CN108159027A - 一种协同抑制mitf和trp1的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种协同抑制MITF和TRP1的组合物及其用途，所述组合物按摩尔质量比为0.11的比例由白藜芦醇和氧化白藜芦醇组成。实验证明，本发明的组合物协同抑制MITF和TRP1的作用，可用于治疗黄褐斑、痤疮后红斑、雀斑、老年斑、晒后修复及抗氧化。

Description

一种协同抑制MITF和TRP1的组合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种具有抗氧化活性的组合物，特别是涉及一种协同抑制MITF和TRP1的组合物及其用途。
背景技术
黄褐斑是最常见的黑色素沉着性疾病,多发于中青年妇女脸部裸露的部位，影响美观，同时又难以治疗，是医学领域较难解决的一大疾病问题。其特点有：发病受多种因素影响(紫外线刺激、炎症反应等)、顽固、易复发。现在针对黄褐斑的治疗技术和祛斑产品繁多，大多成本高，费用昂贵；但是疗效差强人意，且几乎都伴有不良反应。
黑色素合成是由复杂的调控系统调节的，小眼畸形相关转录因子(MITF)可调控酪氨酸基因家族(TYR和TRP1(人酪氨酸酶相关蛋白1))的表达，从而参与黑色素细胞中黑色素生成的调控。受紫外线照射刺激后的黑色素细胞中的MITF及其下游基因、酪氨酸酶和TRP1上调，可促进黑色素的合成，故抑制MITF和TRP1的表达可降低黑色素的合成，避免黄褐斑的产生。
目前尚未有将白藜芦醇与氧化白藜芦醇组合成组合物协同用于抑制MITF和TRP1。
发明内容
本发明的目的是提供一种协同抑制MITF和TRP1的组合物。
本发明的第二个目的是提供一种协同抑制MITF和TRP1的组合物在制备具有抑制MITF和 TRP1的药物或化妆品的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种协同抑制MITF和TRP1的组合物，按摩尔比为0.11的比例由白藜芦醇和氧化白藜芦醇组成。
上述组合物在制备具有抑制MITF和TRP1的药物或化妆品的应用。
本发明的优点：
本发明的一种协同抑制MITF和TRP1的组合物，实验证明白藜芦醇与氧化白藜芦醇合用能达到协同增效的作用，减少了单组份使用时的用量。本发明的组合物可用于治疗黄褐斑、晒后修复及抗氧化。
附图说明
图1为白藜芦醇与氧化白藜芦醇摩尔比为0.11时对细胞内MITF和TRP1的抑制作用。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种协同抑制MITF和TRP1的组合物，按摩尔比为0.11的比例由白藜芦醇和氧化白藜芦醇组成。
实施例2
实施例1的组合物对细胞内MITF和TRP1的抑制作用。
1材料与试剂
1.1实验仪器
实验仪器见表1
表1实验所用仪器一览表
1.2实验试剂
实验所用试剂见表2
表2实验所用试剂一览表
2样品制备
完全M254培养基的配制：5％胎牛血清的M254培养基，加入HMGS，体积含量为0.5％(不含抗生素)。
样品母液的配制：以DMSO为溶剂，分别配制浓度为100mM的氧化白藜芦醇母液和白藜芦醇母液，备用。
白藜芦醇样品的配制：取白藜芦醇100mM的母液0.6μL加入到10mL的完全M254培养基中混匀，得到6μM的白藜芦醇的溶液。
氧化白藜芦醇样品的配制：取氧化白藜芦醇100mM的母液5.4μL加入到10mL的完全M254培养基中混匀，得到54μM的氧化白藜芦醇的溶液。
白藜芦醇和氧化白藜芦醇组合物的配制：取白藜芦醇和氧化白藜芦醇100mM的母液分别0.6和5.4μL，加入到10mL的完全M254培养基中混匀，得到白藜芦醇和氧化白藜芦醇的浓度比为0.11μM的溶液。
电泳缓冲液的配制：分别准确称取Tris 3.03g，甘氨酸8.77g，SDS 1g，加蒸馏水至1000mL 溶解后至室温保存。
转膜液的配制：分别准确称取甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，加入甲醇200mL，加蒸馏水至1000mL，调节pH值至8.3左右。
1.5mol/L Tris-HCl(pH＝8.8)溶液的配制：准确称取Tris 45.43g，使用超纯水200mL溶解后，用浓盐酸调pH值至8.8，最后用超净水定容至250mL，高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris-HCl(pH＝6.8)溶液的配制：准确称取Tris 15.14g，使用超纯水200mL溶解后，用浓盐酸调pH值至6.8，最后用超净水定容至250mL，高温灭菌后室温下保存。
1mol/LTris-HCl(pH＝7.5)溶液的配制：准确称取Tris 30.29g，使用超纯水200mL溶解后，用浓盐酸调pH值至7.5，最后用超净水定容至250mL，高温灭菌后室温下保存。
TBS溶液的配制：量取Imol/LTris-HCI(pH＝7.5)溶液10mL，准确称取NaCl8.8g，加蒸馏水至1000mL，保存备用。
TBST溶液的配制：精密量取20％Tween201.65mL，量取TBS溶液700mL,混习后即可使用，现用现配。
封闭液的配制：称取脱脂奶粉5g，加入TBST溶液100mL溶解后，调节封闭液pH值至7.3左右，放于4℃保存，使用时恢复室温，一次性使用。
10％SDS溶液的配制：称取SDS粉末10g，加蒸馏水至1000mL使其在50℃下洛解，室温保存。如在长期保存下出现沉淀，加热溶化后仍可使用。
10％AP溶液的配制：称取AP 0.1g，用超净水1mL溶解后，4℃保存，保存时间为一周。
3实验方法
3.1人表皮黑色素细胞PIG1的培养
人表皮黑色素细胞PIG1置于完全M254培养基中，于含5％CO2的37℃孵育箱中常规培养。用0.05％的胰酶消化细胞后，计数，接种于96孔板中，每孔个数为104个，置于孵育箱中培养24h。弃掉培养基加入100μL的PBS溶液，于300mJ的UVB下照射168s后，弃掉 PBS溶液后向对应的96孔板中分别加入完全M254培养基(对照组)、加入步骤2配制的白藜芦醇样品(RES组)，加入步骤2配制的氧化白藜芦醇样品(OXY组)，加入步骤2配制的白藜芦醇和氧化白藜芦醇组合物(OXY+RES组)培养48h后收取蛋白。
3.2总蛋白的提取、定量及变性
3.2.1总蛋白的提取
将3.1中各组96孔板中培养基弃去，加入预冷的PBS 1mL洗涤1次，弃去PBS，每孔加入配好的工作液100μL(Ripa：蛋白酶抑制剂＝100:1)，在冰上孵育20min后转移至新的离心管中，14000×g条件下离心10min后取上清液至新的离心管中备用。
3.2.2总蛋白的定量
根据BCA蛋白定量试剂盒说明书做一条标准曲线。根据样品数计算所需BCA工作液总量，将BCA-A和BCA-B按照50：1的体积比配制工作液并充分混匀。在新的96孔板中每孔加入40μL(200μL)BCA工作液。取3.2.1中的上清液5μL(25μL)加入到BCA工作液中，充分混匀，盖上96孔板盖，37℃孵育30min，冷却至室温后在562nm下用酶标仪测定吸光值，根据标曲计算浓度。须在3-5min内完成检测。
3.2.3总蛋白的变性
根据蛋白上样的浓度，加入5×蛋白上样缓冲液，涡旋混匀，置于水浴95℃煮7min，冷却至室温后放置于冰上备用，即得上样的样品。
3.3采用western-blot方法检测MITF和TRP1蛋白
3.3.1制胶与上样
选择洁净的玻璃板固定于板架上。配制适量体积的分离胶(约7.5mL/板)，配制完成后摇匀立即灌胶，待胶面升至玻璃板中间刻度时(可达上层红色界面)停止灌胶，加入适量无水乙醇排气泡、压平液面。等待30min后，灌入现配好的积层胶(约4mL/板)。待积层胶灌入结束后立即插入梳子，形成进样孔。等待30min后，待积层胶凝固后，拔出梳子，拔梳子这一动作在电泳液中进行。之后向胶两端的进样孔各加入5μLMark溶液，其余各孔顺次加入
3.2.3中对照组、OXY组、RES组和OXY+RES组(实施例1)的样品，每组样品设置两复孔。
3.3.2电泳
将电泳槽以“红对红、黑对黑”的方式连接电路进行电泳。积层胶电泳30min，电压为 60V；分离胶电泳55min，电压为110V。
3.3.3转膜
电泳结束后，对照Mark，将3.3.2中电泳结束后的分离胶切出目的蛋白所在的胶条。打开转膜时所需夹子，使黑面保持水平，在上面垫一块海绵垫。将剥下的胶条盖在位于海绵垫上的滤纸上，用玻璃棒轻轻擀去气泡。再将膜盖于胶上，并除去气泡。之后将另外一张滤纸盖在膜上，并除去气泡。最后盖上另一块海绵垫后合上夹子。整个操作需在转膜液中进行。按照“夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面”的方式将夹子放入转移槽中。转移槽连接电路在冰盒中进行转膜，转移90min，电流为250mA。
3.3.4免疫反应
转膜结束后，取出膜用TBST将膜从下向上浸湿，之后转移至含有封闭液的平皿中，室温下在脱色摇床上摇动封闭2h。封闭结束后，将膜放入用5％脱脂奶粉稀释至适当浓度的一抗稀释液中，于4℃孵育过夜。第二天，从4℃取出膜于室温下放置30min后用TBST在脱色摇床上洗脱5次，每次5min。同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1h后，用TBST于室温下在脱色摇床上洗脱5次，每次5min，进行化学发光反应。
3.3.5化学发光与凝胶图像 分析
将发光底物A液与B液等体积混合，将膜与此混合液充分接触，5min后置于凝胶成像仪中曝光，应用Image J图像 处理软件分析样品β-actin及目的条带的灰值，重复3次，分别算比值，单因素方差分析，计算目的条带灰度值/β-actin灰度值，进行统计分析。
4实验结果
见图1和表3
表3白藜芦醇与氧化白藜芦醇比例为9:1对细胞内MITF和TRP1的抑制作用
5结果
采用western-blot检测方法对对照组、OXY组、RES组和OXY+RES组中的MITF和TRP1蛋白进行检测，结果发现：OXY+RES组与OXY组和RES组相比较，OXY+RES组能够对 MITF和TRP1蛋白显著性降低，说明OXYR和RES合用对MITF和TRP1蛋白具有很强的协同抑制作用。
将本发明的组合物按常规方法制备成溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂及贴剂等剂型用于黄褐斑、痤疮后红斑、雀斑、老年斑的治疗。

Claims (2)

1.一种协同抑制MITF和TRP1的组合物，其特征是按摩尔比为0.11的比例由白藜芦醇和氧化白藜芦醇组成。
2.权利要求1的组合物在制备具有抑制MITF和TRP1的药物或化妆品的应用。
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