CN107952073B - 一种延长血小板体外保存时间的肽产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种调节血小板活性的药物组合物、试剂盒、其筛选方法和在预防或治疗血栓性血小板减少性紫癜等血小板生存期缩短相关疾病以及延长血小板体外保存时间中的应用。其中本发明公开了一种抑制血小板线粒体自噬的药物组合物，其可以抑制血小板中FUNDC1与LC3相互作用，抑制血小板线粒体自噬，保持血小板的活性，包括具有FUNDC1的LIR结构域的可穿膜寡肽。特别地，本发明还涉及一种以线粒体FUNDC1和LC3相互作用为靶点的药物筛选方法，通过所述方法可筛选出能够抑制FUNDC1和LC3相互作用并调节线粒体自噬和血小板活性的药物，该药物用于预防或治疗血栓性血小板减少性紫癜等血小板生存期缩短相关疾病或延长血小板体外保存时间，具有良好的临床应用前景。

Description

一种延长血小板体外保存时间的肽产品
技术领域
本发明属于血液病学范畴和生物制造领域，涉及调节血小板活性和延长血小板体外保存时间的药物和药物筛选方法。本发明还涉及该药物在保护血小板活性和延长血小板体外保存时间中的用途。
背景技术
线粒体是控制细胞能量代谢的重要的细胞器，也是细胞凋亡的调控中心，在凋亡因子的刺激下线粒体通过释放细胞色素C等凋亡相关分子来启动细胞凋亡过程。同时，线粒体也是细胞自由基产生中心。鉴于线粒体在细胞生命活动中的这些重要作用，受损伤的或不需要的线粒体必须被有效清除，以保证细胞正常生命活动的进行。线粒体自噬(Mitophagy)就是这样一种通过自噬机制选择性清除受损伤或不必需的线粒体的过程。线粒体自噬还可能参与红细胞(哺育动物红细胞没有细胞核和线粒体)的发生和成熟过程。线粒体自噬的异常也可能与神经退行性疾病，糖尿病和肿瘤的发生有密切关系。
线粒体上存在几种蛋白质受体，包括酵母Atg32以及哺乳动物系统 NIX/BNIP3L、BNIP3和FUNDC1，都在线粒体自噬中直接发挥作用。 NIX/BNIP3L、BNIP3和FUNDC1通过LC3互作区域(LIR)直接结合 LC3(哺乳动物中Atg8同系物)进而激活线粒体自噬。
FUNDC1，一个新的介导哺乳动物细胞线粒体自噬的受体分子，它定位在线粒体外膜上，并通过特有的LIR保守的结构域与自噬的关键分子LC3相互作用来介导低氧诱导的线粒体自噬。此前的研究显示，LC3 与线粒体自噬受体FUNDC1之间存在重要的相互作用，后者存在一个 LC3相互作用区(LIR)，这一相互作用对于线粒体自噬选择性过程必不可少。LIR保守结构域的突变或缺失能够抑制其与LC3的相互作用和线粒体自噬。深入的研究还表明Fundc1的磷酸化在线粒体自噬调控中发挥了关键作用。
循环血液中的血小板是包含线粒体、内质网、溶酶体等细胞器的无核血细胞。血小板是参与止血、血栓形成、特别是动脉血栓形成的主要有形成份。近几年的研究发现，血小板作为起源于巨核细胞的一种无核细胞，同样表达死亡受体、半胱氨酸蛋白酶caspases及Bcl-2蛋白家族等凋亡调控蛋白，可发生凋亡，血小板寿命降低。现有国内外临床上只是从抑制血小板凋亡的角度提高血小板体外保存时间。
目前，针对线粒体自噬和血小板功能之间的报道并不多见，曾报道过抑制细胞自噬性降解会减弱血小板的聚集和粘附功能，申请号为 CN200780033800.1中曾公开了多种增强或保持血小板的生存能力或寿命期的方法，该方法包括施用对细胞凋亡进行负调控的制剂。但对血小板中线粒体自噬的调控的药物用于血小板体外储存期或调控血小板活性的应用未见报道，且由于线粒体自噬和血小板生存期的现象和分子机制未知，因此通过调控细胞线粒体自噬，筛选影响血小板体外储存期或血小板活性的药物，将有利于开发具有临床应用价值的新型药物。
发明内容
基于以上问题，本发明研究发现，在血小板发生凋亡前，血小板功能特别是其线粒体功能都已发生了功能障碍，导致血小板功能大大降低，进而引起其储存期大大缩短。因此，本发明从另一全新角度提高血小板的体外保存质量和时间，大大提高医用血小板体外储存期和保护血小板活性。
本发明一方面公开了一种保持或调节血小板活性的药物组合物，其中，所述药物组合物包括能抑制血小板线粒体自噬的药物和药学上可接受的载体。
所述能抑制血小板线粒体自噬的药物包括肽、抗体或小分子化合物。
优选地，所述的药物能抑制FUNDC1与LC3相互作用。
所述的肽包括FUNDC1的LIR结构域Y18xxL21，优选地，所述的肽包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70％、 75％、80％、85％、90％以上的同源性或与之相同的肽，
SEQ ID NO:1QDYESDDDSYEVLDLTE；
SEQ ID NO:2QDYESDDESYEVLDLTE。
本发明中，所述的肽还包括穿膜糖蛋白寡肽或其修饰物、衍生物。
所述的穿膜糖蛋白寡肽优选为HIV-1TAT、penetratin、MAP、 transportan/T10、VP22、polyarginine、MPG、PEP-1、pVEC、YTA2、 YTA4、M918或CADY。
优选地，所述的肽包括与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％以上的同源性或与之相同的肽，
SEQ ID NO:3
GRKKRRQRRRPQDYESDDDSYEVLDLTE；
SEQ ID NO:4
GRKKRRQRRRPQDYESDDESp-YEVLDLTE。
本发明中，所述的肽还包括哺乳动物来源的，优选地包括LIR基序第9个至第25个氨基酸残基。
更优选地，所述的肽是非磷酸化的。
本发明第二方面公开了一种调节血小板活性的试剂盒，其中，所述试剂盒包括能抑制血小板线粒体自噬的药物和药学上可接受的试剂盒组件，所述药物优选包括如前所述的药物，优选地，所述试剂盒用于延长血小板体外保存时间。
本发明第三方面公开了治疗或预防血小板生存期缩短相关疾病或延长血小板体外保存时间的方法，包括施与能抑制血小板线粒体自噬的药物，所述的药物优选如前所述的药物。
所述血小板生存期缩短相关疾病优选血栓性血小板减少性紫癜、血小板破坏增多性疾病、血小板消耗过多性疾病、血栓性疾病、癌症、胰腺炎、神经退行性疾病、炎症性疾病、感染疾病或细胞内病原体引起的感染
本发明第四方面公开了诊断血小板生存期缩短相关疾病的方法，优选采用能够检测FUNDC1和LC3之间相互作用的试剂，优选所述试剂检测FUNDC1的LIR的磷酸化，所述血小板生存期缩短相关疾病优选血栓性血小板减少性紫癜、血小板破坏增多性疾病、血小板消耗过多性疾病、血栓性疾病、癌症、胰腺炎、神经退行性疾病、炎症性疾病、感染疾病或细胞内病原体引起的感染。
本发明第五方面公开了筛选治疗或预防血小板生存期缩短相关疾病的药物的方法，其中，所述筛选方法包括测试候选药物调节血小板线粒体自噬和血小板活性，优选测试候选药物抑制血小板中FUNDC1和LC3 之间相互作用或抑制AMPK激活的活性，优选所述方法是体外实施的。
本发明还公开了以上药物组合物或筛选方法获得的药物。
发明的有益效果
本发明的有益效果在于本发明所述的肽可特异性地抑制血小板中 FUNDC1与LC3相互作用和线粒体自噬，保护血小板活性和延长血小板体外储存时间。它们具有良好的药物开发潜力。其中，所述肽分子量较小，对哺乳动物的免疫原性低，可直接用于哺乳动物上。该分子结构稳定，易于合成与纯化，可大量生产，具有广阔的产业化前景。
附图说明
图1示出Fundc1基因敲除小鼠的构建和鉴定
(a)Fundc1基因敲除小鼠的构建方案。(b)使用PCR和免疫印记实验对 Fundc1基因敲除小鼠进行鉴定。(c,d)血细胞技术分析。(e)使用噻唑橙处理，用流式细胞仪分析网织红细胞。(f)脾形态。
图2示出缺氧会导致体内血小板中FUNDC1-依赖性的线粒体自噬 (a)在缺氧环境中(8％氧浓度)分别处理Fundc1基因敲除小鼠和野生型小鼠72小时，收集经处理后的小鼠血小板，利用免疫印记实验检测自噬分子标记物蛋白(每一基因型中有28只小鼠)。(b)使用电镜(TEM) 检测线粒体的自噬。比例尺：500nm。(c)来源于缺氧处理小鼠的血小板中的FUNDC1和LC3之间的免疫共沉淀结果。(d,e)使用cre重组技术产生的特异性Fundc1基因敲除小鼠和同窝对照小鼠分别在缺氧环境 (8％氧浓度)下处理72小时，收集处理后的小鼠血小板。经处理的血小板用免疫印记实验(d)和FUNDC1和LC3之间的免疫共沉淀实验(e) 进行分析(每一基因型中有15只小鼠)。(f)血小板特异性基因Atg5敲除小鼠和同窝野生型小鼠分别在缺氧环境(8％氧浓度)中处理72小时，收集处理后的小鼠血小板。利用免疫印记实验检测自噬分子标记物蛋白 (每一基因型中有9只小鼠)。
图3示出缺氧导致的自噬决定了体内线粒体的功能和质量 (a,b)P1是模拟非磷酸化的FUNDC1的LIR结构域 (GRKKRRQRRRPQDYESDDESYEVLDLTEY)，P2是模拟磷酸化的 FUNDC1的LIR结构域(GRKKRRQRRRPQDYESDDESpYEVLDLTEY)。在8％氧浓度的缺氧环境下连续3天每天向Fundc1基因敲除小鼠和野生型小鼠分别注射具有膜透性的P1和P2(1mg/kg)。从经处理的小鼠中分离得到血小板，采用免疫印记实验(a)检测自噬相关分子标记蛋白，采用免疫共沉淀实验 (b)检测FUNDC1和LC3之间的相互作用。(c,d)经线粒体抑制剂(0.25 μM寡霉素，5μM三氟甲氧苯腙羰基氰化物FCCP，1μM鱼藤酮和抗霉素)处理后，使用Seahorse检测经(a)描述方法处理得到的血小板的氧耗速率(OCR)。(c)示出典型的氧耗速率曲线。根据产品说明书进行相应实验，并对线粒体的氧耗速率与血小板数目的比率进行定量分析(d)。 (e)采用购自Sigma的试剂盒，依照说明书步骤检测ATP水平。(f)在 37℃条件下，使用NAO(20nM)染色30分钟，通过流式细胞术检测线粒体的质量。(g)使用TMRE并通过流式细胞术分析线粒体的膜电位。(h) 使用DCF染色并通过流式细胞术分析ROS水平。定量结果为三次重复实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。
图4示出FUNDC1参与的自噬可以调节血小板的聚集和分散 (a-d)在8％氧浓度的缺氧环境下连续3天每天向Fundc1基因敲除小鼠和野生型小鼠注射1mg/kg具有膜透性的肽。从经处理的小鼠中分离得到血小板，在37℃的温度和每分钟1000转的搅拌速度下用0.05U/ml凝血酶(a,b)或10μM ADP(c,d)分别刺激血小板后，用浊度仪(货号Precil LBY-NJ,购自辛普森，北京，中国)分析血小板的凝聚(样本数n＝16)。 (e)采用免疫印记检测血小板体内自噬情况，条带如图所示。(f,g,h,i)小鼠经上述方法处理，血小板用0.05U/ml的α-凝血酶(f,g)或10μM的 ADP(h,i)刺激，并置于用30μg/ml血管性血友病因子(VWF)包被的盖玻片上孵育60分钟(37℃)。固定和透化后，经预处理的血小板与Alexa Fluor 633结合的鬼笔环肽共孵育，在共焦显微镜(63×物镜)(货号 LSM510，购自Lab-Tek MicroImaging公司)下进行分析。各组中至少有 96个血小板被分析。图中显示的是代表性图。定量结果为三次重复实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。比例尺：10μm。
图5示出Fundc1缺陷不影响ABT737诱导的血小板凋亡 (a,b)野生型和F1KO缺失的血小板在10μM的ABT737的处理下37℃孵育60分钟。通过流式细胞仪和使用Annexin V-FITC抗体对经预处理的血小板中的磷脂酰丝氨酸进行分析。统计数据如(b)所示。(c,d,e,f) 用流式细胞术(c,d)和免疫印记(e)检测Caspase-3的活化水平，用 caspase-3活性检测试剂盒分析caspase-3活性(f)。
图6示出自噬调节AMPK激活，继而导致血小板功能丧失 (a)Fundc1基因敲除小鼠和野生型小鼠在8％氧浓度的缺氧环境中分别处理72小时。从经处理的小鼠中制备出血小板，并使用指定抗体、采用免疫印记方法检测AMPK的激活水平(每一基因型中有13只小鼠)。(b)在 8％氧浓度的缺氧环境下连续3天每天向小鼠注射1mg/kg具有膜透性的肽(P1，P2)。从经处理的小鼠中分离得到血小板，用0.05U/ml凝血酶进一步诱导血小板10分钟，用免疫印记检测自噬和AMPK的激活水平。 (c)在缺氧处理之前，小鼠被注射了AMPK抑制剂compound C。从 compound C处理过的小鼠体内分离得到血小板，用0.05U/ml凝血酶进一步激活血小板10分钟，然后用免疫印记进行分析。(d)离体洗涤过的血小板与compound C预孵育，然后缺氧刺激2小时，处理后的血小板用0.05U/ml凝血酶进一步激活10分钟，用免疫印记进行分析。(e,f) 血小板与compound C预孵育后，分析血小板的聚集。定量结果为三次重复实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。
图7示出线粒体数量和AMPK信号对于血小板体外储存的影响 (a)将血小板储存于22℃，经过不同时间后检测血小板自噬相关分子标记蛋白的表达水平。(b)采用免疫共沉淀检测血小板经过体外储存3天后FUNDC1和LC3之间的相互作用。(c,d)血小板经过P1(c)或compound C(d)预处理后检测自噬分子标记蛋白的表达水平。(e,f)在不同时间点检测经体外储存的血小板线粒体氧消耗率(e)和ATP产生水平(f)。(g,h)在经体外储存血小板中检测血小板聚集情况。定量结果为三次重复实验的平均值±SD。(i)缺氧下的线粒体自噬如何调节血小板激活的模型图。压力条件如缺氧、延长储存时间和膜电位降低以及 FUNDC1缺失都会激活AMPK和抑制血小板激活，其中用P1肽和 compound C处理野生型的血小板或处理体外储存的血小板会保护血小板活性。*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。
如本文中所使用，术语“肽”指是指包含通过肽键或变形肽键彼此连接的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。“肽”包括短链(通常指称作肽、寡肽和寡聚体)和长链(通常称作蛋白质)。肽可以包含20个基因编码氨基酸之外的氨基酸。“肽”包括通过自然过程(例如加工和其它的翻译后修饰)和通过化学修饰技术修饰的肽。这些修饰在基础文献里和更加详细的专题论文中以及大量的研究文献中进行了很好的描述，且是本领域技术人员公知的。应当理解的是相同类型的修饰在给定肽的几个位点上可以以相同或不同的程度存在。另外，给定的肽可以包含多种类型的修饰。修饰可以发生在肽中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端。修饰包括，例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊二烯化、消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP- 核糖基化、硒基化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的蛋白质的氨基酸添加(例如精氨酰化)和泛素化。例如，在本发明中，“肽”可指能够特异性抑制FUNDC1与LC3相互作用，包括一种穿膜糖蛋白寡肽或其修饰物/衍生物。
如本文中所使用，术语“小分子化合物”指代一种分子量小于3千道尔顿的有机化合物，该有机化合物可以是天然的或者是化学合成的。例如，本发明中，“小分子化合物”是指能抑制线粒体自噬的有机化合物，或其衍生物和类似物。本发明所用术语“衍生物”是指通过一种或多种化学反应对母体有机化合物进行修饰所产生的化合物，其与母体有机化合物具有相似的结构，在功能上具有相似的效果。本发明所用术语“类似物”则是指这样一类有机化合物，其并不一定是通过对母体有机化合物进行化学修饰而获得的，但其从结构上看与母体有机化合物相似，且在功能上也具有相似的效果。
如本文中所使用，术语“抗体”指代是指结合特定表位的任何免疫球蛋白或完整分子以及其片段。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。所述抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、以及完整抗体的片段和/或部分，只要这些片段或部分保留亲本抗体的抗原结合能力。
本发明所用的术语“治疗”是指逆转、减轻或抑制该术语所应用的疾病的进展，或疾病的一种或多种症状。如本文所使用的，根据患者的状况，该术语也包括预防疾病，包括预防疾病或与其相关的任何症状的发作，以及减轻病症或其在发作前的任何病状的严重性。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
具体实施例：
实施例1缺氧促进体内血小板中FUNDC1依赖性的线粒体自噬
我们从桑格研究所(英国剑桥)获得Fundc1基因敲除小鼠(简称 F1KO小鼠)，并进行了相应的鉴定，证明其Fundc1基因敲除能力等(图 1a-b)。我们发现，Fundc1基因敲除小鼠同样拥有正常的血液和脾脏表型 (图1c-f)。接下来，我们将小鼠暴露于8％氧含量的缺氧环境下连续处理3天，然后分别从Fundc1敲除小鼠和野生型小鼠中分离得到血小板，用免疫印记法检测线粒体相关蛋白质的表达水平(其中，Tim23为线粒体外膜的分子标记物，Tom20为线粒体内膜的分子标记物)、p62的表达水平和LC3-II表达水平(p62和LC3-II是自噬的生化标志)。我们发现，从野生型小鼠中分离得到的血小板中，线粒体相关的蛋白质水平和p62的表达水平会伴随缺氧处理而显著性下降，而这些蛋白质的降解在Fundc1 基因敲除小鼠中却几乎被完全阻断(图2a)。此外，我们观察到野生型小鼠的血小板中FUNDC1蛋白和其磷酸化水平会随着低氧处理而降低。这些实验结果初步说明Fundc1参与了血小板中线粒体的自噬过程。
为了进一步证实这些现象是由于血小板自噬引起的变化，我们采用透射电子显微镜观察血小板中线粒体的形态，发现经缺氧处理的野生型小鼠血小板中，螯合线粒体双层膜中含有自噬膜结构(图2b)。然而，这种现象在相同的条件下处理得到的Fundc1敲除小鼠血小板中却没有观察到。
进一步，我们采用PF4-Cre-LoxP/FLP重组系统构建了的血小板的特异性基因敲除小鼠。Fundc1f/f和Fundc1-/-小鼠经缺氧处理，如在图2d和图2e中所示，在野生型小鼠中LC3-II水平相应增加，Tim23、Tom20和 P62的水平降低，而来源于血小板特异性Fundc1基因敲除小鼠的血小板中，其趋势是相反的。ATG5是自噬的主调节器，我们曾发现，FUNDC1 介导的自噬也需要ATG5的参与。由于ATG5的缺失会导致小鼠胚胎致死，所以我们采用PF4-Cre小鼠和Atg5FLOX/FLOX小鼠交配获得血小板中Atg5 基因特异性敲除。我们发现，在ATG5敲除的血小板中，缺氧并不能激活自噬(图2)。以上数据也说明，FUNDC1在调节小鼠血小板中缺氧诱导的自噬过程中是ATG5依赖性的。
实施例2缺氧导致的自噬决定了体内线粒体的功能和质量
我们合成了的可穿透膜的肽，用以模拟FUNDC1的LIR域的第18位酪氨酸去磷酸化和磷酸化。实际上，去磷酸化的合成肽(P1： GRKKRRQRRRPQDYESDDESYEVLDLTEY)可以有效地阻止缺氧诱导的线粒体蛋白和p62的降解，并且可以阻止野生型血小板中LC-3I向LC3-II的转化，而磷酸化肽(P2：GRKKRRQRRRPQDYESDDESpYEVLDLTEY) 没有这个功能(图3b)。免疫共沉淀实验结果表明P1肽有效抑制低氧条件处理的野生型血小板中FUNDC1和LC3的相互作用，而P2肽不会(图 3a)。以上实验初步说明磷酸化的合成肽P1可以阻止血小板线粒体的自噬。
Seahorse分析表明，无论是线粒体最大氧化能力还是线粒体基底耗氧水平，在缺氧处理的野生型血小板和FUNDC1缺陷的血小板中均有显著降低 (图3c，d)。具体地讲，线粒体的两大功能，即氧的消耗速率和ATP生产的能力，在缺氧处理的野生型小鼠血小板或在Fundc1敲除小鼠血小板中均明显降低。更重要的是，P1肽，而不是P2肽，会有效阻止了缺氧诱导的氧消耗率及ATP生成量的减少，而在Fundc1敲除小鼠中无太大的影响(图3c-e)。类似地，野生型小鼠中缺氧引起的血小板线粒体膜电位的减少也可以通过P1肽处理来逆转(图3g)。我们还评估了经缺氧处理的野生型或FUNDC1缺陷小鼠的线粒体数量。NAO染色和流式细胞术分析结果显示，经缺氧处理后，来自野生型小鼠的血小板线粒体数量显著减少(图3f)。与此相反，相比野生型，F1KO小鼠来源的线粒体数量却显着增加，但缺氧处理不会导致相应的减少(图2f)，这与其线粒体相关蛋白质变化趋势是一致的(图2a)。另一方面，野生型血小板经缺氧处理或F1KO小鼠的血小板活性氧水平(ROS)都有所增加(图3h)。此外，P1肽，而不是P2肽，能够阻断线粒体膜电位的减少，能够阻断在缺氧处理的血小板的ROS增加。综上，这些数据表明，FUNDC1与LC3的相互作用介导的自噬会决定线粒体退化程度和血小板中线粒体的数量水平。
实施例3FUNDC1参与的自噬可以调节血小板的活性
野生型血小板，经过凝血酶和ADP处理，缺氧会显著减少血小板聚集，而P1肽处理，而不是P2肽，会逆转该趋势(图4a-d)。另一方面， Fundc1基因敲除小鼠来源的血小板经过ADP和凝血酶处理，血小板的聚集能力显着降低，可能是由于线粒体数量的受损(图4a-d)。同样，在缺氧处理的野生型血小板和在未处理的Fundc1缺陷血小板中，ADP和凝血酶诱导的血小板在VWF包被的盖玻片上的扩散能力都被抑制(图4e-h)。但ADP和凝血酶受体P2Y12和Par2以及下游信号血小板整合素蛋白受体 IIbIIIa的表达没有显著变化。通过测定磷脂酰丝氨酸(PS)和caspase-3 的激活，结果显示，在实验条件下，Fundc1的不足并没有促进血小板(10μM 的ABT737处理)的凋亡(图5)。
实施例4自噬调节AMPK激活，导致血小板功能丧失
我们进一步观察到，P1肽，而不是P2肽，可以有效抑制经缺氧处理的野生型血小板中AMPK信号的激活(图6a-b)。具体而言，Fundc1缺陷血小板中的AMPK可以被适度激活，然后缺氧会进一步将其激活(图 6a-b)。Fundc1缺陷血小板中，P1肽对于缺氧导致的AMPK激活没有作用 (图6a-b)。但是，在野生型和Fundc1缺陷血小板中，凝血酶诱导的AMPK 的活化，也不能被P1肽所抑制的，这些证据表明凝血酶导致的AMPK的活化和由缺氧引起的AMPK活化是不同的。AMPK抑制剂compound C会显著抑制AMPK的活化，并阻止由缺氧和凝血酶引起的受损的血小板聚集，这些进一步支持了我们的观点，即AMPK负责血小板灭活。
上述数据表明，缺氧会显著上升线粒体压力并减少之后的AMPK活化和血小板活性所需的ATP产生。
实施例5线粒体数量和AMPK信号对于血小板体外储存很重要
先前的研究已经表明，血小板线粒体呼吸和功能下降是作为血小板体外储存时间的判定指标，而延长血小板体外储存时间是血小板输液的主要临床挑战。我们发现，生化分析显示，在体外储存条件下野生型血小板的自噬会被激活，而在类似的存储条件下Fundc1缺陷血小板中却没有这样的表型(图7a)。此外，我们观察到，储存条件下的野生型血小板中AMPK 被活化，线粒体耗氧率和ATP生产能力都显著地被损害。更重要的是，我们发现，P1肽能有效阻止体外储存所导致的自噬(图7a-g)。P1肽和 compound C也显著阻止了体外存储所导致的血小板聚集的减少(图7e-f)。总之，这些数据表明，线粒体/AMPK在血小板体外储存中至关重要，可作为开发新的抗血小板存储和抗血小板治疗的新靶标。
以上，基于本发明的实施方式进行了说明，但本发明不限定于此，本领域的技术人员应该明白，在本发明的主旨的范围内能够以进行变形和变更的方式实施，这样的变形和变更的方式，理应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种肽在制备用于延长血小板体外保存时间的产品中的用途，其中所述肽的序列如GRKKRRQRRRPQDYESDDDSYEVLDLTEY所示，所述肽是非磷酸化的。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述肽是哺乳动物来源的。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述产品为试剂。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述产品为试剂盒。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述肽是通过抑制血小板中FUNDC1与LC3相互作用和线粒体自噬进而延长血小板体外保存时间。
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