CN108051553A - 一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法 - Google Patents
一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108051553A CN108051553A CN201711498038.6A CN201711498038A CN108051553A CN 108051553 A CN108051553 A CN 108051553A CN 201711498038 A CN201711498038 A CN 201711498038A CN 108051553 A CN108051553 A CN 108051553A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- experiment
- piglet
- function
- piglings
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,包括以下步骤:将试验仔猪分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂;于试验第7天开始,在Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂后1h时,对Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射,对Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射;于试验第10天时,同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D‑木糖口腔灌服,1h后采集试验仔猪的血样并测定血液指标;血样采集2h后,取试验仔猪的小肠样品,观测肠道病理学变化,并检测肠道功能基因的mRNA水平。本发明提出的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,具有试验周期短、针对性强、结果准确、可重复性高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及仔猪饲料添加剂技术领域,特别涉及一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法。
背景技术
肠道不仅是所有营养物质消化吸收的最终场所,也是动物体内最大的免疫器官,是机体防御体系的第一道屏障,维护动物肠道健康对保障养猪生产至关重要。研究证明,肠道是机体应激反应的中心器官,各种应激因素(如心理性、生理性、营养性和病原性的应激因子)会导致肠道功能紊乱、损伤仔猪肠道的结构与功能,导致仔猪腹泻,造成严重的经济损失。而传统饲用抗生素因耐药性和残留性问题将逐步被禁止,因此,为了改善仔猪腹泻问题,需要筛选出具有猪肠道功能保护作用的饲料添加剂。
然而,现有技术中,对于具有猪肠道功能保护作用的饲料添加剂的筛选方法十分有限,且所采用的肠道损伤模型、肠道功能衡量指标、仔猪日龄、试验周期等并不一致,易导致试验结果重复性差、所筛选的饲料添加剂应用效果不稳定、针对性不强,并不能准确、快速地筛选出适合于仔猪饲养的仔猪肠道功能保护添加剂。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,旨在提高仔猪肠道功能保护剂的筛选方法的准确性和可重复性。
为实现上述目的,本发明提出一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,包括以下步骤:
步骤S10、将试验仔猪分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂,试验连续进行6天;
步骤S20、于试验第7天开始,在Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂后1h时,对Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射,对Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射,连续进行3天;
步骤S30、于试验第10天时,对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的所有试验仔猪进行禁食、但不断水处理8h后,称重并计算Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪对应的平均日增重;
步骤S40、对试验仔猪称重后,同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服,1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并测定血液指标;
步骤S50、血样采集2h后,对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品,观测肠道病理学变化,并检测肠道功能基因的mRNA水平,根据试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平,分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果,进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
优选地,在步骤S10中:
Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂的剂量为每千克体重10~50mg,每日一次;
Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水的剂量为每千克体重10~50mg,每日一次。
优选地,步骤S10包括:
步骤S11、选取健康良种仔猪于7日龄断奶,用人工乳喂养,作为试验仔猪;
步骤S12、将7日龄的试验仔猪在代谢笼中代谢适应3天后,按照体重相近原则随机分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,设为试验第1天并开始试验;
步骤S13、试验过程中,使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂,试验连续进行6天。
优选地,在步骤S20中:
Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射的注射量为每千克体重5mg;
Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射的注射量为每千克体重5mg。
优选地,在步骤S40中:D-木糖口腔灌服的剂量为每千克体重100mg。
优选地,步骤S40具体包括:
对试验仔猪称重后,同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服,1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并分离血清,测定血液指标;
其中,所述血液指标包括血液中二胺氧化酶活力、以及D-木糖、肠脂肪酸结合蛋白和瓜氨酸水平。
优选地,步骤S50包括:
步骤S51、血样采集2h后,对所有试验仔猪进行戊巴比妥酸钠肌肉注射,使试验仔猪麻醉后,屠宰试验仔猪并对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品;
步骤S52、将小肠样品制作为肠道组织切片,观测肠道病理学变化;同时刮取肠道黏膜样品,检测肠道功能基因的mRNA水平;
步骤S53、根据Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平,分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果,进而筛选出仔猪肠道功能保护剂;
其中,所述肠道功能基因包括绒毛素、肠脂肪酸结合蛋白、基质金属蛋白酶、钾离子通道以及水通道蛋白。
优选地,在步骤S51中:戊巴比妥酸钠肌肉注射的注射量为每千克体重100mg。
本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,采用腹腔注射吲哚美辛为仔猪肠道损伤模型,以仔猪平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平为肠道功能衡量指标,具有针对性强、结果准确、可重复性高的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例3中Ⅰ组试验仔猪肠道的外观形态图;
图2为本发明实施例3中Ⅱ组试验仔猪肠道的外观形态图;
图3为图2中A处回肠剖开后的外观形态图;
图4为本发明实施例3中Ⅲ组试验仔猪肠道的外观形态图;
图5为本发明实施例3中IV组试验仔猪肠道的外观形态图;
图6为本发明实施例3中Ⅰ组试验仔猪肠道组织形态图;
图7为本发明实施例3中Ⅱ组试验仔猪肠道组织形态图;
图8为本发明实施例3中Ⅲ组试验仔猪肠道组织形态图;
图9为本发明实施例3中IV组试验仔猪肠道组织形态图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,在本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法的第一实施例中,所述仔猪肠道功能保护剂的筛选方法包括以下步骤:
步骤S10、将试验仔猪分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂,试验连续进行6天;
选取健康状况良好的良种断奶仔猪,按照体重相近原则随机分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,即为对照组、吲哚美辛组和试验组,并开始试验,试验时,试验组(Ⅲ组)用待筛选添加剂进行口腔灌服,对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)用生理盐水进行口腔灌服,试验连续进行6天,完成肠道损伤诱导处理前的准备工作。
其中,在步骤S10中:Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂的剂量为每千克体重10~50mg,每日一次;Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水的剂量为每千克体重10~50mg,每日一次。试验组(Ⅲ组)用待筛选添加剂进行口腔灌服,剂量控制在每千克体重10~50mg,每日一次;对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)口腔灌服与待筛选添加剂相同体积的生理盐水,同样为每日一次,以确保试验的严谨性。
步骤S20、于试验第7天开始,在Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂后1h时,对Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射,对Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射,连续进行3天;
试验第7天开始,对试验仔猪进行肠道损伤诱导处理,在本实施例中,以吲哚美辛为仔猪肠道损伤诱导剂,具体做法为:自试验第7天开始,在对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)完成生理盐水口腔灌服、试验组(Ⅲ组)完成待筛选添加剂口腔灌服后1h时,对吲哚美辛组(Ⅱ组)和试验组(Ⅲ组)进行吲哚美辛腹腔注射、对照组(Ⅰ组)进行生理盐水腹腔注射,连续进行3天,完成仔猪肠道损伤诱导处理。
其中,在步骤S20中:Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射的注射量为每千克体重5mg;Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射的注射量为每千克体重5mg。吲哚美辛组(Ⅱ组)和试验组(Ⅲ组)腹腔注射吲哚美辛的注射量与对照组(Ⅰ组)腹腔注射生理盐水的剂量相同,以确保试验的严谨性。另外,由于对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)进行生理盐水口腔灌服、试验组(Ⅲ组)进行待筛选添加剂口腔灌服的频率为每日一次,因此,吲哚美辛组(Ⅱ组)和试验组(Ⅲ组)腹腔注射吲哚美辛、以及对照组(Ⅰ组)腹腔注射生理盐水的频率也为每日一次。
步骤S30、于试验第10天时,对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的所有试验仔猪进行禁食、但不断水处理8h后,称重并计算Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪对应的平均日增重;
试验第10天时,对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)的所有试验仔猪禁食、但不断水(以便于后续的血液检测以及肠道样品取样),8h后对每一组的试验仔猪进行称重,并根据试验仔猪从试验开始到试验第10天的体重变化计算每一组的试验仔猪的增重量,并计算每一组的试验仔猪对应的平均日增重,通过试验仔猪的平均日增重,来判断待筛选添加剂对试验仔猪生长性能的影响,可作为分析待筛选添加剂对仔猪肠道功能影响的依据之一。
步骤S40、对试验仔猪称重后,同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服,1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并测定血液指标;
在本实施例中,步骤S40具体包括:对试验仔猪称重后,同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服,1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并分离血清,测定血液指标;其中,所述血液指标包括血浆中二胺氧化酶(DAO)活力、以及D-木糖、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)和瓜氨酸水平。
其中,在步骤S40中:D-木糖口腔灌服的剂量为每千克体重100mg。
待试验仔猪称重完成后,同时对对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)的所有试验仔猪进行D-木糖口腔灌服,1h后对应采集对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)试验仔猪的血样,分离血清后测定血浆二胺氧化酶(DAO)活力、以及D-木糖、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)和瓜氨酸水平,作为分析待筛选添加剂对仔猪肠道功能影响的依据之一。
步骤S50、血样采集2h后,对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品,观测肠道病理学变化,并检测肠道功能基因的mRNA水平,根据试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平,分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果,进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
对试验仔猪进行血样采集2h后,分别取对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)试验仔猪的小肠样品,观察试验仔猪小肠样品的组织形态,进而判断试验仔猪的肠道病理学变化,同时通过实时荧光定量PCR法检测小肠样品中的肠道功能基因的mRNA水平;最后,根据试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平,综合分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果,进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,采用腹腔注射吲哚美辛为仔猪肠道损伤模型,以仔猪平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平为肠道功能衡量指标,具有针对性强、结果准确、可重复性高的优点;同时,本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,体内实验周期短,只需10天即可准确、快速地筛选出仔猪肠道功能保护剂。
在本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法的第二实施例中,步骤S10包括:
步骤S11、选取健康良种仔猪于7日龄断奶,用人工乳喂养,作为试验仔猪;
断奶仔猪对于由各种应急因素导致的肠道损伤的不良反应更为显著,以7日龄的断奶仔猪作为试验仔猪,使得实验结果更为稳定、准确。
步骤S12、将7日龄的试验仔猪在代谢笼中代谢适应3天后,按照体重相近原则随机分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,设为试验第1天并开始试验;
选取30头7日龄的试验仔猪,在代谢笼中代谢适应3天后,按照体重相近原则随机分为对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)和试验组(Ⅲ组),设为试验第1天并开始试验,其中,每组重复10个,每个重复1头仔猪,通过多个平行试验组的设置,使得试验结果更为准确、可靠。
步骤S13、试验过程中,使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂,试验连续进行6天。
试验第1天至第6天,试验组(Ⅲ组)用待筛选添加剂进行口腔灌服,对照组(Ⅰ组)和吲哚美辛组(Ⅱ组)用生理盐水进行口腔灌服,试验连续进行6天,完成肠道损伤诱导处理前的准备工作。
在本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法的第三实施例中,步骤S50包括:
步骤S51、血样采集2h后,对所有试验仔猪进行戊巴比妥酸钠肌肉注射,使试验仔猪麻醉后,屠宰试验仔猪并对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品;
其中,在步骤S51中:戊巴比妥酸钠肌肉注射的注射量为每千克体重100mg。
对试验仔猪进行血样采集2h后,用戊巴比妥酸钠按每千克体重100mg的剂量肌肉注射对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)的试验仔猪,待试验仔猪彻底麻醉后,屠宰解剖试验仔猪,对应取出对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)的试验仔猪的小肠样品,备用。同时,在屠宰后解剖试验仔猪时,还可以通过对试验仔猪肠道外观形态的直观观察(例如肠壁厚度、肠壁是否有出血点等),分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道的影响,作为分析待筛选添加剂对仔猪肠道功能影响的依据之一。
步骤S52、将小肠样品制作为肠道组织切片,观测肠道病理学变化;同时刮取肠道黏膜样品,检测肠道功能基因的mRNA水平;
其中,所述肠道功能基因包括绒毛素(villin)、肠脂肪酸结合蛋白(iFABP)、基质金属蛋白酶(MMP3)、钾离子通道(KCNJ13)以及水通道蛋白(AQP10)。
将取出的小肠样品制作成肠道组织切片,通过显微镜观察试验仔猪肠道组织形态的变化,同时,刮取肠道黏膜样品,利用实时荧光定量PCR法检测小肠样品中的肠道功能相关基因(包括绒毛素、肠脂肪酸结合蛋白、基质金属蛋白酶、钾离子通道以及水通道蛋白)的mRNA水平,分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的影响。
步骤S53、根据Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平,判断待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果,进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
根据对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)以及试验组(Ⅲ组)试验仔猪的平均日增重、血液指标(包括血液中DAO活力、以及D-木糖、iFABP和瓜氨酸水平)、肠道病理学变化以及肠道功能相关基因(包括villin、iFABP、MMP3、KCNJ13以及AQP10)的mRNA水平,综合分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果,进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
以下根据具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明,应当理解,以下实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
(1)选取40头健康良好的良种仔猪于7日龄断奶,用优质人工乳喂养,并将7日龄仔猪置于代谢笼适应3天期后,将试验仔猪(10日龄,试验第1天)按体重相近原则随机分为四个组(每组10头仔猪):空白对照组(Ⅰ组)、吲哚美辛组(Ⅱ组)、试验组(Ⅲ组)、试验对照组(IV组)。其中,Ⅲ组用N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为待筛选添加剂进行口腔灌服,剂量范围控制在每千克体重40mg,每日一次,连续6天;IV组用丙氨酸(Ala)作为待筛选添加剂进行口腔灌服,剂量范围控制在每千克体重40mg,每日一次,连续6天;Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服相同体积的生理盐水,连续6天。
(2)于试验第7天(16日龄),Ⅲ组和IV组试验仔猪在对应灌服NAC、Ala后1h,按每千克体重5mg腹腔注射吲哚美辛,连续注射3天;Ⅱ组在灌服生理盐水后1h,按每千克体重5mg腹腔注射吲哚美辛,连续注射3天;Ⅰ组在灌服生理盐水后1h,按每千克体重5mg腹腔注射生理盐水,连续3天。
(3)于试验第10天(19日龄),所有组仔猪禁食、但不断水处理,持续8小时后称重,并计算Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和IV组试验仔猪对应的平均日增重,同时计算饲养Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和IV组试验仔猪的饲料的料重比。
(4)称重完成后,对所有试验仔猪按每千克体重100mg口腔灌服D-木糖,1h后采集血样并分离血清,待测。
(5)血样采集2h后,对所有试验仔猪按每千克体重100mg肌肉注射戊巴比妥酸钠,麻醉并屠宰试验仔猪,取小肠样品,制作成肠道组织切片,并刮取空肠黏膜样品速冻于液氮中,待测;同时,观察并记录试验仔猪屠宰解剖过程中试验仔猪肠道组织的外观形态。
实施例2 试验仔猪生长性能
Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和IV组试验仔猪对应的平均日增重、料重比的计算结果如表1所示。
表1 实施例2中各组试验仔猪的生长性能
项目 | Ⅰ组 | Ⅱ组 | Ⅲ组 | IV组 |
平均日增重(g) | 130±15.2a | 90.7±16.9b | 115±21.1ab | 92.5±18.8b |
料重比(%) | 0.79±0.14b | 1.04±0.11a | 0.84±0.09ab | 0.99±0.13b |
由表1可知,Ⅱ组与Ⅰ组相比,Ⅱ组试验仔猪的平均日增重降低了30.23%(P<0.05),但料重比提高了31.65%(P<0.05);Ⅲ组与Ⅱ组相比,Ⅲ组中,采用NAC处理可以提高仔猪平均日增重26.79%,并降低料重比19.23%;IV组与II组相比,平均日增重和料重比并未得到改善。说明待筛选添加剂NAC可以缓解吲哚美辛刺激对仔猪生长性能产生的不利影响,而待筛选添加剂Ala对缓解吲哚美辛刺激对仔猪生长性能产生的不利影响没有明显帮助。
实施例3 试验仔猪肠道组织病理学变化
(1)在屠宰解剖试验仔猪时,观察并拍照记录Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪肠道组织的外观形态,结果如图1至图5所示。其中,图1、图2、图4、图5依次为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪肠道组织的外观形态图,图3为图2中局部A处回肠剖开后的外观形态图。
由图1至图4观察可知,Ⅱ组和IV组中,试验仔猪灌服生理盐水后再注射吲哚美辛,其肠道后段(空肠和回肠)出现大面积出血点(图2中A处所示),将回肠剖开后发现肠壁变薄,且布满出血点(如图3所示),说明腹腔注射吲哚美辛可明显诱导试验仔猪肠道后段损伤;而Ⅲ组中,试验仔猪灌服NAC后再注射吲哚美辛,其肠道后段仅有零星出血点(如图4所示),基本接近Ⅰ组中未注射吲哚美辛的试验仔猪肠道组织的外观形态(如图1所示)。说明待筛选添加剂NAC可恢复吲哚美辛诱导的仔猪肠道后段损伤。
(2)将实施例1中取出的试验仔猪小肠样品,制作成肠道组织切片,观察并记录Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪的肠道组织形态,结果如图6至图9所示。其中,图6、图7、图8和图9依次为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪的肠道组织形态图。
由图6至图9观察可知,Ⅱ组和IV组中,试验仔猪灌服生理盐水后再注射吲哚美辛,其空肠绒毛大面积脱落,组织形态异常(如图7和图9所示),表明吲哚美辛诱导仔猪肠道组织形态发生异常,抑制肠道发育,且Ala对吲哚美辛诱导仔猪肠道组织形态发生异常的现象无明显改善作用;而Ⅲ组中,试验仔猪灌服NAC后再注射吲哚美辛,其肠道绒毛基本无脱落,组织形态结构正常(如图7所示)。说明待筛选添加剂NAC可恢复吲哚美辛诱导的仔猪肠道组织形态异常,保护仔猪肠道功能,而Ala并不能改善吲哚美辛诱导的仔猪肠道组织形态异常。
实施例4 试验仔猪血液DAO活力、以及D-木糖、iFABP和瓜氨酸水平
按照常规血液检测方法,检测Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪血液中DAO(二胺氧化酶)活力、以及D-木糖、iFABP(肠脂肪酸结合蛋白)和瓜氨酸水平,结果如表2所示。
表2 实施例4中各组试验仔猪血液DAO活力、以及D-木糖、iFABP和瓜氨酸水平
项目 | Ⅰ组 | Ⅱ组 | Ⅲ组 | IV组 |
D-木糖(mmol/L) | 0.95±0.14a | 0.65±0.12b | 0.83±0.15ab | 0.60±0.10b |
二胺氧化酶活力(U/L) | 1.63±0.10b | 3.69±0.51a | 2.02±0.47b | 3.72±0.63a |
肠脂肪酸结合蛋白(pg/mL) | 73.2±14.3b | 148±28.5a | 64.0±13.4b | 151±30.7a |
瓜氨酸(nmol/mL) | 450±73.4a | 352±51.2b | 416±72.8ab | 331±67.1b |
由表2可知,Ⅱ组与Ⅰ组相比,Ⅱ组中,试验仔猪灌服生理盐水后再注射吲哚美辛,使试验仔猪血液D-木糖和瓜氨酸水平分别降低了31.58%(P<0.05)和21.78%(P<0.05),使试验仔猪血液二胺氧化酶活力和iFABP水平分别提高了126%(P<0.05)和122%(P<0.05),表明腹腔注射5mg/kg体重的吲哚美辛,可破坏肠道吸收和屏障功能,诱导仔猪肠道损伤。Ⅲ组与Ⅱ组相比,在Ⅲ组中,试验仔猪灌服NAC后再注射吲哚美辛,使试验仔猪血液D-木糖和瓜氨酸水平分别提高了27.69%和18.18%,并使试验仔猪血液二胺氧化酶活力和iFABP水平分别降低了45.26%(P<0.05)和56.76%(P<0.05)。IV组与II组相比,DAO(二胺氧化酶)活力、以及D-木糖、iFABP(肠脂肪酸结合蛋白)和瓜氨酸水平并未有显著改变。因此,说明待筛选添加剂NAC可缓解吲哚美辛诱导的肠道吸收和屏障功能紊乱,保护仔猪的肠道功能,Ala对吲哚美辛诱导的肠道吸收和屏障功能紊乱并无改善作用。
实施例5 试验仔猪肠道功能相关基因表达水平
通过实时荧光定量PCR法,检测Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及IV组试验仔猪的空肠黏膜样品中肠道功能相关基因,包括villin(绒毛素)、iFABP(肠脂肪酸结合蛋白)、MMP3(基质金属蛋白酶)、KCNJ13(钾离子通道)以及AQP10(水通道蛋白)的mRNA水平,结果如表3所示。其中,检测结果用2-ΔΔCt法进行统计分析,Ⅰ组设为1。
表3 实施例5中各组试验仔猪空肠黏膜肠道功能相关基因的mRNA水平
由表3可知,Ⅱ组与Ⅰ组相比,在Ⅱ组中,试验仔猪灌服生理盐水后再注射吲哚美辛,使试验仔猪空肠黏膜Villin、iFABP、KCNJ13和AQP10的mRNA相对表达量分别降低了51%(P<0.05)、63%(P<0.05)、45%(P<0.05)和94%(P<0.05),使试验仔猪空肠黏膜MMP3的mRNA相对表达量提高了268%(P<0.05),表明腹腔注射5mg/kg体重的吲哚美辛,可抑制肠道养分转运通道的表达和肠道绒毛生长,导致肠道功能紊乱。Ⅲ组与Ⅱ组相比,在Ⅲ组中,试验仔猪灌服NAC后再注射吲哚美辛,使仔试验猪空肠黏膜Villin、iFABP、KCNJ13和AQP10的mRNA相对表达量分别提高了36.73%(P<0.05)、91.89%(P<0.05)、66.67%(P<0.05)和700%(P<0.05),使试验仔猪空肠黏膜MMP3的mRNA相对表达量降低了32.07%(P<0.05)。IV组与II组相比,Villin、iFABP、KCNJ13、AQP10和MMP3的mRNA相对表达量均未有显著的变化。因此,说明待筛选添加剂NAC可缓解吲哚美辛诱导的肠道功能紊乱,保护仔猪的肠道功能,而Ala对吲哚美辛诱导的仔猪肠道功能紊乱并无改善作用。
综合上述各项测试结果,说明待筛选添加剂NAC对保护仔猪肠道功能有显著的积极作用,可选用为仔猪肠道功能保护剂;而待筛选添加剂Ala对保护仔猪肠道功能并无明显的作用,并不适合于作为仔猪肠道功能保护剂使用。也即,通过本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,可明确筛选出对仔猪肠道功能起到显著保护作用的肠道功能保护剂,也可以排除掉对仔猪肠道功能没有明显保护作用的添加剂,准确性高,针对性强。
综上所述,本发明提供的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,具有体内试验周期短的特点,并且采用腹腔注射吲哚美辛为仔猪肠道损伤模型,以仔猪平均日增重,血液DAO活力、以及D-木糖、iFABP和瓜氨酸水平,肠道病理学变化以及肠道villin、iFABP、MMP3、KCNJ13和AQP10基因的mRNA水平为肠道功能衡量指标,具有针对性强、结果准确、可重复性高的优点,能准确、快速地筛选出仔猪肠道功能保护剂,而且所筛选出来的肠道功能保护剂具有针对性强、稳定性好的特点,可有效替代抗生素,并降低仔猪肠道疾病的发生率、改善仔猪健康状况和提高其生长性能。
以上仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S10、将试验仔猪分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂,试验连续进行6天;
步骤S20、于试验第7天开始,在Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂后1h时,对Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射,对Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射,连续进行3天;
步骤S30、于试验第10天时,对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的所有试验仔猪进行禁食、但不断水处理8h后,称重并计算Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪对应的平均日增重;
步骤S40、对试验仔猪称重后,同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服,1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并测定血液指标;
步骤S50、血样采集2h后,对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品,观测肠道病理学变化,并检测肠道功能基因的mRNA水平,根据试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平,分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果,进而筛选出仔猪肠道功能保护剂。
2.如权利要求1所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,其特征在于,在步骤S10中:
Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂的剂量为每千克体重10~50mg,每日一次;
Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水的剂量为每千克体重10~50mg,每日一次。
3.如权利要求2所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,其特征在于,步骤S10包括:
步骤S11、选取健康良种仔猪于7日龄断奶,用人工乳喂养,作为试验仔猪;
步骤S12、将7日龄的试验仔猪在代谢笼中代谢适应3天后,按照体重相近原则随机分为Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,设为试验第1天并开始试验;
步骤S13、试验过程中,使Ⅰ组和Ⅱ组口腔灌服生理盐水、Ⅲ组口腔灌服待筛选添加剂,连续进行6天。
4.如权利要求1或2任意一项所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,其特征在于,在步骤S20中:
Ⅱ组和Ⅲ组进行吲哚美辛腹腔注射的注射量为每千克体重5mg;
Ⅰ组进行生理盐水腹腔注射的注射量为每千克体重5mg。
5.如权利要求1所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,其特征在于,在步骤S40中:D-木糖口腔灌服的剂量为每千克体重100mg。
6.如权利要求5所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,其特征在于,步骤S40具体包括:
对试验仔猪称重后,同时对Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组进行D-木糖口腔灌服,1h后对应采集Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的血样并分离血清,测定血液指标;
其中,所述血液指标包括血液中二胺氧化酶活力、以及D-木糖、肠脂肪酸结合蛋白和瓜氨酸水平。
7.如权利要求1或6任意一项所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,其特征在于,步骤S50包括:
步骤S51、血样采集2h后,对所有试验仔猪进行戊巴比妥酸钠肌肉注射,使试验仔猪麻醉后,屠宰试验仔猪并对应取Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的小肠样品;
步骤S52、将小肠样品制作为肠道组织切片,观测肠道病理学变化;同时刮取肠道黏膜样品,检测肠道功能基因的mRNA水平;
步骤S53、根据Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组试验仔猪的平均日增重、血液指标、肠道病理学变化以及肠道功能基因的mRNA水平,分析待筛选添加剂对试验仔猪肠道功能的保护效果,进而筛选出仔猪肠道功能保护剂;
其中,所述肠道功能基因包括绒毛素、肠脂肪酸结合蛋白、基质金属蛋白酶、钾离子通道以及水通道蛋白。
8.如权利要求7所述的仔猪肠道功能保护剂的筛选方法,其特征在于,在步骤S51中:戊巴比妥酸钠肌肉注射的注射量为每千克体重100mg。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711498038.6A CN108051553A (zh) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | 一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711498038.6A CN108051553A (zh) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | 一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108051553A true CN108051553A (zh) | 2018-05-18 |
Family
ID=62129846
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201711498038.6A Pending CN108051553A (zh) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | 一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108051553A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109105665A (zh) * | 2018-09-05 | 2019-01-01 | 山东大学 | 一种筛选大菱鲆饲料保护剂的方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1254285A (zh) * | 1997-04-29 | 2000-05-24 | 里克特格登化工有限公司 | 透明质酸锌抗消化性溃疡的应用 |
WO2006109881A1 (en) * | 2005-04-12 | 2006-10-19 | Sucampo Ag | Combined use of prostaglandin compound and proton pump inhibitor for the treatment of gastrointestinal disorders |
CN103494851A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-08 | 邬建明 | 一种胃舒欣制剂的制备方法 |
CN104031883A (zh) * | 2014-05-16 | 2014-09-10 | 浙江大学 | 抗菌肽c-bf保护小鼠溃疡性结肠炎模型 |
CN105434451A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-03-30 | 海南医学院 | 两个用于治疗胃溃疡疾病的黄酮类化合物 |
-
2017
- 2017-12-29 CN CN201711498038.6A patent/CN108051553A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1254285A (zh) * | 1997-04-29 | 2000-05-24 | 里克特格登化工有限公司 | 透明质酸锌抗消化性溃疡的应用 |
WO2006109881A1 (en) * | 2005-04-12 | 2006-10-19 | Sucampo Ag | Combined use of prostaglandin compound and proton pump inhibitor for the treatment of gastrointestinal disorders |
CN103494851A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-08 | 邬建明 | 一种胃舒欣制剂的制备方法 |
CN104031883A (zh) * | 2014-05-16 | 2014-09-10 | 浙江大学 | 抗菌肽c-bf保护小鼠溃疡性结肠炎模型 |
CN105434451A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-03-30 | 海南医学院 | 两个用于治疗胃溃疡疾病的黄酮类化合物 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
乔雪静: "海参肠对吲哚美辛诱导的大鼠胃黏膜损伤的保护作用及机制探讨", 《青岛大学硕士学位论文》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109105665A (zh) * | 2018-09-05 | 2019-01-01 | 山东大学 | 一种筛选大菱鲆饲料保护剂的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Grounds et al. | Towards developing standard operating procedures for pre-clinical testing in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy | |
Allred et al. | The vermicelli handling test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats | |
Inoue et al. | Genetic parameters for fatty acid composition and feed efficiency traits in Japanese Black cattle | |
Trusell et al. | Compositional and instrumental firmness variations within fresh pork bellies | |
Mamun et al. | Biochemical analysis of blood of native cattle in the hilly area of Bangladesh | |
Schubach et al. | Impacts of stocking density on development and puberty attainment of replacement beef heifers | |
CN109072186A (zh) | 利用前列腺素e2进行肌肉再生的组合物和方法 | |
Juárez et al. | Quantifying the relative contribution of ante-and post-mortem factors to the variability in beef texture | |
Bossen et al. | Allocation of feed based on individual dairy cow live weight changes: II: Effect on milk production | |
CN108051553A (zh) | 一种仔猪肠道功能保护剂的筛选方法 | |
Martin et al. | Progeny of high muscling sires have reduced muscle response to adrenaline in sheep | |
Carta et al. | Understanding the phenotypic and genetic background of the lactose content in Sarda dairy sheep | |
Hannigan et al. | Altered grooming responses to stress in rats exposed prenatally to ethanol | |
CN104142384B (zh) | 一种筛选具有保护或改善肾功能活性化合物的方法 | |
Hubner et al. | A randomized controlled trial examining the effects of treatment with propylene glycol and injectable cyanocobalamin on naturally occurring disease, milk production, and reproductive outcomes of dairy cows diagnosed with concurrent hyperketonemia and hypoglycemia | |
CN111926071A (zh) | 一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物及其在改善健康衰老中的应用 | |
CN107737138B (zh) | 一种环境污染物对记忆损害动物模型的建立方法 | |
CHU et al. | Inhibition effects of hypoxia on embryonic development and erythropoiesis in zebrafish | |
Cobb et al. | Nephron-deficient HSRA rats exhibit renal injury with age but have limited renal damage from streptozotocin-induced hyperglycemia | |
Madureira et al. | Association between genomic daughter pregnancy rate and expected milk production on the resumption of estrus behavior in Holstein cattle | |
CN116784253B (zh) | 一种鉴定癫痫动物模型皮层兴奋性异常的方法和应用 | |
Markel | Characterizing Effects of Management Strategy and Degree of Pulmonary Hypertension on Live Growth Performance, Carcass Quality, and Respiratory Microbiome of Finishing Beef Cattle | |
Tolomeiu et al. | The relevance of a metabolic profile analysis in the protocol of testing the bioequivalence of antihelmintic products on sheep | |
Li et al. | Effect of water temperature on the recovery of spinal cord injury in zebrafish | |
Johanns | Unravelling the role of miRNAs and its potential as Biomarker in a SARA animal model |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180518 |