CN108048444A - 一种微胶囊微生物型时间温度指示器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微胶囊微生物型时间温度指示器及其制备方法，目的在于提供一种稳定的、小巧的、可应用的微生物型TTI制作方法。先制作包含微生物的W/O乳液；使用氯化钙溶液对乳液系统中的微胶囊进行固定；经过静置分离后收集微胶囊并清洗；将制得的微胶囊按比例移入基质；充分混合后按定量将TTI液体移入特殊定制容器并密封保存。微生物型TTI的应用要求简单的线性响应动力学方程及小巧的外观，本方法提供了一种有效地解决其应用问题的方法，优化了微生物型TTI的响应，提高了微生物型TTI容器的可用性。

Description

一种微胶囊微生物型时间温度指示器及其制备方法

技术领域

本发明涉及智能包装技术领域，特别是涉及一种微胶囊的微生物型时间温度指示器及其制备方法。

背景技术

食品质量与安全与人们的健康息息相关，因此应对其进行严密的检测。通常来说，温度是决定食品的新鲜度与货架寿命的主要变量。最近，一种新型的、可以测量单个食品温度历程的方法成为现实，即时间温度指示器(Time-temperature integrator，TTI)。TTI根据时间温度历程会产生可见的变化，如颜色、外形等，以此来解决对于单个食品质量预测的误差较大的问题。

TTI是一种轻盈小巧、成本低廉的设备，通过简单的方法以及不可逆的变化，向消费者即时展示食品的质量变化。根据反应机理，TTI主要分为生物型、化学型及物理型。其中，微生物型TTI的反应时间是基于特定菌株与基质的反应而决定的，这种反应会改变反应系统的pH值，并在特定pH指示剂的作用下产生颜色变化。由于食品的质量变化与腐败多数是由微生物的生长导致，因此微生物型TTI相比较其他的TTI，能够更加贴切地表示出食品的质量变化。

采用SPG(Shiraus porous glass)膜技术对微生物进行微胶囊化，可使得到的微胶囊具有粒径分布集中的特点。微胶囊大小相同，则意味着每个微胶囊包裹的微生物数量相同，也就是说，在放入相同质量的微胶囊时，微生物TTI的活化能以及反应时间都是一致的。这极大有利于微生物TTI的应用。若将微生物直接放入基质中，由于微生物本身的生长以及发酵过程，响应曲线往往是非线性的，分析起来非常复杂，这种情况下会导致预测模型精度下降。而使用微胶囊技术处理后，微生物本身的生长受到抑制，只进行发酵作用，此时的响应是线型的，对于后续预测模型的建立以及精度的提高都有非常大的作用。

但是目前采用SPG技术制备微生物型时间温度指示器用微胶囊时，存在HLB值不匹配、生成乳液不稳定、后续分离步骤复杂、失败率高的问题，因此本申请需要进一步的开发研究。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种微胶囊微生物型时间温度指示器及其制备方法。本方法改进了SPG技术制作微生物微胶囊的步骤，创新了微生物型TTI的容器，从而制作反应稳定、应用简单的微生物型TTI。

本发明的技术方案如下：

一种微胶囊微生物型时间温度指示器的制备方法，包括以下步骤：

(1)使用SPG技术，包裹Weissella cibaria CIFP 009菌，制作W/O乳液；

(2)在生物洁净工作台中，将制作完毕的W/O乳液倾入浓度为0.1N的氯化钙溶液中，对微胶囊进行固定；

(3)在生物洁净工作台中，将混合液倒入1L容量的分液漏斗中，密封后移入震荡机震荡10分钟，而后静置分离，将由下层得到的微胶囊使用经过杀菌的蒸馏水进行清洗5-6次后，于4℃进行保存；

(4)制作微生物型TTI时，在生物洁净工作台中，使用0.1N的氢氧化钠将基质的pH调整至7.0，而后将保存的微胶囊按w:v为1:2的比例移入营养基质；

(5)在生物洁净工作台中，将微生物型TTI充分混合，移入提前经过紫外线杀菌的定制容器中，并将整个TTI系统密封，微生物型TTI即制作完成。

所述步骤(1)的微生物W/O乳液的制备步骤如下：

在生物洁净工作台中将经过灭菌的SPG膜缓缓放入连续相石蜡油中，密封后用超声波处理30分钟，保证充分浸润；

将Weissella cibaria CIFP 009菌细胞悬液5ml移入保持在35℃的海藻酸钠溶液中，充分均匀混合后放入SPG机器的分散相罐中；

将经超声波处理的膜安装到SPG设备上，后将石蜡油倒入连续相罐中；

将SPG设备的搅拌器调至60rpm/min，氮气压强调至15kPa，而后开始乳化作业；

乳化结束后在低速下再搅拌30分钟，稳定生成的W/O乳液。

所述步骤(4)的营养基质包含：以水为溶剂，分别加入MRS琼脂培养基、终浓度为4％w/v的葡萄糖、终浓度为15％w/v的甘油以及终浓度为10％v/v的指示剂；其中指示剂由终浓度分别为0.04％w/v的溴甲酚紫、0.05％w/v的溴甲酚绿与0.1％w/v的甲基橙溶解于95％v/v的乙醇溶液中制得。

所述步骤(5)的定制容器，底面为PVC贴纸，使用时直接撕下粘贴在指示食品上；其容器为特殊形状的双面胶，中央有20mm×20mm的空间穿孔，贴在PVC贴纸上后形成可容纳微生物型TTI的空间；微生物型TTI制作完毕后使用LDPE塑料薄膜密封整个微生物型TTI系统。

所述Weissella cibaria CIFP 009菌来自于the Center for IntelligentAgro-Food Packaging，Seoul，Korea。

本发明有益的技术效果在于：

本发明在进行微胶囊的制作时，优化了所用原材料及制作步骤，例如连续相采用了透明的石蜡油而非浅黄色的大豆油，对以颜色来进行质量指征的微生物型TTI来说更加适用，并在其中加入2％的表面活性剂Span 80(w/v)。常规方法中W/O乳液完成后加入氯化钙溶液中的步骤非常繁琐，且稳定性不好，本申请进行了一系列尝试，最终获得了既简便又优化的制备方法。

本发明TTI的容器是底面是PVC贴纸，制作完成后可以直接撕下贴到产品上，有极强的应用性。容器本身是双面胶，可以贴在底面贴纸上，TTI移入完毕后上层可以贴密封膜，非常方便，且很小巧。

附图说明

图1为本发明微生物型TTI的结构图；

图2为检测例中微生物型TTI的颜色变化图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

实施例1：制备微生物型TTI

(1)获得Weissella cibaria CIFP 009菌细胞悬液：从冷库中将菌株(1mL)取出，融化后使用10mL的MRS培养液进行隔代培养至少两次。将隔代培养后的营养液均质，将100μl的细胞悬浮液移液至25mL的MRS培养液中，如此制作4个。经过18h，37℃的培养后，采用离心分离(5050×g,10min,4℃)取得菌株。将离心分离的菌种用经过杀菌的蛋白胨水进行三次清洗。

(2)获得包裹微生物的微胶囊，准备试剂及设备如下：

2％(w/v)，100ml的海藻酸钠溶液；

2％(w/v)，100ml的石蜡油，其中表面活性剂使用span 80；

400ml，1M的氯化钙溶液；

300ml的缓冲蛋白胨水；

500ml的蒸馏水；

SPG设备(分散相罐，膜，连续相罐，连接铰链等)；

Falcon tube 6个；

分液漏斗1个；

500ml烧杯1个。

除菌种外，所有的材料及设备使用前均需经过15min，121℃的高温高压杀菌。于实验前2小时需打开SPG设备的灭菌灯进行紫外线灭菌。制作步骤如下：

在生物洁净工作台中将经过灭菌的SPG膜缓缓放入连续相(石蜡油)中，密封后用超声波处理30分钟，保证充分浸润；

将Weissella cibaria CIFP 009菌细胞悬液5ml移入保持在35℃左右的海藻酸钠溶液中，充分均匀混合后放入SPG机器的分散相罐中。

将经超声波处理的膜安装到SPG设备上，后将石蜡油倒入连续相罐中。

将SPG设备的搅拌器调至60rpm/min，氮气压强调至15kPa，而后开始乳化作业。

乳化结束后在低速下再搅拌30分钟，稳定生成的W/O乳液；

在生物洁净工作台中，将使用SPG技术制作完毕的W/O乳液倾入浓度为0.1N的氯化钙溶液中，对微胶囊进行固定；

在生物洁净工作台中，将混合液倒入1L容量的分液漏斗中，密封后移入震荡机震荡10分钟，而后静置分离，将由下层得到的微胶囊使用经过杀菌的蒸馏水进行清洗5-6次后，于4℃进行保存。

(3)获得微生物型TTI：在生物洁净工作台中，使用0.1N的氢氧化钠将基质的pH调整至7.0，而后将保存的微胶囊按1:2(w:v)的比例移入营养基质，营养基质由MRS琼脂培养基(de Man,Rogosa and Sharpe,Difco,Detroit,MI,USA)、终浓度为4％(w/v)葡萄糖、终浓度为15％(w/v)甘油以及终浓度为10v/v％的指示剂组成，其中指示剂由终浓度分别为0.04％的溴甲酚紫、0.05％的溴甲酚绿与0.1％的甲基橙溶解于95％v/v的乙醇溶液中制得。

实施例2：微生物型TTI整合至定制容器中

如图1所示，本申请提供的承载微生物型TTI的容器的底板为PVC贴纸1，该贴纸具有粘胶的一面是将来贴到待检测样品上的；该贴纸没有粘胶的一面贴上双面胶2；该双面胶2中间有孔，当与贴纸1贴合以后，中间的孔是盛装微生物型TTI 3的。将微生物型TTI 3装入孔中以后，在双面胶2的上面贴上透明薄膜4，薄膜4完全覆盖微生物型TTI 3及其边缘；薄膜4可以采用LDPE材料。

具体的制备方法为：在生物洁净工作台中，将微生物型TTI移入提前经过2小时紫外线杀菌的特殊定制容器中。其底面的PVC贴纸1在使用时可直接撕下粘贴在指示食品上，PVC贴纸1上覆盖的双面胶2中央的空间穿孔可以为20mm×20mm大小，贴在PVC贴纸1上后形成可容纳微生物型TTI 3的空间，微生物型TTI 3移入并凝固后，使用LDPE塑料薄膜4密封整个微生物型TTI系统，即制作得到微生物型时间温度指示器。

检测例1：

制备完毕的微生物型时间温度指示器应于零下35℃保存，使用时，将微生物型时间温度指示器从冷库中取出并贴到酸奶容器上，不需要撕掉上层的塑料薄膜层，即已经激活，并分别于5、15、25℃下观察，微生物型TTI从激活至反应终点的颜色变化如图2所示。左边第一幅图是微生物TTI激活时的状态，为深绿色，而后颜色随着时间推移由深绿、草绿、黄绿、深黄，一直变化至浅黄色，即第五幅图，为反应终点，当颜色为深绿色时，表示食品新鲜，而当颜色变化至浅黄色，则警示消费者食品已过期，不得食用。

检测例2：

本发明采用了石蜡油作为乳液制备中的连续相，这种油无色无味，比豆油等本身具有颜色的油脂更加适合制作以颜色为指标的微生物型TTI。本发明采用Span 80作为表面活性剂进行W/O乳液的制备，这种组合由于更加接近的HLB值，因此能够生成更加稳定的W/O乳液。本发明采取将乳液直接倾倒入两倍体积的氯化钙溶液中、而后进行震荡的做法，比传统的将氯化钙溶液缓慢滴入乳液、并需要不断搅拌、小心操作的做法，更加简便且成功率高。

在实际操作中，本方法具有较高的精度，通过颜色变化，直观、实时地向消费者表示出单一食品的质量状态，以保证食品安全，同时优化食品供应链，减少统一的货架期所造成的食品浪费。本发明较好地解决了微生物型TTI使用过程中的可操作性和稳定性问题，具有一定的通用性，当指示食品发生改变，只需改变配方中原料配比即可应用于其他食品，以适应不同的应用需求。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定。在本发明设计精神和原则之内，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的任何修改和改进，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种微胶囊微生物型时间温度指示器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)使用SPG技术，包裹Weissella cibaria CIFP 009菌，制作W/O乳液；

(2)在生物洁净工作台中，将制作完毕的W/O乳液倾入浓度为0.1N的氯化钙溶液中，对微胶囊进行固定；

(3)在生物洁净工作台中，将混合液倒入1L容量的分液漏斗中，密封后移入震荡机震荡10分钟，而后静置分离，将由下层得到的微胶囊使用经过杀菌的蒸馏水进行清洗5-6次后，于4℃进行保存；

(4)制作微生物型TTI时，在生物洁净工作台中，使用0.1N的氢氧化钠将基质的pH调整至7.0，而后将保存的微胶囊按w:v为1:2的比例移入营养基质；

(5)在生物洁净工作台中，将微生物型TTI充分混合，移入提前经过紫外线杀菌的定制容器中，并将整个TTI系统密封，微生物型TTI即制作完成。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的微生物W/O乳液的制备步骤如下：

在生物洁净工作台中将经过灭菌的SPG膜缓缓放入连续相石蜡油中，密封后用超声波处理30分钟，保证充分浸润；

将Weissella cibaria CIFP 009菌细胞悬液5ml移入保持在35℃的海藻酸钠溶液中，充分均匀混合后放入SPG机器的分散相罐中；

将经超声波处理的膜安装到SPG设备上，后将石蜡油倒入连续相罐中；

将SPG设备的搅拌器调至60rpm/min，氮气压强调至15kPa，而后开始乳化作业；

乳化结束后在低速下再搅拌30分钟，稳定生成的W/O乳液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的营养基质为以水为溶剂，分别加入MRS琼脂培养基、终浓度为4％w/v的葡萄糖、终浓度为15％w/v的甘油以及终浓度为10％v/v的指示剂；其中指示剂由终浓度分别为0.04％w/v的溴甲酚紫、0.05％w/v的溴甲酚绿与0.1％w/v的甲基橙溶解于95％v/v的乙醇溶液中制得。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的定制容器，底面为PVC贴纸，使用时直接撕下粘贴在指示食品上；其容器为特殊形状的双面胶，中央有20mm×20mm的空间穿孔，贴在PVC贴纸上后形成可容纳微生物型TTI的空间；微生物型TTI制作完毕后使用LDPE塑料薄膜密封整个微生物型TTI系统。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Weissella cibaria CIFP 009菌来自于the Center for Intelligent Agro-Food Packaging，Seoul，Korea。