CN108064131A - 水牛来源的肽抗菌治疗剂 - Google Patents

Abstract

本公开涉及抗菌剂和使用这样的药剂的方法。本公开包括具有广谱抗菌活性的抗菌剂、编码这样的抗菌剂的核酸和氨基酸序列，以及使用抗菌剂的方法。本公开的抗菌剂可作为抗菌治疗剂用于在微生物处理方案和研究中减少微生物的存活，以及其他涉及减少微生物存活的用途。另外，本公开还包括含有广谱抗菌剂的组合物以及制品。

Description

水牛来源的肽抗菌治疗剂

相关申请的交叉引用

本申请涉及和要求2014年8月4日提交的美国临时专利申请号62/032,737、2015年5月19日提交的美国专利号9,029,319、2015年4月3日提交的非临时专利申请号14/678,558、2015年4月21日提交的美国非临时专利申请号14/692,518、以及2015年6月25日提交的美国非临时专利申请号14/750,719的优先权，据此将其中的每一项通过引用全文并入。

技术领域

本公开涉及抗微生物剂和使用方法。更具体地，本公开涉及抗菌肽和其治疗用途。

序列表

本公开包含纸质形式和计算机可读形式的序列表，据此将所述序列表的教导和内容通过引用并入。

背景技术

抗微生物剂耐药性正在世界范围内减少有效的抗菌治疗的可用性。因为耐药生物体(包括细菌、真菌、病毒和寄生虫)能够抵挡抗菌药物的攻击，所以标准治疗变得无效。这样的耐药生物体的感染持续增加了传播给其他个体的风险。生物体耐药菌株的进化是当微生物暴露于抗菌药物时发生的自然现象，耐药特性可以在细菌的某些类型之间交换。抗菌药物的滥用也促进了耐药生物体的出现。

随着由于耐药生物体的出现导致的有效抗菌治疗的减少，需要新的抗菌治疗剂。开发和批准的新抗菌治疗剂的数量在过去的三十年里稳步减少，留下了甚至更少的治疗耐药生物体的选项。

因此，存在对具有广谱抗菌活性的抗菌治疗剂和疗法的需求。此外，存在对有效抑制有害微生物的生长和传播的需求。

发明内容

本公开提供了具有广谱抗菌活性的抗微生物剂和抑制微生物生长的方法。具体地，本公开涉及具有抗菌活性的肽和使用肽抑制微生物的方法。

本公开提供了具有可操作地连接的至少两条14个氨基酸的肽序列的合成抗微生物剂。氨基酸肽序列通常是式1(Gly-X₁-X₂-X₃-X₁-X₁-X₁-Arg-X₄-X₁-X₅-X₆-X₆-Gly)的序列，其中X₁选自Leu或Ile的组；X₂选自Ala、Val、Leu、Ile或Pro的组；X₃选自Arg或Trp的组；X₄选自Trp、Ile或Leu的组；X₅选自Phe或Trp的组；以及X₆选自Phe、Trp或Arg的组。在某些方面，氨基酸肽序列与SEQ ID NO:3-33中提供的序列具有至少70％的序列一致性。在某些方面，氨基酸肽序列与SEQ ID NO:3-33中提供的至少一个序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。优选地，氨基酸肽序列与SEQ ID NO:8具有至少85％的序列一致性。

在某些方面，公开的抗微生物剂包括可操作地连接的第一合成氨基酸序列和第二合成氨基酸序列。与第一合成氨基酸序列一样，这样的第二合成氨基酸序列为至少14个氨基酸的肽序列。通常，第二合成氨基酸序列也具有上述的式1的序列。在某些方面，第二合成氨基酸序列与第一合成氨基酸序列相同，产生同二聚体。在其他方面，第二合成氨基酸序列与第一合成氨基酸序列不相同，产生异二聚体。在某些方面，抗微生物剂包括与SEQ ID NO:40-4101提供的序列具有至少70％的序列一致性的序列。在某些方面，抗微生物剂包括与SEQ ID NO:40-4101提供的至少一个序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性的序列。优选地，抗微生物剂包括与SEQ IDNO:40具有至少85％的序列一致性的序列。

在某些方面，本公开的抗微生物剂包括可操作地使第一合成氨基酸序列连接于第二合成氨基酸序列的接头序列。适当的接头序列进一步提高了抗微生物剂的抗菌活性的动力学。在某些方面，定制接头序列以提高其在极性环境中的溶解度。在某些方面，定制接头序列以提高其在亲脂环境中的溶解性。在某些方面，定制接头序列以提高在各种化学环境中的化学稳定性。适当的接头序列可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸的长度。优选地，接头序列是约5、6、7、8、9或10个氨基酸的长度。更优选地，接头序列是约5～8个氨基酸的长度。适当的接头序列可包括在每个位置的任意氨基酸，只要不破坏抗微生物剂的抗菌活性。这样的接头序列包括允许由第一合成氨基酸序列和第二合成氨基酸序列形成的两条不同的螺旋反向平行排列的序列。这样的接头序列还包括提高第一合成氨基酸序列和第二合成氨基酸序列的抗菌活性的序列。通过举例而非限制性的方式，接头序列的第一氨基酸位置有效地被阴离子残基(如天冬氨酸根或谷氨酸根)占据，所述阴离子残基通过使活性构象稳定提高抗菌活性。而且，通过举例而非限制性的方式，接头序列可包括5～8个天冬酰胺残基以提高在极性环境中的溶解度，同时不干扰分子的剩余部分中活性构象的职责(incumbent)。可供选择地，接头序列可以包括5～8个甘氨酸残基以提高在极性环境中的溶解度，同时不干扰分子的剩余部分中活性构象的职责。在其他方面，接头序列可以是异种形式，由选自以下氨基酸的约5至约8个残基组成：包括天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸和其组合。可以选择适当的异种制剂以提高在极性环境中的溶解度，同时不干扰分子的剩余部分中活性构象的职责。

在某些方面，接头序列通常是式2的序列：(A1-P2-P3-...Pn)，其中“A”是指阴离子残基，“P”是指极性残基，以及“n”是指约3至约25的整数。适当的阴离子残基包括本领域本身已知的阴离子残基，包括但不限于天冬氨酸根和谷氨酸根。适当的极性残基包括本领域本身已知的极性残基，包括但不限于天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。在某些方面，n是如包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25的整数。优选地，n是如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数。在某些方面，接头序列与式2的序列具有至少70％的序列一致性。在某些方面，氨基酸序列与式2的序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。优选地，接头序列与式2的序列具有至少85％的序列一致性。

在某些方面，接头序列与SEQ ID NO:34-39中提供的序列具有至少70％的序列一致性。在某些方面，氨基酸序列与SEQ ID NO:34-39中提供的至少一个序列具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。优选地，接头序列与SEQ ID NO:34-39中提供的至少一个序列具有至少85％的序列一致性。

本公开的抗微生物剂也包括编码本文描述的氨基酸序列的核酸分子，以及编码抗微生物剂、其变体或片段的表达载体。而且，本公开提供了含有本文描述的这样的核酸、表达载体或肽的分离的细胞。本公开提供了含有本公开的核酸分子或肽，以及其变体或片段的组合物。此外，本公开提供了含有本公开的核酸分子或肽，以及其变体或片段的制品。

本公开提供了具有抗微生物(包括细菌、酵母、原生动物、真菌、霉菌、病毒和其组合)的广泛抗菌活性的抗微生物剂。在某些方面，抗微生物剂具有抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性。本公开的抗微生物剂可以用于抑制或阻止微生物的生长。这样的微生物可以包括但不限于：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、嗜血杆菌属(Haemophilus)和其组合的菌株。

在某些方面，抗菌组合物可以包括药物载体。在某些方面，抗菌组合物可以包括食品添加剂。

本公开提供了减少或抑制微生物的生长或存活的方法。这样的方法包括使微生物与抗微生物剂接触。

在某些方面，本公开提供了减少或抑制受试者的微生物的生长或存活的方法。该方法包括将含有抗微生物剂的组合物接触或施用于受试者。将治疗有效量的组合物递送至受试者。

在某些方面，本公开提供了治疗受试者的微生物感染的方法。该方法包括将含有本文公开的抗微生物剂的组合物接触或施用于受试者。将治疗有效量的组合物递送至受试者。

在某些方面，本公开提供了治疗受试者的乳腺炎的方法。该方法包括鉴定具有乳腺炎的受试者和将含有抗微生物剂的组合物接触或施用于受试者。在某些方面，将治疗有效量的组合物直接施用于受试者的乳腺组织。

本公开进一步提供了包括容器和抗微生物剂的制品或试剂盒。制品可以包括含有抗微生物剂和表明抗微生物剂可以用于治疗乳腺炎的标签的包装材料。制品可以包括含有抗微生物剂和表明抗微生物剂可以用于治疗受试者的微生物感染的标签的包装材料。制品可以包括含有抗微生物剂和表明抗微生物剂可以用于抑制微生物的生长或存活的标签的包装材料。制品可以包括含有抗微生物剂和表明抗微生物剂可以用于抑制受试者的微生物的生长或存活的标签的包装材料。

附图说明

以下附图组成了本说明书的一部分，还被包括以进一步证实本公开的某些方面。通过结合本文提供的具体实施方式的详细描述，参考这些附图中的一幅或多幅，可以更好地理解本公开。

本专利或申请文件包含至少一幅用彩色表示的附图。将根据要求和支付必要的费用，由专利局提供本专利或专利申请公开的具有彩图附图的副本。

图1图示了某些抗微生物剂方面的氨基酸组成。残基颜色反映了亲脂性(黄色)或碱性(蓝色)的偏好。

图2显示了基于分子动力学模拟的抗菌活性二聚体结构。绿色物体和黄色物体是以反向平行排列取向的组成相同的肽。数字鉴别了包括氨基末端(第0位)和羧基末端(第15位)的特定氨基酸位置。固体表面表示根据中性(蓝色)脂质或阴离子(红色)脂质着色的脂质膜。

图3图示了某些抗微生物剂方面的非共价二聚体构建体内特定氨基酸位置的作用。图示显示了二聚体内的稳定化(黑色箭头)、二聚体-膜脂质相互作用(黄色箭头)和二聚体-膜静电耦合(红色箭头)。

图4图示了基于图1中显示的非共价式的最小跨距的共价连接二聚体。在模型膜表面显示了以中性(蓝色)脂质相对于阴离子(红色)脂质着色的二聚体(银色图画和使CPK着色的棒)。

图5图示本公开的抗菌肽的抗菌活性。在组间发现统计学上的显著差异(P<0.001)(下方盒型图)，事后检验显示WB-14F与三个对照组(PBS、ATBX和非-Tx)之间的差异在5％水平的显著性。

图6描绘了以棒(左；如在螺旋轴上方显示的)和溶剂可及表面(中和右，如从前视图和侧视图显示的，螺旋轴在该页平面中向上)呈现的抗微生物剂(SEQ ID NO:17；)。着色如下：疏水残基是黄色；极性残基通过元素着色(H＝青色，C＝白色，N＝蓝色，O＝红色)。

图7显示了膜破坏模型。环状孔的形成(图7A)，其中肽亲脂表面以系统的方式协调脂质介质，以便协同形成跨膜孔或平面内扩散(图7B)。单独的肽或二聚体通过亲脂性肽-膜相互作用和带正电荷的肽氨基酸(蓝色表面)对带负电的磷脂头基(红色表面)的阳离子吸引的组合局部破坏膜序，失调的局部袋(local pockets)扩散性地聚集形成显著脆弱的膜区域。

具体实施方式

根据本公开，发现了用于抑制微生物的生长和存活的抗微生物剂组合物和使用抗微生物剂的方法。特别地，含有具有抗菌活性的肽的抗微生物剂用于抑制微生物的生长和存活。因此，本文描述的组合物和方法对抗菌治疗和治疗剂是有用的。此外，本文描述的组合物和方法可用于抗菌耐药性减少了抗菌治疗剂或抗菌疗法的可用性的情况。

I.组合物

本公开的组合物包括具有抗至少一种微生物的抗菌活性的抗微生物剂。在某些方面，本公开的组合物包括具有抗多于一种微生物的抗菌活性的抗微生物剂。

a.编码抗微生物剂的核酸

本公开提供了包括具有抗菌活性的合成肽的抗微生物剂。在某些方面，抗微生物剂包括肽、其片段或其变体，以及编码本公开的合成肽的核酸分子。这样的核酸分子可以包括表达载体。

公开了编码来源于水牛宿主防御蛋白的抗菌肽的核酸。编码本公开的抗菌肽的核酸序列来源于SEQ ID NO:1和编码的SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述编码的SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有SEQ ID NO:3的抗菌肽序列。本公开的适当的核苷酸序列包括编码具有抗细菌活性的肽和本文描述的的肽的核苷酸序列，所述具有抗细菌活性的肽如SEQ ID NO:3-33、40-4101所提供的那些肽。

只要突变体包括本文描述的编码功能性抗菌肽的核酸序列，就可以使用抗菌肽的突变核苷酸。可以使目的核酸突变以改变编码的肽的特性，如表达特性、折叠特性、溶解特性和抗细菌特性。技术人员会识别，由编码同系物或突变体的核酸所编码的蛋白可以具有与SEQ ID NO:3-33和40-4101相同的抗细菌特性，或可以具有改变的抗细菌特性。这样的突变的DNA序列或蛋白产物通常与本文提供的序列大体上相似，并且区别在于一个或多个核苷酸或氨基酸。序列改变可以是替换、插入、缺失或其组合。用于克隆的基因发生突变的技术是本领域已知的。在Gustin等人,Biotechniques 14:22,1993、Barany,Gene 37:1 11-23,1985、Colicelli等人.,Mol.Gen.Genet.199:537-9,1985和Sambrook等人,分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),CSH Press 1989,pp.15.3-15.108中可以发现用于位点特异性突变发生的方法，所有这些通过引用并入本文。这样的突变的核酸衍生物可以用于研究特定抗菌肽的结构-功能关系或改变肽的影响其功能或调节的特性。总之，本公开涉及编码序列，如编码SEQ ID NO:3-33、40-4101的氨基酸序列的那些序列的抗菌肽和其变体或突变体。而且，本公开涵盖了由描述的核酸序列编码的中间RNA(intermediary RNA)，所述中间RNA翻译为本公开的抗菌肽。

b.抗菌肽组合物

使用本领域已知的方法可以获得本文公开的合成肽，所述方法包括从表达肽的细胞中分离、化学合成或所述肽可以从重组核酸分子表达。蛋白质科学分册，第5单元(Current Protocols in Protein Science,Units 5),pub.John Wiley&Sons,Inc.,2002和蛋白质科学分册，第6单元(Current Protocols in Protein Science,Units 6),pub.John Wiley&Sons,Inc.,2002中描述了合成目的肽的方法，这两者通过引用并入本文。

本公开考虑了抗菌肽和其变体，其包括由目的核酸编码的那些肽。SEQ ID NO:3-33和40-4101的序列例证了本文公开的合成的抗细菌肽或抗细菌剂。而且，本公开包括本文描述的抗细菌肽的同二聚体和异二聚体两者。

本公开还包括了在氨基酸序列SEQ ID NO:3-33和40-4101的序列中变化的同系物(homolog)或肽。同系物是指使用如Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,微型计算机上的快速和灵敏的多序列比对(Fast and Sensitive Multiple Sequence Alignments on aMicrocomputer),CABIOS,5:151-153,1989中描述的MegAlign,DNAstar(1998)clustal算法确定的(均通过引用并入本文)，与SEQ ID NO:3-33或40-4101编码的蛋白质具有至少约10％，通常至少约25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高的氨基酸序列一致性的蛋白质。

可以突变或改变本文公开的抗菌肽以提高或改变蛋白质的生物特性。这样的生物特性包括但不限于体内或体外稳定性(例如半衰期)、溶解性、两亲性和抗菌活性的各种方面。这样的抗菌活性方面包括但不限于组织特异性、微生物靶标选择性、广谱抗菌效力和根据微生物耐药性机制的不变性。适当的突变包括单个氨基酸改变、一个或多个氨基酸的缺失，N-末端截短、C-末端截短、插入等。使用分子生物学的标准技术可以产生突变体，所述标准技术包括如现代分子生物学实验技术，第8单元(Current Protocols in MolecularBiology,Unit8),pub,John Wiley&Sons,Inc.,2000(通过引用并入本文)中描述的随机突变产生和靶向突变产生。

当前考虑的多种(manifold)肽制剂具有巨大价值，因为作为整体的多特征具有如下的作用机制：不易受由葡萄球菌黄素的膜表达提供的关键微生物抗氧化耐性机制影响。此外，可以应用多种内的策略性序列变异抵消受适应性膜电荷分布影响的微生物防御，所述适应性膜电荷分布与阴离子脂质的共价修饰或更多的膜葡萄球菌黄素表达相关。

本文公开的抗菌肽的特征是具有抗菌活性。具体地，公开的肽能够使微生物的细胞膜分裂，引起微生物的破坏。

抗菌肽通常具有式1(Gly-X₁-X₂-X₃-X₁-X₁-X₁-Arg-X₄-X₁-X₅-X₆-X₆-Gly)的第一合成氨基酸序列，其中X₁选自Leu或Ile的组；X₂选自Ala、Val、Leu、Ile或Pro的组；X₃选自Arg或Trp的组；X₄选自Trp、Ile或Leu的组；X₅选自Phe或Trp的组；以及X₆选自Phe、Trp或Arg的组。

抗菌肽也可以具有式1(Gly-X₁-X₂-X₃-X₁-X₁-X₁-Arg-X₄-X₁-X₅-X₆-X₆-Gly)的第二抗菌合成氨基酸序列，其中X₁选自Leu或Ile的组；X₂选自Ala、Val、Leu、Ile或Pro的组；X₃选自Arg或Trp的组；X₄选自Trp、Ile或Leu的组；X₅选自Phe或Trp的组；X₆选自Phe、Trp或Arg的组。抗微生物剂可以包括抗菌肽的同二聚体，其中第一抗菌合成序列具有与第二抗菌合成序列相同的序列。抗微生物剂可以包括抗菌肽的异二聚体，其中第一抗菌合成序列具有与第二抗菌合成序列不同的序列。这样的差异可以在于一个或多个氨基酸序列。

典型地，抗菌肽的长度为约14个氨基酸残基至约30个氨基酸残基。在某些方面，抗菌肽的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多个氨基酸残基。优选地，抗菌肽的长度为14个氨基酸残基。在某些方面，包括抗菌肽的同二聚体的抗微生物剂的长度为约28个氨基酸残基。在某些方面，包括抗菌肽的同二聚体的抗微生物剂的长度为约35个氨基酸残基。在某些方面，包括抗菌肽的异二聚体的抗微生物剂的长度为约28个氨基酸残基。在某些方面，包括抗菌肽的异二聚体的抗微生物剂的长度为约35个氨基酸残基。技术人员会认识到抗菌肽的同二聚体或异二聚体的长度取决于各自的同二聚体或异二聚体中所使用的抗菌肽的长度。

抗微生物剂可以包括将第一抗菌合成序列连接于第二抗菌合成序列的接头序列。在某些方面，连接于第一和第二抗菌肽的接头序列产生共价连接的二聚体制剂(formulation)。适当的接头序列可以用于改善抗菌动力学。在一个方面，接头序列通过促进二聚化结构保持对抗菌活性有益的构象来提高动力学。在一个方面，接头序列可用于提高二聚体的递送。这样的接头序列可以包括促进在极性介质或亲脂性介质中的溶解度的特定氨基酸制剂。在另一方面，接头序列可以用于提高在不同环境中的化学稳定性。

可以定制适当的接头序列以提供特定的提高。接头序列可以是不破坏抗菌肽的抗菌活性的任何尺寸的长度。在某些方面，接头序列可以是约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸残基的长度。优选地，接头序列是约2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的长度。在某些方面，接头序列是约7个氨基酸残基的长度。可以定制接头序列的氨基酸残基以提供特定的提高。在某些方面，接头序列主要包括极性氨基酸。在某些方面，接头序列包括SEQ ID NO:34-39的至少一个序列。在某些方面，接头序列包括SEQ ID NO:34的序列。

c.药物组合物

本公开提供了包含至少一种本文描述的抗微生物剂的药物组合物。为了制备这样的药物组合物，合成或另外获得抗微生物剂、抗菌肽、同二聚体、异二聚体或其组合，必要或需要时将它们纯化，然后冻干和稳定化。然后可以将抗微生物剂调节至适当的浓度，以及与其他试剂或药学上可接受的载体组合。适当的药学上可接受的载体包括但不限于与制剂的其他成分相容并且对其受体无毒的载体、稀释剂、赋形剂、盐或其组合。

使用熟知和容易获得的成分，通过本领域已知的方法可以制备含有本文公开的抗微生物剂的药物制剂。例如，可以用常见的赋形剂、稀释剂或载体配制抗微生物剂，并且使抗微生物剂形成片剂、胶囊剂、溶液剂、悬液剂、粉剂、气雾剂等。适用于这样的制剂的赋形剂、稀释剂和载体的实例包括：缓冲液以及填料和填充剂(extender)如淀粉、纤维素、糖、甘露醇和硅衍生物。还可以包括粘合剂如羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和其他纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮。

II.方法

本公开的包含至少一种抗微生物剂的组合物在减少微生物生长或存活的方法中是有用的。技术人员会理解使用本文公开的抗微生物剂的多种方法。因此，本文包括的方法是示例而不是对可以使用抗微生物剂的范围的限制。本公开的方法包括减少微生物的生长或存活、治疗具有微生物感染的受试者和治疗具有乳腺炎的受试者，以及使用本文公开的抗微生物剂的其他方法。

本文公开的抗微生物剂起作用所对抗的微生物包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、真菌、霉菌、病毒、单细胞寄生虫和其他本领域已知的微生物。非限制性实例包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、犬生殖道脲原体(Ureaplasmacanigenitalium)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase negative staphylococci)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、皮炎链球菌(Streptococcus hyicus)、表皮链球菌(Streptococcusepidermidis)、木糖链球菌(Streptococcus xylosus)、中间链球菌(Streptococcusintermedius)。停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)、支原体属(Mycoplasma spp.)(牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛生殖道支原体(Mycoplasma bovigenitalium)、加拿大支原体(Mycoplasma canadense)、加利福尼亚支原体(Mycoplasma californicum)、产碱支原体(Mycoplasma alkalescens))、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)(肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca))、肠杆菌属(Enterobacter spp.)(产气肠杆菌(E.aerogenes)、河生肠杆菌(E.amnigenus)、成团肠杆菌(E.agglomerans)、花生肠杆菌(E.arachidis)、阿氏肠杆菌(E.asburiae)、生癌肠杆菌(E.cancerogenous)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)、卡尤内肠杆菌(E.cowanii)、溶解肠杆菌(E.dissolvens)、日勾维肠杆菌(E.gergoviae)、瑞士肠杆菌(E.helveticus)、霍氏肠杆菌(E.hormaechei)、中间肠杆菌(E.intermedius)、神户肠杆菌(E.kobei)、路德维希肠杆菌(E.ludwigii)、桑肠杆菌(E.mori)、超压肠杆菌(E.nimipressuralis)、水稻肠杆菌(E.oryzae)、粉尘肠杆菌(E.pulveris)、梨形肠杆菌(E.pyrinus)、雷氏肠杆菌(E.radicincitans)、秦洛氏肠杆菌(E.taylorae)、苏黎世肠杆菌(E.turicensis)、阪崎肠杆菌(E.sakazakii)、索利肠杆菌(Enterobacter soli))、柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp)(无丙二酸柠檬酸杆菌(C.amalonaticus)、布氏柠檬酸杆菌(C.braakii)、差异柠檬酸杆菌(C.diversus)、法氏柠檬酸杆菌(C.farmeri)、弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)、吉伦氏柠檬酸杆菌(C.gillenii)、柯氏柠檬酸杆菌(C.koseri)、莫氏柠檬酸杆菌(C.murliniae)、鼠类柠檬酸杆菌(C.rodentium)、塞氏柠檬酸杆菌(C.sedlakii)、魏氏柠檬酸杆菌(C.werkmanii)、杨氏柠檬酸杆菌(C.youngae))、变形杆菌属(Proteus spp.)(豪氏变形杆菌(P.hauseri)、奇异变形杆菌、产粘变形杆菌(P.myxofaciens)、彭氏变形杆菌(P.penneri)、普通变形杆菌(P.vulgaris))、肠球菌属(Enterococci)、沙雷氏菌属(Serratia spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)(铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、病鳝假单胞菌(P.anguilliseptica)、阿根廷假单胞菌(P.argentinensis)、烂泥假单胞菌(P.borbori)、香茅醇假单胞菌(P.citronellolis)、变黄假单胞菌(P.flavescens)、门多萨假单胞菌(P.mendocina)、硝基还原假单胞菌(P.nitroreducens)、食油假单胞菌(P.oleovorans)、类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)、食树脂假单胞菌(P.resinovorans)、稻草假单胞菌(P.straminea))、绿针假单胞菌组(P.chlororaphis group)(伞菌假单胞菌(P.agarici)、铁角蕨假单胞菌(P.asplenii)、橘黄假单胞菌(P.aurantiaca)、致金色假单胞菌(P.aureofaciens)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、皱纹假单胞菌(P.corrugata)、莓实假单胞菌(P.fragi)、隆德假单胞菌(P.lundensis)、腐臭假单胞菌(P.taetrolens))、荧光假单胞菌组(P.fluorescens group)(南极假单胞菌(P.antarctica)、产氮假单胞菌(P.azotoformans)、油菜假单胞菌(P.brassicacearum)、布氏假单胞菌(P.brenneri)、塞氏假单胞菌(P.cedrina)、皱纹假单胞菌(P.corrugata)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、盖氏假单胞菌(P.gessardii)、黎巴嫩假单胞菌(P.libanensis)、孟氏假单胞菌(P.mandelii)、边缘假单胞菌(P.marginalis)、地中海假单胞菌(P.mediterranea)、梅氏假单胞菌(P.meridiana)、米氏假单胞菌(P.migulae)、霉味假单胞菌(P.mucidolens)、东方假单胞菌(P.orientalis)、人参假单胞菌(P.panacis)、保护假单胞菌(P.protegens)、蛋白分解假单胞菌(P.proteolytica)、罗氏假单胞菌(P.rhodesiae)、类黄假单胞菌(P.synxantha)、赛维瓦尔假单胞菌(P.thivervalensis)、托拉氏假单胞菌(P.tolaasii)、斡氏假单胞菌(P.veronii))、百日咳假单胞菌组(P.pertucinogena group)(脱氮假单胞菌(P.denitrificans)、百日咳假单胞菌(P.pertucinogena))、恶臭假单胞菌组(P.putidagroup)(克雷默里假单胞菌(P.cremoricolorata)、黄褐假单胞菌(P.fulva)、蒙氏假单胞菌(P.monteilii)、莫塞里假单胞菌(P.mosselii)、栖稻假单胞菌(P.oryzihabitans)、副黄褐假单胞菌(P.parafulva)、变形假单胞菌(P.plecoglossicida)、恶臭假单胞菌(P.putida))、施氏假单胞菌组(P.stutzeri group)(巴利阿里假单胞菌(P.balearica)、浅黄假单胞菌(P.luteola)、施氏假单胞菌(P.stutzeri))、丁香假单胞菌组(P.syringaegroup)(扁桃假单胞菌(P.amygdali)、榛子假单胞菌(P.avellanae)、番木瓜假单胞菌(P.caricapapayae)、菊苣假单胞菌(P.cichorii)、晕斑假单胞菌(P.coronafaciens)、天仙果假单胞菌(P.ficuserectae)、苦楝假单胞菌(P.meliae)、萨瓦斯塔诺假单胞菌(P.savastanoi)、丁香假单胞菌(P.syringae)、绿黄假单胞菌(P.viridiflava))、地位未定(incertae sedis)(阿必坦假单胞菌(P.abietaniphila)、嗜酸假单胞菌(P.acidophila)、伞菌假单胞菌(P.agarici)、嗜碱假单胞菌(P.alcaliphila)、解碱假单胞菌(P.alkanolytica)、介支淀粉假单胞菌(P.amyloderamosa)、铁角蕨假单胞菌(P.asplenii)、阿左假单胞菌(P.azotifigens)、大麻假单胞菌(P.cannabina)、寇氏假单胞菌(P.coenobios)、孔氏假单胞菌(P.congelans)、康氏假单胞菌(P.costantinii)、克罗斯韦假单胞菌(P.cruciviae)、德里假单胞菌(P.delhiensis)、外囊假单胞菌(P.excibis)、极东假单胞菌(P.extremorientalis)、弗雷德里克斯堡假单胞菌(P.frederiksbergensis)、褐鞘假单胞菌(P.fuscovaginae)、冷水假单胞菌(P.gelidicola)、格里蒙假单胞菌(P.grimontii)、因地卡假单胞菌(P.indica)、杰氏假单胞菌(P.jessenii)、晋州假单胞菌(P.jinjuensis)、基尔假单胞菌(P.kilonensis)、纳克假单胞菌(P.knackmussii)、韩国假单胞菌(P.koreensis)、丽尼假单胞菌(P.lini)、黄假单胞菌(P.lutea)、摩拉维亚假单胞菌(P.moraviensis)、耳炎假单胞菌(P.otitidis)、海绵假单胞菌(P.pachastrellae)、帕勒隆尼氏假单胞菌(P.palleroniana)、罂粟假单胞菌(P.papaveris)、佩利假单胞菌(P.peli)、腐卵假单胞菌(P.perolens)、草假单胞菌(P.poae)、浦项假单胞菌(P.pohangensis)、保护假单胞菌(P.protegens)、嗜冷假单胞菌(P.psychrophila)、耐冷假单胞菌(P.psychrotolerans)、拉梭假单胞菌(P.rathonis)、食爬虫假单胞菌(P.reptilivora)、嗜树脂假单胞菌(P.resiniphila)、草根假单胞菌(P.rhizosphaerae)、浅红假单胞菌(P.rubescens)、萨氏假单胞菌(P.salomonii)、缓慢假单胞菌(P.segitis)、败血假单胞菌(P.septica)、猿猴假单胞菌(P.simiae)、猪假单胞菌(P.suis)、耐热假单胞菌(P.thermotolerans)、山黄麻假单胞菌(P.tremae)、平凡假单胞菌(P.trivialis)、螺状假单胞菌(P.turbinellae)、杜蒂戈林假单胞菌(P.tuticorinensis)、阴城假单胞菌(P.umsongensis)、温哥华假单胞菌(P.vancouverensis)、乌兰诺瓦假单胞菌(P.vranovensis)、黄色海假单胞菌(P.xanthomarina))、原壁菌属(Prototheca)、牛棒状杆菌(Corynebacterium bovis)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)(嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、蜂房芽孢杆菌(B.alvei)、噬胺芽孢杆菌(B.aminovorans)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、解硫胺芽孢杆菌(B.aneurinolyticus)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、海水芽孢杆菌(B.aquaemaris)、萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)、固氮芽孢杆菌(B.azotoformans)、栗褐芽孢杆菌(B.badius)、嗜硼芽孢杆菌(B.boroniphilus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、热溶芽孢杆菌(B.caldolyticus)、中孢芽孢杆菌(B.centrosporus)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、苛求芽孢杆菌(B.fastidious)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、黄热芽孢杆菌(B.flavothermus)、梭形气芽孢杆菌(B.fusiformis)、加里西亚芽孢杆菌(B.galliciensis)、球芽孢杆菌(B.globigii)、圆孢芽孢杆菌(B.globisporus)、下层芽孢杆菌(B.infernus)、异常芽孢杆菌(B.insolitus)、幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、浸麻芽孢杆菌(B.macerans)、马阔里芽孢杆菌(B.macquariensis)、海洋芽孢杆菌(B.marinus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、肠膜芽孢杆菌(B.mesentericus)、胶冻样芽孢杆菌(B.mucilaginosus)、蕈状芽胞杆菌(B.mycoides)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、泛酸芽孢杆菌(B.pantothenticus)、巴氏芽孢杆菌(B.pasteurii)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、日本甲虫芽孢杆菌(B.popilliae)、假炭疽芽孢杆菌(B.pseudoanthracis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、施氏芽孢杆菌(B.schlegelii)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、耐热芽孢杆菌(B.sporothermodurans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、普通芽孢杆菌(B.vulgatis)、维恩斯特凡纳芽孢杆菌(B.weihenstephanensis))、巴斯德氏菌属(Pasteurella spp.)(产气巴斯德氏菌(P.aerogenes)、鸭巴斯德氏菌(P.anatis)、鸟巴斯德氏菌(P.avium)、贝氏巴斯德氏菌(P.bettyae)、马巴斯德氏菌(P.caballi)、犬巴斯德氏菌(P.canis)、达可马巴斯德氏菌(P.dagmatis)、鸡杀巴斯德氏菌(P.gallicida)、鸡巴斯德氏菌(P.gallinarum)、肉芽肿巴斯德氏菌(P.granulomatis)、兰氏巴斯德氏菌(P.langaaensis)、淋巴管巴斯德氏菌(P.lymphangitidis)、麦氏巴斯德氏菌(P.mairii)、多杀巴斯德氏菌(P.multocida)、口腔巴斯德氏菌(P.oralis)、侵肺巴斯德氏菌(P.pneumotropica)、天空巴斯德氏菌(P.skyensis)、口巴斯德氏菌(P.stomatis)、龟巴斯德氏菌(P.testudinis)、海藻巴斯德氏菌(P.trehalosi)、脲巴斯德氏菌(P.ureae)、飞禽巴斯德氏菌(P.volantium))、沙雷氏菌属(Serratia spp.)(嗜虫沙雷氏菌(S.entomophila)、无花果沙雷氏菌(S.ficaria)、居泉沙雷氏菌(S.fonticola)、格氏沙雷氏菌(S.grimesii)、液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、气味沙雷氏菌(S.odorifera)、普城沙雷氏菌(S.plymuthica)、变形斑沙雷氏菌(S.proteamaculans)、食醌沙雷氏菌(S.quinivorans)、深红沙雷氏菌(S.rubidaea)、共生沙雷氏菌(S.symbiotica))和本领域已知的其他微生物。这样的单细胞寄生虫包括但不限于：利什曼原虫、密螺旋体、贾第虫和其他本领域已知的单细胞寄生虫。

在某些方面，本文公开的抗微生物剂起作用所对抗的微生物还可以包括医学相关的细菌。这样的医学相关的细菌可以包括但不限于，金黄色葡萄球菌、表皮链球菌、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、中间葡萄球菌(S.intermedius)、路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)、腐生葡萄球菌(S.saprophiticus)、施氏葡萄球菌(S.schleiferi)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)；无乳链球菌、咽峡链球菌(S.anginosus)、牛链球菌(S.bovis)、似马链球菌(S.equisimilis)、缓症链球菌(S.mitis)、变异链球菌(S.mutans)、肺炎链球菌(S.pneumonia)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、血链球菌(S.sanguis)、唾液链球菌(S.salivarius)、猪链球菌(S.suis)；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)；淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitides)；黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、腔隙莫拉氏菌(M.lacunata)、不液化莫拉氏菌(M.nonliquefaciens)、尿道莫拉氏菌(M.urethralis)；金氏金氏菌(Kingella kingae)、反硝化金氏菌(K.denitrificans)；啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)；蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、短芽孢杆菌(B.brevis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、浸麻芽孢杆菌(B.macerans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、双酶梭菌(C.bifermentans)、拜氏梭菌(C.butyricum)、卡尼梭菌(C.carnis)、梭状梭菌(C.clostridioforme)、艰难梭菌(C.difficile)、谲诈梭菌(C.fallax)、溶组织梭菌(C.histolyticum)、无害梭菌(C.innocuum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、诺氏梭菌(C.novyi)、多枝梭菌(C.ramosum)、败毒梭菌(C.septicum)、索氏梭菌(C.sordellii)、第三梭菌(C.tertium)、破伤风梭菌(C.tetani)；单核细胞增生李斯特氏菌；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)；肉芽肿鞘杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)；吉氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)、脆弱拟杆菌(B.fragilis)、多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)、卵形拟杆菌(B.ovatus)、普通拟杆菌(B.vulgatus)；死亡梭杆菌(Fusobacterium mortiferum)、具核梭杆菌(F.nucleatum)、坏死梭杆菌(F.necrophorum)；麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum)；消化链球菌属(Peptostreptococcus)(厌氧消化链球菌(P.anaerobius)、不解糖消化链球菌(P.asaccharolyticus)、氢消化链球菌(P.hydrogenalis)、大消化链球菌(P.magnus)、产黑色素消化链球菌(P.melaninogenica)、微小消化链球菌(P.micros)、四联消化链球菌(P.tetradius)、普氏消化链球菌(P.prevotii))；卟啉单胞菌属(Porphyromonas)(不解糖卟啉单胞菌(P.asaccharolytica)、牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis))；普雷沃氏菌属(Prevotella)(产黑色素普雷沃氏菌(P.melaninogenica)、口普雷沃氏菌(P.oris)、颊普雷沃氏菌(P.buccae))；小韦荣氏球菌(Veillonella parvula)；猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、肠炎沙门氏菌、肠胃炎沙门氏菌(S.gastroenteritis)、甲型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi-A)、薛氏沙门氏菌(S.schottmuelleri)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌；鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)、痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(S.flexneri)、索氏志贺氏菌(S.sonnei)；嗜低温弓形菌(Arcobacter cryaerophilia)、布氏弓形菌(A.butzleri)、斯氏弓形菌(A.skirrowii)；大肠弯曲杆菌(Campylobactercoli)、胚胎弯曲杆菌(C.fetus)、豚肠弯曲杆菌(C.hyointestinalis)、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)、红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari)、唾液弯曲杆菌(C.sputorum)、乌普萨拉弯曲杆菌(C.upsaliensis)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、同性恋螺杆菌(H.cinaedi)、芬纳尔螺杆菌(H.fennelliae)；霍乱弧菌(Vibrio cholera)、美人鱼弧菌(V.damsela)、胎儿弧菌(V.fetus)、河流弧菌(V.fluvialis)、弗氏弧菌(V.furnissia)、霍氏弧菌(V.hollisae)、最小弧菌(V.mimicus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)；弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、差异柠檬酸杆菌(C.diversus)(克氏柠檬酸杆菌(C.koseri))；大肠埃希氏菌；产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)；肺炎克雷伯氏菌、鼻硬结克雷伯氏菌(K.rhinoscleromatis)、臭鼻克雷伯氏菌(K.ozaenae)；奇异变形杆菌；粘质沙雷氏菌；铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌(P.cepacia)、荧光假单胞菌、噬麦芽假单胞菌(P.maltophilia)、鼻疽假单胞菌(P.mallei)、类鼻疽假单胞菌(P.pseudomallei)、恶臭假单胞菌(P.putida)、腐败假单胞菌(P.putrefaciens)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)；流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、狗布鲁氏菌(B.canis)、马耳他布鲁氏菌(B.melitensis)、猪布鲁氏菌(B.suis)；溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)、多杀巴斯德氏菌(P.multicida)；小肠结肠耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、副流感嗜血杆菌(H.parainfluenzae)、杜氏嗜血杆菌(H.ducreyi)、埃及嗜血杆菌(H.aegyptius)；鸟博德特氏杆菌(Bordetella avium)、支气管炎博德特氏杆菌(B.bronchiseptica)、欣氏博德特氏杆菌(B.hinzii)、副百日咳博德特氏杆菌(B.parapertussis)、百日咳博德特氏杆菌(B.pertussis)；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、库氏棒状杆菌(C.kutscheri)、假结核棒状杆菌(C.pseudotuberculosis)、假白喉棒状杆菌(C.pseudodiphtheriticum)、牛肾盂炎棒状杆菌(C.renale)、干燥棒状杆菌(C.xerosis)、溃疡棒状杆菌(C.ulcerans)；非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、胞内鸟分枝杆菌(M.avium-intracellulare)、牛分枝杆菌(M.bovis)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)、田鼠分枝杆菌(M.microtii)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)；星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、巴西诺卡氏菌(N.brasiliensis)、豚鼠耳炎诺卡氏菌(N.caviae)；博尔德氏放线菌(Actinomyces bernardiae)、牛型放线菌(A.bovis)、齿垢放线菌(A.denticolens)、戈氏放线菌(A.gerencseriae)、乔氏放线菌(A.georgiae)、受损大麦放线菌(A.hordeovulneris)豪威尔放线菌(A.howellii)、猪阴道放线菌(A.hyovaginalis)、衣氏放线菌(A.israelii)、麦尔放线菌(A.meyeri)、内氏放线菌(A.naeslundii)、纽氏放线菌(A.neuii)、龋齿放线菌(A.odontolyticus)、化脓放线菌(A.pyogenes)、罗亚放线菌(A.radingae)、斯氏放线菌(A.slackii)、猪放线菌(A.suis)、图列茨放线菌(A.turicensis)、粘放线菌(A.viscosus)；丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumpropionicus)；索马里链霉菌(Streptomyces somaliensis)；问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、双曲钩端螺旋体(L.biflexa)；布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、赫氏蜱疏螺旋体(B.hermsii)、回归热疏螺旋体(B.recurrentis)、特里蜱疏螺旋体(B.turicatae)；减少螺菌(Spirillum minum)；苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、斑点病密螺旋体(T.carateum)；发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖道支原体(M.genitalium)、人型支原体(M.hominis)、穿透支原体(M.penetrans)、梨支原体(M.pirum)、肺炎支原体(M.pneumonia)；解脲支原体；螨立克次氏体(Rickettsiae akari)、澳大利亚立克次氏体(R.australis)、康氏立克次氏体(R.conorii)、日本立克次氏体(R.japonica)、普氏立克次氏体(R.prowazekii)、立氏立克次氏体(R.rickettsii)、西伯利亚立克次氏体(R.sibirica)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)；犬埃里希氏体(Ehrlichiacanis)、恰菲埃里希氏体(E.chaffeensis)、马埃里希氏体(E.equi)、尤氏埃里希氏体(E.ewingii)、嗜噬胞埃里希氏体(E.phagocytophila)、扁平埃里希氏体(E.platys)、里氏埃里希氏体(E.risticii)、腺热埃里希氏体(E.sennetsu)；恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)；伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)；杆状巴尔通氏体(Bartonellabacilliformis)；汉氏巴尔通氏体(B.henselae)、五日热巴尔通氏体(B.Quintana)；肺炎衣原体(Chlamydia pneumonia)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、沙眼衣原体(C.trachomatis)；茴芹军团菌(Legionella ansia)、杜氏军团菌(L.dumollii)、菲氏军团菌(L.feelei)、麦氏军团菌(L.micdadei)、侵肺军团菌(L.pneumophila)，以及其他本领域已知或尚未发现的医学相关的细菌。

在某些方面，本文公开的抗微生物剂起作用所对抗的微生物还可以包括兽医相关的细菌。这样的相关的细菌可以包括但不限于，莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)；马驹放线杆菌(Actinobacillusequuli)、李氏放线杆菌(A.lignieresii)、大叶性肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)、罗氏放线杆菌(A.rossi)、猪放线杆菌(A.suis)、猪放线棒菌(Actinobaculum suis)；牛型放线菌(Actinomyces bovis)、粘放线菌(A.viscosus)；嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)；杀鲑异弧菌(Aliivibrio salmonicida)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)；布氏弓形菌(Arcobacter butzleri)；副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)；炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌；脆弱拟杆菌；克氏巴尔通氏体(Bartonellaclarridgeiae)、伊氏巴尔通氏体(B.elizabethae)、汉氏巴尔通氏体(B.henselae)、温氏巴尔通氏体(B.Vinsonii)；虫茧蜜比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)；鸟博德特氏菌(B.avium)、支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)、百日咳博德特氏菌(B.pertussis)；阿氏疏螺旋体(Borreliaafzelii)、鹅疏螺旋体(B.anserine)、布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、嘎氏疏螺旋体(B.garinii)；奥尔堡短螺旋体(Brachyspira aalborgi)、阿氏短螺旋体(B.alvinipulli)、痢疾短螺旋体(B.hyodysenteriae)、媒介短螺旋体(B.intermedia)、毛肠短螺旋体(B.pilosicoli)、苏氏短螺旋体(B.suanatina)；热杀索丝菌(Brochothrixthermosphacta)；流产布鲁氏菌、狗布鲁氏菌、鲸型布鲁氏菌(B.ceti)、马耳他布鲁氏菌、羊布鲁氏菌(B.ovis)、鳍型布鲁氏菌(B.pinnipedialis)、猪布鲁氏菌(B.suis)；鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)；大肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、乌普萨拉弯曲杆菌；沙眼衣原体；流产嗜衣原体(Chlamydophila abortus)猫嗜衣原体(C.felis)、鹦鹉热嗜衣原体(C.psittaci)；弗氏柠檬酸杆菌；肉毒梭菌I组、II组、III组、IV组；肖氏梭菌(Clostridiumchauvoei)、艰难梭菌、溶血梭菌(C.haemolyticum)、诺氏梭菌、产气荚膜梭菌、毛状梭菌(C.piliforme)、败毒梭菌、索氏梭菌、破伤风梭菌；牛棒状杆菌、白喉棒状杆菌、库氏棒状杆菌、假结核棒状杆菌、牛肾盂炎棒状杆菌、溃疡棒状杆菌；伯氏考克斯氏体；刚果嗜皮菌(Dermatophilus congolensis)；节瘤偶蹄形菌(Dichelobacter nodosus)；鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、迟钝爱德华氏菌(E.tarda)；犬埃里希氏体、反刍动物埃里希氏体(E.ruminantium)；粪肠球菌、屎肠球菌；猪红斑丹毒丝菌；大肠埃希氏菌；柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、嗜冷黄杆菌(F.psychrophilum)；诺神弗朗西丝氏菌(Francisella noatunensis)、土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)；康氏梭形菌(Fusobacterium canifelinum)、马梭形菌(F.equinum)、坏疽梭形菌(F.necrophorum)；鸭卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)；副猪嗜血菌(Haemophilus parasuis)；肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus)、幽门螺杆菌；绵羊嗜组织菌(Histophilus somni)；产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)；侵肺军团菌；博氏钩端螺旋体(Leptospiraborgpetersenii)、问号钩端螺旋体、柯氏钩端螺旋体(L.kirschneri)；无害李斯特氏菌(Listeria innocu)、伊氏李斯特氏菌(L.ivanovii)、单核细胞增生李斯特氏菌；鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)；肉芽肿曼氏杆菌(Mannheimia granulomatis)、溶血曼氏杆菌(M.haemolytica)、多源曼氏杆菌(M.varigen)；冥王星蜜蜂球菌(Melissococcusplutonius)；铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)；牛莫拉氏菌(Moraxellabovis)、奥斯陆莫拉氏菌(M.osloensis)；摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)；鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、结核分枝杆菌；无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)、牛支原体、山羊支原体(M.capricolum)、猫支原体(M.felis)、鸡败血支原体(M.gallisepticu)、血小体支原体(M.haemofelis)、猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、猪关节支原体(M.hyosynoviae)、火鸡支原体(M.meleagridi)、蕈状支原体(M.mycoides)、肺炎支原体、肺支原体(M.pulmonis)、猪支原体(M.suis)、关节液支原体(M.synoviae)；淋病奈瑟氏球菌；里氏新立克次氏体(Neorickettsia risticii)；小麦尼可拉氏体(Nicoletella semolina)；星状诺卡氏菌；幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)；马巴斯德氏菌、达可马巴斯德氏菌、多杀巴斯德氏菌、侵肺巴斯德氏菌；吲哚嗜胨菌(Peptoniphilus indolicus)；类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)；产黑色素普雷沃氏菌；奇异变形杆菌、普通变形菌；铜绿假单胞菌、病鳝假单胞菌；沙氏肾杆菌(Renibacterium salmoninarum)；马红球菌(Rhodococcus equi)；普氏立克次氏体、立氏立克次氏体；鸭瘟立默氏菌(Riemerellaanatipestifer)；沙门氏菌属(Salmonella spp.)、肠沙门氏菌(S.enterica)；粘质沙雷氏菌；痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌；金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、猫葡萄球菌(S.felis)、猪葡萄球菌、中间葡萄球菌、假中间葡萄球菌(S.pseudintermedius)、施氏葡萄球菌；嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)；念珠状链杆菌；无乳链球菌；犬链球菌(S.canis)、德弗里斯链球菌(S.devriesei)、停乳链球菌、马链球菌(S.equi)、肺炎链球菌、豕链球菌(S.porcinus)、酿脓链球菌、猪链球菌、乳房链球菌；驴生殖道泰勒氏菌(Taylorella asinigenitalis)、马生殖道泰勒氏菌(T.equigenitalis)；苍白密螺旋体、兔梅毒密螺旋体(T.paraluiscuniculi)、足密螺旋体(T.pedis)、溃蚀密螺旋体(T.phagedenis)；化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)；差异尿支原体(Ureaplasmadiversum)；解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、霍乱弧菌(V.cholera)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)；小肠结肠耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)、鲁氏耶尔森氏菌(Y.ruckeri)，以及其他本领域已知或尚未发现的兽医相关的细菌。

减少微生物的生长或存活的方法包括将本公开的抗微生物剂接触微生物群。该方法可以包括首先鉴定微生物群。

本文公开的方法包括抑制微生物的存活或生长的方法。术语“抑制”包括任何可检测量的减少，例如5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少，并且可以通过本领域已知的方法确定。检测抑制的示例性方法包括通过计数确定(如细菌培养或病毒滴度)，或通过评价一种或多种与微生物感染相关的症状确定。与微生物感染相关的症状是本领域已知的。这样的症状是特定的感染性微生物和所产生的疾病特有的。

可以使能支持微生物的生长或存活的组合物与有效量的抗微生物剂以多种方式接触。例如，如果组合物是食品类，可以将抗微生物剂直接添加至食品，可以将抗微生物剂掺入到包装材料的基质中，或将其涂覆在包装材料上，在这种情况下，可以在储存期间当封装材料分解时释放抗微生物剂，使抗微生物剂与水分接触或在设定的温度下与水分接触。如果组合物是体液，可以将抗微生物剂直接添加至体液中。

可以使受试者与抗微生物剂以多种方式接触，包括但不限于使用本领域通常已知的途径施用。这样的途径包括口、非肠胃(包括皮下、静脉内、肌肉内和腹膜内)、直肠、阴道、真皮、透皮(局部)、透粘膜、胸腔内、肺内和鼻内(呼吸道)途径。施用的方式可以是通过注射、使用泵或任何其他合适的装置。

可以以单剂量、以多剂量、以连续或以间歇的方式，根据例如受试者的生理状况、施用目的是治疗性或预防性和其他技术人员已知的因素，将本文公开的抗微生物剂施用于受试者。抗微生物剂的施用可以是在预选的一段时间内基本上连续的，或可以是以一系列的隔开的剂量施用。考虑了局部或全身施用两者。

要施用于受试者的剂量可以是适合于减少或预防感染或适合于治疗至少一种与感染相关的症状的任何量。确定适合剂量的一些因素是对本领域技术人员已知的，并且可以用常规的实验解决。例如，可以使用标准化学和生物学测定，通过使用化学、药理学和毒理学领域已知的数学建模技术，进行物理化学、毒理学和药代动力学性质的确定。由这样的技术的结果以及通过使用适合的药代动力学和药效动力学模型，推测治疗效果和给药方案。其他因素将取决于个体患者的参数(包括年龄、身体状况、体型(size)、体重、要治疗的疾病、疾病的严重程度和任何同时的治疗)。剂量还将取决于选择的试剂和是否实现预防或治疗，以及试剂是否是化学修饰的。

施用于受试者的准确的量是主治医生的职责。然而，为了实现希望的效果，可以以单剂量或分开的剂量施用本文公开的抗微生物剂。例如，至少约0.01mg/kg至约500～750mg/kg体重、至少约0.01mg/kg至约300～500mg/kg体重、至少约0.1mg/kg至约100～300mg/kg体重或至少约1mg/kg至约50～100mg/kg体重的抗微生物剂，虽然其他的剂量可能提供有利的结果。

单位剂量中包括的本文公开的给定的抗微生物剂的绝对重量可以广泛地变化。例如，施用约0.01至约2g，或约0.1至约500mg的至少一种抗微生物剂。供选择地，单位剂量可以为约0.01g至约50g、约0.01g至约35g、约0.1g至约25g、约0.5g至约12g、约0.5g至约8g、约0.5g至约4g或约0.5g至约2g。

抗微生物剂的日剂量同样可以变化。这样的日剂量可以为例如约0.1g/日至约50g/日、约0.01g/日至约25g/日、约0.1g/日至约12g/日、约0.5g/日至约8g/日、约0.5g/日至约4g/日和约0.5g/日至约2g/日。

可以单独使用抗微生物剂或与第二药物联合使用抗微生物剂。第二药物可以是已知的抗微生物剂，比如但不限于β-内酰胺、大环内酯或其他抗生素，例如阿奇霉素、强力霉素、四环素和红霉素；抗真菌剂比如克霉唑、制霉菌素、氟康唑、酮康唑、两性霉素B、卡泊芬净或伏立康唑；有效抗原生动物的药剂，例如甲硝哒；唑或磺甲硝咪唑(timidazole)。第二种药物也可以是抗病毒剂，如阿巴卡维、阿昔洛韦、金刚烷胺、地达诺新、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、更昔洛韦、加德西、拉米夫定、奈韦拉平、奈非那韦、奥司他韦、利巴韦林、金刚烷乙胺、利托那韦、司他夫定、伐昔洛韦、阿糖腺苷、扎西他滨和齐多夫定。第二药物的有销量将遵循第二药物制造商的推荐、主治医生的判断，并且将由量和给药的方案和施用因素指导，如医师手册(PHYSICIAN'S DESK REFERENCE)所示(如本领域通常已知的)。

通过监测受试者的如上讨论的微生物感染的体征或症状，以及通过本领域已知的方法确定受试者中微生物的存在或量，评估治疗的方法的有效性。

III.试剂盒

本公开提供了含有用于治疗本文描述的疾病的物质的制品和试剂盒。制品可以包括如本文描述的组合物的、具有标签的容器。适合的容器包括，例如瓶、小瓶和试管。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。容器盛有具有本公开的抗微生物剂的组合物，所述抗微生物剂对抑制微生物的生长或治疗由微生物导致的疾病是有效的。容器上的标签可以表明组合物对治疗特定的疾病是有用的，以及还可以表明施用的说明。

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常所理解的相同的含义。所有专利、申请、公开的申请和其他公开通过引用全文并入。在本文的术语存在多种定义的情况下，除非另有说明，以该部分为准。

如本文使用的，“施用”以其最广泛的意义用于表示使受试者与本文公开的组合物接触。

如本文使用的，术语“抗菌活性”是指抗一种或多种微生物的杀微生物或抑制微生物活性或其组合。微生物活性是指对靶微生物杀伤或导致不可逆损伤的能力。抑制微生物活性是指抑制靶微生物的生长或繁殖能力而不必杀伤或不可逆损伤靶微生物的能力。

如本文使用的，术语“一致性”或“序列一致性”是指两个或更多个多肽序列之间，以及两个或更多个多核苷酸序列之间，也就是参比序列和待与参比序列比较的给定序列之间的关系。在最佳地比对序列以产生最高程度的序列相似性后，通过比较给定序列与参比序列来确定序列一致性，所述序列相似性如由这样的序列串之间的匹配确定的。在这样比对时，在逐个位置的基础上确定序列一致性。例如，如果在特定位置处，核苷酸或氨基酸残基是一致的，则序列在该特定位置处是“一致的”。这样的位置一致的总数除以参比序列中核苷酸或残基的总数得到序列一致性的百分比(％)。通过已知的方法可以容易地计算序列一致性，所述方法包括但不限于：计算分子生物学(Computational Molecular Biology),Lesk,A.N.等.,牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约(1988)；生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),Smith,D.W.编,学术出版社(Academic Press),纽约(1993)；序列数据的计算机分析(Computer Analysis ofSequence Data),Part I,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.编.,胡玛纳出版社(HumanaPress),新泽西(1994)；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology),von Heinge,G.,学术出版社(Academic Press)(1987)；序列分析引物(SequenceAnalysis Primer),Gribskov,M.和Devereux,J.,编,M.斯托克顿出版社(StocktonPress),纽约(1991)；以及Carillo等人,应用数学(Applied Math).,48:1073(1988)中描述的那些方法，其教导通过引用并入本文。

如本文使用的，术语“抑制”是指任何量的减少，包括但不限于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％。

本文使用的术语“核酸”是指脱氧核糖核酸以及核糖核酸的聚合物。术语包括线性分子以及共价闭合的环状分子。它包括单链分子以及双链分子。

如本文使用的，“受试者”是指具有中枢神经系统的活有机体。特别地，受试者包括但不限于人受试者或患者以及伴侣动物。示例性的伴侣动物可以包括家养哺乳动物(例如狗、猫、马)、具有显著的商业价值的哺乳动物(例如奶牛、肉牛、运动动物)、具有显著的科学价值的的哺乳动物(例如，濒危物种的圈养或野生样本)或具有其他价值的哺乳动物。适合的受试者还包括：小鼠、大鼠、狗、猫、有蹄类动物(如牛、猪、绵羊、马和山羊)、兔形动物(如家兔和野兔)、其他啮齿类动物以及灵长类动物(猴和猿)。在某些方面，受试者可能被诊断为微生物感染，可能处在微生物感染的风险中，或可能正在经历微生物感染。受试者可以是任何年龄的受试者，包括新生、青少年、成年、中年或老年受试者。

本文使用的短语“治疗有效量”是指与未处理的对照相比，足以增加治愈或改善感染的某些有利程度的量，优选足以增加至少约1％至100％，更优选足以增加至少约5％至95％，以及更优选足以增加至少8％或更高的量。“有效量”是意欲指使药剂或化合物的量合适的药学有效量，当施用于受试者时，将实现治愈感染部位、抑制微生物的生长或对受体环境有利的目标。

术语“变体”涉及具有相似序列和以相同的方式起作用的核苷酸或氨基酸序列。

氨基酸名称可以包括如本公开所属的领域的技术人员所通常理解的全称、三字母或单字母名称。

由于在以上组合物和方法中可以进行多种变化而不背离本公开的范围，因此意图是，以上描述和以下给出的实施例中包含的所有情况应该被理解为描述性的而非限定性的意义。

实施例

实施例1：抗微生物剂的抗微生物活性

公开的抗微生物剂是具有14个氨基酸和广谱抗微生物活性的SEQ.ID.NO.:3的衍生物。合成和分析本公开的抗微生物剂以评价抗微生物活性。首先，评价SEQ.ID.NO.:3的抗微生物剂对常见乳腺炎病原体的临床分离物的抑制(表1)。

表1.以最小抑菌浓度(MIC)表示的SEQ.ID.NO.:3的抗微生物剂的抗微生物活性

临床病原体分离物	MIC(μΜ)	细菌菌株
			335 B-S	12.5	停乳链球菌
335 B-15	25.0	肺炎克雷伯氏菌
			404 C-18	12.5	棒状杆菌属物种
416 B-10	25.0	金黄色葡萄球菌
			331 C-10	25.0	金黄色葡萄球菌
422 C-10	25.0	金黄色葡萄球菌

评价另外的抗微生物剂的抗微生物活性，包括SEQ ID NO:3的23种计算衍生的类似物。将这些类似物分组为两个功能系列，包括合成的用于改善螺旋度的类似物(表2；A-P)和合成的用于提高活性的类似物(表2；IND、Q-T和W-X)。使用如Sang,等人.2007Dev.Comp.Immunol.(通过引用并入本文)中描述的标准技术评价表2提供的合成类似物的抗微生物活性。基于采集的数据，将3种合成的抗微生物剂(表2，阴影行)鉴定为与SEQID NO:3或SEQ ID NO:19相比具有优越的抗微生物活性的抗微生物剂(表2)。

表2.以最小抑菌浓度(MIC)表示的抗金黄色葡萄球菌的类似物的抗微生物活性

实施例2.抗微生物剂的结构/功能分析

评价了本文描述的抗微生物剂的结构/功能机制。为了对不同位置处的不同氨基酸的作用进行更好地理解，以及开发最大生物活性和最稳定的合成肽，使用定量构效关系(Quantitative Structure-Activity Relationship,QSAR)建模以引导指导多药耐药性金黄色葡萄球菌的抗微生物制剂的优化。

在细胞肽的抗微生物作用的四种主要机制中，两种(桶板(barrel-stave)和环状孔(toroidal pore))模型需要稳定的两亲螺旋肽，第三种(平面内扩散(in-planediffusion))需要可通过二级(螺旋或折叠)或三级(二硫键或盐桥)结构元件实现的显著的分子内稳定，所述二级或三级结构元件可以保证肽两亲性的存留。因为已知肽家族具有抗微生物活性和具有表明螺旋形成的结构方面(即少量或无脯氨酸；在约4个单体的周期中具有极性-非极性交替的序列)，所以合理的是假设，肽的生物活性构象是螺旋的，以及作用机制是以上列出的三种机制之一。由该假设，将本文提供的抗微生物剂定制为具有高度螺旋倾向(如经Agadir软件预测的)，以及在螺旋构象中显示显著的两亲性。图5中描绘了本文描述的最有效的抗微生物剂(SEQ ID NO:17)之一的这样的属性。

桶板模型的经典标志是疏水、阴离子、疏水和阳离子的膜片(patches)的周期性交替，使肽能够在细胞膜中静电自组装为稳定孔，所述稳定孔排斥周围脂质并且破坏膜完整性。本文描述的抗微生物剂是严格地阳离子的，因此排除了桶板模型，这是因为与其他肽相比，给定的肽通常更优先与脂质介质结合。然而，它们仍然可以通过图7中描绘的其余两种可能的模型中的任一个显著干扰膜。

肽制剂中明显的高度螺旋稳定性和两亲性强有力地说明，形成了诱导细胞离子泄露的跨微生物细胞膜的环状孔(图7A)或形成了二聚体，所述二聚体的选择性脂质相互作用破坏脂质膜的几何规则性和稳定性，其中这些相互作用包括肽阳离子与脂质阴离子的相互作用，以及脂质脂肪族/脂肪族相互作用的肽芳基破坏。

基于本文描述的实施例，主要基于改进螺旋倾向和两亲性谱的抗微生物有效的肽说明了观察到的活性是由以上机制之一引起的。肽的高度系统化的性质(严格疏水的，除了每第四个或第五个位置的精氨酸以外)支持环状孔的结构上更规律的模型(其可以功能性地假设起电压门控通道的作用以按照KvAP肽平衡细胞pH)。然而，抗微生物剂肽的短长度(螺旋构象中的端至端为～)意味着它们可能不够长以跨膜，这支持了平面内扩散模型。

解决了解释观察到的抗微生物活性趋势的某些非常基本的定性规则。

1)考虑到在序列第4位的Trp，肽活性与第3位的亲脂残基的空间紧密度成正比(即Pro>Ala>Val>Leu)，这说明朝肽的N末端空间紧密度是最佳的，

2)如果第4位具有除了大的亲脂残基的任何残基，在第3位由脯氨酸引起的骨架卷曲是不可忍受的，并且脯氨酸在任何所有其他位置是完全不可忍受的，

3)考虑到在第4位的Arg，肽活性根据Ala-3>Val-3>Leu-3>Pro-3变化，这表明空间紧密度是期望的，但是在该情况下由脯氨酸引起的骨架卷曲是不可接受的，以及

4)在第12和13位交换残基对活性没有主要影响，但是这些残基中仅一个的显著改变会破坏活性，表明该区域的亲脂/带正电平衡对活性是关键的。

为了区分上一部分中描述的作用范例的两种机制，一个策略是选择性地用芳香族残基(即Phe、Trp)替换脂肪族残基(Ile、Leu)，和选择性地用脂肪族残基(Ile、Leu)替换芳香族残基(即Phe、Trp)。这些替换通常应保存两种模型所需的两亲性，某些替换可以提高螺旋稳定性(而且支持两种模型)，然而它们的作用可以如下变化：

a)平面的芳基比Ile和Leu侧链的分支烷基更紧密，并且能与不可缺少的精氨酸中的平面的鸟嘌呤基团更好地堆叠，这可能有利于形成与膜良好地相互作用的有序的孔，同时

b)烷基基团对主要的烷基脂质介质天生更具有吸引力，但是它们的分支性质倾向于产生根据平面内扩散情况的更大结构无序性。

已经阐述了某些重要的结构/功能趋势，进行对保守替换(即稍微而不多地改变残基的大小和静电特征的替换)的Agadir计算以进一步优化WB合成肽的抗微生物活性。因此，合成和评价以下列出的肽(SEQ ID NO:26-33)以利用它们的螺旋稳定性(表3)。

表3.针对螺旋稳定性优化的抗微生物剂

肽	序列
		WB14-F1(SEQ ID NO：26)	GLARILLRLLFFRG
WB14-N1(SEQ ID NO：27)	GLARILLRLLFRFG
		WB14-O1(SEQ ID NO：28)	GLVRILLRLLFRFG
WB14-O2(SEQ ID NO：29)	GLVRILLRLLLRFG
		WB14-O3(SEQ ID NO：30)	SLVRILLRLLLRFG
WB14-O4(SEQ ID NO：31)	GLTRILLRLLLRFG
		WB14-O5(SEQ ID NO：32)	GLVRILLRLLLRYG
WB14-O6(SEQ ID NO：33)	GLVRILLRLLLRFS

实施例3.抗微生物剂类似物的抗微生物活性

评价了实施例2(表3)中针对螺旋稳定性优化的另外的抗微生物剂类似物的抗微生物活性。使用如Sang，等人.2007 Dev.Comp.Immunol.(通过引用并入本文)中描述的标准技术评价了表3中提供的合成类似物的抗微生物活性。表4中提供了药剂的抗微生物活性。

表4.螺旋稳定性优化的药剂抗金黄色葡萄球菌的抗微生物活性(最小抑菌浓度：以μg/ml计的MIC)

结果表明具有SEQ ID NO：8的抗微生物剂是最有效的抗微生物合成肽。进一步评价SEQ ID NO.8对抗引起乳腺炎的细菌的临床分离株的抗微生物活性(表5)。

表5.WB-14F肽(SEQ ID NO.：8)对抗引起乳腺炎的细菌的临床分离株的体外抗微生物活性

临床分离株	细菌菌株	多药耐药性	MIC(μg/ml)
				335-B05	停乳链球菌	++	8.0
335-B15	肺炎克雷伯氏菌	++++	16.0
				404-C18	棒状杆菌属物种	++	16.0
416-B10	金黄色葡萄球菌	+++	2.0
				212-B05	大肠埃希氏菌	++	4.0
BAA 44＊(ATCC)	金黄色葡萄球菌	+++++	4.0

在以下条件下合成WB-14F：＞95％纯度；TFA盐；所有氨基酸都是L-氨基酸；无末端修饰；^*ATCC分类号BAA44。

实施例4.抗微生物活性的体内分析

使用细菌感染的体内模型评价SEQ ID NO：8的抗微生物剂以评估药剂的抗微生物活性。使用以下方法和材料。

细菌菌株。金黄色葡萄球菌分离自具有临床乳腺炎的奶牛的乳汁(牲畜疾病诊断中心(Livestock Disease Diagnostic Center)，肯塔基大学(University of Kentucky).列克星敦，KY)。到达时，在血琼脂平板(TSA+来自Remel，堪萨斯城.MO的5％绵羊血)上分离细菌，并且在37℃下培养24小时。将从琼脂平板上挑取的新鲜单个细菌菌落接种在10ml穆勒辛顿II肉汤(Muller Hinton II broth，MHB)中，并且在37℃下培养4-6小时，直到625nm分光光度计滤波器下获得0.8的吸光度。在该吸光度下，已经证明MHB 50μl体积中含有1×10⁵个菌落形成单位(CFU)。

水牛宿主防御肽的合成。化学合成了WB-14F肽(SEQ ID NO：8；GLARILLRWLFFRG)(肽2.0；尚蒂伊，VA)。合成后，在RP-HPLC上的单峰处洗脱WB-14F分子，并且通过质谱法证实。肽的最终纯度＞97％，分子量为1718.4。将肽冻干和在-80℃储存至使用。

乳腺炎小鼠模型。使用处于哺乳期7-10天的56只雌性Balb/c小鼠(BW～50g)。4组n＝14的小鼠用于以下描述的每个实验。对于乳房内接种，根据Chandler描述的方案(J.Med.Microbiol.V3；273-282：1970)并进行小的改变。简单地，在接种前4小时使哺乳期母鼠与幼鼠分离。然后，在接种前1小时允许幼鼠哺乳以排空乳腺。再次使母鼠与幼鼠分离，然后不再使幼鼠与母鼠团聚。然后，以100mg/kg IM的剂量使用替来他明(Tiletamine)/唑拉西泮(Zolazepam)(100,Virbac)的组合麻醉小鼠，用70％乙醇对乳腺消毒。使用立体显微镜，将50μl之前制备的金黄色葡萄球菌悬液(含有1×10⁵CFU)经乳腺内接种。使用33G针头(Hamilton,肯特,英国)，缓慢注射至左和右腹部乳头(L4和R4)。在接种后，使小鼠从麻醉中恢复。

与对照组和抗生素处理组对比的WB-14F的治疗效果。使用立体观察技术如下经乳腺内处理小鼠(n＝14/组)：第1组：WB-14F(32μg稀释于50μl无菌PBS每个腺体中)；第2组：对照，无菌磷酸盐缓冲盐水(50μl每个腺体)；第3组：头孢噻夫(400μg稀释于50μl矿物油每个腺体中)；第4组：感染但未处理。所有组(除了第4组以外)在感染后24小时，每24小时接受处理，持续连续3天(总共3次处理)。

乳腺中菌落形成单位(CFU)的确定。最后一次处理后24小时按照AVMA处死指南将所有小鼠处死(使用CO₂)。使用软组织切除将感染的乳腺(L4和R4)单独移出，并且使用Polytron组织匀浆器(Kinematica,瑞士)在于Falcon管中的1ml无菌PBS中匀浆化。将匀浆液的稀释液(10^-1、10^-2、10^-3)定量地铺板以确定每个腺体中的CFU的数目。以来自每只动物的两个腺体(L4和R4)的结果的平均数报告结果。

统计分析。使用GraphPad Prism Ver.5.0a for Mac,GraphPad软件,圣地亚哥，加利福尼亚，美国，进行克鲁斯卡-沃利斯与邓恩事后检验(Kruskal-Wallis with Dunn'spost-test)。组间发现了统计学显著性差异(P<0.001)(图5)，事后检验显示WB-14F与三个对照组(PBS、ATBX和N1901.27on-Tx)在5％水平显著性的差异。

实施例5.连接的二聚体肽抗微生物剂的结构/功能分析

共价接头肽二聚体式的初步设计和筛选的关键组件需要使用分子动态模拟。

未连接(非共价的)的肽二聚体的分子动态模拟中观察到的二聚体内相互作用查不多证实了体内研究中观察到的序列特异性活性依赖性。随后的分子动态模拟产生了有力证据，即非共价二聚体中明显的相互作用(图3中图示的)在专门地以式子表示的共价连接二聚体中被保留或增强(如图4所示)。

很好地证实实验性体内活性的非共价和共价连接的二聚体系统的关键结构特征包括1)单体螺旋结构的保留，2)二聚体内亲脂和静电耦合的保留，加上以下两个分子间相互作用的有力证据：通过肽/膜非极性耦合，肽芳基氨基酸与膜脂质相互作用，以便将芳基插入个体的脂质分子之间，以及4)肽阳离子残基和阴离子脂质头基之间的肽/膜静电耦合。对于这四种相互作用类别中的每种，基于模拟时间的相对百分比定义特定的定量指标，其中肽的特定原子位于分子内或分子间相互作用配偶体的特定原子的设定距离内。具体地，不大于4.0埃的非极性原子间距离的始终保持用于鉴定关键的非极性特征的保持，不大于2.5埃的极性原子间距离的始终保持用于鉴定关键的极性特征的保持。

通过以下特定的共价接头式由分子动态模拟发现以上描述的四个结构特征被尤其好地保留或增强：DNNNNNN(SEQ ID NO:34)；DGGGGGG(SEQ ID NO:38)；DNNNNN(SEQ IDNO:35)；以及DGGGGG(SEQ ID NO:37)，其中在以上情况中的每一种下，接头序列的N末端通过正常肽键与第一肽单体的C末端共价偶联，接头序列的C末端通过正常肽键与第二肽单体的N末端共价偶联。

本文说明性地公开的本发明可合适地在缺少任何本文未特别公开的元素的情况下被实践。然而，对本领域技术人员明显的是，对方法进行的许多改变、变化、修改、其他用途和应用是可能的，而且认为仅由权利要求限定的本公开涵盖了不背离本公开的精神的改变、变体、修改、其他用途和应用。

Claims (20)

1.一种包含抗菌肽的抗菌组合物，其中，所述肽包括具有如下式1的序列的合成氨基酸序列：

Gly-X₁-X₂-X₃-X₁-X₁-X₁-Arg-X₄-X₁-X₅-X₆-X₆-Gly

其中，

X₁选自Leu或Ile的组，

X₂选自Ala、Val、Leu或Ile的组，

X₃选自Arg或Trp的组，

X₄选自Trp、Ile或Leu的组，

X₅选自Phe或Trp的组，以及

X₆选自Phe、Trp或Arg的组。

2.一种包含抗菌肽的抗菌组合物，其中，所述肽包括具有如下式1的序列的合成氨基酸序列：

Gly-X₁-X₂-X₃-X₁-X₁-X₁-Arg-X₄-X₁-X₅-Arg-X₆-Gly

其中，

X₁选自Leu或Ile的组，

X₂选自Ala、Val、Leu、Ile或Pro的组，

X₃选自Arg或Trp的组，

X₄选自Trp、Ile或Leu的组，

X₅选自Phe或Trp的组，以及

X₆选自Phe、Trp或Arg的组。

3.一种包含抗菌肽的抗菌组合物，其中，所述肽包括：

a.第一合成氨基酸序列，具有如下式1的序列：

Gly-X₁-X₂-X₃-X₁-X₁-X₁-Arg-X₄-X₁-X₅-X₆-X₆-Gly

其中，

X₁选自Leu或Ile的组，

X₂选自Ala、Val、Leu或Ile的组，

X₃选自Arg或Trp的组，

X₄选自Trp、Ile或Leu的组，

X₅选自Phe或Trp的组，和

X₆选自Phe、Trp或Arg的组；

b.第二合成氨基酸序列，具有如下式1的序列：

Gly-X₁-X₂-X₃-X₁-X₁-X₁-Arg-X₄-X₁-X₅-X₆-X₆-Gly

其中，

X₁选自Leu或Ile的组，

X₂选自Ala、Val、Leu、Ile或Pro的组，

X₃选自Arg或Trp的组，

X₄选自Trp、Ile或Leu的组，

X₅选自Phe或Trp的组，和

X₆选自Phe、Trp或Arg的组；以及

c.接头序列，其中所述接头序列可操作地连接所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列。

4.一种包含抗菌肽的抗菌组合物，其中，所述肽包括：

a.第一合成氨基酸序列，具有如下式1的序列：

Gly-X₁-X₂-X₃-X₁-X₁-X₁-Arg-X₄-X₁-X₅-Arg-X₆-Gly

其中，

X₁选自Leu或Ile的组，

X₂选自Ala、Val、Leu、Ile或Pro的组，

X₃选自Arg或Trp的组，

X₄选自Trp、Ile或Leu的组，

X₅选自Phe或Trp的组，和

X₆选自Phe或Trp的组；

b.第二合成氨基酸序列，具有式1的序列：

Gly-X₁-X₂-X₃-X₁-X₁-X₁-Arg-X₄-X₁-X₅-Arg-X₆-Gly

其中，

X₁选自Leu或Ile的组，

X₂选自Ala、Val、Leu、Ile或Pro的组，

X₃选自Arg或Trp的组，

X₄选自Trp、Ile或Leu的组，

X₅选自Phe或Trp的组，和

X₆选自Phe或Trp的组；以及

c.接头序列，其中所述接头序列可操作地连接所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列。

5.权利要求1-4中任一项所述的抗菌组合物，其中，所述组合物抑制微生物的生长。

6.权利要求5所述的抗菌组合物，其中，所述微生物选自由细菌、真菌、酵母菌、霉菌及其组合组成的组。

7.权利要求6所述的抗菌组合物，其中，所述细菌选自由假单胞菌属、埃希氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、分支杆菌属、嗜血杆菌属及其组合组成的组。

8.权利要求1-4中任一项所述的抗菌组合物，进一步包含药物载体。

9.权利要求1-4中任一项所述的抗菌组合物，其中，所述合成氨基酸序列与SEQ ID NO:8具有至少85％的序列一致性。

10.一种抑制微生物生长的方法，包括使所述微生物与权利要求1-4中任一项所述的组合物在抑制微生物生长有效的条件下接触一段时间。

11.权利要求10所述的方法，其中，所述微生物选自由细菌、真菌、酵母菌、霉菌及其组合组成的组。

12.权利要求11所述的方法，其中，所述细菌选自由假单胞菌属、埃希氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、分支杆菌属、嗜血杆菌属及其组合组成的组。

13.权利要求11所述的方法，其中，所述微生物选自由无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、化脓放线菌(Actinomycespyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)及其组合组成的组。

14.权利要求10所述的方法，其中，所述微生物的生长被抑制至少10％。

15.一种治疗微生物感染的方法，所述方法包括：

a.鉴定具有微生物感染的受试者；以及，

b.施用治疗有效量的权利要求1-4中任一项所述的抗菌组合物。

16.权利要求15所述的方法，其中所述抗菌组合物进一步包含药物载体。

17.权利要求15所述的方法，进一步包括使引起乳腺炎感染的微生物的生长抑制至少10％。

18.一种治疗乳腺炎的方法，所述方法包括：

a.鉴定具有乳腺炎的受试者；以及，

b.施用治疗有效量的权利要求1-4中任一项所述的抗菌组合物。

19.权利要求18所述的方法，其中，将所述抗菌组合物施用于所述受试者的乳腺组织。

20.权利要求18所述的方法，进一步包括使引起乳腺炎感染的微生物的生长抑制至少10％。