CN108051553A - 一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法 - Google Patents

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CN108051553A CN201711498038.6A CN201711498038A CN108051553A CN 108051553 A CN108051553 A CN 108051553A CN 201711498038 A CN201711498038 A CN 201711498038A CN 108051553 A CN108051553 A CN 108051553A
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侯永清
易丹
丁斌鹰
吴涛
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Wuhan Polytechnic University
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Abstract

本发明公开一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，包括以下步骤：将试验仔猪分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂；于试验第7天开始，在Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂后1h时，对Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射，对Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射；于试验第10天时，同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D‑木糖口腔灌服，1h后采集试验仔猪的血样并测定血液指标；血样采集2h后，取试验仔猪的小肠样品，观测肠道病理学变化，并检测肠道功能基因的mRNA水平。本发明提出的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，具有试验周期短、针对性强、结果准确、可重复性高的优点。

Description

一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法
技术领域
本发明涉及仔猪饲料添加剂技术领域，特别涉及一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法。
背景技术
肠道不仅是所有营养物质消化吸收的最终场所，也是动物体内最大的免疫器官，是机体防御体系的第一道屏障，维护动物肠道健康对保障养猪生产至关重要。研究证明，肠道是机体应激反应的中心器官，各种应激因素(如心理性、生理性、营养性和病原性的应激因子)会导致肠道功能紊乱、损伤仔猪肠道的结构与功能，导致仔猪腹泻，造成严重的经济损失。而传统饲用抗生素因耐药性和残留性问题将逐步被禁止，因此，为了改善仔猪腹泻问题，需要筛选出具有猪肠道功能保护作用的饲料添加剂。
然而，现有技术中，对于具有猪肠道功能保护作用的饲料添加剂的筛选方法十分有限，且所采用的肠道损伤模型、肠道功能衡量指标、仔猪日龄、试验周期等并不一致，易导致试验结果重复性差、所筛选的饲料添加剂应用效果不稳定、针对性不强，并不能准确、快速地筛选出适合于仔猪饲养的仔猪肠道功能保护添加剂。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，旨在提高仔猪肠道功能保护剂的筛选方法的准确性和可重复性。
为实现上述目的，本发明提出一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，包括以下步骤：
步骤S10、将试验仔猪分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂，试验连续进行6天；
步骤S20、于试验第7天开始，在Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂后1h时，对Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射，对Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射，连续进行3天；
步骤S30、于试验第10天时，对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的所有试验仔猪进行禁食、但不断水处理8h后，称重并计算Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪对应的平均日增重；
步骤S40、对试验仔猪称重后，同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服，1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并测定血液指标；
步骤S50、血样采集2h后，对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品，观测肠道病理学变化，并检测肠道功能基因的mRNA水平，根据试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平，分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果，进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
优选地，在步骤S10中：
Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂的剂量为每千克体重10～50mg，每日一次；
Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水的剂量为每千克体重10～50mg，每日一次。
优选地，步骤S10包括：
步骤S11、选取健康良种仔猪于7日龄断奶，用人工乳喂养，作为试验仔猪；
步骤S12、将7日龄的试验仔猪在代谢笼中代谢适应3天后，按照体重相近原则随机分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，设为试验第1天并开始试验；
步骤S13、试验过程中，使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂，试验连续进行6天。
优选地，在步骤S20中：
Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射的注射量为每千克体重5mg；
Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射的注射量为每千克体重5mg。
优选地，在步骤S40中：D-木糖口腔灌服的剂量为每千克体重100mg。
优选地，步骤S40具体包括：
对试验仔猪称重后，同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服，1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并分离血清，测定血液指标；
其中，所述血液指标包括血液中二胺氧化酶活力、以及D-木糖、肠脂肪酸结合蛋白和瓜氨酸水平。
优选地，步骤S50包括：
步骤S51、血样采集2h后，对所有试验仔猪进行戊巴比妥酸钠肌肉注射，使试验仔猪麻醉后，屠宰试验仔猪并对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品；
步骤S52、将小肠样品制作为肠道组织切片，观测肠道病理学变化；同时刮取肠道黏膜样品，检测肠道功能基因的mRNA水平；
步骤S53、根据Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平，分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果，进而筛选出仔猪肠道功能保护剂；
其中，所述肠道功能基因包括绒毛素、肠脂肪酸结合蛋白、基质金属蛋白酶、钾离子通道以及水通道蛋白。
优选地，在步骤S51中：戊巴比妥酸钠肌肉注射的注射量为每千克体重100mg。
本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，采用腹腔注射吲哚美辛为仔猪肠道损伤模型，以仔猪平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平为肠道功能衡量指标，具有针对性强、结果准确、可重复性高的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例3中Ⅰ组试验仔猪肠道的外观形态图；
图2为本发明实施例3中Ⅱ组试验仔猪肠道的外观形态图；
图3为图2中A处回肠剖开后的外观形态图；
图4为本发明实施例3中Ⅲ组试验仔猪肠道的外观形态图；
图5为本发明实施例3中IV组试验仔猪肠道的外观形态图；
图6为本发明实施例3中Ⅰ组试验仔猪肠道组织形态图；
图7为本发明实施例3中Ⅱ组试验仔猪肠道组织形态图；
图8为本发明实施例3中Ⅲ组试验仔猪肠道组织形态图；
图9为本发明实施例3中IV组试验仔猪肠道组织形态图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，在本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法的第一实施例中，所述仔猪肠道功能保护剂的筛选方法包括以下步骤：
步骤S10、将试验仔猪分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂，试验连续进行6天；
选取健康状况良好的良种断奶仔猪，按照体重相近原则随机分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，即为对照组、吲哚美辛组和试验组，并开始试验，试验时，试验组(Ⅲ组)用待筛选添加剂进行口腔灌服，对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)用生理盐水进行口腔灌服，试验连续进行6天，完成肠道损伤诱导处理前的准备工作。
其中，在步骤S10中：Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂的剂量为每千克体重10～50mg，每日一次；Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水的剂量为每千克体重10～50mg，每日一次。试验组(Ⅲ组)用待筛选添加剂进行口腔灌服，剂量控制在每千克体重10～50mg，每日一次；对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)口腔灌服与待筛选添加剂相同体积的生理盐水，同样为每日一次，以确保试验的严谨性。
步骤S20、于试验第7天开始，在Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂后1h时，对Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射，对Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射，连续进行3天；
试验第7天开始，对试验仔猪进行肠道损伤诱导处理，在本实施例中，以吲哚美辛为仔猪肠道损伤诱导剂，具体做法为：自试验第7天开始，在对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)完成生理盐水口腔灌服、试验组(Ⅲ组)完成待筛选添加剂口腔灌服后1h时，对吲哚美辛组(Ⅱ组)和试验组(Ⅲ组)进行吲哚美辛腹腔注射、对照组(Ⅰ组)进行生理盐水腹腔注射，连续进行3天，完成仔猪肠道损伤诱导处理。
其中，在步骤S20中：Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射的注射量为每千克体重5mg；Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射的注射量为每千克体重5mg。吲哚美辛组(Ⅱ组)和试验组(Ⅲ组)腹腔注射吲哚美辛的注射量与对照组(Ⅰ组)腹腔注射生理盐水的剂量相同，以确保试验的严谨性。另外，由于对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)进行生理盐水口腔灌服、试验组(Ⅲ组)进行待筛选添加剂口腔灌服的频率为每日一次，因此，吲哚美辛组(Ⅱ组)和试验组(Ⅲ组)腹腔注射吲哚美辛、以及对照组(Ⅰ组)腹腔注射生理盐水的频率也为每日一次。
步骤S30、于试验第10天时，对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的所有试验仔猪进行禁食、但不断水处理8h后，称重并计算Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪对应的平均日增重；
试验第10天时，对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)的所有试验仔猪禁食、但不断水(以便于后续的血液检测以及肠道样品取样)，8h后对每一组的试验仔猪进行称重，并根据试验仔猪从试验开始到试验第10天的体重变化计算每一组的试验仔猪的增重量，并计算每一组的试验仔猪对应的平均日增重，通过试验仔猪的平均日增重，来判断待筛选添加剂对试验仔猪生长性能的影响，可作为分析待筛选添加剂对仔猪肠道功能影响的依据之一。
步骤S40、对试验仔猪称重后，同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服，1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并测定血液指标；
在本实施例中，步骤S40具体包括：对试验仔猪称重后，同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服，1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并分离血清，测定血液指标；其中，所述血液指标包括血浆中二胺氧化酶(DAO)活力、以及D-木糖、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)和瓜氨酸水平。
其中，在步骤S40中：D-木糖口腔灌服的剂量为每千克体重100mg。
待试验仔猪称重完成后，同时对对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)的所有试验仔猪进行D-木糖口腔灌服，1h后对应采集对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)试验仔猪的血样，分离血清后测定血浆二胺氧化酶(DAO)活力、以及D-木糖、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)和瓜氨酸水平，作为分析待筛选添加剂对仔猪肠道功能影响的依据之一。
步骤S50、血样采集2h后，对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品，观测肠道病理学变化，并检测肠道功能基因的mRNA水平，根据试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平，分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果，进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
对试验仔猪进行血样采集2h后，分别取对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)试验仔猪的小肠样品，观察试验仔猪小肠样品的组织形态，进而判断试验仔猪的肠道病理学变化，同时通过实时荧光定量PCR法检测小肠样品中的肠道功能基因的mRNA水平；最后，根据试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平，综合分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果，进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，采用腹腔注射吲哚美辛为仔猪肠道损伤模型，以仔猪平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平为肠道功能衡量指标，具有针对性强、结果准确、可重复性高的优点；同时，本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，体内实验周期短，只需10天即可准确、快速地筛选出仔猪肠道功能保护剂。
在本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法的第二实施例中，步骤S10包括：
步骤S11、选取健康良种仔猪于7日龄断奶，用人工乳喂养，作为试验仔猪；
断奶仔猪对于由各种应急因素导致的肠道损伤的不良反应更为显著，以7日龄的断奶仔猪作为试验仔猪，使得实验结果更为稳定、准确。
步骤S12、将7日龄的试验仔猪在代谢笼中代谢适应3天后，按照体重相近原则随机分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，设为试验第1天并开始试验；
选取30头7日龄的试验仔猪，在代谢笼中代谢适应3天后，按照体重相近原则随机分为对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)和试验组(Ⅲ组)，设为试验第1天并开始试验，其中，每组重复10个，每个重复1头仔猪，通过多个平行试验组的设置，使得试验结果更为准确、可靠。
步骤S13、试验过程中，使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂，试验连续进行6天。
试验第1天至第6天，试验组(Ⅲ组)用待筛选添加剂进行口腔灌服，对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)用生理盐水进行口腔灌服，试验连续进行6天，完成肠道损伤诱导处理前的准备工作。
在本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法的第三实施例中，步骤S50包括：
步骤S51、血样采集2h后，对所有试验仔猪进行戊巴比妥酸钠肌肉注射，使试验仔猪麻醉后，屠宰试验仔猪并对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品；
其中，在步骤S51中：戊巴比妥酸钠肌肉注射的注射量为每千克体重100mg。
对试验仔猪进行血样采集2h后，用戊巴比妥酸钠按每千克体重100mg的剂量肌肉注射对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)的试验仔猪，待试验仔猪彻底麻醉后，屠宰解剖试验仔猪，对应取出对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)的试验仔猪的小肠样品，备用。同时，在屠宰后解剖试验仔猪时，还可以通过对试验仔猪肠道外观形态的直观观察(例如肠壁厚度、肠壁是否有出血点等)，分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道的影响，作为分析待筛选添加剂对仔猪肠道功能影响的依据之一。
步骤S52、将小肠样品制作为肠道组织切片，观测肠道病理学变化；同时刮取肠道黏膜样品，检测肠道功能基因的mRNA水平；
其中，所述肠道功能基因包括绒毛素(villin)、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)、基质金属蛋白酶(MMP3)、钾离子通道(KCNJ13)以及水通道蛋白(AQP10)。
将取出的小肠样品制作成肠道组织切片，通过显微镜观察试验仔猪肠道组织形态的变化，同时，刮取肠道黏膜样品，利用实时荧光定量PCR法检测小肠样品中的肠道功能相关基因(包括绒毛素、肠脂肪酸结合蛋白、基质金属蛋白酶、钾离子通道以及水通道蛋白)的mRNA水平，分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的影响。
步骤S53、根据Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平，判断待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果，进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
根据对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)试验仔猪的平均日增重、血液指标(包括血液中DAO活力、以及D-木糖、iFABP和瓜氨酸水平)、肠道病理学变化以及肠道功能相关基因(包括villin、iFABP、MMP3、KCNJ13以及AQP10)的mRNA水平，综合分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果，进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
以下根据具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)选取40头健康良好的良种仔猪于7日龄断奶，用优质人工乳喂养，并将7日龄仔猪置于代谢笼适应3天期后，将试验仔猪(10日龄，试验第1天)按体重相近原则随机分为四个组(每组10头仔猪)：空白对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)、试验组(Ⅲ组)、试验对照组(IV组)。其中，Ⅲ组用N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为待筛选添加剂进行口腔灌服，剂量范围控制在每千克体重40mg，每日一次，连续6天；IV组用丙氨酸(Ala)作为待筛选添加剂进行口腔灌服，剂量范围控制在每千克体重40mg，每日一次，连续6天；Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服相同体积的生理盐水，连续6天。
(2)于试验第7天(16日龄)，Ⅲ组和IV组试验仔猪在对应灌服NAC、Ala后1h，按每千克体重5mg腹腔注射吲哚美辛，连续注射3天；Ⅱ组在灌服生理盐水后1h，按每千克体重5mg腹腔注射吲哚美辛，连续注射3天；Ⅰ组在灌服生理盐水后1h，按每千克体重5mg腹腔注射生理盐水，连续3天。
(3)于试验第10天(19日龄)，所有组仔猪禁食、但不断水处理，持续8小时后称重，并计算Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和IV组试验仔猪对应的平均日增重，同时计算饲养Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和IV组试验仔猪的饲料的料重比。
(4)称重完成后，对所有试验仔猪按每千克体重100mg口腔灌服D-木糖，1h后采集血样并分离血清，待测。
(5)血样采集2h后，对所有试验仔猪按每千克体重100mg肌肉注射戊巴比妥酸钠，麻醉并屠宰试验仔猪，取小肠样品，制作成肠道组织切片，并刮取空肠黏膜样品速冻于液氮中，待测；同时，观察并记录试验仔猪屠宰解剖过程中试验仔猪肠道组织的外观形态。
实施例2 试验仔猪生长性能
Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和IV组试验仔猪对应的平均日增重、料重比的计算结果如表1所示。
表1 实施例2中各组试验仔猪的生长性能
项目 Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 IV组
平均日增重(g) 130±15.2a 90.7±16.9b 115±21.1ab 92.5±18.8b
料重比(％) 0.79±0.14b 1.04±0.11a 0.84±0.09ab 0.99±0.13b
由表1可知，Ⅱ组与Ⅰ组相比，Ⅱ组试验仔猪的平均日增重降低了30.23％(P＜0.05)，但料重比提高了31.65％(P＜0.05)；Ⅲ组与Ⅱ组相比，Ⅲ组中，采用NAC处理可以提高仔猪平均日增重26.79％，并降低料重比19.23％；IV组与II组相比，平均日增重和料重比并未得到改善。说明待筛选添加剂NAC可以缓解吲哚美辛刺激对仔猪生长性能产生的不利影响，而待筛选添加剂Ala对缓解吲哚美辛刺激对仔猪生长性能产生的不利影响没有明显帮助。
实施例3 试验仔猪肠道组织病理学变化
(1)在屠宰解剖试验仔猪时，观察并拍照记录Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪肠道组织的外观形态，结果如图1至图5所示。其中，图1、图2、图4、图5依次为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪肠道组织的外观形态图，图3为图2中局部A处回肠剖开后的外观形态图。
由图1至图4观察可知，Ⅱ组和IV组中，试验仔猪灌服生理盐水后再注射吲哚美辛，其肠道后段(空肠和回肠)出现大面积出血点(图2中A处所示)，将回肠剖开后发现肠壁变薄，且布满出血点(如图3所示)，说明腹腔注射吲哚美辛可明显诱导试验仔猪肠道后段损伤；而Ⅲ组中，试验仔猪灌服NAC后再注射吲哚美辛，其肠道后段仅有零星出血点(如图4所示)，基本接近Ⅰ组中未注射吲哚美辛的试验仔猪肠道组织的外观形态(如图1所示)。说明待筛选添加剂NAC可恢复吲哚美辛诱导的仔猪肠道后段损伤。
(2)将实施例1中取出的试验仔猪小肠样品，制作成肠道组织切片，观察并记录Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪的肠道组织形态，结果如图6至图9所示。其中，图6、图7、图8和图9依次为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪的肠道组织形态图。
由图6至图9观察可知，Ⅱ组和IV组中，试验仔猪灌服生理盐水后再注射吲哚美辛，其空肠绒毛大面积脱落，组织形态异常(如图7和图9所示)，表明吲哚美辛诱导仔猪肠道组织形态发生异常，抑制肠道发育，且Ala对吲哚美辛诱导仔猪肠道组织形态发生异常的现象无明显改善作用；而Ⅲ组中，试验仔猪灌服NAC后再注射吲哚美辛，其肠道绒毛基本无脱落，组织形态结构正常(如图7所示)。说明待筛选添加剂NAC可恢复吲哚美辛诱导的仔猪肠道组织形态异常，保护仔猪肠道功能，而Ala并不能改善吲哚美辛诱导的仔猪肠道组织形态异常。
实施例4 试验仔猪血液DAO活力、以及D-木糖、iFABP和瓜氨酸水平
按照常规血液检测方法，检测Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪血液中DAO(二胺氧化酶)活力、以及D-木糖、iFABP(肠脂肪酸结合蛋白)和瓜氨酸水平，结果如表2所示。
表2 实施例4中各组试验仔猪血液DAO活力、以及D-木糖、iFABP和瓜氨酸水平
项目 Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组 IV组
D-木糖(mmol/L) 0.95±0.14a 0.65±0.12b 0.83±0.15ab 0.60±0.10b
二胺氧化酶活力(U/L) 1.63±0.10b 3.69±0.51a 2.02±0.47b 3.72±0.63a
肠脂肪酸结合蛋白(pg/mL) 73.2±14.3b 148±28.5a 64.0±13.4b 151±30.7a
瓜氨酸(nmol/mL) 450±73.4a 352±51.2b 416±72.8ab 331±67.1b
由表2可知，Ⅱ组与Ⅰ组相比，Ⅱ组中，试验仔猪灌服生理盐水后再注射吲哚美辛，使试验仔猪血液D-木糖和瓜氨酸水平分别降低了31.58％(P＜0.05)和21.78％(P＜0.05)，使试验仔猪血液二胺氧化酶活力和iFABP水平分别提高了126％(P＜0.05)和122％(P＜0.05)，表明腹腔注射5mg/kg体重的吲哚美辛，可破坏肠道吸收和屏障功能，诱导仔猪肠道损伤。Ⅲ组与Ⅱ组相比，在Ⅲ组中，试验仔猪灌服NAC后再注射吲哚美辛，使试验仔猪血液D-木糖和瓜氨酸水平分别提高了27.69％和18.18％，并使试验仔猪血液二胺氧化酶活力和iFABP水平分别降低了45.26％(P＜0.05)和56.76％(P＜0.05)。IV组与II组相比，DAO(二胺氧化酶)活力、以及D-木糖、iFABP(肠脂肪酸结合蛋白)和瓜氨酸水平并未有显著改变。因此，说明待筛选添加剂NAC可缓解吲哚美辛诱导的肠道吸收和屏障功能紊乱，保护仔猪的肠道功能，Ala对吲哚美辛诱导的肠道吸收和屏障功能紊乱并无改善作用。
实施例5 试验仔猪肠道功能相关基因表达水平
通过实时荧光定量PCR法，检测Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪的空肠黏膜样品中肠道功能相关基因，包括villin(绒毛素)、iFABP(肠脂肪酸结合蛋白)、MMP3(基质金属蛋白酶)、KCNJ13(钾离子通道)以及AQP10(水通道蛋白)的mRNA水平，结果如表3所示。其中，检测结果用2-ΔΔCt法进行统计分析，Ⅰ组设为1。
表3 实施例5中各组试验仔猪空肠黏膜肠道功能相关基因的mRNA水平
由表3可知，Ⅱ组与Ⅰ组相比，在Ⅱ组中，试验仔猪灌服生理盐水后再注射吲哚美辛，使试验仔猪空肠黏膜Villin、iFABP、KCNJ13和AQP10的mRNA相对表达量分别降低了51％(P＜0.05)、63％(P＜0.05)、45％(P＜0.05)和94％(P＜0.05)，使试验仔猪空肠黏膜MMP3的mRNA相对表达量提高了268％(P＜0.05)，表明腹腔注射5mg/kg体重的吲哚美辛，可抑制肠道养分转运通道的表达和肠道绒毛生长，导致肠道功能紊乱。Ⅲ组与Ⅱ组相比，在Ⅲ组中，试验仔猪灌服NAC后再注射吲哚美辛，使仔试验猪空肠黏膜Villin、iFABP、KCNJ13和AQP10的mRNA相对表达量分别提高了36.73％(P＜0.05)、91.89％(P＜0.05)、66.67％(P＜0.05)和700％(P＜0.05)，使试验仔猪空肠黏膜MMP3的mRNA相对表达量降低了32.07％(P＜0.05)。IV组与II组相比，Villin、iFABP、KCNJ13、AQP10和MMP3的mRNA相对表达量均未有显著的变化。因此，说明待筛选添加剂NAC可缓解吲哚美辛诱导的肠道功能紊乱，保护仔猪的肠道功能，而Ala对吲哚美辛诱导的仔猪肠道功能紊乱并无改善作用。
综合上述各项测试结果，说明待筛选添加剂NAC对保护仔猪肠道功能有显著的积极作用，可选用为仔猪肠道功能保护剂；而待筛选添加剂Ala对保护仔猪肠道功能并无明显的作用，并不适合于作为仔猪肠道功能保护剂使用。也即，通过本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，可明确筛选出对仔猪肠道功能起到显著保护作用的肠道功能保护剂，也可以排除掉对仔猪肠道功能没有明显保护作用的添加剂，准确性高，针对性强。
综上所述，本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，具有体内试验周期短的特点，并且采用腹腔注射吲哚美辛为仔猪肠道损伤模型，以仔猪平均日增重，血液DAO活力、以及D-木糖、iFABP和瓜氨酸水平，肠道病理学变化以及肠道villin、iFABP、MMP3、KCNJ13和AQP10基因的mRNA水平为肠道功能衡量指标，具有针对性强、结果准确、可重复性高的优点，能准确、快速地筛选出仔猪肠道功能保护剂，而且所筛选出来的肠道功能保护剂具有针对性强、稳定性好的特点，可有效替代抗生素，并降低仔猪肠道疾病的发生率、改善仔猪健康状况和提高其生长性能。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S10、将试验仔猪分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂，试验连续进行6天；
步骤S20、于试验第7天开始，在Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂后1h时，对Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射，对Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射，连续进行3天；
步骤S30、于试验第10天时，对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的所有试验仔猪进行禁食、但不断水处理8h后，称重并计算Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪对应的平均日增重；
步骤S40、对试验仔猪称重后，同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服，1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并测定血液指标；
步骤S50、血样采集2h后，对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品，观测肠道病理学变化，并检测肠道功能基因的mRNA水平，根据试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平，分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果，进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
2.如权利要求1所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，其特征在于，在步骤S10中：
Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂的剂量为每千克体重10～50mg，每日一次；
Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水的剂量为每千克体重10～50mg，每日一次。
3.如权利要求2所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，其特征在于，步骤S10包括：
步骤S11、选取健康良种仔猪于7日龄断奶，用人工乳喂养，作为试验仔猪；
步骤S12、将7日龄的试验仔猪在代谢笼中代谢适应3天后，按照体重相近原则随机分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，设为试验第1天并开始试验；
步骤S13、试验过程中，使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂，连续进行6天。
4.如权利要求1或2任意一项所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，其特征在于，在步骤S20中：
Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射的注射量为每千克体重5mg；
Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射的注射量为每千克体重5mg。
5.如权利要求1所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，其特征在于，在步骤S40中：D-木糖口腔灌服的剂量为每千克体重100mg。
6.如权利要求5所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，其特征在于，步骤S40具体包括：
对试验仔猪称重后，同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服，1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并分离血清，测定血液指标；
其中，所述血液指标包括血液中二胺氧化酶活力、以及D-木糖、肠脂肪酸结合蛋白和瓜氨酸水平。
7.如权利要求1或6任意一项所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，其特征在于，步骤S50包括：
步骤S51、血样采集2h后，对所有试验仔猪进行戊巴比妥酸钠肌肉注射，使试验仔猪麻醉后，屠宰试验仔猪并对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品；
步骤S52、将小肠样品制作为肠道组织切片，观测肠道病理学变化；同时刮取肠道黏膜样品，检测肠道功能基因的mRNA水平；
步骤S53、根据Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平，分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果，进而筛选出仔猪肠道功能保护剂；
其中，所述肠道功能基因包括绒毛素、肠脂肪酸结合蛋白、基质金属蛋白酶、钾离子通道以及水通道蛋白。
8.如权利要求7所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法，其特征在于，在步骤S51中：戊巴比妥酸钠肌肉注射的注射量为每千克体重100mg。
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