链的FR3及重链的FR3的任一者，但优选被导入轻链的FR3。当轻链及重链的两方的FR3有变异时，优选向轻链的FR3导入至少3个氨基酸残基的变异，并且向重链的FR3导入至少3个氨基酸残基的变异。
在本实施方式中，改变的抗体的FR3中的变异的数的上限不特别限定，优选为16个氨基酸以下。改变的抗体的FR3中的变异的数，具体而言，是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个。
在本实施方式中，改变的抗体所具有的至少3个变异也可为FR3的中性氨基酸残基被荷电氨基酸残基取代的变异。另外，在本实施方式中，至少3个变异优选全部是用有相同的电荷的荷电氨基酸残基取代。即，至少3个变异优选全部是用酸性氨基酸残基取代或用碱性氨基酸残基取代。
作为本实施方式的改变的抗体，例如，可举出以下的(1)～(3)的抗体。(1)CDR的电特性是中性，根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基被酸性氨基酸残基取代，抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低的抗体、(2)CDR的电特性是中性，根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基被碱性氨基酸残基取代，抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比提高的抗体、及(3)CDR的电特性是负电荷，根据Chothia法定义的FR3的至少3个氨基酸残基被酸性氨基酸残基取代，抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低的抗体。
作为改变的抗体的具体性的例，可举出抗胰岛素抗体及抗TSHR抗体的改变的抗体。在这样的抗胰岛素抗体的改变的抗体中，CDR的电特性是中性，在轻链的FR3中的第63、65、67、70及72位的氨基酸残基被碱性氨基酸残基取代。在此改变的抗体中，与未改变的抗体比，对于作为抗原的胰岛素的亲和性提高。一方面，在将轻链的FR3中的第63、65、67、70及72位的氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代的改变的抗体中，与未改变的抗体比，对于作为抗原的胰岛素的亲和性降低。另外，在抗TSHR抗体的改变的抗体中，CDR的电特性是负电荷，在轻链的FR3中的第63、65、67、70及72位的氨基酸残基被酸性氨基酸残基取代。在此改变的抗体中，与未改变的抗体比，对于作为抗原的TSHR的亲和性降低。
本实施方式的改变的抗体可由DNA重组技术及其他分子生物学技术等的公知的方法制作。例如，当有产生CDR的电特性是中性或负电荷的抗体的杂交瘤时，与对于本实施方式的控制方法及制造方法所述的同样，可制作将FR3的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代的抗体。
在本实施方式中，改变的抗体的使用法与未改变的抗体无特别不同之处。改变的抗体与未改变的抗体同样，可在各种试验或研究等中利用。另外，本实施方式的改变的抗体也可用现有技术中公知的标记物质等修饰。
在本发明的范围内含编码本实施方式的对于抗原的亲和性发生改变的抗体或其片段的单离并且纯化的多核苷酸。本实施方式的编码改变的抗体的片段的经单离并且纯化的多核苷酸优选编码含导入有变异的FR3的可变区域。在本发明的范围内也包括含上述的多核苷酸的载体。载体是为了转导或转染而设计的多核苷酸构建物。载体的种类不特别限定，可从表达载体、克隆载体、病毒载体等现有技术中公知的载体适宜选择。另外，在本发明的范围内，也包括含该载体的宿主细胞。宿主细胞的种类不特别限定，可从真核细胞、原核细胞、哺乳动物细胞等适宜选择。
接下来，将本发明通过实施例详细地说明，但本发明不限于这些实施例。
【实施例】
【实施例1：向FR3导入荷电氨基酸残基的抗体的制作】
将抗胰岛素抗体及抗甲状腺刺激激素受体(TSHR)抗体的FR3的3个或5个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代而制作各抗体的变体。
(1)野生型抗胰岛素抗体及野生型抗TSHR抗体的基因的取得
[试剂]
ISOGEN 株式会社日本基因
SMARTer(注册商标)RACE 5'/3'试剂盒 Clontech公司
10×A-附接混剂 东洋纺株式会社
pcDNA(商标)3.4topO(注册商标)TA克隆试剂盒 Thermo Fisher公司
高感受态DH5α 东洋纺株式会社
QIAprep Spin Miniprep试剂盒 QIAGEN公司
KOD plus neo 东洋纺株式会社
Ligation high ver.2 东洋纺株式会社
(1.1)野生型抗胰岛素抗体的基因的取得
(1.1.1)自产生抗体的杂交瘤提取总RNA
将人胰岛素用于抗原，由Kohler及Milstein,Nature,vol.256,p.495-497,1975中记载的方法制作产生野生型的小鼠抗人胰岛素抗体的杂交瘤。将此杂交瘤的培养物(10mL)以1000rpm离心处理5分钟之后，除去上清。将得到的细胞用ISOGEN(1mL)溶解，于室温静置5分钟。向其中添加氯仿(200μL)，搅拌15秒钟之后，于室温静置3分钟。进而，将其于4℃以12000×G离心处理10分钟，回收含RNA的水相(500μL)。向回收的水相添加异丙醇(500μL)而混合。将得到的混合物于室温静置5分钟之后，于4℃以12000×G离心处理10分钟。除去上清而向得到的沉淀物(总RNA)添加70％乙醇(1mL)，于4℃以7500×G离心处理10分钟。除去上清，使RNA风干，溶解于无RNA酶的水(20μL)。
(1.1.2)cDNA的合成
使用在上述(1.1.1)中得到的各总RNA而调制以下的组成的RNA样品。
[RNA样品]
总RNA(500ng/μL) 1μLRT
引物 1μL
去离子水 1.75μL
合计 3.75μL
将调制的RNA样品于72℃加热3分钟之后，于42℃温育2分钟。进而，向RNA样品添加12μM SMARTerIIA寡核苷酸(1μL)而调制cDNA合成用样品。使用此cDNA合成用样品而调制以下的组成的逆转录反应液。
[逆转录反应液]
5×第一链缓冲液 2μL
20mM DTT 1μL
10mM dNTP混剂 1μL
RNA酶抑制剂 0.25μL
SMARTScribe RT(100U/μL) 1μL
cDNA合成用样品 4.75μL
合计 10μL
使调制的逆转录反应液于42℃反应90分钟。进而，将反应液于70℃加热10分钟，添加N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸-EDTA(50μL)。以得到的溶液作为cDNA样品使用而调制以下的组成的5'RACE反应液。
[5'RACE反应液]
10×PCR缓冲液 5μL
dNTP混剂 5μL
25mM Mg2SO4 3.5μL
cDNA样品 2.5μL
10×通用引物混剂 5μL
3'-引物 1μL
KOD plus neo(1U/μL) 1μL
纯化水 27μL
合计 50μL
将调制的5'RACE反应液在下述的反应条件下供于RACE反应。再者，下述的“Y”对于轻链是90秒钟，对于重链是150秒钟。
[反应条件]
将于94℃2分钟、于98℃10秒钟、于50℃30秒钟、及于68℃Y秒钟实施30个循环、及于68℃3分钟。
使用在上述的反应中得到的5’RACE产物而调制以下的组成的溶液。使该溶液于60℃反应30分钟而向5’RACE产物的末端附加腺嘌呤。
5’RACE产物 9μL
10×A-附接混剂 1μL
合计 10μL
使用得到的腺嘌呤附加产物及pcDNA(商标)3.4TOPO(注册商标)TA克隆试剂盒而调制以下的组成的TA克隆反应液。将该反应液于室温温育10分钟，向pCDNA3.4克隆腺嘌呤附加产物。
[TA克隆反应液]
腺嘌呤附加产物 4μL
盐溶液 1μL
pCDNA3.4 1μL
合计 6μL
(1.1.3)转化、质粒提取及测序的确认
将在上述(1.1.2)中得到的TA克隆样品(3μL)添加到DH5α(30μL)中而在冰上静置30分钟之后，将混合物于42℃加热45秒钟而进行热休克。再次在冰上静置2分钟之后，全部涂布于含有氨苄西林的LB板。将该板于37℃温育16小时。取板上的单集落而放入含有氨苄西林的LB液体培养基中，于37℃振荡(250rpm)培养16小时。将培养物以5000×G离心处理5分钟而回收大肠杆菌的转化体。从回收的大肠杆菌使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒提取质粒。具体性的操作根据该试剂盒附带的手册而进行。使用pCDNA3.4载体引物确认得到的质粒的碱基序列。以下，以此质粒作为哺乳动物细胞表达用质粒使用。
(1.2)野生型抗TSHR抗体的基因的取得
向GenScript日本株式会社委托野生型人抗TSHR抗体的基因的合成而取得野生型人抗TSHR抗体的基因。
(2)各抗体的变体的基因的取得
(2.1)引物的设计及PCR
为了向在各抗体的轻链中的根据Chothia法定义的FR3导入变异，使用含在上述(1.1.3)中得到的野生型抗胰岛素抗体的基因的质粒、在(1.2)中得到的野生型抗TSHR抗体的基因及下述的碱基序列所示的引物而实施PCR。再者，D5变体是指FR3的5个氨基酸残基变异为天冬氨酸残基的变体，E5变体是指FR3的5个氨基酸残基变异为谷氨酸残基的变体，K5变体是指FR3的5个氨基酸残基变异为赖氨酸残基的变体，R5变体是指FR3的5个氨基酸残基变异为精氨酸残基的变体，R3变体是指FR3的3个氨基酸残基变异为精氨酸残基的变体。
[抗胰岛素抗体的引物]
序列1 D5变体REV 5’-TTCGTATTCGGTCCCTTCCCCTTCGCCTTCAAAGCGAGCA-3’ SEQ ID NO:1
序列2 E5变体REV 5’-ATCGTAATCGGTCCCATCCCCATCGCCATCAAAGCGAGCA-3’ SEQ ID NO:2
序列3 K5变体REV 5’-CTTGTACTTGGTCCCCTTCCCCTTGCCCTTAAAGCGAGCA-3’ SEQ ID NO:3
序列4 R5变体REV 5’-TCTGTATCTGGTCCCTCTCCCTCTGCCTCTAAAGCGAGCA-3’ SEQ ID NO:4
序列5 FOR 5’-CTCACAATCAGCTGATTG-3’ SEQ ID NO:5
序列6 R3变体REV 5’-TCTCCCTCTGCCTCTAAAGCGAGCA-3’ SEQ ID NO:6
序列7 R3变体FOR 5’-GGGACCAGATACAGA-3’ SEQ ID NO:7
以序列5的引物作为对于序列1～4的引物共同的正向引物使用。另外，以序列7的引物作为对于序列6的引物的正向引物使用。
[抗TSHR抗体的引物]
序列8 D5变体FOR 5’-GGCACAGACGCCGACCTGGCAATCA-3’ SEQ ID NO:8
序列9 D5变体REV 5’-GTCCCGGTCTCCGTCAAACCGGTCG-3’ SEQ ID NO:9
序列10 E5变体FOR 5’-GGCACAGAGGCCGAGCTGGCAATCA-3’ SEQ ID NO:10
序列11 E5变体REV 5’-CTCCCGCTCTCCCTCAAACCGGTCG-3’ SEQ ID NO:11
序列12 K5变体FOR 5’-GGCACAAAGGCCAAGCTGGCAATCA-3’ SEQ ID NO:12
序列13 K5变体REV 5’-CTTCCGCTTTCCCTTAAACCGGTCG-3’ SEQ ID NO:13
序列14 R5变体FOR 5’-GGCACAAGGGCCAGGCTGGCAATCA-3’ SEQ ID NO:14
序列15 R5变体REV 5’-CCTCCGCCTTCCCCTAAACCGGTCG-3’ SEQ ID NO:15
以在上述(1.3)中得到的质粒作为模板使用而调制以下的组成的PCR反应液。
[PCR反应液]
10×PCR缓冲液 5μL
25mM Mg2SO4 3μL
2mM dNTP混剂 5μL
正向引物 1μL
反向引物 1μL
模板质粒(40ng/μL) 0.5μL
KOD plus neo(1U/μL) 1μL
纯化水 33.5μL
合计 50μL
将调制的PCR反应液在下述的反应条件下供于PCR反应。
[反应条件]
将于98℃2分钟、于98℃10秒钟、于54℃30秒钟、及于68℃4分钟实施30个循环、及于68℃3分钟。
向得到的PCR产物(50μL)添加2μL的DpnI(10U/μL)而使PCR产物片段化。使用DpnI处理完了PCR产物调制以下的组成的连接反应液。将该反应液于16℃温育1小时，进行连接反应。
[连接反应液]
DpnI处理结束PCR产物 2μL
Ligation high ver.2 5μL
T4多核苷酸激酶 1μL
纯化水 7μL
合计 15μL
(2.2)转化、质粒提取及测序的确认
将连接反应后的溶液(3μL)添加到DH5α(30μL)中，与上述(1.1.3)同样，得到大肠杆菌的转化体。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒从得到的大肠杆菌提取质粒。使用pCDNA3.4载体引物确认所得到的各质粒的碱基序列。以下，以这些质粒作为哺乳动物细胞表达用质粒使用。
(3)在哺乳动物细胞中的表达
[试剂]
Expi293(商标)细胞 Invitrogen公司
Expi293(商标)表达培养基 Invitrogen公司
ExpiFectamine(商标)293转染试剂盒 Invitrogen公司
(3.1)转染
使Expi293细胞在5％CO2气氛下、于37℃振荡培养(150rpm)而增殖。准备对应于样品数的数的30mL的细胞培养物(3.0×106个细胞/mL)。使用编码FR3的各变体的质粒及编码野生型的抗体的质粒而调制以下的组成的DNA溶液，静置5分钟。
[DNA溶液]
轻链质粒溶液 相当于15μg的量(μL)
重链质粒溶液 相当于15μg的量(μL)
Opti-MEM(商标) 适量(mL)
合计 1.5mL
调制以下的组成的转染试剂，静置5分钟。
ExpiFectamine试剂 80μL
质粒溶液 1420μL
合计 1.5mL
将调制的DNA溶液及转染试剂混合而静置20分钟。将得到的混合液(3mL)添加到细胞培养物(30mL)中，在5％CO2气氛下、于37℃振荡培养20小时(150rpm)。20小时后，向各培养物各自添加150μL及1.5mL的ExpiFectamine(商标)转染增强剂1及2，在5％CO2气氛下、于37℃振荡培养6天(150rpm)。
(3.2)抗体的回收及纯化
将各细胞培养物以3000rpm离心处理5分钟而回收培养上清。在培养上清中含从转染的Expi293(商标)细胞分泌的各抗体。将得到的培养上清再次以15000×G离心处理10分钟而回收上清。向得到的上清(30mL)添加100μL的抗体纯化用载体Ab-Capcher Mag(ProteNova公司)而于室温反应2小时。使载体集磁而除去上清，添加PBS(1mL)而清洗载体。向载体添加400μL的100mM Gly-HCl(pH 2.8)而溶出被载体捕获的抗体(IgG)。将此溶出操作进行合计3次。将得到的溶出液使用100mM Tris-HCl(pH 8.0)中和而取得抗体溶液。
(4)结果
得到将在野生型抗胰岛素抗体及野生型抗TSHR抗体中的根据Chothia法定义的轻链FR3的第63、第65、第67、第70及第72位的丝氨酸残基用荷电氨基酸残基(天冬氨酸残基、谷氨酸残基、赖氨酸残基或精氨酸残基)取代的抗体。另外，得到将在野生型抗胰岛素抗体中的根据Chothia法定义的轻链FR3的第63、第65及第67位的丝氨酸残基用荷电氨基酸残基(精氨酸残基)取代的抗体。
【实施例2：向FR3导入荷电氨基酸残基的抗体的亲和性的测定】
探讨在实施例1中制作的各变体的对于抗原的亲和性与野生型比如何改变。
(1)抗体的片段化
使用Pierce(商标)小鼠IgG1Fab和F(ab')2制备试剂盒(Thermo Fisher公司)，使在实施例1中得到的各抗体成为Fab片段。具体性的操作根据该试剂盒附带的手册而进行。将得到的反应液使用Superdex 200Increase 10/300GL(GE Healthcare公司)进行凝胶过滤纯化。回收50kDa溶出级分，以得到的级分作为含有Fab片段的溶液，在往后的实验中使用。
(2)亲和性的测定
(2.1)由SPR技术的亲和性的测定
将野生型抗胰岛素抗体及其变体对抗原的亲和性，如以下一样，由SPR技术测定。作为抗胰岛素抗体的抗原，使用HumulinR注100单位(ELI LILLY公司)。向Biacore(注册商标)用传感器芯片Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare公司)固定化抗原(固定化：100RU)。稀释抗胰岛素抗体的含有Fab片段的溶液而调制50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.13nM的溶液。向Biacore(注册商标)T200(GE Healthcare公司)输送各浓度的含有Fab片段的溶液(联合时间120秒钟及解离时间1200秒钟)。使用Biacore(注册商标)评估软件解析测定数据，取得关于抗胰岛素抗体的亲和性的数据。
(2.2)由ELISA法的亲和性的评价
将野生型抗TSHR抗体及其变体对抗原的亲和性，如以下一样，由ELISA法测定。
(2.2.1)捕获用抗体的固相化
作为捕获用抗体，使用作为小鼠单克隆抗TSHR抗体的4E31抗体(RSR公司)。将4E31抗体(5μg)用PBS稀释而得到抗体溶液。向NUNC-免疫模块(Cat No.469949、NUNC公司制，以下称为“板”)的各孔各添加100μL此抗体溶液。将此板于室温静置3小时，将4E31抗体在孔中固相化。除去抗体溶液而向板的各孔添加各300μL封闭溶液(含有1％BSA的PBS)。于4℃进行20小时以上封闭。
(2.2.2)第一次反应
作为抗TSHR抗体的抗原，使用去污剂增溶的含TSHR的细胞膜制剂(RSR公司)。将此抗原用含有1％BSA的PBS稀释500倍而得到抗原溶液。从使4E31抗体固相化的板除去封闭液，向各孔添加各50μL抗原溶液。将此板于室温振荡60分钟而进行抗原抗体反应。
(2.2.3)第二次反应
作为检测用抗体，使用野生型抗TSHR抗体、D5变体及R5变体。将各抗体用含有1％BSA的PBS阶段性地稀释而得到1000pM、100pM、10pM、1pM及0.1pM的浓度的抗体溶液。另外，作为第二抗体，使用HRP标记抗人IgG(Fc特异性)抗体。将此第二抗体用含有1％BSA的PBS稀释而得到0.2μg/mL的浓度的第二抗体溶液。将各浓度的抗体溶液(50μL)和第二抗体溶液(50μL)混合而得到抗体的混合液。从上述的板除去抗原溶液，向各孔添加各300μL清洗液(含有1％BSA的PBS)。进而，从板除去清洗液，向各孔添加各300μL清洗液而进行清洗。将此清洗操作重复3次。从板除去清洗液，向各孔添加各100μL上述的抗体的混合液。将此板于室温振荡60分钟而进行抗原抗体反应。反应后，将上述的清洗操作重复3次。
(2.2.4)检测
作为底物溶液，使用1步Ultra TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific公司)。从板除去清洗液，以100μL/孔添加底物溶液。将此板于室温静置5分钟。5分钟后，向板的各孔添加各100μL停止液(0.1M H2SO4)而使反应停止。进而，对于板的各孔而测定450nm处的吸光度。
(3)结果
从对于抗胰岛素抗体得到的结合速度常数(kon)及解离速度常数(koff)算出解离常数(KD)。另外，从使用抗TSHR抗体的ELISA法的测定值算出解离常数(KD)。各抗体的动力学参数示于表3及表4、以及图1A及图1B。图中，“正电荷”表示R5变体的KD值，“负电荷”表示D5变体的KD值。表3中，由全球拟合得到的值是“平均值±标准误差”。
【表3】抗胰岛素抗体
样品 KD(M) kon(M-1s-1) koff(s-1)
野生型 2.22×10-10 (2.48±0.01)×106 (5.49±0.01)×10-4
R3变体 5.49×10-11 (8.79±0.02)×106 (4.83±0.01)×10-4
R5变体 2.03×10-12 (7.19±0.05)×106 (1.46±0.01)×10-5
K5变体 8.04×10-12 (5.44±0.04)×107 (4.37±0.01)×10-4
D5变体 9.69×10-10 (7.64±0.04)×105 (7.40±0.02)×10-4
E5变体 1.52×10-9 (2.79±0.01)×105 (4.24±0.01)×10-4
【表4】抗TSHR抗体
样品 KD(M)
野生型 7.0×10-10
D5变体 3.0×10-8
R5变体 6.5×10-10
表3及图1A显示，抗胰岛素抗体的R3变体、R5变体及K5变体的KD值变得低于野生型的KD值。另外，D5变体及E5变体的KD值变得高于野生型的KD值。从而得知，通过对于抗胰岛素抗体，将FR3的3个或5个氨基酸残基变异为碱性氨基酸残基，可制作与野生型比，对于抗原的亲和性提高的抗体。另外得知，通过将FR3的5个氨基酸残基变异为酸性氨基酸残基，可制作与野生型比，对于抗原的亲和性降低的抗体。
表4及图1B显示，抗TSHR抗体的D5变体的KD值变得高于野生型的KD值。得知对于抗TSHR抗体，通过将FR3的5个氨基酸残基变异为酸性氨基酸残基，可制作与野生型比，对于抗原的亲和性降低的抗体。一方面，抗TSHR抗体的R5变体的KD值与野生型的KD值是同程度。即，对于抗TSHR抗体，即使将FR3的5个氨基酸残基变异为碱性氨基酸残基，也提示亲和性不发生改变。
【实施例3：CDR的氨基酸序列的电特性和对抗原的亲和性的关联】
实施例2显示，抗胰岛素抗体可由向FR3导入变异而提高及降低亲和性。一方面，抗TSHR抗体虽然可通过向FR3导入变异而使亲和性降低，但无法使亲和性提高。从而，探讨由向FR3导入变异而抗体对抗原结合部位的表面电荷的影响。
(1)由变异导入的抗体的表面电荷的变化的探讨
使用Discovery Studiou(Dassault·Systems·BIOVIA株式会社)分析在实施例1中制作的各种Fab片段的表面电荷分布。作为抗胰岛素抗体的Fab片段及抗原的胰岛素的表面电荷分布图示于图2A。作为抗TSHR抗体的Fab片段及抗原的TSHR的表面电荷分布图示于图2B。图中，箭头表示抗原结合部位，PI表示等电点的值。其中，抗原结合部位与CDR相同。另外，图中，表面电荷分布用颜色表示，蓝色的部分表示正电荷、红色的部分表示负电荷、白色的部分表示电中性。
从图2A得知，在野生型的抗胰岛素抗体中，抗原结合部位的表面电荷是中性。在向FR3导入碱性氨基酸残基的变异型(正电荷变异)中，含抗原结合部位的宽的范围的表面电荷变成正。其中，当作为抗原的胰岛素是负电荷的蛋白质时，图1A显示，导入正电荷变异的变异型的对于抗原的亲和性提高。一方面，在向FR3导入酸性氨基酸的变异型(负电荷变异)中，含抗原结合部位的宽的范围的表面电荷变成负。从图1A得知，导入负电荷变异的变异型的对于抗原的亲和性降低。由这些可知，在野生型的抗胰岛素抗体中，由向FR3导入的荷电氨基酸残基而对表面电荷的贡献是广泛的。
从图2B得知，在野生型的抗TSHR抗体中，抗原结合部位的表面电荷是负。在向FR3导入碱性氨基酸的变异型(正电荷变异)中，除抗原结合部位之外的范围的表面电荷变成正，但抗原结合部位的表面电荷不怎么改变。其中，作为抗原的TSHR是负电荷的蛋白质，图1B显示，导入正电荷变异的变异型对于抗原的亲和性无变化。一方面，在向FR3导入酸性氨基酸的变异型(负电荷变异)中，含抗原结合部位的宽的范围的表面电荷变成负。图1B显示，导入负电荷变异的变异型对于抗原的亲和性降低。从这些得知，在野生型的抗TSHR抗体中，由导入FR3的酸性氨基酸残基而对表面电荷的贡献是广泛的。一方面得知，即使向野生型的抗TSHR抗体的FR3导入碱性氨基酸残基，表面电荷也局部不同。
(2)CDR的氨基酸序列的电特性和亲和性的控制的关联
本发明人认为，通过向抗体的FR3导入荷电氨基酸残基而对抗原的亲和性如何改变与该抗体的CDR的电特性相关。其中，本发明人将CDR的电特性由下述的式(I)定义。
X＝[CDR的氨基酸序列中的碱性氨基酸残基的数]-[CDR的氨基酸序列中的酸性氨基酸残基的数]…(I)
(式中，
当X是-1、0或1时，CDR的电特性是中性，
当X是2以上时，CDR的电特性是正电荷，
当X是-2以下时，CDR的电特性是负电荷)
表5显示野生型的抗TSHR抗体的轻链CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO:16及17)。再者，这些CDR的氨基酸序列是根据Chothia法定义的序列。
【表5】
抗体 CDR1 CDR2 CDR3 CDR的电特性
抗TSHR抗体 GNSSNIGNNA YDD WDDSLDSQ 负电荷
由于在抗胰岛素抗体的CDR中，有1个碱性氨基酸残基(精氨酸)，不存在酸性氨基酸残基，CDR的电特性被定义为中性(X＝1)。如表5所示，由于在抗TSHR抗体的CDR中，有5个酸性氨基酸残基(天冬氨酸)，不存在碱性氨基酸残基，CDR的电特性被定义为负电荷(X＝-5)。如从图2A及B得知，由式(I)确定的抗胰岛素抗体及抗TSHR抗体的CDR的电特性与在Discovery Studiou分析的抗原结合部位的表面电荷一致。这样得知，因抗体而CDR的电特性及抗原结合部位的表面电荷有偏倚。
(3)结果
从实施例2及实施例3的分析提示，在CDR的电特性是中性的抗体中，由向FR3导入荷电氨基酸残基的贡献大。另外提示，在CDR的电特性是中性的抗体中，由因该导入而发生的静电相互作用而能进行抗原结合部位的取向控制。一方面提示，CDR的电特性是负电荷的抗体，即使向FR3导入碱性氨基酸残基，由静电相互作用的效果也是局部的。但是提示，在CDR的电特性是负电荷的抗体中，当向FR3导入酸性氨基酸残基时，则能由静电斥力降低对抗原的亲和性。
【实施例4：向FR3导入荷电氨基酸残基的抗体的热稳定性的探讨】
探讨在实施例1中制作的抗胰岛素抗体的各变体的热稳定性与野生型比，如何改变。
(1)由凝胶过滤的缓冲液的取代
将在实施例2中得到的含有Fab片段的溶液的溶剂，由凝胶过滤，用在利用示差扫描热量计(DSC)的测定中使用的缓冲液(磷酸缓生理盐水：PBS)取代。凝胶过滤的条件如下所述。
[凝胶过滤的条件]
缓冲液：PBS
使用的柱：Superdex 200Increase 10/300(GE Healthcare公司)
柱体积(CV)：24mL
样品体积：500μL
流速：1.0mL/min
溶出量：1.5CV
级分体积：500μL
(2)变性温度(Tm)的测定
将含Fab片段的级分用PBS稀释而调制含有Fab片段的样品(终浓度5μM)。使用MicroCal VP-Capillary DSC(Malvern Instruments Ltd公司)而测定各Fab片段的Tm。测定条件如下所述。
[DSC测定条件]
样品量：400μL
测定范围：30℃～90℃
升温速度：60℃/小时
(3)结果
由DSC测定取得的Tm值及解析峰各自示于表6及图3。
【表6】
样品 Tm(℃)
野生型 76.8±0.087
D5变体 66.9±0.046
E5变体 69.5±0.071
R5变体 71.1±0.150
R3变体 74.4±0.069
D5变体与野生型比而热稳定性最降低，但其降低停留在13％左右。得知在绝大部分的变体中，热稳定性与野生型比几乎不改变。从而提示，向FR3导入荷电氨基酸残基几乎不影响抗体的热稳定性。
【实施例5：抗溶菌酶抗体对于抗原的亲和性的控制】
基于CDR的电特性而向抗溶菌酶抗体的FR3导入变异，确认得到的变体对于溶菌酶的亲和性。
(1)抗溶菌酶抗体的CDR的电特性
向GenScript日本株式会社委托抗溶菌酶抗体的基因的合成而取得含野生型抗溶菌酶抗体的基因的质粒DNA。基于该基因的碱基序列而确定抗溶菌酶抗体的氨基酸序列。表7显示野生型的抗溶菌酶抗体的轻链及重链CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO:18～23)。再者，这些CDR的氨基酸序列是根据Chothia法定义的序列。
【表7】
CDR1 CDR2 CDR3
轻链 RASQSIGNNLH YASQSIS QQSNSWPYT
重链 SDYWS YVSYSGSTYYNPSLKS WDGDY
如表7所示，在抗溶菌酶抗体的轻链及重链的CDR中，碱性氨基酸残基有2个，酸性氨基酸残基有3个。从而，抗溶菌酶抗体的CDR的电特性被定义为中性(X＝-1)。
(2)抗溶菌酶抗体的变体的制作
向GenScript日本株式会社委托抗溶菌酶抗体的R5变体及D5变体的基因的合成而取得含抗溶菌酶抗体的变异型的基因的质粒DNA。其中，抗溶菌酶抗体的R5变体是将在野生型抗体中的根据Chothia法定义的轻链FR3的第63、第65及第67位的丝氨酸残基、第70位的天冬氨酸残基、及第72位的苏氨酸残基用精氨酸残基取代的抗体。另外，抗溶菌酶抗体的D5变体是将在野生型抗体中的根据Chothia法定义的轻链FR3的第63、第65及第67位的丝氨酸残基、第70位的天冬氨酸残基、及第72位的苏氨酸残基用天冬氨酸残基取代的抗体。
使用得到的质粒，与实施例1同样，使各抗体在Expi293(商标)细胞表达，纯化得到的培养上清而取得抗溶菌酶抗体的野生型、R5变体及D5变体的各自的溶液。
(3)变体的对于抗原的亲和性的测定
作为抗溶菌酶抗体的抗原，使用使鸡卵清来源溶菌酶(Sigma-Aldrich公司)溶解于10mM醋酸钠溶液(pH 5.0)的溶液(200ng/mL)。向Biacore(注册商标)用传感器芯片Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare公司)固定化抗原(41RU或33RU)。将各抗体的溶液用HBS EP+缓冲液(GE Healthcare公司)稀释而调制各种浓度的溶液。向Biacore(注册商标)T200(GE Healthcare公司)输送这些溶液。在各溶液中的抗体浓度及测定条件如下所述。使用Biacore(注册商标)评估软件解析测定数据，取得关于各抗体的亲和性的数据。
[抗体浓度]
野生型：30nM、15nM、7.5nM、3.75nM及1.875nM
D5变体：30nM、15nM、7.5nM、3.75nM及1.875nM
R5变体：2nM、1nM、0.5nM、0.25nM及0.125nM
[测定条件]
联合：30μL/min,60sec,120sec
解离：30μL/min,60sec,1200sec
再生：Gly-HCl(pH 2.0)/60μL/min,40sec
(4)结果
从对于抗溶菌酶抗体的野生型及变体得到的结合速度常数(kon)及解离速度常数(koff)算出解离常数(KD)。各抗体的动力学参数示于表8及图4。图中，“负电荷”表示D5变体的KD值，“正电荷”表示R5变体的KD值。
【表8】
样品 KD(M) kon(M-1s-1) koff(s-1)
野生型 2.34×10-10 4.88×105 1.14×10-4
D5变体(负电荷) 4.50×10-10 6.07×105 2.73×10-4
R5变体(正电荷) 2.81×10-12 3.34×107 9.40×10-5
表8及图4显示，抗溶菌酶抗体的R5变体的KD值变得低于野生型的KD值。另外，D5变体的KD值变得高于野生型的KD值。从而得知，通过对于抗溶菌酶抗体，将FR3的5个中性氨基酸残基变异为碱性氨基酸残基，可制作与野生型比，对于抗原的亲和性提高的抗体。另外得知，通过将FR3的5个中性氨基酸残基变异为酸性氨基酸残基，可制作与野生型比，对于抗原的亲和性降低的抗体。这些结果与实施例2的抗胰岛素抗体的变体同样。从而提示，在CDR的电特性是中性的抗体中，由因向FR3导入荷电氨基酸残基而发生的静电相互作用而能进行抗原结合部位的取向控制。
【实施例6：抗HBsAg抗体对于抗原的亲和性的控制】
基于CDR的电特性而向抗HBsAg抗体的FR3导入变异，确认得到的变体的对于溶菌酶的亲和性。
(1)抗HBsAg抗体的CDR的电特性
将重组型HBsAg用于抗原，由Kohler及Milstein,Nature,vol.256,p.495-497,1975中记载的方法制作产生小鼠抗HBsAg抗体的杂交瘤。与实施例1同样，从此杂交瘤的RNA取得含野生型的抗HBsAg抗体的基因的质粒DNA。基于该基因的碱基序列而确定抗HBsAg抗体的氨基酸序列。得知在野生型的抗HBsAg抗体中的根据Chothia法定义的轻链及重链CDR中，碱性氨基酸残基有2个，酸性氨基酸残基有10个。从而，抗HBsAg抗体的CDR的电特性被定义为负电荷(X＝-8)。
(2)抗HBsAg抗体的变体的制作
为了向根据Chothia法定义的轻链FR3导入变异，使用在上述(1)中得到的野生型抗HBsAg抗体的基因及下述的碱基序列所示的引物而与实施例1同样实施PCR。
[抗HBsAg抗体的引物]
D5变体FOR 5’-GGGACCGATTATGATCTCACAATCAGTCGAATGGAG-3’ SEQ ID NO:24
D5变体REV 5’-ATCCCCATCGGCATCGAAACGAACAGGGACTCCAGAAGC-3’ SEQ ID NO:25
使用得到的PCR产物而与实施例1同样地取得含编码变体或野生型的轻链的基因的质粒和含编码野生型的重链的基因的质粒。使用这些质粒，与实施例1同样，使各抗体在Expi293(商标)细胞表达，纯化得到的培养上清而取得抗HBsAg抗体的野生型及D5变体的各自的溶液。其中，抗HBsAg抗体的D5变体是将在野生型抗体中的根据Chothia法定义的轻链FR3的第63、第65、第67及第70位的丝氨酸残基、及第72位的苯丙氨酸残基用天冬氨酸残基取代的抗体。
(3)变体对于抗原的亲和性的测定
(3.1)捕获用抗体的固相化
除了作为捕获用抗体使用从与在上述(1)中得到的杂交瘤不同的杂交瘤产生的小鼠抗HBsAg抗体之外，与实施例2同样，使此捕获用抗体固相化于板(NUNC-免疫模块、CatNo.469949、NUNC公司制)的各孔。另外，与实施例2同样，将板的各孔用封闭溶液(含有1％BSA的PBS)封闭。
(3.2)第一次反应
作为抗HBsAg抗体的抗原，使用HISCL(注册商标)HBsAg校准物(HBsAg浓度0.025IU/mL、Sysmex株式会社)。从使捕获用抗体固相化的板除去封闭液，向各孔添加各50μL抗原溶液。将此板于室温振荡60分钟而进行抗原抗体反应。
(3.3)第二次反应及检测
作为检测用抗体，使用抗HBsAg抗体的野生型及D5变体。将各抗体用含有1％BSA的PBS阶段性地稀释而得到400nM、80nM、16nM、3.2nM、640pM、128pM、25.6pM及5.12pM的浓度的抗体溶液。另外，作为第二抗体，使用HRP标记抗小鼠IgG(Fc特异性)抗体。使用这些而与实施例2同样地进行抗原抗体反应。进而，作为底物溶液，使用1步Ultra TMB-ELISA底物溶液(Thermo Fisher Scientific公司)，与实施例2同样，对于板的各孔而测定450nm处的吸光度。
(4)结果
从使用抗HBsAg抗体的野生型及D5变体的ELISA法的测定值算出解离常数(KD)。结果示于表9及图5。图中，“负电荷”表示D5变体的KD值。
【表9】
样品 KD(M)
野生型 2.00×10-10
D5变体(负电荷) 3.00×10-9
表9及图5显示，抗HBsAg抗体的D5变体的KD值变得高于野生型的KD值。另外，D5变体的KD值变得高于野生型的KD值。从而得知，通过对于抗HBsAg抗体，将FR3的5个中性氨基酸残基变异为酸性氨基酸残基，可制作与野生型比，对于抗原的亲和性降低的抗体。这些结果与实施例2的抗TSHR抗体的D5变体及E5变体同样。从而提示，在CDR的电特性是负电荷的抗体中，能通过由向FR3导入酸性氨基酸残基发生的静电的斥力降低而对抗原的亲和性。
序列表
<110> SYSMEX CORPORATION
<120> 改变抗体对抗原的亲和性的方法及该亲和性被改变的抗体
<130> 16-029CN
<150> JP2016-255492
<151> 2016-12-28
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
ttcgtattcg gtcccttccc cttcgccttc aaagcgagca 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
atcgtaatcg gtcccatccc catcgccatc aaagcgagca 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
cttgtacttg gtccccttcc ccttgccctt aaagcgagca 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tctgtatctg gtccctctcc ctctgcctct aaagcgagca 40
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ctcacaatca gctgattg 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
tctccctctg cctctaaagc gagca 25
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gggaccagat acaga 15
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
ggcacagacg ccgacctggc aatca 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gtcccggtct ccgtcaaacc ggtcg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
ggcacagagg ccgagctggc aatca 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
ctcccgctct ccctcaaacc ggtcg 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
ggcacaaagg ccaagctggc aatca 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
cttccgcttt cccttaaacc ggtcg 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
ggcacaaggg ccaggctggc aatca 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
cctccgcctt cccctaaacc ggtcg 25
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Trp Asp Asp Ser Leu Asp Ser Gln
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 18
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 19
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 20
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 21
Ser Asp Tyr Trp Ser
1 5
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 22
Tyr Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 23
Trp Asp Gly Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
gggaccgatt atgatctcac aatcagtcga atggag 36
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
atccccatcg gcatcgaaac gaacagggac tccagaagc 39

Claims (17)

1.控制抗体对于抗原的亲和性的方法，其中在基于互补性决定区域(CDR)的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷的抗体中，将根据Chothia法定义的框架区域3(FR3)的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代。
2.权利要求1所述的方法，其中在上述CDR的电特性是中性的抗体中，通过将FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低。
3.权利要求1或2所述的方法，其中在上述CDR的电特性是中性的抗体中，通过将FR3的至少3个氨基酸残基用碱性氨基酸残基取代，使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比提高。
4.权利要求1～3之任一项所述的方法，其中在上述CDR的电特性是负电荷的抗体中，通过将FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低。
5.权利要求1～4之任一项所述的方法，其中上述FR3是轻链的FR3。
6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中上述CDR的电特性由以下的式(I)确定。
X＝[CDR的氨基酸序列中的碱性氨基酸残基的数]-[CDR的氨基酸序列中的酸性氨基酸残基的数]…(I)
式中，
当X是-1、0或1时，CDR的电特性是中性，
当X是2以上时，CDR的电特性是正电荷，
当X是-2以下时，CDR的电特性是负电荷。
7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其中上述至少3个氨基酸残基选自上述根据Chothia法定义的
轻链的FR3的第53～81位的氨基酸残基、或
重链的FR3的第56～88位的氨基酸残基。
8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其中上述抗体是抗体片段的形态。
9.权利要求8所述的方法，其中上述抗体片段是Fab片段。
10.对于抗原的亲和性发生改变的抗体的制造方法，其包括：
在基于互补性决定区域(CDR)的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷的抗体中，将根据Chothia法定义的框架区域3(FR3)的至少3个氨基酸残基用荷电氨基酸残基取代的工序，及
回收在上述取代工序中得到的抗体的工序。
11.权利要求10所述的方法，其中上述取代工序是：
在上述CDR的电特性是中性的抗体中，将上述FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低的工序、
在上述CDR的电特性是中性的抗体中，将上述FR3的至少3个氨基酸残基用碱性氨基酸残基取代，使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比提高的工序、或者
在上述CDR的电特性是负电荷的抗体中，将上述FR3的至少3个氨基酸残基用酸性氨基酸残基取代，使抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低的工序。
12.权利要求10或11所述的方法，其中在确定上述电特性的工序中，CDR的电特性由以下的式(I)确定。
X＝[CDR的氨基酸序列中的碱性氨基酸残基的数]-[CDR的氨基酸序列中的酸性氨基酸残基的数]…(I)
式中，
当X是-1、0或1时，CDR的电特性是中性，
当X是2以上时，CDR的电特性是正电荷，
当X是-2以下时，CDR的电特性是负电荷。
13.权利要求10～12之任一项所述的方法，其中上述FR3是轻链的FR3。
14.对于抗原的亲和性发生改变的抗体，其中基于互补性决定区域(CDR)的氨基酸序列的CDR的电特性是中性或负电荷，在未改变的抗体中的根据Chothia法定义的框架区域3(FR3)的至少3个氨基酸残基被荷电氨基酸残基取代。
15.权利要求14所述的抗体，其中上述CDR的电特性是中性，FR3的至少3个氨基酸残基被酸性氨基酸残基取代，抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低。
16.权利要求14或15所述的抗体，其中上述CDR的电特性是中性，FR3的至少3个氨基酸残基被碱性氨基酸残基取代，抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比提高。
17.权利要求14～16之任一项所述的抗体，其中上述CDR的电特性是负电荷，FR3的至少3个氨基酸残基被酸性氨基酸残基取代，抗体对于抗原的亲和性与未改变的抗体比降低。
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