CN108072684B - 法尼醇x受体的新配体及其筛选方法和应用 - Google Patents

法尼醇x受体的新配体及其筛选方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108072684B
CN108072684B CN201611038907.2A CN201611038907A CN108072684B CN 108072684 B CN108072684 B CN 108072684B CN 201611038907 A CN201611038907 A CN 201611038907A CN 108072684 B CN108072684 B CN 108072684B
Authority
CN
China
Prior art keywords
receptor
small molecule
farnesoid
screening
fxr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611038907.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108072684A (zh
Inventor
刘劲松
王娜
阮科
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Original Assignee
Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS filed Critical Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority to CN201611038907.2A priority Critical patent/CN108072684B/zh
Publication of CN108072684A publication Critical patent/CN108072684A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108072684B publication Critical patent/CN108072684B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
    • G01N27/04—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating resistance
    • G01N27/06—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating resistance of a liquid
    • G01N27/08—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating resistance of a liquid which is flowing continuously
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/095—Sulfur, selenium, or tellurium compounds, e.g. thiols
    • A61K31/10—Sulfides; Sulfoxides; Sulfones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/402—1-aryl substituted, e.g. piretanide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/4155—1,2-Diazoles non condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/416—1,2-Diazoles condensed with carbocyclic ring systems, e.g. indazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/428—Thiazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/433—Thidiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/444—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring heteroatom, e.g. amrinone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
    • G01N23/20—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by using diffraction of the radiation by the materials, e.g. for investigating crystal structure; by using scattering of the radiation by the materials, e.g. for investigating non-crystalline materials; by using reflection of the radiation by the materials
    • G01N23/207—Diffractometry using detectors, e.g. using a probe in a central position and one or more displaceable detectors in circumferential positions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N25/00—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means
    • G01N25/20—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means by investigating the development of heat, i.e. calorimetry, e.g. by measuring specific heat, by measuring thermal conductivity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种法尼醇X受体的新配体及其筛选方法和应用。本发明首次利用核磁共振检测，通过记录、分析饱和传递差异和WaterLOGSY两种核磁共振谱图，在小分子片段筛选得到了11种FXR的新配体。再通过Alphascreen实验进一步测定筛选得到体外活性更好的FXR的配体。将这11种小分子化合物扩展应用到ERRγ上，筛选得到与ERRγ蛋白质亲和性好的小分子化合物，并据此衍生得到亲和力更高的6‑硝基吲哚化合物。本发明筛选得到的新配体及其衍生物，可通过进一步的分子优化来制备全新结构的FXR调节剂和ERRγ调节剂，为治疗与FXR相关的疾病或者与ERRγ相关的疾病提供新的有效药物。

Description

法尼醇X受体的新配体及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种法尼醇X受体的新配体及其筛选方法和应用。
背景技术
法尼酯衍生物X受体(Farnesoid X Receptor,FXR)是核激素受体超家族成员之一，是体内胆汁酸的感应器。FXR通过调节胆汁酸合成限速酶cholesterol 7alpha-hydroxylase(CYP7A1)活性而调控体内胆汁酸的稳态。目前的研究发现FXR在调控胆汁酸、脂蛋白和葡萄糖代谢、肝再生、肠道细菌生长以及肝毒素应答反应等多个过程中扮演重要作用。另外，激活FXR能降低血液中甘油三脂和葡萄糖水平，其中的机制可能是通过抑制肝脏中关键的调节基因表达以及在周缘组织中调节胰岛素敏感性。所以寻找高效的FXR的调节剂在治疗糖尿病及脂代谢类疾病中具有重要作用。在内源性的胆汁酸中，鹅去氧胆酸CDCA是亲和力最高的天然配体。然而据报道，富含CDCA的饮食会导致小鼠的肝脏肥大，并且在哺乳动物中，CDCA并不是特异性靶向FXR的。而GW4064会导致体重增加和脂肪积聚，INT-747，PX-102和WAY-362450是合成的FXR的激动剂，现在正在开发用于治疗血脂异常，糖尿病，初级胆汁性肝硬化或者非酒精性脂肪肝，但这些合成的小分子的安全性仍是一个重大的问题。所以开发出具有全新结构的FXR调节剂具有重要的意义。
雌激素相关受体(ERRs)与FXR同样属于核受体亚家族,包含ERRα,ERRβ和ERRγ3个成员；其主要在高能量需求组织中表达,在线粒体功能、线粒体融合、能量代谢以及氧化应激水平等方面发挥着重要的作用，有研究表明其在神经系统疾病中也具有重要作用。在没有外源配体存在时，ERRs被证明具有组成型转录活性。ERRγ在胎儿大脑表达水平很高，但在肝脏表达很少，几乎检测不到，而在成人体内，ERRγ广泛存在于脑、心、肾、肝脏、胰腺，胎盘和骨骼肌中。最近研究发现，ERRγ可以参与糖异生作用而ERRγ抑制剂可以减少肝糖原的产生。ERRγ影响胰岛素生成信号，一方面可以维持血糖平衡，但也会引起2型糖尿病和肝损伤。在神经生物学方面，可以影响神经细胞元分化。另外，ERRγ可以显著地促进棕色脂肪细胞与白色脂肪细胞的分化。ERRγ和ERRα一起参与葡萄糖和谷氨酰胺代谢，调节线粒体活性，脂质代谢和能量代谢。在乳腺癌病人乳腺组织中，ERRγ参与肿瘤细胞的代谢和增殖过程，用作乳腺癌生物发展标志和药物治疗靶标。在小鼠肝脏中，ERRγ参与调节血糖、血脂、酒精和铁代谢。因此，ERRγ可作为肿瘤及代谢性疾病的新型治疗靶点，基于雌激素相关受体开发出来的小分子调节剂，极有可能成为治疗相关疾病(肿瘤及糖尿病等)的新药物分子。
发明内容
基于此，本发明提供了一种法尼醇X受体的配体筛选方法。用该方法简单有效的筛选得到了多种法尼醇X受体的新配体。
具体技术方案如下。
一种法尼醇X受体的配体筛选方法，包括以下步骤：
(1)首次筛选：配制FXR-LBD蛋白样品溶液：用缓冲溶液以及D2O配制FXR-LBD蛋白样品溶液，所述FXR-LBD蛋白样品溶液中FXR-LBD蛋白的浓度为5-15μM的；
配制小分子化合物的混合溶液：将待筛选的小分子化合物编组，每组5-15个，每组小分子化合物共同溶解于DMSO-d6中，每个小分子化合物的浓度为15-25mM，即得各组小分子化合物的混合溶液；
配制核磁样品溶液：移取蛋白样品溶液至塑料管中，每管480-490μL；然后在每管中分别加入1组小分子化合物的混合溶液，每管10-20μL；混匀、静置或离心，即得所述核磁样品溶液；
核磁共振检测：将所述核磁样品溶液转移至核磁管中，依次进行核磁共振检测，采集一维氢谱；
(2)二次筛选：二次筛选时每管核磁样品溶液中只含1-2个化合物，其它条件与首次筛选的条件相同，检查每个化合物的谱图，确认STD和WaterLOGSY都出峰的小分子化合物，二次筛选得到的小分子化合物即为法尼醇X受体的小分子配体，其结构如下：
Figure GDA0002400858100000031
在其中一些实施例中，所述法尼醇X受体的配体筛选方法还包括以下步骤：
通过Alphascreen实验检测筛选得到的小分子化合物对法尼醇X受体的激动活性；和/或
通过X-射线晶体衍射检测FXR-LBD蛋白与筛选得到的小分子化合物形成的复合物晶体的结构，以确定小分子化合物与FXR-LBD蛋白的结合方式和结合能力；和/或
通过等温滴定微量热实验检测筛选得到的小分子化合物与法尼醇X受体蛋白的亲和力。
在其中一些实施例中，所述缓冲溶液为含290-310mM NaCl和0.9-1.1mM DTT的HEPES缓冲液，其中HEPES的浓度为38-42mM，pH为7.8-8.2。
在其中一些实施例中，所述FXR-LBD蛋白样品溶液中D2O的体积分数为45-55％。
本发明还提供了用上述方法筛选得到的小分子化合物及其衍生物的应用。
具体技术方案如下。
用上述筛选方法筛选得到的小分子化合物及其衍生物在制备法尼醇X受体调节剂中的应用，所述小分子化合物及其衍生物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure GDA0002400858100000041
Figure GDA0002400858100000051
在其中一些实施例中，所述小分子化合物及其衍生物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure GDA0002400858100000052
在其中一些实施例中，所述法尼醇X受体调节剂为法尼醇X受体抑制剂，所述小分子化合物及其衍生物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure GDA0002400858100000053
在其中一些实施例中，所述法尼醇X受体调节剂为法尼醇X受体激动剂，所述小分子化合物及其衍生物为：
Figure GDA0002400858100000061
上述筛选方法筛选得到的小分子化合物及其衍生物在制备雌激素相关受体的调节剂中的应用，所述小分子化合物及其衍生物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure GDA0002400858100000062
Figure GDA0002400858100000071
在其中一些实施例中，所述小分子化合物及其衍生物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure GDA0002400858100000072
本发明首次利用核磁共振检测，通过记录、分析饱和传递差异(STD，saturationTransferred Difference和WaterLOGSY(water-ligand observed via gradient)两种核磁共振谱图，在小分子片段(893个化合物)库中寻找FXR的新配体，得到了11种与靶标蛋白(法尼醇X受体蛋白)有相互作用的小分子化合物，即FXR的配体。再通过Alphascreen实验进一步测定筛选得到体外活性更好的FXR的配体。将这11种小分子化合物扩展应用到ERRγ上，进行雌激素相关受体ERRγ的配体的筛选，得到与ERRγ蛋白质亲和性好的小分子化合物，并据此衍生得到亲和力更高的6-硝基吲哚啉化合物。
本发明筛选得到的新配体及其衍生物，可通过进一步的分子优化来制备全新结构的FXR调节剂和ERRγ调节剂，为治疗与FXR相关的疾病(血脂异常，糖尿病，初级胆汁性肝硬化或者非酒精性脂肪肝)或者与ERRγ相关的疾病(肿瘤及代谢性疾病)提供新的有效药物。
本发明的基于片段的药物发现(fragment-based drug discovery,FBDD)与传统高通量筛选等方法相比，FBDD具有显著的优点，发现的活性片段利于优化、获得的活性分子成药性高。FBDD通过筛选较少数量的片段化合物，却探索了更大的化学空间，从药物研发的成本来说，也更为经济。FBDD有更高的几率发现苗头片段分子。很显然，对于一个靶点来说，小的分子可以结合到蛋白口袋的一个亚位点，因而有可能发现靶标蛋白新的调控机制。而大的分子，即使有一部分可以同蛋白结合，但如果有其他地方的不匹配仍将抵消结合，从而使较为复杂的分子不易成为苗头化合物被发现。另外小的片段也可以结合到不同蛋白的口袋，由片段化合物库发现有结合的分子的整体效率得到提高，同一分子有望在不同的靶点上成为苗头化合物。
附图说明
图1为实施例1中小分子化合物4028043的核磁谱图；
图2为实施例1中小分子化合物4000103的核磁谱图；
图3为实施例1中小分子化合物4028691的核磁谱图；
图4为实施例1中小分子化合物4029314的核磁谱图；
图5为实施例1中小分子化合物4031718的核磁谱图；
图6为实施例1中小分子化合物4034496的核磁谱图；
图7为实施例1中小分子化合物4035217的核磁谱图；
图8为实施例1中小分子化合物4032227的核磁谱图；
图9为实施例1中小分子化合物4040907的核磁谱图；
图10为实施例1中小分子化合物4033772的核磁谱图；
图11为实施例1中小分子化合物9070972的核磁谱图；
图12为实施例2中的AlphaScreen测试结果图；
图13为雌激素相关受体ERRγ与4034496的复合物的晶体结构图；
图14为雌激素相关受体ERRγ与4034496的复合物的晶体结构的局部放大图；
图15为雌激素相关受体ERRγ与4028691的复合物的晶体结构图；
图16为雌激素相关受体ERRγ与6-硝基吲哚啉的复合物的晶体结构图；
图17为雌激素相关受体ERRγ与6-硝基吲哚啉的复合物的晶体结构的局部放大图，其中，图A为π-π相互作用，图B为Anion-π相互作用，图C为氢键相互作用；
图18为实施例4中的等温滴定量热曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的法尼醇X受体的新配体及其筛选方法和应用进行进一步详细的说明。
实施例1
通过核磁共振筛选FXR的配体的方法如下：
一、首次筛选
a、按常规方法制备目标蛋白质FXR-LBD(法尼醇X受体的配体结合结构域，是法尼醇X受体全长的一部分)，分子量在30KDa左右。
b、摸索能保持蛋白质FXR-LBD结构稳定的缓冲液体系的条件和温度：尝试不同的缓冲液体系及不同的温度，观察FXR-LBD蛋白在缓冲液体系中是否稳定存在，有无降解等。结果：能保持蛋白质FXR-LBD结构稳定的缓冲液体系为20mM HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液)，pH8.0，含NaCl 150mM，DTT(二硫苏糖醇)0.5mM，温度为25℃。
c、摸索FXR-LBD对DMSO的耐受浓度：在FXR-LBD中滴定DMSO，检查蛋白1D氢谱的变化。结果：蛋白对DMSO的耐受浓度为不小于50uM。
d、根据蛋白对DMSO的耐受性，决定筛选时的小分子化合物的混合液(每组混合液中含有10个小分子化合物，每个小分子化合物的浓度为20mM，溶解在DMSO-d6中)的取样体积Vol uL。
e、在筛选用的V型池中配备总体积略多于(500-Vol)*n的FXR-LBD蛋白样品溶液，n为每次筛选所用的小分子化合物的混合溶液的数目(共90个混合溶液样品，共含小分子化合物893个)。配制方法：用2倍浓度缓冲液(即：40mM HEPES、pH8.0、300mM NaCl、1mMDTT)以及D2O配制FXR-LBD蛋白样品溶液，FXR-LBD蛋白样品溶液中FXR-LBD蛋白的浓度为10uM，D2O的体积分数为50％，且含有20mM HEPES、150mM NaCl、0.5mMDTT。
f、用八通道1250uL自动移液枪将FXR-LBD蛋白样品溶液转移至Theromatrix1.4mL塑料管中，每管转移的体积为490uL。然后用八通道10uL自动移液枪将10uL的小分子化合物混合液按照顺序依次加到这些塑料管中。盖上帽子，震荡混匀10分钟，静止或离心。最后将样品转移到5mm核磁管中。
g、将制备的核磁样品按顺序装上转子，校正中心位置，放置在自动进样器中。然后将一个样品放入磁体中，调谐，锁场，梯度匀场和手动匀场，采集一维氢谱。
h、校正参数，选择自动化采集，仪器将开始自动采集所有提交样品的谱图，跟踪并确认第一个谱图的质量。
二、第二次筛选(hit confirmation)
a、逐个谱图检查，确认STD(saturation Transferred Difference，饱和传递差异)，WaterLOGSY(water-ligand observed via gradient)都出峰的小分子应该是哪个化合物，保存图谱。
b、二次筛选的样品制备类似于首次筛选，不同之处在于每管核磁样品中仅含1个化合物，其他条件不变，再次确认命中化合物。STD出峰，waterLOGSY出负峰，方可鉴定为苗头小分子化合物。单个苗头小分子化合物的二次筛选的化学位移应该和首次筛选的一致。二次筛选得到的小分子化合物(FXR的配体)如下所示。其核磁谱图分别如图1-图11所示。
Figure GDA0002400858100000101
Figure GDA0002400858100000111
实施例2
将实施例1筛选得到的小分子化合物进行FXR激动活性的体外活性测试。
AlphaScreen测试，采用珀金埃尔默仪器有限公司(Perkins-Elmer)的六聚组氨酸检测试剂盒(hexahistidine detection kit)，检测化合物对法尼醇受体hFXR蛋白结合其共激活因子(SRC1-2)的影响，方法如下：
1)制备混合物，包括人法尼醇受体蛋白hFXR(100nM,15μL/孔)、多肽bSRC1-2(50nM,15μL/孔)、10×AlphaScreen缓冲液(15μL/孔)、去离子水(60μL/well)，转入96孔板，105μL/孔；
2)将实施例1筛选得到的小分子化合物按照2倍倍比稀释12次，以15μL/孔加入到步骤1)的混合物中；
3)将供体微珠、受体微珠一共30μL/孔加入到上述混合物中；(注意：避光操作)
4)室温避光孵育2h；
5)转384孔板，40μL/孔，3个复孔。瞬时离心1000rpm，1分钟，使液滴充分混合在孔底；(注意：避光操作)
6)暗室里，仪器读板(均相发光免疫检测系统)，EC50由数据处理软件GraphPadPrism5处理得到。实验结果如图12所示。结果显示，
Figure GDA0002400858100000121
以及
Figure GDA0002400858100000122
具有抑制剂效果，
Figure GDA0002400858100000123
具有激动剂效果。
实施例3
将实施例1筛选得到的小分子化合物应用于雌激素相关受体ERRγ的配体的筛选。
通过X-射线晶体衍射得到ERRγ与小分子化合物形成的复合物的晶体结构，以确定小分子化合物与ERRγ结合方式和结合能力。
具休实验步骤如下：
1.将ERRγ-LBD(雌激素相关受体ERRγ的配体结合结构域，是雌激素相关受体ERRγ全长的一部分)的基因克隆到表达载体PET15b上，并在E.coli(DE3)中表达。
2.通过亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤排阻层析得到高纯度均一的ERRγ-LBD蛋白质。
3.将ERRγ-LBD与实施例1筛选得到的小分子化合物以及共激活因子(RIP140)混合制成三元复合物，进行晶体初筛。
4.将初筛得到的复合物晶体优化后，在上海光源得到晶体的X射线衍射数据。
5.通过CCP4，COOT等软件解析及修正晶体结构，用PYMOL软件做出ERRγ-LBD与小分子的结构模型图。结果如下：
1)雌激素相关受体ERRγ与4034496的复合物的晶体结构如图13所示，其局部放大图如图14所示：4034496能与ERRγ-LBD中的275位谷氨酸生成氢键。
2)雌激素相关受体ERRγ与4028691的复合物的晶体结构如图15所示：4028691与ERRγ-LBD主要是通过疏水相互作用而结合。
3)对4028691小分子化合物进行衍生设计得到衍生物6-硝基吲哚啉，雌激素相关受体ERRγ与衍生物6-硝基吲哚啉的复合物的晶体结构如图16所示，其局部放大图如图17所示：6-硝基吲哚啉与ERRγ-LBD的326位酪氨酸有π-π相互作用(图A)，与435位苯丙氨酸有Anion-π相互作用(图B)，并且在晶体结构中发现6-硝基吲哚啉可以通过结晶中的水分子与ERRγ-LBD口袋出口的309位亮氨酸和275位谷氨酸及316位精氨酸形成氢键相互作用(图C)。与前两个小分子相比，6-硝基吲哚啉与ERRγ-LBD亲和力有很大提升。
实施例4
应用等温滴定微量热法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)实验测定6-硝基吲哚啉与雌激素相关受体ERRγ蛋白的亲和力(Kd)值，用ERRγ-LBD蛋白滴定6-硝基吲哚啉，ERRγ-LBD蛋白的浓度为:500μM，6-硝基吲哚啉的浓度为：50μM。等温滴定量热曲线如图18所示。
实验表明6-硝基吲哚啉与雌激素相关受体ERRγ具有较好的亲和力，其Kd值为0.76uM(Kd值为图中的K值的倒数)，优于现有激动剂GSK4716(Kd＝5.0uM)的效果。GSK4716是一个合成的ERRβ和ERRγ的激动剂，但对ERRβ激动作用是暂时的，而在骨骼肌细胞的分化中显著激活ERRγ。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种法尼醇X受体的配体筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)首次筛选：配制FXR-LBD蛋白样品溶液：用缓冲溶液以及D2O配制FXR-LBD蛋白样品溶液，所述FXR-LBD蛋白样品溶液中FXR-LBD蛋白的浓度为5-15μM的；
配制小分子化合物的混合溶液：将待筛选的小分子化合物编组，每组5-15个，每组小分子化合物共同溶解于DMSO-d6中，每个小分子化合物的浓度为15-25mM，即得各组小分子化合物的混合溶液；
配制核磁样品溶液：移取蛋白样品溶液至塑料管中，每管480-490μL；然后在每管中分别加入1组小分子化合物的混合溶液，每管10-20μL；混匀、静置或离心，即得所述核磁样品溶液；
核磁共振检测：将所述核磁样品溶液转移至核磁管中，依次进行核磁共振检测，采集一维氢谱；
(2)二次筛选：二次筛选时每管核磁样品溶液中只含1-2个化合物，其它条件与首次筛选的条件相同，检查每个化合物的谱图，确认STD和WaterLOGSY都出峰的小分子化合物，二次筛选得到的小分子化合物即为法尼醇X受体的小分子配体，其结构如下：
Figure FDA0002400858090000011
Figure FDA0002400858090000021
2.根据权利要求1所述的法尼醇X受体的配体筛选方法，其特征在于，还包括以下步骤：
通过Alphascreen实验检测筛选得到的小分子化合物对法尼醇X受体的激动活性；和/或
通过X-射线晶体衍射检测FXR-LBD蛋白与筛选得到的小分子化合物形成的复合物的晶体结构，以确定小分子化合物与FXR-LBD蛋白的结合方式和结合能力；和/或
通过等温滴定微量热实验检测筛选得到的小分子化合物与法尼醇X受体蛋白的亲和力。
3.根据权利要求1或2所述的法尼醇X受体的配体筛选方法，其特征在于，所述缓冲溶液为含290-310mM NaCl和0.9-1.1mM DTT的HEPES缓冲液，其中HEPES的浓度为38-42mM，pH为7.8-8.2。
4.根据权利要求1或2所述的法尼醇X受体的配体筛选方法，其特征在于，所述FXR-LBD蛋白样品溶液中D2O的体积分数为45-55％。
5.小分子化合物在制备法尼醇X受体调节剂中的应用，其特征在于，所述小分子化合物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure FDA0002400858090000022
Figure FDA0002400858090000031
6.根据权利要求5所述的小分子化合物在制备法尼醇X受体调节剂中的应用，其特征在于，所述小分子化合物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure FDA0002400858090000032
7.根据权利要求6所述的小分子化合物在制备法尼醇X受体调节剂中的应用，其特征在于，所述法尼醇X受体调节剂为法尼醇X受体抑制剂，所述小分子化合物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure FDA0002400858090000033
8.根据权利要求6所述的小分子化合物在制备法尼醇X受体调节剂中的应用，其特征在于，所述法尼醇X受体调节剂为法尼醇X受体激动剂，所小分子化合物为：
Figure FDA0002400858090000041
9.小分子化合物在制备雌激素相关受体的调节剂中的应用，其特征在于，所述小分子化合物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure FDA0002400858090000042
10.根据权利要求9所述的小分子化合物在制备雌激素相关受体的调节剂中的应用，其特征在于，所述小分子化合物选自以下小分子化合物中的至少一种：
Figure FDA0002400858090000051
CN201611038907.2A 2016-11-11 2016-11-11 法尼醇x受体的新配体及其筛选方法和应用 Active CN108072684B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611038907.2A CN108072684B (zh) 2016-11-11 2016-11-11 法尼醇x受体的新配体及其筛选方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611038907.2A CN108072684B (zh) 2016-11-11 2016-11-11 法尼醇x受体的新配体及其筛选方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108072684A CN108072684A (zh) 2018-05-25
CN108072684B true CN108072684B (zh) 2020-06-16

Family

ID=62161382

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611038907.2A Active CN108072684B (zh) 2016-11-11 2016-11-11 法尼醇x受体的新配体及其筛选方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108072684B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101977505A (zh) * 2007-06-13 2011-02-16 葛兰素史密丝克莱恩有限责任公司 类法尼醇x受体激动剂
CN102507627A (zh) * 2011-11-14 2012-06-20 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种高通量筛选药物的核磁共振方法
CN102574812A (zh) * 2009-09-29 2012-07-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 新型苯并咪唑衍生物及它们作为fxr激动剂的用途
CN102797043A (zh) * 2011-05-23 2012-11-28 众曜(天津)生物技术有限公司 药物分子片段库及其构建方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101977505A (zh) * 2007-06-13 2011-02-16 葛兰素史密丝克莱恩有限责任公司 类法尼醇x受体激动剂
CN102574812A (zh) * 2009-09-29 2012-07-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 新型苯并咪唑衍生物及它们作为fxr激动剂的用途
CN102797043A (zh) * 2011-05-23 2012-11-28 众曜(天津)生物技术有限公司 药物分子片段库及其构建方法
CN102507627A (zh) * 2011-11-14 2012-06-20 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种高通量筛选药物的核磁共振方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Size does matter! Label-free detection of small molecule–protein interaction;Peter Fechner et al.;《Analytical and Bioanalytical Chemistry》;20140511;第406卷(第17期);全文 *
基于片段的先导化合物发现中的核磁应用;阮科 等;《波谱学杂志》;20120630;第29卷(第2期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108072684A (zh) 2018-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ahn et al. Allosteric “beta-blocker” isolated from a DNA-encoded small molecule library
Gomez-Hurtado et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks
Ballif et al. Large-scale identification and evolution indexing of tyrosine phosphorylation sites from murine brain
Zhang et al. Progesterone receptor membrane component 1 is a functional part of the glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor complex in pancreatic β cells
Hényková et al. Stable isotope dilution ultra-high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry quantitative profiling of tryptophan-related neuroactive substances in human serum and cerebrospinal fluid
Sutanto et al. Combining high‐throughput synthesis and high‐throughput protein crystallography for accelerated hit identification
Vethe et al. The effect of Wnt pathway modulators on human iPSC-derived pancreatic beta cell maturation
Rodrigues et al. Omics-based responses induced by bosentan in human hepatoma HepaRG cell cultures
Comunian et al. A comparative MudPIT analysis identifies different expression profiles in heart compartments
WO1999018124A1 (en) Assays for nuclear receptor ligands using fret
Emaduddin et al. Odin (ANKS1A) is a Src family kinase target in colorectal cancer cells
Reinartz et al. Structure-bias relationships for fenoterol stereoisomers in six molecular and cellular assays at the β 2-adrenoceptor
Pagel et al. Tandem mass tags for comparative and discovery proteomics
Kalita et al. Application of mass spectrometry based proteomics to understand diabetes: a special focus on interactomics
CN108072684B (zh) 法尼醇x受体的新配体及其筛选方法和应用
Cuny et al. Simultaneous quantification of 26 NAD-related metabolites in plasma, blood, and liver tissue using UHPLC-MS/MS
Nguyen et al. Analysis of protein prenylation in vitro and in vivo using functionalized phosphoisoprenoids
Kim et al. A metabolomics strategy for detecting protein–metabolite interactions to identify natural nuclear receptor ligands
Qiu et al. CDK12 and Integrator-PP2A complex modulates LEO1 phosphorylation for processive transcription elongation
Łuszczyńska et al. Free mycophenolic acid determination in human plasma ultrafiltrate by a validated liquid chromatography–tandem mass spectrometry method
Xie et al. Characterization of a novel EB1 acetylation site important for the regulation of microtubule dynamics and cargo recruitment
Kofler et al. Proline-rich sequence recognition: I. Marking GYF and WW domain assembly sites in early spliceosomal complexes
Huang et al. KiC assay: a quantitative mass spectrometry-based approach
Mosure et al. Structural basis of interdomain communication in PPARγ
Gil et al. Lysine acetylation stoichiometry analysis at the proteome level

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant