CN108245505A - 一种黄烷醇类化合物在制备保健品或药物中的应用 - Google Patents

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CN108245505A CN201810049897.5A CN201810049897A CN108245505A CN 108245505 A CN108245505 A CN 108245505A CN 201810049897 A CN201810049897 A CN 201810049897A CN 108245505 A CN108245505 A CN 108245505A
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沈涛
李爱玲
王小宁
任冬梅
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Abstract

本发明公开了一种黄烷醇类化合物在制备预防和治疗氧化应激诱发疾病保健品和药物中的应用，所述黄烷醇类化合物的化学式为：

Description

一种黄烷醇类化合物在制备保健品或药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及黄烷醇类的应用，具体涉及一种黄烷醇类化合物在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病药物或保健品中的应用。
背景技术
神经退行性疾病、糖尿病，心血管疾病，慢性阻塞性肺病，肿瘤等，这些疾病具有共同的特点——氧化应激在其发病机制中起重要作用。氧化应激是体内氧化状态与抗氧化作用的失衡，并倾向于氧化的状态，主要特征是细胞内过量存在活性氧和活性氮，过量的活性氧损伤细胞内脂类、蛋白质和DNA导致细胞损伤，进而引发神经退行性疾病、糖尿病，心血管疾病，慢性阻塞性肺病，肿瘤。日常生活中，诱发氧化应激因素包括：环境因素，环境污染物如碳硫氮氧化物(CO、SO2、NO2等)、重金属(铅、铬、砷等)、建筑矿物尘形成的雾霾；生活因素：不健康饮食或生活习惯，如过多的食用烧烤油炸类食物、吸烟。
核转录因子Nrf2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2)信号通路是调控人体氧化应激的关键通路，是调节细胞氧化还原平衡的重要转录因子，通过与抗氧化酶和II相解毒酶启动子区域抗氧化反应原件(ARE)结合调控细胞氧化还原平衡，其目标基因包括编码GST、UGT、NQO1的II相解毒酶，及γGCS、HO-1等内源性抗氧化蛋白。当机体暴露于外源性损伤物等诱发氧化应激损害的因素时，Nrf2便会激活抗氧化酶和II相解毒酶清除有害污染物，预防其对细胞组织的损害，保护机体免受到侵害。
预防和治疗氧化应激引起的机体损害，可以利用小分子Nrf2激动剂上调人体器官和组织Nrf2水平，上调II相解毒酶水平，能够增加细胞内谷胱甘肽水平，增强抗氧化酶活性，清除细胞内活性氧，抑制细胞脂质过氧化，降低慢性阻塞性肺疾病、慢性肾病、呼吸道炎症、糖尿病、神经退行性疾病等疾病的发病率。
天然产物是药物先导化合物的重要来源，对人类药物发展史做出了重要贡献。从天然产物中寻找具有预防和治疗作用的先导化合物，是药物研发的重要途径。肉桂为常用香料和中药，研究证明，肉桂具有预防和治疗糖尿病、心血管疾病的作用。它已被美国食品和药物管理局批准为膳食补充剂，用于调节糖脂代谢和预防心脑血管疾病。肉桂提取物具有Nrf2激动作用，具有成为防治氧化应激诱发疾病药物的潜力。研究证明，肉桂中含有倍半萜类、酚酸类、木脂素类、黄酮类、黄烷醇类、苯丙素类、香豆素类、甾体类、等多种化学成分，其中以以肉桂醛及其衍生物为代表的苯丙素类化合物研究最多，肉桂醛及其衍生物和酚酸类化合物被认为是肉桂中的主要抗氧化成分，对肉桂中的其他类型化学成分的生物活性和药理作用，鲜有研究。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种黄烷醇类化合物在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病的药物或保健品中的应用，能够预防和治疗慢性阻塞性肺疾病、慢性肾病、呼吸道炎症、糖尿病、神经退行性疾病和肿瘤疾病。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种黄烷醇类化合物在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病的药物或保健品中的应用，所述黄烷醇类化合物的化学式为：
命名为：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇。
本发明的发明人通过研究发现5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够上调Nrf2及其调控的抗氧化酶γGCS、II相脱毒酶NQO1蛋白水平，其激活机制是通过增加Nrf2蛋白稳定性抑制Nrf2蛋白降解实现的；采用砷诱导的肺支气管上皮Beas-2B细胞损伤模型评价了5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的细胞保护作用，结果表明该化合物能够增加细胞内源性抗氧化剂GSH水平，抑制砷诱导Beas-2B细胞损伤和凋亡；对人肾小球内皮细胞HRGEC细胞、人神经SHSY5Y细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞表现出相似的细胞保护作用。上述实验结果表明，本发明涉及的5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇具有防治慢性阻塞性肺疾病、慢性肾病、呼吸道炎症、糖尿病、神经退行性疾病和肿瘤疾病的作用。
本发明的目的之二是提供一种实现上述应用的药物组合物，有效组分包括5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇。
本发明的目的之三是提供一种实现上述应用的药剂，包括上述5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇及辅料。
本发明的目的之四是提供一种上述药剂的制备方法，将5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇、淀粉及糊精混合后过筛，再加入羧甲基纤维素钠制粒，然后加入硬脂酸镁混合后压片即得片剂。
本发明的有益效果为：
本发明的发明人通过研究发现5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够上调Nrf2及其调控的抗氧化酶γGCS、II相脱毒酶NQO1蛋白水平，其激活机制是通过增加Nrf2蛋白稳定性抑制Nrf2蛋白降解实现的；采用砷诱导的肺支气管上皮Beas-2B细胞损伤模型评价了5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的细胞保护作用，结果表明该化合物能够增加细胞内源性抗氧化剂GSH水平，抑制砷诱导Beas-2B细胞损伤和凋亡；对人肾小球内皮细胞HRGEC细胞、人神经SHSY5Y细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞表现出相似的细胞保护作用。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为NQO1的诱导活性试验的柱状图，表明5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇对能够诱导Hepa 1c1c7细胞II相解毒酶NQO1的表达并增强其活性，图中的5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇浓度为6.25～200μM，萝卜硫素2.0μM为阳性对照；
图2为不同浓度5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的免疫印迹分析图，表明5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够上调Nrf2和其下游抗氧化γGCS和II相解毒酶蛋白NQO1蛋白水平，其中，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇浓度浓度为0～50μM；
图3为细胞免疫荧光显微照片，表明5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够促进Nrf2转位入核，图中萝卜硫素2.0μM为阳性对照，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇为12.5μM；
图4为不同时间5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的免疫印迹分析图，表明5,7-二甲氧基-3'，4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够延长Nrf2蛋白半衰期，其中，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇浓度为12.5μM；
图5为不同物质对谷胱甘肽的影响的柱状图，表明5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够增加人支气管上皮Beas-2B细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽水平，其中，萝卜硫素5μM为阳性对照，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇浓度为3.12～25μM；
图6为细胞毒性试验的细胞存活量的柱状图，表明5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够降低砷诱导的细胞毒性，其中，A为不同浓度5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇对10μM砷诱导细胞毒性的保护作用，B为12.5μM 5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇对不同浓度砷诱导细胞毒性的保护作用；
图7为细胞调亡的荧光显微照片，AO/EB染色表明5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够抑制砷诱导的细胞凋亡，其中，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇浓度为25μM，砷的浓度为5μM。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在对肉桂活性成分研究不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出一种黄烷醇类化合物在制备保健品或药物中的应用。
本申请的一种典型实施方式，提供了一种黄烷醇类化合物在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病的药物或保健品中的应用，所述黄烷醇类化合物的化学式为：
命名为：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇。
本申请的发明人通过研究发5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够上调Nrf2及其调控的抗氧化酶γGCS、II相脱毒酶NQO1蛋白水平，其激活机制是通过增加Nrf2蛋白稳定性抑制Nrf2蛋白降解实现的；采用砷诱导的肺支气管上皮Beas-2B细胞损伤模型评价了5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的细胞保护作用，结果表明该化合物能够增加细胞内源性抗氧化剂GSH水平，抑制砷诱导Beas-2B细胞损伤和凋亡；人肾小球内皮细胞HRGEC细胞、人神经SHSY5Y细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞表现出相似的细胞保护作用；上述实验结果表明，本申请涉及的5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇具有防治慢性阻塞性肺疾病、慢性肾病、呼吸道炎症、糖尿病、神经退行性疾病和肿瘤疾病的作用。
优选的，所述氧化应激诱发的疾病为慢性阻塞性肺疾病、慢性肾病、呼吸道炎症、糖尿病、神经退行性疾病或肿瘤疾病。
优选的，所述黄烷醇类化合物的浓度为12.5～25μM。该浓度下对细胞产生更好保护作用。进一步优选的，所述5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的浓度为12.5μM。该浓度下对细胞产生最佳保护作用。
优选的，黄烷醇类化合物的制备方法为，肉桂药材以95％乙醇提取得乙醇提取物，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分依次采用石油醚与乙酸乙酯体积比为100:0、95:5、90:10进行洗脱，分别记为Fr.1、Fr.2、Fr.3，Fr.3依次采用石油醚与乙酸乙酯体积比为95:5、90:10、85:15进行洗脱，分别记为Fr3A-B、Fr3C-D、Fr3E，Fr3E通过SephadexLH-20凝胶柱分离，按洗脱顺序先后得到五个部分，第五部分记为Fr3E5，Fr3E5再通过Sephadex LH-20凝胶柱分离，按洗脱顺序先后得到4个部分，第4部分记为Fr3E5d，Fr3E5d通过HPLC得到黄烷醇类化合物，即为5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇。所述5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的化学式为
进一步优选的，Fr.3在进行洗脱之前先先用硅胶柱进行分离。
5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇激活Nrf2信号通路作用以及对污染物诱发细胞损伤保护作用的研究：
采用小鼠Hepa 1c1c7肝癌细胞系，评价了5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇对II相脱毒酶NQO1的诱导作用，结果表明5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇具有上调NQO1活性，即5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇具有抑制氧化应激的作用(图1)。
采用人正常肺上皮细胞Beas-2B细胞，评价了5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇对细胞Nrf2信号通路的作用。蛋白质印迹分析结果表明，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够上调Nrf2蛋白的表达，并能促进下游抗氧化γGCS和II相解毒酶蛋白NQO1的表达(图2)。细胞免疫荧光试验表明，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够促进Nrf2转位入核(图3)，并进一步激活下游基因。进一步研究表明，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够延长Nrf2蛋白半衰期，抑制Nrf2蛋白降解，增加其稳定性(图4)。
选择砷诱导的细胞毒性模型，评价5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇对人正常肺上皮细胞Beas-2B的保护作用。研究已证实，砷通过增加细胞内活性氧水平、诱发细胞氧化应激，导致细胞损伤和死亡。结果表明，经5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇处理细胞其生存率显著高于未加药处理组，证明该化合物能够显著抑制砷诱导的细胞毒性，在25μM对细胞产生最佳保护作用(图6)；此外，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够抑制砷诱导的细胞凋亡。该结果证明，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇可作为药物或保健品用于预防和治疗肿瘤的预防和治疗。
本申请的另一种实施方式，提供了一种实现上述应用的药物组合物，有效组分包括上述黄烷醇类化合物。
本申请的第三种实施方式，提供了一种实现上述应用的药剂，包括上述黄烷醇类化合物及辅料。所述辅料为医学上可接受的辅料。
优选的，所述药剂为胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、注射剂、口服液、酒剂、丸剂、合剂或酊剂。
本申请的第四种实施方式，提供了一种上述药剂的制备方法，将上述5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇、淀粉及糊精混合后过筛，再加入羧甲基纤维素钠制粒，然后加入硬脂酸镁混合后压片即得片剂。
优选的，所述5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇、淀粉及糊精质量比为1～2:1～2:2～4。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
实施例1：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的制备和结构确证
5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的获得方法如下：肉桂药材以95％乙醇提取得乙醇提取物，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯部分采用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，洗脱剂浓度分别为：石油醚-乙酸乙酯＝100：0、石油醚-乙酸乙酯＝95：5、石油醚-乙酸乙酯＝90：10、石油醚-乙酸乙酯＝85：15、石油醚-乙酸乙酯＝80：20、石油醚-乙酸乙酯＝70：20、石油醚-乙酸乙酯＝60：40、石油醚-乙酸乙酯＝50：50，合并后得8个部分(Fr.1-8)。Fr.3(石油醚-乙酸乙酯＝90：10洗脱部分)先用硅胶柱分离，以石油醚/乙酸乙酯(95:5→70:30)为流动相梯度洗脱，共得到7个部分(Fr.3A-G)，其对应的洗脱剂浓度分别为Fr3A-B(石油醚-乙酸乙酯＝95：5)、Fr3C-D(石油醚-乙酸乙酯＝90：10)、Fr3E(石油醚-乙酸乙酯＝85：15)、Fr3F(石油醚-乙酸乙酯＝80：20)、Fr3G(石油醚-乙酸乙酯＝70：30)。Fr3E部分先通过Sephadex LH-20凝胶柱分离，依照从柱子上洗脱先后顺序，共得到5个部分(Fr.3E1-5)。Fr3E5再通过Sephadex LH-20凝胶柱分离，共得到4个部分(Fr.3E5a-d)。Fr3E5d通过HPLC得到化合物5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇。
方法：以DMSO-d6为溶剂，TMS为内标，采用核磁共振波谱仪测定其氢谱并进行结构解析。
结果：化合物的1H-NMR信号为δH:7.05(1H,d,J＝1.2Hz,H-2′)；6.96(1H,dd,J＝8.4,1.2Hz,H-6′)；6.85(1H,d,J＝8.4Hz,H-5′)；6.18(1H,d,J＝2.4Hz,H-8)；6.12(1H,d,J＝2.4Hz,H-6)；5.98(2H,dd,J＝2.4,1.2Hz,-OCH2O-)；4.93(1H,s,H-2)；4.25(1H,m,H-3)；3.79(3H,s,5-OMe)；3.77(3H,s,7-OMe)；2.94(1H,dd,J＝17.4,2.4Hz,H-4a)；2.88(1H,dd,J＝16.8,4.2Hz,H-4b)。经结构确证为5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇。
实施例2：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇的NQO1诱导活性评价
(1)小鼠肝癌细胞Hepa 1c1c细胞系的培养
小鼠肝癌细胞Hepa 1c1c细胞系购自美国模式培养物集存库(ATCC)，采用含10％胎牛血清(FBS)的MEM培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)NQO诱导活性试验
将Hepa 1c1c细胞接种于96孔板上，细胞贴壁后加入不同浓度的5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇(实施例1确证)，处理24h，采用0.8％洋地黄皂苷溶液裂解细胞，加入检测液(1.0mL 0.5M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl),15mg牛血清白蛋白,6mgMTT,150μL吐温-20,150μL 150mM D-葡萄糖-6-磷酸，15μL 7.5mM黄素腺嘌呤二核苷酸，27μL 50mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，20μL 50mM甲萘醌)，放置3min，于630nm测定发光强度。
结果：如图1所示，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够激活Hepa1c1c7细胞中NQO1活性，其最大诱导活性为3.20倍(100μM)，阳性对照药物萝卜硫素(2.0μM)是空白对照组的3.58倍。上述结果表明，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够激活II相脱毒酶，对人体细胞具有保护作用。
实施例3：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够上调Nrf2、γGCS和NQO1蛋白水平。
方法：蛋白质印迹分析(Western blot)检测细胞中蛋白水平的变化
将Beas-2B细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70％-80％后，加入不同浓度的待测化合物处理16h，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液(50μg/ml抑肽酶,0.5mM苯甲基磺酰氟,1mM正钒酸钠,10mM氟化钠,10mMβ-磷酸甘油)，收集蛋白并采用Bradford法测定蛋白浓度。各取样品蛋白(100μg)上样，SDS-PAGE分离蛋白组分并采用电转移法将蛋白条带转移至硝酸纤维素薄膜上。薄膜经TBS配制5％的脱脂奶粉溶液室温封闭1h后，分别与各待测蛋白抗体4℃孵育过夜。经TBS洗涤后分别加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1h后,用增强型ECL化学发光进行蛋白分析。
结果：如图2所示，细胞经5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇处理16h后，Nrf2及其下游抗氧化和II相解毒酶蛋白NQO1和γGCS蛋白水平呈现剂量依赖性增加，Keap1蛋白水平无变化，证实该化合物能够在蛋白水平上激活Nrf2信号通路。
实施例4：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇促进Nrf2蛋白转位入核
方法：免疫荧光法检测Nrf2细胞内位置
将细胞爬片放置于24孔板中，接种Beas-2B细胞，待细胞贴壁后加入5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇处理8h，PBS洗涤2次，加入甲醇-丙酮(1:1)固定4h，PBS洗涤2次，加入Nrf2抗体孵育1h，PBS洗涤3次，加入DAPI和荧光二抗孵育50min，采用荧光显微镜观察并拍照。
结果：免疫荧光结果显示(图3)，细胞正常状态下，Nrf2位于细胞质中，加入5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇和阳性对照萝卜硫素处理8h后，Nrf2转位进入细胞核。
实施例5：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇增加Nrf2蛋白稳定性
方法：蛋白质印迹分析检测Nrf2蛋白半衰期
将Beas-2B细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70％-80％后，加入5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇8h，然后加入放线菌酮，计时，分别在0、10、20、30、40min收取蛋白，进行蛋白质印迹分析检测，采用Image J软件进行量化。
结果：如图4所示，空白组Beas-2B细胞Nrf2蛋白半衰期为15.9min，经5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇处理8h后，Nrf2蛋白半衰期延长至42.4min，表明5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够延长Nrf2蛋白半衰期。
实施例6：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够增加细胞内源性抗氧化剂谷胱甘肽水平
(1)人正常表皮Beas-2B细胞的培养
人正常肺支气管上皮Beas-2B细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)，采用1640培养基，并向其中加入10％胎牛血清(FBS)，5％谷氨酰胺，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)细胞内谷胱甘肽含量的测定
将Beas-2B细胞接种于直径35mm培养皿中，培养至密度达到70％-80％后，加入不同浓度的5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇(实施例1确证)处理24h，PBS洗涤2次，加入0.5mL 50mM磷酸钠和1mM EDTA缓冲液收细胞，超声1min，10000g离心15min，取上清液，按照谷胱甘肽测定试剂盒说明书操作，412nm测定吸光度并计算谷胱甘肽含量。
结果：如图5所示，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够显著增加细胞内谷胱甘肽水平，增强细胞内还原能力。
实施例7：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇对砷诱导的人支气管上皮Beas-2B细胞损伤的保护作用
方法：MTT法测定中药组合物对砷诱导的细胞毒性的保护作用
将Beas-2B细胞接种于96孔板上，细胞贴壁后，采用待测浓度5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇预处理细胞8h，加入不同浓度的砷和待测浓度5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇(实施例1确证)处理48h，或者加入MTT 3h后，590nm测定吸光度并计算细胞生存率。
结果：如图6A所示，采用5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇预处理细胞8h，能够显著抑制10μM砷诱发的细胞毒性，增加细胞生存率，其中12.5μM浓度5,7-二甲氧基-3'，4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇活性最佳。如图6B所示，采用12.5μM浓度5,7-二甲氧基-3'，4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇作为保护药物，能够显著抑制5、10、20μM的砷诱发的细胞毒性，增加细胞生存率。结果证明，5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够抑制致癌物砷诱导的毒性。
实施例8：5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇能够抑制砷诱导的细胞调亡
将Beas-2B细胞接种于35mm培养皿，贴壁后加入5μM砷或12.5μM 5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇处理12h，分别加入吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)进行染色，并采用荧光显微镜观察细胞状态。
结果：如图7所示，采用砷或5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇共处理12h，能够显著抑制砷诱导的细胞凋亡。
实施例9：片剂的制备
5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇(实施例1确证)1g，加入淀粉1g、糊精2g，过筛，加入羧甲基纤维素钠适量，制粒。加入硬脂酸镁适量，混匀，压片，即得。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种黄烷醇类化合物在制备预防或治疗氧化应激诱发疾病的药物或保健品中的应用，所述黄烷醇类化合物的化学式为：
2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述氧化应激诱发疾病为慢性阻塞性肺疾病、慢性肾病、呼吸道炎症、糖尿病、神经退行性疾病或肿瘤疾病。
3.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述黄烷醇类化合物的浓度为12.5～25μM。
4.如权利要求1所述的应用，其特征是，黄烷醇类化合物的制备方法为，肉桂药材以95％乙醇提取得乙醇提取物，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分依次采用石油醚与乙酸乙酯体积比为100:0、95:5、90:10进行洗脱，分别记为Fr.1、Fr.2、Fr.3，Fr.3依次采用石油醚与乙酸乙酯体积比为95:5、90:10、85:15进行洗脱，分别记为Fr3A-B、Fr3C-D、Fr3E，Fr3E通过Sephadex LH-20凝胶柱分离，按洗脱顺序先后得到五个部分，第五部分记为Fr3E5，Fr3E5再通过Sephadex LH-20凝胶柱分离，按洗脱顺序先后得到4个部分，第4部分记为Fr3E5d，Fr3E5d通过HPLC得到黄烷醇类化合物，即为5,7-二甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄烷-3-醇。
5.如权利要求4所述的应用，其特征是，所述Fr.3在进行洗脱之前先先用硅胶柱进行分离。
6.一种实现权利要求1～5任一所述的应用的药物组合物，其特征是，有效组分包括权利要求1～3任一所述应用中采用的黄烷醇类化合物。
7.一种实现权利要求1～5任一所述的应用的药剂，其特征是，包括权利要求1～5任一所述应用中采用的黄烷醇类化合物及辅料。
8.如权利要求7所述的药剂，其特征是，所述药剂为胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、注射剂、口服液、酒剂、丸剂、合剂或酊剂。
9.一种如权利要求8所述的药剂的制备方法，其特征是，将权利要求1～5任一所述应用中采用的黄烷醇类化合物、淀粉及糊精混合后过筛，再加入羧甲基纤维素钠制粒，然后加入硬脂酸镁混合后压片即得片剂。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征是，所述黄烷醇类化合物、淀粉及糊精质量比为1～2:1～2:2～4。
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