CN108061805A - 一种人的鸟苷激酶b突变蛋白及其应用 - Google Patents

一种人的鸟苷激酶b突变蛋白及其应用 Download PDF

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张耀洲
吴玉乾
冯建华
李冬梅
张树军
胖铁良
陈玉皎
王文雅
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Abstract

本发明涉及一种人的鸟苷激酶b突变蛋白及其应用，通过将大量癌症患者作为研究病例，对病例进行基因检测并进行分析，确定出人的鸟苷激酶b的突变蛋白，根据该人的鸟苷激酶b突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为癌症的基因诊断提供的指引作用，实现癌症的早诊断、早发现和相关治疗。

Description

一种人的鸟苷激酶b突变蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种人的鸟苷激酶b突变蛋白及其应用。
背景技术
鸟苷激酶b是催化磷酸基团从ATP转移到鸟苷一磷酸(GMP)，以形成二磷酸鸟苷(GDP)的酶。人的鸟苷激酶b发生突变对人体代谢机制会产生影响，从而影响人类健康，研究发现，在对某些癌症(该癌症包括肺癌、肝癌、胰腺癌和白血病)患者的外周血进行基因测序的过程中，均发现患者的鸟苷激酶b发生了突变，因此，对人的鸟苷激酶b突变的检测对判断人体是否患有癌症具有一定的指引作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种人的鸟苷激酶b突变蛋白及其应用。
本发明技术方案包括：
第一方面，提供一种人的鸟苷激酶b突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
第二方面，提供一种人的鸟苷激酶b突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
第三方面，提供一种基因芯片，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据所述人的鸟苷激酶B突变蛋白的核苷酸序列，与人的鸟苷激酶B正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。
优选地，所述核苷酸探针为SEQ ID NO:3所示的碱基序列。
第四方面，提供一种特异性识别人的鸟苷激酶b突变蛋白的单克隆抗体，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
第五方面，提供一种用于检测人的鸟苷激酶b突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括：包被有上述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的鸟苷激酶b蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
优选地，所述酶标二抗为稀释的HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。
第六方面，提供一种基于上述任一所述ELISA试剂盒检测人的鸟苷激酶b突变蛋白的抗体的方法，包括：
a、使用所述包被缓冲液对上述单克隆抗体进行稀释，并将稀释后的所述单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育；
b、使用所述样品稀释液将检测对象的鸟苷激酶b蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的鸟苷激酶b蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育；
e、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上450nm测定OD值。
优选地，进一步包括：空白对照实验。
本发明提供了一种人的鸟苷激酶b突变蛋白及其应用，将大量癌症患者作为研究病例，对病例进行基因检测并进行分析，确定出人的鸟苷激酶b的突变蛋白，根据该人的鸟苷激酶b突变蛋白制备基因芯片、单克隆抗体和ELISA试剂盒，为癌症的基因诊断提供的指引作用，实现癌症的早诊断、早发现和相关治疗。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明实施例一提供的一种比对结果示意图；
图2是本发明实施例一提供的一种基因芯片布局图；
图3是本发明实施例二提供的一种显色结果示意图；
图4是本发明实施例二提供的另一种显色结果示意图；
图5是本发明实施例五提供的为蛋白含量的标准曲线；
图6是本发明实施例五提供的Western blot检测结果示意图；
图7是本发明实施例六提供的为蛋白含量的标准曲线；
图8是本发明实施例六提供的Western blot检测结果示意图；
图9是本发明实施例七提供的为蛋白含量的标准曲线；
图10是本发明实施例七提供的Western blot检测结果示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一、基因芯片的制备
首先，可以根据申请号为“201710429915.8”、专利名称为“一种突变蛋白的检测方法及装置”的中国发明专利中描述的检测方法，确定出人的鸟苷激酶b突变蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；相应地，根据该编码基因确定出人的鸟苷激酶b突变蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
其次，根据人的鸟苷激酶b突变蛋白及其编码基因，按照如下方式实现基因芯片的制备。
1、核苷酸探针的设计
(1)核苷酸探针的设计：核苷酸探针根据人的鸟苷激酶b突变蛋白的核苷酸序列，与人的鸟苷激酶b正常蛋白的核苷酸序列的比对结果来确定，并根据如下探针的设计原则，设计出针对人的鸟苷激酶b突变蛋白的特异性的核苷酸探针。
其中，核苷酸探针设计的原则如下：
①核苷酸探针Tm值应接近整个基因组的平均Tm值，上下波动5℃；
②核苷酸探针分子内重复的单一碱基连续不超过4个；
③G+C含量为40％-60％，减少非特异性杂交保证杂交的特异性；
④核苷酸探针分子内部稳定二级结构配对碱基长度少于4bp，这样可以保证不会因核苷酸探针内部稳定的二级结构而影响杂交效率；
⑤经同源比较与其他序列的相似性小于40％；
⑥经对比与非探针备选序列的同源片段连续不超过20个碱基。
其中，人的鸟苷激酶b突变蛋白对应的氨基酸序列与人的鸟苷激酶b正常蛋白对应的氨基酸序列的比对结果请参考图1，其中，图1中的Query序列是人的鸟苷激酶b突变蛋白对应的氨基酸序列，Sbjct序列是人的鸟苷激酶b正常蛋白对应的氨基酸序列，Query序列与Sbjct序列之间的序列为比对结果，根据图1可知，人的鸟苷激酶b突变蛋白相对于人的鸟苷激酶b正常蛋白，在两个位置处发生了缺失，以及在一些位置处发生了突变。根据SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列，以及图1的比对结果，为了能够特异性识别待检测对象的鸟苷激酶b是否发生了突变，那么在选取核苷酸探针时，可以按照如下几种方式中的任一种方式设计核苷酸探针：
(1)在缺失位置之前选择若干个核苷酸序列，与在缺失位置之后选择若干个核苷酸序列，生成核苷酸探针；
(2)将包含有突变位置核苷酸的一条核苷酸序列作为核苷酸探针。
在本实施例中，根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列以及根据上述核苷酸探针设计原则，按照上述方式(1)设计一种优选地核苷酸探针如SEQ ID NO:3所示，该核苷酸探针为：accgatctgcg gcagcgcaac actgaaaccg aggaga
(2)核苷酸探针的合成：通过核苷酸序列合成上述设计好的核苷酸探针。
2、检测人的鸟苷激酶b是否发生突变的基因芯片的制备
为了保证检测对象样品的质量，还需在基因芯片上设计空白对照、阳性对照和阴性对照。其中，该基因芯片的布局至少可以为如图2所示的一种布局。在图2中，□为空白对照，○为阴性对照，为阳性对照，为实验组。
其中，实验组的位置即为核苷酸探针的点样位置。
对于空白对照、阴性对照所需点样的阴性内参质控探针、以及阳性对照所需点样的阳性内参质控探针设计如下：
空白对照：是不含任何基因片段的空白点样液作为芯片制备过程中的污染监控指标。
阴性内参质控探针：是一段与检测基因没有同源性的其他基因片段，作为杂交过程中非特异性杂交的监控指标，阴性内参质控探针包括的核苷酸位数可以与核苷酸探针的位数相同，也可以不同。本发明实施例中，基因芯片所需的阴性内参探针序列可以为：tgatgctgat aattgcatag。
阳性内参质控探针：是一段与检测基因有同源性的其他基因片段，在人的鸟苷激酶b突变蛋白中，选择与核苷酸探针对应的序列不同，阳性内参质控探针包括的核苷酸位数与核苷酸探针的位数可以相同，也可以不同。优选地，选取核苷酸位数与核苷酸探针的位数相同的阳性内参质控探针。本发明实施例中，基因芯片所需的阳性内参探针序列可以为：ggtgctgagc gggccttcgg gagctgggaa gagcacc。
需要说明的是，在基因芯片的点样过程中，按照基因芯片的布局点入阴性内参探针和阳性内参探针溶液；空白对照所用的试剂为1倍的点样缓冲液(10％海藻糖溶液)。
实施例二、基因芯片的应用
1、样品处理
(1)采集检测对象的血液1-3mL。
(2)取DEPC处理的1.5mLEP管，为被检测样品处理管，在被检测样品处理管中加入检测对象的血液300μL，再加入Trizol 700μL，充分混匀，室温放置10Min。
(3)加入200μL的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，室温放置3-5min，12000r/min，4℃离心15min，小心吸去所有上清。
(4)加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，12000r/min，4℃离心15min，小心吸去所有上清。
(5)用1mL75％乙醇洗一遍，7500r/min，4℃离心15min，小心吸去所有上清，在超净台中干燥15min，加入10μL DEPC处理水溶解。
(6)所得产物为RNA，如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGEN纯化总RNA。
2、cDNA第一链和第二链一步法合成
(1)取2μg RNA于1.5mL离心管中配置如下反应溶液：
总RNA 2μg最多6.5μL
T7Promotor primer 5μL
RNase-free Water XμL
总体积 11.5μL
(2)65℃保温10分钟冰浴5分钟，提前把5×First Strand Bμffer在65℃预热5分钟。
(3)配置如下cDNA合成体系：
5×First Strand Buffer 4μL
0.1M DTT 2μL
10mM dNTP mix 1μL
MMLV RT 1μL
RNase OUT 0.5μL
总体积 8.5μL
(4)将上述8.5μL mix加入变性后冰浴的RNA中。
(5)用枪头混匀之后离心。
(6)40℃反应2h。
3、aaUTP标记cRNA合成
NTP的配置：
100mM ATP 250μL
100mM GTP 250μL
100mM CTP 250μL
100mM UTP 187.5μL
RNase free H2O 62.5μL
总体积 1000μL
分装成10管备用，注：50％PEG使用之前40℃保温1min。同时按如下操作配置Transcription mix；
(1)配置Transcription mix
(2)加入60μl Transcription mix并混匀
(3)PCR仪中热盖60℃，40℃反应2h。
4、cRNA纯化
QIAGEN RNeasy Mini kit纯化cRNA，具体方法可参见QIAGEN公司随试剂盒提供的操作手册。
(1)加入20μLRNase free水，加入350μL Buffer RLT并充分混匀。
(2)加入250μL无水乙醇，Tip头充分混匀。
(3)将共计700μL含总RNA的溶液转入套在2mL离心管内的RNeasy柱子内≥8000g离心15-30sec，弃去滤过液。
(4)吸取500μL Buffer RPE到RNeasy mini柱子内≥8000g离心洗涤15—30sec弃去滤过液再用500μL Buffer RPE在≥8000g离心洗涤2min弃去滤过液和2mL的套管将RNeasy mini柱子转入一新的1.5mL Eppendorf管中。
(5)吸取30μL RNase free的水静置1min,≥8000g离心洗脱1min。
(6)重复步骤(5)一次。
5、cRNA浓度测定
用分光光度计分析RNA浓度。需要在260和280nm测定吸光度来确定样品的浓度和纯度A260/A280应接近2.0为较纯的RNA(比值在1.9-2.1也可)。
6、cRNA样品荧光标记；
(1)取上述cRNA 4μg并浓缩至6.6μL。
(2)加10μL DMSO混匀。
(3)加3.4μL的0.3M碳酸氢钠(NaHCO3)pH9.0并混匀。
(4)将上述20μL cRNA混合物加入到荧光染料Cy3中并混匀。25℃保温1h。
(5)加9μL的4M Hydroxylamine混匀后25℃保温15min。
7、荧光标记cRNA样品纯化
具体步骤同本实施例的步骤4中cRNA纯化的过程，本步骤不在赘述。
8、cRNA样品片段化和芯片杂交4x44K microarrays
(1)按下表配制片段化混合液然后在60℃温浴30min进行片段化。
Cy3cRNA绿色荧光 875ng
10XBlocking Agent 11μL
25X Fragmentation Buffer 2.2μL
Nuclease-free water XμL
总体积 55μL
(2)加入55μL 2X GEx Hybridization Buffer。
(3)取100μL杂交液滴加到芯片皿上，同时按芯片布局如图2所示分别滴加在空白、阴性、阳性、实验组位置上。盖上芯片并密封于杂交盒中，60℃滚动杂交16h。
9、芯片洗涤
洗液1(1升)配置：
DEPC-H2O 700m L
20*SSPE 300m L
20％N-Lauroylsarcosine 0.25m L
洗液2(1升)配置：
DEPC-H2O 997m L
20*SSPE 3.0m L
20％N-Lauroylsarcosine 0.25m L
洗液3：Stabilization and Drying Solution
(1)取出芯片于洗液1中洗涤1分钟；
(2)再将芯片放入洗液2中洗涤1分钟(37℃)；
(3)最后将芯片于洗液3中洗涤30秒。
10、芯片扫描
将芯片在扫描仪中进行扫描，根据扫描结果确定检测对象的鸟苷激酶b蛋白是否发生了突变。请参考图3和图4，图3所示的结果中，阴性对照无绿色荧光，阳性对照为绿色荧光，表明采集检测对象的样品质量是没有问题的，而实验组为绿色荧光，那么表明检测对象的鸟苷激酶b蛋白发生了突变。图4所示的结果中，阴性对照为无色荧光，阳性对照为绿色荧光，表明采集检测对象的样品质量是没有问题的，而实验组无绿色荧光，那么表明检测对象的鸟苷激酶b蛋白未发生突变。
实施例三、特异性识别人的鸟苷激酶b突变蛋白的单克隆抗体的制备
1、根据人的鸟苷激酶b突变蛋白的碱基序列(如SEQ ID NO:2所示)设计上游引物如SEQ ID NO:4所示，以及，下游引物如SEQ ID NO:5所示：
上游引物(P)：atgtcgggcc ccaggcctgt
下游引物(F)：ctctgcgtag gcctggtc
2、检测对象的DNA为模板进行PCR扩增
10×Buffer 5uL
dNTP 2uL
Ex Taq 1uL
ddH2O 5uL
模板DNA 1uL
引物(P) 3uL
引物(F) 3uL
总体系 20uL
以检测对象的DNA为模板进行PCR扩增，获得人的鸟苷激酶b突变蛋白基因完整片段，并连接pMD19-T Vector(Takara公司)，进行测序。然后由专门的生物公司制备抗体，是一种人源化或嵌合型抗体。将制备的抗体采用ELISA法测定含量。
实施例四、用于检测人的鸟苷激酶b突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒
本实施例中，ELISA试剂盒的组成为：包被有实施例三所述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的鸟苷激酶b蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
其中，上述各个组成的参数至少可以为如下一种参数：
ELISA酶标板可以为96孔的ELISA酶标；
酶标二抗可以是稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗人IgG；其中，稀释倍数可以是8000倍。
包被缓冲液可以是1×PBS，pH:7.4；
ELISA酶标板洗涤液可以是含0.05％Tween-20的1×PBS溶液；
显色液可以是3,3′,5,5′-四甲基联苯胺；
终止液可以是2mol/L的硫酸溶液。
实施例五
在本发明实施例中，将白血病患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该白血病患者的鸟苷激酶b蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：
a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如稀释成2.0ug/ml，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h；
b、使用样品稀释液将白血病患者的鸟苷激酶b蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的鸟苷激酶b蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育1-2h；
e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上450nm测定OD值。
h、制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；根据ELISA Calc软件绘制出标准曲线，根据该ELISA Calc软件可以得出该R2＝0.99826，因此，本次测定有效。将检测得到的OD450值带入标准曲线即可求得白血病患者的鸟苷激酶b蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测白血病患者血清样品中鸟苷激酶b蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图5，为OD值的标准曲线。其中，X轴为OD值，Y轴为对应的浓度。
i、Western blot鉴定
1、制胶
(1)清洗玻璃板并擦干；
(2)参考分子克隆方法配制SDS-PAGE胶：
A.下层分离胶配制体系(Total Volum：15mL)
ddH2O 5.9mL
30％丙烯酰胺混合液 5.9mL
1.5mol/L Tris(PH 8.8) 3.8mL
10％SDS 0.15mL
10％过硫酸铵 0.15mL
TEMED 0.006mL
B.上层积层胶浓缩配制体系(Total Volum：8mL)
ddH2O 5.5mL
30％丙烯酰胺混合液 1.3mL
1.0mol/L Tris(PH 6.8) 1.0mL
10％SDS 0.08mL
10％过硫酸铵 0.08ml
TEMED 0.008mL
(3)在每个胶板中加入相应体积的下层分离胶，再加入1mL的无菌ddH2O，压平分离胶，待分离胶凝固后，用滤纸吸干制胶板中剩余的水分，而后加入上层浓缩胶，插入梳子后等待上层浓缩胶凝固。
2、蛋白上样电泳：
(1)拔下梳子，做好孔道标记，加入5×SDS电泳缓冲液，随后给蛋白样品中加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，沸水浴加热3-5min，上样；
(2)先用80V电压进行电泳，待条带跑过浓缩胶之后，换用100V电压跑大约100min。
3、转膜及孵育：
(1)先把PVDF膜在甲醇中活化约30s。分别将凝胶、海绵垫和PVDF膜预先在电转移缓冲液中平衡30min。按滤纸-胶-膜-滤纸的顺序夹好，按照黑面对黑面的原则放入转膜器中，加入制冷器(冰袋)，在冰中以150mA的电流跑约120min；
(2)完成后将膜取出，立刻放入5％的脱脂牛奶中，摇床上轻轻室温封闭膜1h；
(3)PBST清洗已封闭的膜，清洗3次，每次10min；
(4)加入稀释到相应倍数的一抗，4℃摇床过夜孵育；
(5)回收一抗，PBST清洗膜三次，每次10min；
(6)二抗(用3％的牛奶以1:5000-10000稀释)室温孵育膜2h；
(7)用PBST清洗膜三次，每次10min；
(8)Pierce ECL Western Blotting Substrate试剂盒A、B液等体积混匀后，逐滴滴加在PVDF膜上；
(9)FluorChem E FE0511中曝光成像，实验用Image J分析。
其中，一抗是公司制备的人的鸟苷激酶b突变蛋白单克隆抗体，二抗是辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。
j、Western blot检测结果分析：按照Western blot实验步骤显示结果，如图6所示，其中，图6中的Marker用于表征标记蛋白的大小。与空白对照相比，仅在实验组35KD附近出现明显条带，其中，鸟苷激酶b突变蛋白的分子量大约为35KD，表明该白血病患者的鸟苷激酶b蛋白确实存在突变。
实施例六
在本发明实施例中，将肝癌患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该肝癌患者的鸟苷激酶b蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：
a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如，稀释成2.0ug/ml，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h；
b、使用样品稀释液将检测对象的鸟苷激酶b蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的鸟苷激酶b蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育1-2h；
e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上450nm测定OD值。
h、制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；根据ELISA Calc软件绘制出标准曲线，根据该ELISA Calc软件可以得出该R2＝0.99329，因此，本次测定有效。将检测得到的OD450值带入标准曲线即可求得样品中肝癌患者的鸟苷激酶b蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测肝癌患者血清样品中鸟苷激酶b蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图7，为OD值的标准曲线。其中，X轴为OD值，Y轴为对应的浓度。
i、Western blot鉴定
j、Western blot检测结果分析
其中，步骤i和步骤j与实施例五中的相同，在此不再赘述，请参考图8，图8中的Marker用于表征标记蛋白的大小。本实施例的实验显示结果，与空白对照相比，仅在实验组35KD附近出现明显条带，其中，鸟苷激酶b突变蛋白的分子量大约为35KD，表明该肝癌患者的鸟苷激酶b蛋白确实存在突变。
实施例七
在本发明实施例中，将胰腺癌患者作为检测对象，并利用ELISA试剂盒检测该胰腺癌患者的鸟苷激酶b蛋白是否发生了突变，该方法至少可以包括如下一种：
a、使用所述包被缓冲液将实施例三制备的单克隆抗体进行稀释，例如，稀释成2.0ug/ml，并将稀释后的单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，室温孵育1-2h；
b、使用样品稀释液将胰腺癌患者的鸟苷激酶b蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的鸟苷激酶b蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育1-2h；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，室温孵育1-2h；
e、甩去各孔中的液体，加入ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育10-20min，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上450nm测定OD值。
h、制作标准曲线，以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；根据ELISA Calc软件绘制出标准曲线，根据该ELISA Calc软件可以得出该R2＝0.99715，因此，本次测定有效。将检测得到的OD450值带入标准曲线即可求得样品中胰腺癌患者的鸟苷激酶b蛋白的浓度。利用建立的ELISA方法检测胰腺癌患者血清样品中鸟苷激酶b蛋白的含量。并用Western blot进行鉴定。请参考图9，为OD值的标准曲线。其中，X轴为OD值，Y轴为对应的浓度。
i、Western blot鉴定
j、Western blot检测结果分析
其中，步骤i和步骤j与实施例五中的相同，在此不再赘述，请参考图10，图10中的Marker用于表征标记蛋白的大小。本实施例的实验显示结果，与空白对照相比，仅在实验组35KD附近出现明显条带，其中，鸟苷激酶b突变蛋白的分子量大约为35KD，表明该胰腺癌患者的鸟苷激酶b蛋白确实存在突变。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司
<120> 一种人的鸟苷激酶b突变蛋白及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 147
<212> PRT
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 1
Met Ser Gly Pro Arg Pro Val Val Leu Ser Gly Pro Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15
Lys Ser Thr Leu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu His Ser Gly Ile Phe
20 25 30
Gly Phe Ser Val Ser His Thr Thr Arg Asn Pro Arg Pro Gly Glu Glu
35 40 45
Asn Gly Lys Asp Tyr Tyr Phe Val Thr Arg Glu Val Met Gln Arg Gly
50 55 60
Ile Ala Ala Gly Asp Ser Ile Glu His Ala Glu Phe Ser Gly Asn Leu
65 70 75 80
Tyr Gly Thr Ser Lys Val Ala Val Gln Ala Val Gln Ala Met Asn Arg
85 90 95
Ile Cys Val Leu Asp Val Asp Leu Gln Gly Val Arg Asn Ile Lys Ala
100 105 110
Thr Asp Leu Arg Gln Arg Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ser Ser Lys Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Phe Asp Val Val Ile Ile Asn Asp Ser Leu Asp Gln Ala
130 135 140
Tyr Ala Glu
145
<210> 2
<211> 441
<212> DNA
<213> 智人种(Homo sapiens)
<400> 2
atgtcgggcc ccaggcctgt ggtgctgagc gggccttcgg gagctgggaa gagcaccctg 60
ctgaagaggc tgctccagga gcacagcggc atctttggct tcagcgtgtc ccataccacg 120
aggaacccga ggcccggcga ggagaacggc aaagattact actttgtaac cagggaggtg 180
atgcagcgtg gcatagcagc cggcgactcc atcgagcatg ccgagttctc ggggaacctg 240
tatggcacga gcaaggtggc ggtgcaggcc gtgcaggcca tgaaccgcat ctgtgtgctg 300
gacgtggacc tgcagggtgt gcggaacatc aaggccaccg atctgcggca gcgcaacact 360
gaaaccgagg agagcagcaa ggagcccggc ctgtttgatg tggtcatcat taacgacagc 420
ctggaccagg cctacgcaga g 441
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgatctgcg gcagcgcaac actgaaaccg aggagag 37
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtcgggcc ccaggcctgt 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctctgcgtag gcctggtc 18

Claims (9)

1.一种人的鸟苷激酶b突变蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种人的鸟苷激酶b突变蛋白的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种基因芯片，其特征在于，包括：固相载体和固定在该载体上的核苷酸探针；所述核苷酸探针根据所述人的鸟苷激酶B突变蛋白的核苷酸序列，与人的鸟苷激酶B正常蛋白的核苷酸序列的比对结果确定。
4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于，所述核苷酸探针为SEQ ID NO:3所示的碱基序列。
5.一种特异性识别人的鸟苷激酶b突变蛋白的单克隆抗体，其特征在于，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
6.一种用于检测人的鸟苷激酶b突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒包括：包被有权利要求5所述单克隆抗体的ELISA酶标板、酶标二抗、检测对象的鸟苷激酶b蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、ELISA酶标板洗涤液、显色液和终止液。
7.根据权利要求6所述用于检测人的鸟苷激酶b突变蛋白的抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为稀释的HRP辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG。
8.一种基于权利要求6或7所述ELISA试剂盒检测人的鸟苷激酶b突变蛋白的抗体的方法，其特征在于，包括：
a、使用所述包被缓冲液对权利要求5所述单克隆抗体进行稀释，并将稀释后的所述单克隆抗体加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育；
b、使用所述样品稀释液将检测对象的鸟苷激酶b蛋白稀释成不同浓度梯度，并将不同浓度梯度的鸟苷激酶b蛋白分别加样至ELISA酶标板的孔中，并室温孵育；
c、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
d、加入所述酶标二抗，并室温孵育；
e、甩去各孔中的液体，加入所述ELISA酶标板洗涤液，洗涤并甩干；
f、加入所述显色液，室温避光孵育，加入所述终止液终止反应；
g、在酶标仪上450nm测定OD值。
9.根据权利要求8所述ELISA试剂盒检测人的鸟苷激酶b突变蛋白的抗体的方法，其特征在于，进一步包括：空白对照实验。
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