CN108096245A - 千里光菲灵在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开千里光菲灵在诱导肿瘤细胞自噬及抑制肿瘤细胞增殖中的应用，千里光菲灵能够以剂量依赖和时间依赖的方式抑制HeLa细胞增殖和诱导HeLa细胞自噬，且千里光菲灵诱导HeLa细胞自噬依赖于通过激活MEK/ERK1/2途径，为抗人类宫颈癌提供一类新型治疗药物。

Description

千里光菲灵在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地涉及一种植物活性物质千里光菲灵在诱导肿瘤细胞自噬及抑制肿瘤细胞增殖中的应用。

背景技术

在世界范围内，宫颈癌严重威胁着广大育龄妇女的健康和生命，它是妇女第二常见的恶性肿瘤，同时也是妇女发病和死亡的主要原因之一，近几年其发病率呈现年轻化趋势。目前，化疗是宫颈癌患者主要治疗手段之一，但在临床上化疗耐药使得宫颈癌治疗失效和复发，如何克服宫颈癌化疗耐药是其治疗面临的一大挑战。

近年来，传统中药活性物质的抗肿瘤研究越来越受到研究学者们的关注，尝试从天然植物提取物中寻求治疗癌症的特效成分。大量研究表明，很多抗肿瘤药物如麦冬皂苷B、盐酸青藤碱等可以不同程度地诱导肿瘤细胞发生自噬。

自噬是真核生物细胞内普遍存在的一种现象，是细胞质内出现的一种自我保护过程，其在维持细胞发育及肿瘤发生发展中发挥着重要作用。但自噬是一把双刃剑，一方面，细胞通过自噬可以实现代谢需要和某些细胞器的更新，起一种细胞保护作用；另一方面，自噬也可以诱导细胞发生自噬性死亡。随着对自噬作用及其调控机理的深入研究，很多证据表明，自噬在肿瘤的发生发展及肿瘤治疗中起着重要作用。

千里光菲灵(Seneciphylline,SENE)是一种来源于菊科植物[Gynura segetum(Lour)Merr]根部的生物碱，近年来，国内外学者对千里光菲灵的抗肿瘤作用较为关注，有报道称千里光菲灵有抗肿瘤的作用，但其抗肿瘤的作用机理尚不明确，有待进一步研究。

发明内容

为了揭示千里光菲灵的抗肿瘤机制，本发明公开千里光菲灵在诱导肿瘤细胞自噬及抑制其增殖的机制以及在抗肿瘤药物中的应用。

为了达到上述发明目的，本发明的技术方案为：

千里光菲灵在制备抗肿瘤药物中的应用。

其中所述肿瘤为人宫颈癌HeLa细胞引起的肿瘤。

千里光菲灵在制备诱导肿瘤细胞自噬药物中的应用。

千里光菲灵在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。

其中所述肿瘤细胞为人宫颈癌HeLa细胞。

进一步地，千里光菲灵通过激活MEK/ERK1/2途径诱导HeLa细胞自噬。

本发明有益效果：

本发明千里光菲灵能够以剂量依赖和时间依赖的方式抑制HeLa细胞增殖和诱导HeLa细胞自噬，为抗人类宫颈癌提供一类新型治疗药物。

附图说明

图1为千里光菲灵处理HeLa细胞后的细胞活力图，与对照组相比*P<0.05，**P<0.01，下同；

图2A为对照DMSO组、Tre组和浓度为200、400、800μM的SENE组诱导HeLa细胞自噬荧光显微镜图；

图2B为对照DMSO组和浓度为200、400、800μM的SENE组处理HeLa细胞24小时后的相关蛋白LC3和P62的Western Blot表达图；

图2C为对照DMSO组和浓度为400μM的SENE处理HeLa细胞24、48、72小时后的相关蛋白LC3和P62的Western Blot表达图；

图3A为对照DMSO组、SENE组、SENE和CQ联合组、CQ组处理HeLa细胞24小时后的相关蛋白LC3-II及P62的Western Blot表达图；

图3B为Tre组和千里光菲灵分别处理GFP-LC3/HeLa细胞24小时后的自噬荧光显微镜图；

图4A为对照DMSO组、SENE组、SENE和3MA联合组、3MA组处理HeLa细胞24小时后的相关蛋白LC3-II及P62的Western Blot表达图；

图4B为对照DMSO组、SENE组、SENE和3MA联合组、3MA组处理HeLa细胞24小时后的细胞活力图。

图5A为对照DMSO组、SENE组、SENE和U0126联合组、U0126组处理HeLa细胞24小时后的相关蛋白P-ERK1/2及T-ERK1/2的Western Blot表达图；

图5B为对照DMSO组、SENE组、SENE和U0126联合组处理HeLa细胞24小时后的荧光显微镜图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

1、试剂和材料来源：

人宫颈癌HeLa细胞株购于ATCC；

DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自Hyclone公司；

千里光菲灵(SENE)购于成都德思特生物技术有限公司，用二甲基亚砜(DMSO)溶解；

MTT试剂盒、RIPA裂解液、ECL化学发光试剂购于碧云天生物技术有限公司；

Opti-MEM培养基、3000、Lysotraker Red均购于Invitrogen公司；

G418购自Gibco公司；

DMSO、海藻糖(Trehalose,Tre)、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)、氯喹(chloroquine,CQ)、U0126均购自Sigma-Aldrich公司；

LC3抗体购于Novus公司；

GAPDH抗体购于Millipore Chemicon公司；

p62抗体购自Santa Cruz公司；

P-ERKl/2(Thr202/Thr 204)及T-ERKl/2抗体购自Cell Signaling Technology。

GFP-LC3质粒由Noboru Mizushima教授(日本东京京都临床医学综合研究所)和Tamotsu Yoshimori教授馈赠(日本京都大学)。

2、细胞株培养

人宫颈癌HeLa细胞株购于ATCC，用含10％的胎牛血清、青霉素和链霉素(各100U/mL)的DMEM培养液，在37℃、5％CO2的饱和湿度条件下进行传代培养，当细胞处于对数生长期时用于实验。细胞实验所有操作均为无菌操作，在超净工作台中进行。细胞实验中所用的所有物品(EP管、玻璃瓶、枪头等)均需经过灭菌消毒后使用。

3、MTT法检测千里光菲灵对HeLa细胞增殖的影响

根据MTT试剂盒说明书，将HeLa细胞接种于96孔板中，调整细胞密度为6×10⁴个/mL，培养24h后，弃去上清，分对照组与实验组进行实验，对照组不加千里光菲灵，加入与实验组等体积的DMSO处理细胞，实验组在细胞液中加入浓度为25、50、100、200、400、800、1000μM的千里光菲灵分别处理细胞24、48、72h，每组设6个重复。培养结束后加入5mg/mL MTT液20μL，在37℃避光培养箱孵育4h后，吸去上清，再在每孔中加入DMSO 120μL，摇床轻微振荡15min，用酶标仪于570nm处测量各孔的吸光度值A，并计算细胞存活率。细胞存活率＝(药物组平均A值/对照组平均A值)×100％。

图1结果显示，不同浓度的千里光菲灵分别处理HeLa细胞24、48、72h后，千里光菲灵对细胞增殖抑制作用呈时间、剂量依赖性。当处理时间为24、48、72h，千里光菲灵浓度分别为200、100、50μM时细胞存活率与对照组均呈显著性差异(P<0.05)。采用OriginPro 8.2软件进行多项式细胞生长曲线拟合，拟合方程为Y＝A+B1×X+B2×X²，其中Y代表细胞活力，X代表药物浓度，药物处理24h时，拟合的各参数分别为A＝101.9，B1＝-0.06,B2＝6.6×10^-6；药物处理48h时，拟合的各参数分别为A＝101.8，B1＝-0.14,B2＝6.8×10^-5；药物处理72h时，拟合的各参数分别为A＝95.0，B1＝-0.17,B2＝9.4×10^-5。根据生长曲线得出，千里光菲灵处理HeLa细胞24、48、72h的IC₅₀分别为882.8、494.2、330.6μM。

4、千里光菲灵对诱导HeLa细胞自噬的影响

1)细胞转染及荧光显微镜观察

实验分对照DMSO组(不加千里光菲灵SENE和海藻糖(Tre)，加入体积分数为0.08％的DMSO)、海藻糖组(100mM)及200、400、800μM千里光菲灵组。

根据3000转染试剂盒说明书操作：

[1]HeLa细胞种植到6孔板，待汇合度达70％-85％时行转染操作。以下各操作中，所使用的试剂的用量均是针对6孔板的一个孔。

[2]50μL的opti-MEM培养基溶解稀释1μg GFP-LC3质粒。

[3]50μL opti-MEM培养基溶解稀释6μL Lipofectamine 3000。约5分钟后，将质粒溶液轻轻加入到含有Lipofectamine 3000的溶液中，轻轻吹打，混合均匀，而后室温静置20分钟。

[4]20分钟后，将以上转染体系加入到培养孔中，而后继续补加900μL的opti-MEM培养基。6个小时后，补加1mL DMEM完全培养基，继续培养24小时。

[5]GFP-LC3质粒上带有G418抗性，使用G418筛选出具有抗性的HeLa细胞，细胞传代，0.6g/L G418筛选稳定转染的细胞系，每3天更换一次新鲜的完全培养基。

[6]而后经过多轮筛选之后，将细胞消化搜集，分到新的培养板或者培养皿内，进行单克隆培养。借助于倒置荧光显微镜，使用记号笔标记GFP阳性的细胞克隆，而后挑出GFP阳性细胞克隆，最后用含有浓度减半的G418(0.3mg/mL)的DMEM完全培养基扩大培养或者维持培养。

[7]将生长状态良好的GFP-LC3/HeLa细胞接种到24孔板中，接种密度为3×10⁵个/孔，培养20h后，弃去上清，分为对照组(体积分数为0.08％的DMSO)、海藻糖组(100mM)及千里光菲灵组(200、400、800μM)分别处理GFP-LC3/HeLa细胞24小时，处理结束后在倒置荧光显微镜下观察GFP聚集的产生情况并进行图片采集。

2)Western blot分析

实验分对照DMSO组(不加千里光菲灵SENE，加入体积分数为0.08％的DMSO)及200、400、800μM千里光菲灵组。

Western Blot使用试剂及配方

[1]SDS-PAGE胶制备试剂及储液：超纯水、30％丙烯酰胺溶液、10％过硫酸铵(APS),1M Tris-HCl(pH 6.8)，1.5M Tris-HC1(pH8.8),10％SDS和TEMED。

[2]2x电泳上样缓冲液(Loading buffer)：准确称量0.02g澳酚蓝，加入1mL lmol/L Tris-HCl(pH6.8)，4mL 10％SDS，4mL 50％甘油。临用前再加入1mLβ-疏基乙醇混匀后使用。

[3]lx电泳缓冲液：准确称量甘氨酸Glycine 14.4g，Tris 3.03g，SDS 1g，溶解于800mL的双蒸水，最后定容至IL，现配现用。

[4]1x电转缓冲液：准确称量甘氨酸Glycine 14.4g，Tris 3.03g，溶解于800mL双蒸水，待溶解完毕后，溶液中再加入200mL乙醇，混合均匀并使用超声波去除溶液中的气泡，现配现用。

[5]1xTBST：准确称量Tris 2.42g，NaCl 8.87g溶解于900mL双蒸水中，最后定容至IL，再加入1mL的去垢剂Tween-20。

Western Blot实验流程

[1]电泳样品制备：细胞经过特定的实验处理后，使用胰酶消化，收集到EP管中，1000rpm离心5分钟，去除上清，保留完整的细胞沉淀。再用PBS重悬细胞沉淀，再次1000rpm离心5分钟，去除上清，保留完整的细胞沉淀。加入RIPA裂解液，冰上裂解15分钟后，加入与裂解液等体积的2x电泳上样缓冲液。在沸水浴中煮沸10分钟，使细胞完全裂解。低速离心，将管壁的液滴离心至管底，再使用涡旋振荡器混匀后，10000rpm离心30秒后，放置在-20℃保存。

[2]SDS-PAGE电泳：配制13％的蛋白胶，上样的同时并点上预染Marker浓缩胶电泳电压为100V，分离胶电泳电压为140V进行分离胶电泳。

[3]电转：按照自阴极到阳极“海绵一双层滤纸一蛋白胶一PVDF膜一双层滤纸一海绵”此“三明治结构”在350mA恒流条件下冰浴持续转移90分钟。

[4]牛奶封闭：膜在5％的脱脂牛奶中封闭1小时。

[5]一抗孵育：取洁净Parafilm封口膜平整的贴附在细胞培养板盖上，使用1XTBST配制的合适浓度的一抗滴加在封口膜的表面，而后将膜结合蛋白的一侧贴附在含有一抗的封口膜上，最后将其置于湿盒中，37℃孵育2小时，或者4℃过夜。注:封口膜与PVDF膜之间需避免气泡的产生。

[6]一抗的洗涤：在摇床上，使用1XTBST震荡漂洗结合一抗的膜5次，每次5分钟。

[7]二抗孵育：经1XTBST漂洗过的结合一抗的膜放进HRP标记的抗兔/抗鼠二抗的TBST溶液中，孵育1小时。

[8]二抗漂洗：在摇床上，1XTBST震荡漂洗膜5次，每次5分钟。

[9]显色与曝光：用辣根过氧化物酶底物与PVDF膜孵育，而后在暗室使用X射线感光片进行显影。根据带型的明暗程度，适当调节曝光时间以获得较好的显影结果。

[10]Western Blot显影底片上蛋白条带深浅代表蛋白的含量。用Image J软件对目的蛋白条带的灰度值与内参灰度值进行相比获得反映蛋白含量变化的数值。

GFP-LC3/HeLa是稳定转染并持续表达绿色荧光标签的HeLa细胞系，当自噬被激活后，GFP-LC3-I就会被加工成GFP-LC3-II，聚集在自噬小体膜中，在荧光显微镜下，能够观测到具有绿色荧光的点状聚集(自噬体)。图2A显示，处理细胞24h后，对照DMSO组不能引起GFP-LC3/HeLa细胞中出现GFP的点状聚集，而经典的自噬诱导剂海藻糖(Tre)组出现了明显的GFP点状聚集；用浓度为200、400、800μM的千里光菲灵处理GFP-LC3/HeLa细胞24h后，出现的绿色荧光点状聚集呈现剂量依赖效应，即随千里光菲灵处理浓度的增加，绿色荧光点状聚集阳性细胞的比例增多。以上结果表明千里光菲灵可能诱导了HeLa细胞发生自噬。

为了进一步证实千里光菲灵可能诱导了HeLa细胞发生自噬的结果，用Westernblot分析了自噬相关蛋白(LC3和P62)的表达情况。如图2B所示，不同浓度的200、400、800μM千里光菲灵处理HeLa细胞24小时后，与对照(DMSO)相比，其P62/GAPDH值显著降低，且呈浓度依赖性，而LC3-II/LC3-I值显著提高，亦呈浓度依赖性。另外，400μM的千里光菲灵处理HeLa细胞不同时间(24、48、72h)后，P62/GAPDH值和LC3-II/LC3-I值与药物处理呈时间依赖性(图2C)。以上结果均表明千里光菲灵能诱导HeLa细胞发生自噬。

5、千里光菲灵诱导HeLa细胞产生完整自噬流

自噬是一个完整的过程，包括双层分隔膜的产生，双层分隔膜包裹待降解物形成自噬体，自噬体与溶酶体融合，降解自噬底物。当自噬性降解被抑制，如自噬体与溶酶体融合被阻或溶酶体功能受损，均可导致细胞内出现自噬现象。因此，实验中出现的GFP点状聚集、LC3-II蛋白的累积并不能说明细胞是否发生了完整自噬。氯喹是细胞发生自噬的下游抑制剂，主要通过改变溶酶体的PH值，阻断自噬体与溶酶体的融合从而阻止自噬底物的降解，饱和浓度的氯喹(50μM)可以完全抑制自噬底物的降解。

为了证明千里光菲灵是否可以诱导HeLa细胞发生完整的自噬流，本实施例的步骤为：

1)Western blot分析，分析方法见上述第4部分。实验分为对照DMSO组(不加千里光菲灵SENE和氯喹CQ，加入体积分数为0.04％的DMSO)、千里光菲灵(400μM)组、联合组(400μM千里光菲灵和50μM CQ)、CQ组(50μM)处理HeLa细胞24h。

2)Lysotraker Red染色

实验分海藻糖组(100mM)及400μM千里光菲灵组。

取对数生长期HeLa细胞接种于6孔板，调整细胞密度为6×10⁴个/mL，培养24h后，加入经典的完整自噬流诱导剂100mM的海藻糖(Tre)和400μM的千里光菲灵分别处理GFP-LC3/HeLa细胞24小时后，弃培养基，加入75nM的Lysotraker Red染色25min，再弃去上清，经PBS洗涤2次后，倒置荧光显微镜观察染色情况并拍照。

3)完整自噬流结果分析

将千里光菲灵(400μM)与饱和浓度的自噬的下游抑制剂氯喹(CQ50μM)分别单独和联合处理HeLa细胞24h，与对照组相比，CQ组出现了显著的P62及LC3-II的累积，说明CQ阻断了HeLa细胞自噬下游底物的降解。与单独千里光菲灵组相比，千里光菲灵联合CQ处理组具有显著的LC3-II及P62的蛋白累积(图3A)，这说明千里光菲灵并没有阻断自噬下游底物的降解。接下来，进一步用荧光共定位方法进行验证，Lysotraker Red是一种细胞碱性染料，它可以选择性的给细胞内部的溶酶体染色，同时亦可指示溶酶体的合成及活性。如图3B显示，100mM的海藻糖(Tre)和400μM的千里光菲灵分别处理GFP-LC3/HeLa细胞24小时，千里光菲灵与阳性对照海藻糖一样，能够诱导HeLa细胞内出现绿色荧光点聚集(自噬体)，且这些荧光点聚集可与Lysotraker Red染色的溶酶体实现共定位。这进一步说明了千里光菲灵不会干扰自噬体与溶酶体的融合。

6、抑制自噬增强千里光菲灵对HeLa细胞增殖的抑制作用

自噬是一种高度动态的过程，其在肿瘤的发生、发展中具有两面性。为了明确千里光菲灵诱导的自噬是导致自噬性死亡还是导致细胞对千里光菲灵的耐药性增加，发明人使用了自噬抑制剂3MA，3MA是一种蛋白激酶抑制剂，它主要作用于细胞内的III类磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)，而PI3K是激活自噬上游一种重要的激酶，最近许多研究者发现其与抗肿瘤药物联合作用可增加药物对肿瘤细胞的敏感性。

1)Western blot分析，分析方法见上述第4部分。实验分为对照DMSO组(不加千里光菲灵SENE和3-甲基腺嘌呤3MA，加入体积分数为0.04％的DMSO)、千里光菲灵(400μM)组、联合组(400μM千里光菲灵SENE和5mM 3MA)、3MA组(5mM)处理HeLa细胞24h。

2)MTT法检测细胞活力同第3点，实验分组同第6点1)。

自噬对肿瘤细胞的增殖具有双重作用，为明确千里光菲灵诱导的自噬与HeLa细胞增殖的关系，本发明将自噬抑制剂3MA与千里光菲灵联合作用于HeLa细胞。

将千里光菲灵(400μM)与自噬抑制剂3MA(5mM)单独和联合处理HeLa细胞24h后，与对照组相比，3MA单独处理组出现了显著的LC3-II的累积，说明3MA阻止了HeLa细胞自噬的发生。与千里光菲灵处理组相比，千里光菲灵联合3MA处理组具有更高的LC3-II/LC3-I值，呈极显著性差异(图4A)。MTT细胞增殖实验表明(图4B)，自噬上游抑制剂3MA提高了千里光菲灵对HeLa细胞增殖的抑制作用，使得细胞存活率从单药时的80.6％下降到联合用药时的40.4％。表明自噬导致了HeLa细胞对千里光菲灵的抗肿瘤作用降低，自噬阻断可使千里光菲灵对HeLa细胞增殖的抑制作用增加，抑制自噬可以提高药物对肿瘤细胞的敏感性，增加对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

7、千里光菲灵诱导的HeLa细胞自噬依赖于MEK/ERK1/2途径1)Western blot分析方法见上述第4部分2)。实验分为对照DMSO组(不加千里光菲灵SENE和U0126，加入体积分数为0.04％的DMSO)、千里光菲灵(400μM)组、联合组(400μM千里光菲灵SENE和10mM U0126)、U0126组(10mM)处理HeLa细胞24h。

2)免疫荧光检测方法同第4部分。实验分为对照DMSO组(不加千里光菲灵SENE和U0126，加入体积分数为0.04％的DMSO)、千里光菲灵(400μM)组、联合组(400μM千里光菲灵SENE和10mM U0126)处理HeLa细胞24h。

为明确千里光菲灵诱导的自噬是否激活MEK/ERK1/2途径，本发明进行了Westernbolt实验和免疫荧光检测。细胞外调节蛋白激酶(ERK)，可以感知细胞内外的信号刺激，其与细胞的增殖、转分化等现象关系密切；U0126是MEK特异性的磷酸化抑制剂，而MEK的活性抑制将直接导致ERK的活性抑制。

将千里光菲灵(400μM)与U0126(10mM)单独和联合处理HeLa细胞24h后，与对照组相比，单独千里光菲灵处理组出现了显著的P-ERK1/2蛋白累积，即千里光菲灵诱导了ERK的活化。而与单独千里光菲灵处理组相比，千里光菲灵联合U0126处理组抑制了千里光菲灵诱导的ERK活化，两组呈极显著性差异，HeLa细胞内部总ERK(T-ERK1/2)蛋白含量没有明显变化(图5A)；同时，图5B表明，U0126抑制了千里光菲灵诱导的自噬体的形成。综上，千里光菲灵诱导的HeLa细胞自噬激活了MEK/ERK1/2途径。

综上所述，千里光菲灵可以抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖，并能诱导完整的自噬流，抑制HeLa细胞自噬可增强千里光菲灵的抗肿瘤作用，千里光菲灵诱导的HeLa细胞自噬激活了MEK/ERK1/2信号通路。这为千里光菲灵对人宫颈癌的临床治疗提供了实验依据和理论基础。

Claims (6)

1.千里光菲灵在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.千里光菲灵在制备诱导肿瘤细胞自噬药物中的应用。

3.千里光菲灵在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为人宫颈癌HeLa细胞引起的肿瘤。

5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述所述肿瘤细胞为人宫颈癌HeLa细胞。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述千里光菲灵通过激活MEK/ERK1/2途径诱导HeLa细胞自噬。