CN107899020A

CN107899020A - Cd20阳性疾病治疗的化合物及方法

Info

Publication number: CN107899020A
Application number: CN201710690999.0A
Authority: CN
Inventors: 秦超; 周远清; 萧翠珍; 李胜峰; 俞金泉
Original assignee: Baiaotai Biotechnology Guangzhou Co ltd
Current assignee: Baiaotai Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2018-04-13
Also published as: WO2019029628A1

Abstract

本文公开了与美登木素生物碱药物缀合的抗CD20抗体，用于靶向递送至疾病组织。提供了与这些药物偶联物在癌症中治疗CD20阳性细胞的制备和用途有关的方法。

Description

CD20阳性疾病治疗的化合物及方法

技术领域

本发明涉及一类能与人CD20结合的抗体、CD20抗原结合单元、多肽和免疫偶联物等化合物。本发明也涉及将这些CD20结合分子用于诊断和治疗诸如如恶性肿瘤的方法。

背景技术

CD20分子在B细胞及多数恶性B淋巴细胞表面存在，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织表面并不表达。CD20分子是治疗B细胞淋巴瘤的理想靶标。抗CD20抗体主要有三种类型的功能活性：靶细胞 CD20结合导致生长抑制和(非经典的)细胞凋亡(指直接的细胞死亡)，依赖补体的细胞毒性(CDC)，和依赖抗体细胞毒性(ADCC)，这种细胞毒由细胞显现Fc受体(FcrR)所介导，比如表达FcrRIIIa的NK 细胞和巨噬细胞。

利妥昔单抗(Rituximab)，一种I型嵌合IgG1抗CD20抗体，大大改进了B细胞恶性癌细胞的治疗与管理，增加了这些疾病患者的中位数生存期。联合化疗，它能有效地提高扩散性大的B细胞淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤病人的反应率及无进展和总生存期。利妥昔单抗治疗同时也对服从于B细胞清除治疗的其他疫病有利，包括B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和风湿性关节炎。

然而，临床研究的证据表明，将利妥昔单抗“耐药”或“疗效变异”已越来越普遍。为了使利妥昔单抗达到最佳疗效，需要了解影响利妥昔单抗疗效的各种因素，大多数对利妥昔单抗反应不佳的患者不一定是“耐药”，而是利妥昔单抗Fc杀伤功能没有达到与其癌细胞负担相适应的能力，包括补体和ADCC效应功能。有学者对伴有利妥昔单抗疗效变异患者在应用利妥昔单抗前输注新鲜血浆，提高补体浓度以提高疗效，可使30％患者获益。然而，复发是一种普遍的事情，不能靠输血解决问题。例如B-CLL，仍然需要一种延迟无毒性复发治疗。为了这个目的，各种各样的冶疗方法正在被开发，包括新化疗，小分子，抗体结合药和使用可选择的B细胞靶标。然而，许多这种药剂呈现了低安全性和耐受性，或是需要使用其他更复杂的治疗方案。很明显，一种新型的高活性的抗CD20药物，对治疗对利妥昔单抗有抵抗的血癌和相关的涉及 CD20表达的疾病，包括炎症疾病，很有必要。

通过工程化宿主细胞来改造单克隆抗体的寡糖组分增强其Fc介导的效应的方法散见于不同的文献、专利报道。例如用β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTIII)过表达的CHO细胞制备的抗体表现出比亲本细胞中表达的抗体更高的ADCC活性，而且活性的差异大约为10到20 倍，但GnTIII的过度表达对于CHO细胞有毒性并且由于是外源表达往往随着培养过程中传代次数增加，GnTIII表达量会下降，用此作为宿主细胞产生的抗体的岩藻糖含量会变化，从而影响抗体药物的均一性。产生脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子还包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)，但由于其极低的蛋白产量不适合作为治疗性抗体生产的宿主细胞(Yutaka Kandaet al Biotechnol Bioeng.(2006)Jul 5；94(4):680-8)。α-1-6岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki et al.(2004), Biotech.Bioeng.87:614)也导致生产的抗体岩藻糖含量降低。在如 Yamane-Ohnuki和Kyowa Hakko专利所述的FUT8敲除细胞系中，公开了一种控制抗体岩藻糖化水平和提高ADCC效应的方法【18】，该方法就是用特异的siRNA抑制宿主细胞中fut8基因的表达从而降低该宿主细胞所生产抗体的岩藻糖水平，该方法与前述GnTIII过度表达的CHO细胞系有一样的缺点，首先宿主细胞需要引入外源序列，其次siRNA抑制目的基因的效率最多只能到70％左右，最后siRNA表达的稳定性可能影响抗体药物的质量属性。

最近，利用新兴的基因组编辑技术对宿主细胞目的基因进行编辑，失活胞内的FUT8酶，降低抗体的岩藻糖水平在不同的文献、专利中屡有报道。如Malphettes et al(2010)报道了采用锌指酶(ZFN)技术敲除亲本细胞DG44，得到fut8基因纯合敲除的DG44衍生克隆，用该细胞系生产的抗体完全不含岩藻糖；Beurdeley et al(2012)报道了采用TALEN技术对CHO-K1细胞的fut8基因进行编辑，使宿主细胞丧失 FUT8酶活性；再如Sun etal(2015)报道了用CRISPR/Cas9技术对fut8基因的10号外显子编辑，使CHO-K1细胞丧失FUT8酶活性。用FUT8酶失活的宿主细胞生产的抗体由于降低了抗体的岩藻糖水平，抗体的ADCC 效应增强，从而针对CD20分子阳性的肿瘤细胞有更强的抗肿瘤作用。

靶向CD20的ADC的散见于不同的专利和文献中，如Che-Leung Lawe等(ClinCancer Res 7842 Vol.10,7842–7851)报道用抗CD20抗体偶联中等毒性的药物甲基澳瑞他汀monomethyl auristatin E (MMAE)，因此药物与单克隆抗体(mAb)的缀合必须具有高得多的比例以上才能达到有效性。然而，由于该使用的是可剪切的的连接子，人血清中MMAE从抗体偶联物上释放半衰期约为24h；与之相比，使用稳定的连接子的抗CD20抗体偶联物Batansine-4306F预计会拥有较长的平均滞留时间和较低的用药频率；此外，定点偶联技术在提高 A D C产品均一性的同时也能改善其体内过程。

美登木素生物碱是抑制微管蛋白聚合高度细胞毒化合物 (Remillard等，Science189，1002-1005(1975))。美登素最早由 Kupchan等从东非灌木Maytenus serrata分离得到(J.Am.Chem.Soc. 94：1354-1356(1972))。美登木素生物碱，包括美登醇及美登醇 C-3酯也可由某些微生物产生(U.S.Pat.No.4,151,042)。具有不同细胞毒性的美登醇的各种类似物也可由合成化学制备(for review see Chem.Pharm.Bull.52(1)1-26(2004))。美登木素生物碱的实例包括美登素﹑DM1﹑DM3及DM4。美登素为一种强有力的有丝分裂抑制剂并且在实体鼠源肿瘤模型中对多种肿瘤，包括路易斯(Lewis)肺癌和B-16黑素瘤展现显著的抑制活性。据报道，美登素在浓度低至10-7 μg/mL可以抑制人类急性淋巴细胞白血病C.E.M.系(Wolpert- DeFillippes等，Biochem.Pharmacol.1735-1738(1975))。业已证明，其细胞毒性比传统化疗试剂如甲氨蝶呤(methotrexate)﹑柔红霉素 (daunorubicin)和长春新碱(vincristine)高100到1000倍(U.S.Pat. No.3,896,111)。

安丝菌素是一种细菌美登木素生物碱，与美登素有着相似的活性谱和效应剂量范围。其抑制P388白血病的日剂量低至0.8g/kg。安丝菌素 P3(AP3)对许多肿瘤细胞系均有效(综述参考Alkaloids,2:149-204 (1984)；Chem.Pharm.Bull.52(1):1-26(2004))。研究发现，美登醇C-3 酯连N-甲基-L-丙氨酸衍生物比对应酯上为单纯的羧酸有更强的毒性，同时，其毒性为其对应的N-甲基-D-丙氨酸差向异构体的100多倍(U.S. Pat.Nos.4,137,230；4,260,608；Kawai,et al.,Chem.Pharm.Bull.32: 3441-3451(1984)；Widdison,etal.,J.Med.Chem.49:4392-4408 (2006))。

由于其高毒性性质及体外抗多种癌细胞系活性，美登木素生物碱有望能治疗多种不同的癌症。然而，其毒性也使得这类化合物在人类临床试验中不是令人满意的，因为其副作用对很多患者是无法忍受的(Issel 等，Cancer Treat.Rev.199-207(1978))。因此，人们通过将毒性药物偶联到单克隆抗体上靶向传递毒性药物至肿瘤细胞，以降低毒副作用。

ADC由三个关键元素组成：抗体﹑连接子和药物。特定抗体和药物的选择取决于特定疾病，其对药物的有效性和安全性有重大影响。连接子的稳定性及药物偶联到抗体的方法对ADC药物开发成功或失败起决定性作用。

抗体药物偶联物的疗效部分取决于各种参数的组合，不仅包括抗体的特异性、药物的药效强度和ADC的偶联方式，而且包括连接子的稳定性或其对断裂的敏感性﹑细胞表面激发内化﹑转运和随后有效细胞毒性“弹头”的释放。因此，即便针对同一靶点，不同的药物，或不同的连接子，或针对同一靶标的不同抗体，乃至相同的抗体不同的偶联方式，ADC的应用性和有效性显著不一样。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供的是与美登木素生物碱偶联的抗 CD20抗体，用于靶向病患细胞或组织。该抗CD20抗体可与病患细胞或组织上的一种抗原相结合。偶联到抗体上的药物可对抗原表达细胞产生细胞毒性、细胞生长抑制性或免疫抑制效果，以用于治疗或预防CD20阳性肿瘤复发。ADC的高亲和力能确保细胞毒性美登木素生物碱精确靶向肿瘤细胞，否则，强毒性的美登木素生物碱将会与结合到全身的非预期的靶点，从而导致经常性的难以接受的毒副作用。目前的技术提供了一种对 CD20阳性细胞传递具有抑制或杀伤效果的美登木素生物碱的方法，这种方法同时能减少美登木素生物碱可能带来的副作用，如对抗原阴性细胞的旁观者杀伤效应。

在另一个实施方案中，本发明提供的是一个偶联了美登素生物碱化合物的抗CD20抗体，在其中，美登素生物碱化合物是通过一个连接子偶联到该抗CD20抗体上。该连接子对酸、肽酶和组织蛋白酶均不敏感，不含二硫键，使ADC在血液循环中稳定一旦进入细胞即能释放药物。类似的连接子预期能在进入细胞前为偶联的小分子提供稳定性(如在血液循环中稳定)，以避免连接子过早降解释放毒性药物，从而降低药物的毒副作用。在一些实施例中，偶联物的美登素-连接子部分是N2’-去乙酰-N2’(6-马来酰亚胺基-1-氧代己基)-美登素(3AA-MDC或batansine)，或其衍生物。在另一些实施例中，为改善ADC的安全性和活性，偶联物的1个抗体分子中至少载有1分子药物。令人惊奇的是，即便在高载药情况下，抗体在靶向传递药物至靶细胞的过程中仍足够稳定。

在一些实施例中，本发明提供了式Ia或Ib的美登木素生物碱连接子抗CD20抗体偶联物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中

X为氢或卤素；

Y选自氢﹑C₁-C₆烷基﹑C₃-C₆环烷基和-C(＝O)R⁵；

R¹选自H﹑-OH﹑-OC(＝O)R⁵和-OR⁵基团；

R²为H或C₁-C₆烷基；

R³为甲基﹑-CH₂OH或-CH₂OC(＝O)R⁶；

R⁴为-OH或–SH；

R⁵为C₁-C₆烷基或苄基；

R⁶为C₁-C₆烷基﹑苯基或苄基；

R⁷为氢、C_1-6烷基或氨基酸侧链；

R⁸为氢或者C_1-6烷基；

n为0、1、2、3、4、5、6、7或8；

p选自1、2、3﹑4﹑5﹑6﹑7﹑8﹑9以及10；

Anti-CD20为抗CD20抗体。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包含如上所述美登木素生物碱连接子抗CD20抗体偶联物，如式Ia的组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备如上所述美登木素生物碱连接子抗CD20抗体偶联物的方法，该方法包括将抗CD20抗与一个或一个以上本文所述的可偶联到抗CD20抗体的美登木素生物碱化合物相连接。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种将美登木素生物碱送达抗原阳性细胞或组织的靶向给药方法，所述美登素与抗CD20抗体偶联。

在一些实施例中，本发明所提供的抗CD20抗体可以为BAT4306F, 其中BAT4306F为所述SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列在适应悬浮生长的细胞系(该细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:C2017127,所述细胞系被命名为CHO-BAT-KF。)表达，其特征是抗体的岩藻糖含量为0-5％。在一些实施例中，本发明所提供的抗CD20抗体可以为其他CD20抗原结合单元。

在另一个实施方案中，本发明涉及所述美登木素生物碱化合物用于制备治疗疾病的药物的用途，所述疾病可以包括：增生性疾病，如肿瘤；感染或自身免疫疾病，如移植排斥。所述疾病还可包括其他可以用靶向疗法治疗的疾病，这些疾病的特征包括：细胞产生抗原或靶点，该抗原或靶点能与CD20抗原结合单元特异结合。所述美登木素生物碱化合物可以由 CD20抗原结合单元与一个或多个美登素偶联而成。

附图说明

图1显示了Sephadex G25(M)柱分离抗体药物偶联物 Batansine-4306F的图谱。

图2显示了美登木素生物碱衍生物DM1和3AA-MDC对人正常肝细胞(LO2)的生长抑制作用。

图3显示了Batansine-4306F、Batansine-4306和BAT4306F对 CD20阳性Raji的生长抑制作用。

图4显示了药物偶联的Batansine-4306F、Batansine-4306和 BAT4306F根除Raji异种移植动物模型肿瘤的结果。

图5A和5B显示了抗CD20抗体BAT4306F的轻重链氨基酸序列。

图6A和6B显示了其他抗CD20抗体BAT4406F的轻重链氨基酸序列。

图7A和7B显示了BAT4306F和Batansine-4306F通过尺寸排阻色谱测定聚集率。

图8显示了Batansine-4306F的ADCC增强效果。与 Batansine-4306和BAT4306F相比，较低浓度的Batansine-4306F就能显著抑制外周血中B细胞数，显示出Batansine-4306F ADCC增强的优势。

具体实施方式

定义

除非另作说明，正如于此使用的那样，否则应适用以下定义。

除非另作说明，正如于此使用的那样，单数形式“一(a，an)” 和“所述(the)”，包括复数例证。因而，如提到“一个化合物”也包括其复数“一些化合物”。

正如于此使用的那样，“大约”为本领域普通技术人员所理解并且依据使用其上下文可在某种程度发生变化。如果有条款不为本领域普通技术人员所清楚，考虑其使用的上下文，“大约”意味着个别条款的加或减10％﹑或加或减5％﹑或加或减1％。

正如于此使用的那样，术语“包括”意指组合物和方法包括列举的元素，但未将其他的排除在外。当用来定义组成和方法时，“基本由…组成”意指排除对这一组合具有本质意义的其他元素。例如，正如于此定义的那样，基本由某些元素组成的成分并不排除其它对所要求发明的基本和新颖特点没有本质影响的其它元素。“由…组成”意味着排除超过所列举的衡量的其它组分和本质意义的方法步骤。每个过渡条款所界定的实施方案中在本发明范围内。

正如于此使用的那样，“美登木素生物碱”指的是具美登素类似物，包括其立体异构体。美登素可从美登木属植物分离得到(参见美国专利3896111)，其结构式为：

美登木素生物碱为具有美登素的环结构且其环上具有一个或一个以上取代基修饰的化合物。

“烷基”指的是具有1到10个碳原子(优选为1到6个碳原子) 的单价饱和脂肪烃基。C_v烷基，其中v为整数表示具有v个碳原子的烷基。这一术语包括，例如，直链和支链的烃基如甲基(CH₃-)﹑乙基(CH₃CH₂-)﹑正丙基(CH₃CH₂CH₂-)﹑异丙基(CH₃)₂CH-)﹑正丁基(CH₃CH₂CH₂CH₂-)﹑异丁基((CH₃)₂CHCH₂-)﹑仲丁基 ((CH₃)(CH₃CH₂)CH-)﹑叔丁基((CH₃)₃C-)﹑正戊基 (CH₃CH₂CH₂CH₂CH₂-)和新戊基((CH₃)₃CCH₂-)。“亚烃基”是具有1到10个碳原子(优选为1到6个碳原子)的二价饱和脂肪烃基。

“烯基”指的是具有2到6个碳原子(优选为2到4个碳原子) 并且具有至少1个(优选为1到2个)位置的不饱和烯基(>C＝C<) 直链或支链烃基。这些基团实例包括乙烯基﹑烯丙基和3-丁烯-1-基。顺式和反式异构体或这些异构体的混合物包括在该范围内。

“炔基”指的是具有2到6个碳原子(优选为2到3个碳原子) 并且具有至少1个(优选为1到2个)位置的不饱和炔基(-C≡C-) 的直链或支链烃基。这些炔基的实例包括乙炔基(-C≡CH)和炔丙基 (-CH₂C≡CH)。

“氨基”指的是-NR’R”基团，其中R’和R”独立选自氢﹑烷基﹑取代烷基﹑烯基﹑取代烯基﹑炔基﹑取代炔基﹑芳基﹑取代芳基﹑ 环烷基﹑取代环烷基﹑环烯基﹑取代环烯基﹑杂芳基﹑取代杂芳基﹑ 杂环﹑取代杂环，以及如果R’和R”都不是氢，其中R’和R”可选地与结合的氮原子共同连接形成杂环或取代杂环(其中烷基﹑取代烷基﹑烯基﹑取代烯基﹑炔基﹑取代炔基﹑环烷基﹑取代环烷基﹑芳基﹑取代芳基﹑杂芳基﹑取代杂芳基﹑杂环﹑取代杂环定义如上)。当R’为氢和R”为烷基，取代氨基有时称作烷氨基。当R’和R” 为烷基，取代氨基有时称作二烷氨基。-NH2有时称作未取代氨基。当提及单取代氨基，意为R’和R”两者中任一个为氢，但并非两者都是。当提及二取代氨基，意为R’和R”两者都不是氢。

“氨基酸”指包含氨基和羧基的任何化合物，不论其为天然，非天然还是合成的。氨基酸的实例包括，但不限于甘氨酸 (NH₂CH₂COOH)﹑半胱氨酸﹑丙氨酸﹑N-甲基丙氨酸，其包括D 和L光学异构体。“氨基酸侧链”指取代甘氨酸亚甲基上一个氢原子的取代基。氨基酸侧链实例包括，但不限于天然氨基酸侧链﹑烷基﹑ 取代烷基﹑烯基﹑取代烯基﹑炔基﹑取代炔基﹑芳基﹑取代芳基﹑环烷基﹑取代环烷基﹑环烯基﹑取代环烯基﹑杂芳基﹑取代杂芳基﹑杂环基﹑取代杂环基。

“芳基”指具有6到14碳原子的单价芳香族碳环基团，其可为单一环系(如苯基)或多稠环(如萘或蒽)，只要连接点在芳香碳原子上，这些稠环可以是或者不是芳香族的(如2-苯并噁唑酮﹑2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)。优选的芳基包括苯基和萘基。

“羰基”指二价基团-C(O)-，其等价于-C(＝O)-。

“羧基”指的是-COOH或CO2H，或其盐。

“羧酸”指含有至少一个羧基的化合物。

“氰基”指–CN基团。

“环烷基”指具有3到10个碳原子的环状烷基，可以是单个或多个环状环，包括稠环﹑桥环和螺环系统。只要连接点是通过非芳香﹑ 非杂环碳环形的环，这些环中一个或多个可以是芳基﹑杂芳基或杂环基。合适的环烷基的实例包括，如：环丙基﹑环丁基﹑环戊基和环辛基。其它环烷基的实例包括双环[2,2,2]辛基﹑降莰基和螺双环如螺[4.5] 癸-8-基：

环烯指的是环状的烯烃。

“环烯基”指的是具有单个或多个环且含有至少一个>C＝C<(优选1到2个位置为>C＝C<)的具有3到10个碳原子的非芳香环状烷基。

“卤原子”或“卤素”指的是氟﹑氯﹑溴和碘，优选为氟或氯。

“卤代烷基”指的是被1到5﹑1到3或1到2个卤原子取代的烷基，其中烷基和卤原子定义如上。

“羟基”指的是-OH基团。

“杂芳基”指的是环中具有6到10个碳原子和1到4个杂原子(从氧﹑氮和硫原子选择)的芳基。这些杂芳基可以是单一环(如吡啶基或呋喃基)或多个稠环(如吲哚基或苯并噻吩基)，其中只要连接点是通过杂芳基上的原子，稠环可以是或不是芳香族的和/或含有一个杂原子。在一个实施方案中，杂芳基上的氮和/或硫环原子另外可氧化成氮- 氧(N→O),或磺酰部分。优选的杂芳基包括吡啶基﹑吡咯基﹑吲哚基和呋喃基。

“杂环”或“杂环的”或“杂环烷基”或“杂环基”指的是饱和的或部分饱和的，但不是芳香族的基团，其具有3到10个环碳原子和 1到4个环杂原子(由氮﹑硫或氧基团选择)。这些杂环包括单一环或多个稠环(包括稠桥和稠螺环系)。在稠环系中，只要连接点是通过非芳香环，一个或多个环可以是环烷基﹑芳基或杂芳基。在一个实施方案中，杂环基上的氮和/或硫环原子另外可氧化成氮-氧(N→O)，或磺酰部分。

杂环和杂芳基的实例包括但不限于吖丁啶﹑吡咯﹑吡唑﹑吡啶﹑ 吡嗪﹑嘧啶﹑哒嗪﹑吲嗪﹑异吲哚﹑吲哚﹑二氢吲哚﹑吲唑﹑嘌呤﹑ 喹嗪﹑异喹啉﹑喹啉﹑酞嗪﹑萘吡啶﹑喹喔啉﹑喹唑啉﹑噌啉﹑碟啶﹑ 咔唑﹑咔啉﹑菲啶﹑吖啶﹑菲啰啉﹑异噻唑﹑吩嗪﹑异噁唑﹑吩噁嗪﹑ 吩噻嗪﹑咪唑啉﹑哌啶﹑哌嗪﹑吲哚啉﹑邻苯二甲酰亚胺﹑1,2,3,4-四氢异喹啉﹑4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩﹑噻唑﹑噻唑烷﹑噻吩﹑苯并[b] 噻吩﹑吗啉基﹑硫代吗啉基﹑1,1-二氧代硫代吗啉基﹑哌啶基,吡咯烷和四氢呋喃基。

“取代烷基”﹑“取代烯基”﹑“取代炔基”﹑“取代环烷基”﹑“取代环烯基” ﹑“取代芳基”﹑“取代杂芳基”或“取代杂环基”指的是各自被1到5个﹑特别是1 到3个﹑优选是1到2个取代基取代的烷基﹑烯基﹑炔基﹑环烷基﹑环烯基﹑芳基或杂环基，这些取代基选自烷基﹑卤代烷基﹑-O-R²⁰﹑-S-R²⁰﹑烯基﹑炔基﹑氧代﹑-C(＝O)R²⁰﹑-C(＝S)R²⁰﹑-C(＝O)OR²⁰﹑-NR²⁰C(＝O)R²¹﹑-OC(＝O)R²¹﹑-NR²⁰R²⁰﹑-C(＝O)NR²⁰R²⁰﹑-C(＝S)NR²⁰R²⁰﹑-NR²⁰C(＝O)NR²⁰R²⁰﹑-NR²⁰C(＝S)NR²⁰R²⁰﹑-OC(＝O)NR²⁰R²⁰﹑-SO₂NR²⁰R²⁰﹑-OSO₂NR²⁰R²⁰﹑-NR²⁰SO₂NR²⁰R²⁰﹑-C(＝NR²⁰)NR²⁰R²⁰﹑芳基﹑-NR²⁰C(＝O)OR²¹﹑-OC(＝O)OR²¹﹑氰基﹑环烷基﹑环烯基﹑-NR²⁰C(＝NR²⁰)NR²⁰R²⁰﹑卤素﹑羟基﹑杂芳基﹑杂环基﹑硝基 ﹑-SO₃H﹑-SO₂R²¹和-OSO₂R²¹，其中R²⁰独立地为氢﹑烷基﹑烯基﹑炔基﹑芳基﹑环烷基﹑ 环烯基﹑杂芳基和杂环基，或两个R²⁰与其结合的原子形成一个杂环，R²¹为烷基﹑烯基﹑ 炔基﹑芳基﹑环烷基﹑环烯基﹑杂芳基和杂环基。

“硝基”指-NO₂基团。

“氧代”指的为原子(＝O)或(-O)。

“螺环系”指的是双环系，其中有一个单一环原子为两个环所共有。

“巯基”指的是-SH基团。

“硫羰基”指的是二价-C(S)-基团，等同于-C(＝S)-。

“硫酮”指的是原子(＝S)。

如上使用的“化合物”应包括指明的分子式的立体异构体和互变异构体。

“立体异构体”指的是一个或多个立体中心的手性不同的化合物。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体。

“互变异构体”指的是一个化合物其质子的位置不同的变化形式，如烯醇-酮和亚胺-烯胺互变异构体，或者杂芳基的互变异构形式包括环原子连接到环-NH-部分和环＝N-部分如吡唑﹑咪唑﹑苯并咪唑﹑三氮唑和四氮唑。

“溶剂合物”指的是溶剂以晶型方式和化合物缔合。溶剂缔合通常由于在化合物的合成﹑结晶和/或重结晶中使用溶剂。“溶剂合物” 包括水以晶型方式和化合物缔合的水合物。

“患者”或“接受实验的对象”指的是哺乳动物，其中包括人和非人类哺乳动物。在一些实施例中，“患者”或“接受实验的对象” 指人。在另一些实施例中，“患者”或“接受实验的对象”指非人哺乳动物，如野生的、家养的和农场动物。在其他一些实施例中，“患者”或“接受实验的对象”指狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或灵长类，如黑猩猩。

“药学上可接受的盐”指的是化合物药学上可接受的盐，所述盐产生该技术领域众所周知的各种各样的有机和无机抗衡离子，仅仅示例性盐包括，当分子含有酸性官能团时，有机或无机盐如钠盐﹑钾盐﹑ 钙盐﹑镁盐﹑铵盐﹑异丙胺﹑三甲胺﹑二乙胺基﹑三乙胺﹑三丙胺﹑ 乙醇胺﹑2-二甲胺基乙醇﹑2-二乙胺基乙醇﹑二环己基胺﹑赖氨酸﹑ 精氨酸﹑组氨酸﹑咖啡因﹑普鲁卡因﹑hydrabamine﹑胆碱﹑甜菜碱﹑ 乙二胺﹑葡糖胺﹑甲葡糖胺﹑可可碱﹑嘌呤﹑哌嗪﹑哌啶﹑N-乙基哌啶﹑多胺树脂及四烷基铵盐等；以及当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸盐如盐酸盐﹑氢溴酸盐﹑酒石酸盐﹑甲磺酸盐﹑醋酸盐﹑马来酸盐和草酸盐。酸的其它非限制例子包括硫酸﹑硝酸﹑磷酸﹑丙酸﹑ 乙醇酸﹑丙酮酸﹑丙二酸﹑琥珀酸﹑富马酸﹑酒石酸﹑柠檬酸﹑苯甲酸﹑肉桂酸﹑扁桃酸﹑甲磺酸﹑乙磺酸﹑对甲苯磺酸﹑水杨酸等。

患者疾病“治疗”指的是(1)阻止疾病在有倾向性或还没表现疾病症状的患者中出现；(2)抑制疾病或阻止其发展；或(3)减轻疾病或致其退化。

“有效量”意指活性化合物或药剂的量，其导致研究人员﹑兽医﹑ 医生或其他临床医生正寻求的组织﹑系统﹑动物﹑个体以及人的生物或药用响应，这包含治疗一种疾病。

“给药”指组合物可能通过口服、注射、输液、肠外、静脉、粘膜、舌下、肌内、皮内、鼻腔、腹腔、动脉内、皮下吸收或通过任意其他与现有技术相结合的给药方式完成。在本发明的一个实施例中，给药是系统性的。

正如于此使用的那样，短语“有需要”一词意为受试者需要特殊的方法或治疗。在一些实施例中，识别可以通过任何方式的诊断。在本发明所述的任何方法和治疗中，受试者可能是需要的。

抗CD20抗体药物偶联物

在一个实施方案中，本发明公开的是美登木素生物碱通过一个连接子偶联到抗CD20抗体，该连接子酸稳定、肽酶组织蛋白酶不敏感且在循环系统中是稳定的，同时能向细胞内释放毒性药物。在另一个实施方案中，本发明公开的是一个抗体药物偶联物，此处的药物是特异性的连接在重链的经过人工改造的半胱氨酸位点，并且抗体药物偶联物每个抗体具有2.0个分子的平均药物负载量。

适于偶联连接基团的类美登素包括美登醇和美登醇类似物包括可以按照已知方法从天然源分离﹑使用生物技术制造(见如：Yu等，99 PNAS 7968-7973(2002))﹑或按照已知方法合成制备(见如：Cassady 等，Chem.Pharm.Bull.52(1)1-26(2004))。

适合的美登醇类似物的实例包括：

(1)C-19-去氯(参见美国专利4256746)(由安丝菌素P2经氢化锂铝还原制备)；

(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(参见美国专利 4361650和4307016)(使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌 (Actinomyces)去甲基或使用氢化锂铝(LAH)去氯制备)；

(3)C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去氯(参见美国专利4294757)(使用酰氯通过酰化制备)；

(4)C-9-巯基(美国专利号4424219)(通过美登醇与H2S或P2S5 反应制备)；

(5)C-14-羟甲基(CH2OH)或酰氧甲基(CH2OC(＝O)苯基或 CH2OC(＝O)(C1-C5烷基))(参见美国专利4331598)(从诺卡氏菌(Nocardia)制备)；

(6)C-15-羟基/酰氧基(参见美国专利4364866)(美登醇经由链霉菌(Streptomyces)转化而成)；

(7)C-15-甲氧基(参见美国专利4313946和4315929)(从Trewia nudlflora分离得到)；

(8)C-18-N-去甲基(参见美国专利4362663和4322348)(美登醇经由链霉菌(Streptomyces)去甲基制备)；以及

(9)4,5-去氧(参见美国专利4371533)(美登醇经由三氯化钛/氢化锂铝还原制备)。

取决于连接子类型，美登醇上的很多位置可用作连接位置。例如，对于形成酯键，C-3位置具有羟基，C-14位置为羟甲基修饰，C-15位置为羟基修饰以及C-20位置具有羟基都是合适的。在一些实施方案中，连接处为C-3位置。

在一些实施方案中，本发明提供了式Ia或Ib的类美登素衍生物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中

X为氢或卤素；

Y选自氢﹑C₁-C₆烷基﹑C₃-C₆环烷基和-C(＝O)R⁵；

R¹选自H﹑-OH﹑-OC(＝O)R⁵和-OR⁵基团；

R²为H或C¹-C⁶烷基；

R³为甲基﹑-CH₂OH或-CH₂OC(＝O)R⁶；

R⁴为-OH或–SH；

R⁵为C₁-C₆烷基或苄基；

R⁶为C₁-C₆烷基﹑苯基或苄基；

R⁷为氢、C_1-6烷基或氨基酸侧链；

R⁸为氢或者C_1-6烷基；

n是0,1,2,3,4,5,6,7或8；

p是从1，2，3,4,5,6,7,8,9,10中选择的；

Anti-CD20是抗CD20的抗体。

在一些实施方案中，化合物Ia为

或在药学上可接受的盐或溶剂合物，其中Anti-CD20是抗CD20 抗体。

在一些实施方案中，抗CD20的抗体是BAT4306F、 Batansine-4306、Batansine-4306F或其它抗原结合片段。

具有连接基团能偶联到抗CD20抗体的类美登素衍生物或类美登素连接子抗CD20抗体偶联物的类美登素组分也可由其它合适的细胞毒试剂例如：auristatin﹑DNA小沟结合试剂﹑DNA小沟烷基化试剂 ﹑烯二炔(enediyne)﹑lexitropsin﹑duocarmycin﹑紫杉烷(taxane) ﹑嘌呤霉素(puromycin)﹑dolastatin及长春花碱(vinca alkaloid) 所取代。其它合适的细胞毒试剂包括抗微管蛋白试剂如：auristatin﹑ 长春花碱(vinca alkaloid)﹑竹叶草霉素(podophyllotoxin)﹑紫杉烷(taxane)﹑浆果赤霉素衍生物(baccatinderivative)﹑cryptophysin ﹑类美登素(maytansinoid)﹑combretastatin﹑或尾海兔素(dolastatin)。在一些实施方案中，细胞毒试剂为AFP﹑MMAF﹑ MMAE﹑AEB﹑AEVB﹑auristatinE﹑长春新碱(vincristine)﹑长春花碱(vinblastine)﹑长春地辛(vindesine)﹑长春瑞滨(vinorelbine) ﹑VP-16﹑喜树碱(camptothecin)﹑紫三醇(paclitaxel)﹑多西紫杉醇(docetaxel)﹑埃博霉素A(epothilone A)﹑埃博霉素B(epothilone B)﹑诺考达唑(nocodazole)﹑秋水仙碱(colchicines)﹑colcimid ﹑雌氮芥(estramustine)﹑西马多丁(cemadotin)﹑圆皮海绵内酯 (discodermolide)﹑美登素(maytansine)﹑DM-1﹑DM-3﹑DM-4或eleutherobin。合适的免疫抑制剂包括如丙氧鸟苷(gancyclovir)﹑ 依那西普(etanercept)﹑环孢霉素(cyclosporine)﹑他克莫司 (tacrolimus)﹑雷柏霉素(rapamycin)﹑环磷酰胺 (cyclophosphamide)﹑咪唑硫嘌呤(azathioprine)﹑霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)﹑甲氨蝶呤(methotrexate)﹑氢化可的松 (cortisol)﹑醛甾酮(aldosterone)﹑地塞米松(dexamethasone)﹑ 环氧酶抑制剂(cyclooxygenaseinhibitor)﹑5-脂氧合酶抑制剂 (5-lipoxygenase inhibitor)或白三烯受体拮抗剂(leukotriene receptor antagonist)。在一些实施方案中，细胞毒试剂为AFP﹑MMAF ﹑MMAE﹑AEB﹑AEVB﹑auristatin E﹑紫杉醇(paclitaxel)﹑多西紫杉醇docetaxel﹑CC-1065﹑SN-38﹑拓扑替康(topotecan)﹑吗啉代阿霉素(morpholino-doxorubicin)﹑根霉素(rhizoxin)﹑氰基吗啉代阿霉素(cyanomorpholino-doxorubicin)﹑尾海兔素-10(dolastatin-10)﹑棘霉素(echinomycin)﹑combretatstatin﹑卡里奇霉素(calicheamicin)﹑美登素(maytansine)﹑DM-1﹑DM-3﹑DM-4 或纺锤霉素(netropsin)。

具有连接基团能偶联到抗CD20抗体的类美登素衍生物或类美登素连接子抗CD20抗体偶联物的类美登素组分也可由其它合适的免疫抑制剂例如：丙氧鸟苷(gancyclovir)﹑依那西普(etanercept)﹑环孢霉素(cyclosporine)﹑他克莫司(tacrolimus)﹑雷柏霉素 (rapamycin)﹑环磷酰胺(cyclophosphamide)﹑咪唑硫嘌呤(azathioprine)﹑麦考酚酸酯(mycophenolate mofetil)﹑氨甲喋呤 (methotrexate)﹑氢化可的松(cortisol)﹑醛固酮(aldosterone)﹑ 地塞米松(dexamethasone)﹑环氧酶抑制剂(cyclooxygenase inhibitor) ﹑5-脂氧合酶抑制剂(5-lipoxygenase inhibitor)或白三烯受体拮抗剂 (leukotriene receptor antagonist)所取代。

抗CD20抗体

抗CD20抗体包括抗体的片段(多克隆和单克隆，如Fab,Fab', F(ab')2,and Fv)(参见,如.,Parham,J.Immunol.131:2895-2902 (1983)；Spring et al.,J.Immunol.113:470-478(1974)；Nisonoff et al., Arch.Biochem.Biophys.89:230-244(1960))，结构域抗体(dAb)及其抗原结合片段，包括骆驼抗体(参见,如,Desmyter et al.,NatureStruct. Biol,3:752(1996))；shark antibodies called new antigen receptors(IgNAR)(see,e.g.,Greenberg et al.,Nature,374:168(1995)；Stanfield etal.Science 305:1770-1773(2004))，称为新抗原受体(IgNAR)的鲨鱼抗体(参见,如,Greenberg et al.,Nature,374:168(1995)；Stanfield et al.Science 305:1770-1773(2004)),和糖基化基因工程改造的ADCC功能增强的抗体，以及在一些情况下，通过基因工程改变氨基酸用于毒素定点偶联的抗体。

单克隆抗体技术使得抗CD20抗体的特异性单克隆抗体的形式成为可能。本行业内最众所周知的生产单克隆的方法是使用如靶细胞中分离的肿瘤特异性抗原去免疫小鼠、大鼠或其他哺乳动物。另外一种制备抗CD20的抗体的方法是利用scFv的噬菌体库(单链可变区)，尤其是人scFv(参见Griffiths et al.,US 5,885,793和5,969,108；McCafferty et al.,WO 92/01047；Liming et al.,WO 99/06587)，或者用酵母筛选系统制备结构域抗体(参见US 7,195,595)。另外，如美国专利5,639,641中所公布的抗体人源化技术也可以用做嵌合抗体或人源化抗体。此外，也可以使用专利U.S.Pat.No.5,639,641揭示的技术产生抗体，该抗体可以是嵌合或人源化抗体。

抗体部分可以是单克隆抗体，抗原结合抗体片段，双特异性或其他多价抗体或其他基于抗体的分子。抗体可以是各种同种型，优选人 IgG1，IgG2，IgG3或IgG4，更优选包含人IgG1铰链和恒定区序列。抗体或其片段可以是嵌合的，人源化的或人抗体，以及其变体，例如由van der Neut Kolfschoten et al.Science 317:1554-1557(2007)所述的半抗IgG4抗体(称为“单体”)。更优选地，抗体或其片段可以被设计或选择为包含属于特异性同种异型的人恒定区序列，当将ADC施用于人类受试者时可能导致降低的免疫原性。用于给药的优选同种异型包括非G1m1异型(nG1m1)，例如G1m3，G1m3,1，G1m3,2或 G1m3,1,2。更优选地，同种异型选自nG1m1，G1m3，nG1m1,2和Km3 同种异型。

挑选特定的抗CD20抗体是一个重要问题，这取决于要靶向的疾病类型，细胞和组织。

在某些实施方案中，抗CD20抗体是全人单克隆抗体，在另一个实施方案中，抗CD20的抗体是人源化的单克隆抗体。

可以使用能特异结合肿瘤抗原的抗CD20抗体。本文所用的“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生的抗原物质,也就是说它能诱发宿主的免疫反应。肿瘤抗原可用于鉴定肿瘤细胞，并且是癌症治疗的潜在靶点。人体内正常蛋白不具有抗原性。然而一些特定的蛋白质在肿瘤发生的过程中会产生或者过表达，因而对机体来说是外来物质。这可能包括从不与免疫系统接触的正常蛋白质，表达量极低的蛋白质，仅在某些发育阶段产生的蛋白质或其结构由于突变而被修饰的蛋白质

抗CD20抗体能与CD20特异结合并有极高的亲和力，它在一系列的非霍奇金淋巴瘤中都有过度表达，但在正常组织细胞中很少甚至不表达。

CD20分子在B细胞及多数恶性B淋巴细胞表面存在，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织表面并不表达。CD20分子是治疗B细胞淋巴瘤的理想靶标。因为CD20分子在细胞膜上比较暴露，且在B 淋巴细胞表面表达水平较高，这使得利妥昔或者奥法木此类单克隆抗体比较容易接近并与之结合，同时，CD20分子与单克隆抗体结合后，没有显著的内吞及脱落现象。这使得单克隆抗体可以长时间存在于细胞膜表面，长期提供由补体及FcR表达引起的持续性免疫攻击。CD20 分子是一个四次跨膜的结构，胞外段有大小2个loop。其不同结合位点使其有着不同的作用。

与CD20抗原表达相关的B淋巴细胞瘤主要是指NHL，在我国， NHL在所有肿瘤中发病率约占4％。在世界范围内，大约每年新发病例数约30万例，且发病率呈现逐年上升趋势，每年在以约3％的速度持续增长。

预期可以通过引入具有增强抗体依赖性细胞毒性功能的氨基酸序列修饰抗CD20抗体。例如，可以修饰Fc和/或铰链区中的氨基酸以实现 ADCC增强。介导ADCC增强的IgG1-Fc的实例以及筛选这些序列的方法是本领域是已知的(例如,Stewart et al.ProteinEng Des Sel.24(9):671-8 (2011))。也可以通过基因工程改造抗体以降低或去除岩藻糖，增加对Fc- γIII亲和力，从而增强ADCC活性。

药物与抗CD20抗体的偶联

如上所述，化合物(例如：类美登素药物衍生物)可以通过连接子偶联至抗CD20抗体。在一些实施方案中，抗CD20抗体可以用适当的双官能团修饰试剂修饰。在一些实施方案中，含有巯基(SH)的基团也可以引入到抗CD20抗体的氨基酸残基侧链，如赖氨酸侧链。例如，抗CD20抗体的赖氨酸残基的氨基可以与2-亚氨基硫烷(Traut’ s Reagent)或与3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP) ﹑4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(DPDB)等反应，随后用还原剂如2-巯基乙醇﹑二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原转化成含巯基基团。在一些实施方案中，抗CD20抗体可以通过突变产生半胱氨酸，或者可以通过在特定位点引入半胱氨酸，最小的影响抗体的活性，包括亲和力、特异、ADCC、CDC、ADCP 和免疫原性。例如，在CD20抗体上引入半胱氨酸可以用于将毒素连接在特定位点。可以在抗CD20抗体分子上引入多个半胱氨酸。

可取代赖氨酸残基上侧链氨基的含巯基基团的非限制性实例包括 -NHC(＝NH)(CH₂)_nSH和-NHC(O)(CH₃)_nSH，其中n为1﹑2﹑3﹑4﹑5 或6。当含巯基基团引入氨基酸残基，氨基酸残基被指为巯基化氨基酸。例如，当赖氨酸侧链氨基转化成含巯基基团，赖氨酸残基被指为巯基化赖氨酸。抗CD20抗体上引入的游离巯基个数可以变化，比如在1 和大约20之间，或者5到15，以及或者5到12。连接子或药物-连接子可以与抗CD20抗体上巯基化赖氨酸残基的游离巯基(SH)成键。在一些实施方案中，与抗CD20抗体半胱氨酸残基成键的连接子或连接子-药物个数在1和大约10之间。在一些实施方案中，如此成键个数至少是1，或至少为2或3或4或5。在一些实施方案中，如此连接的个数为不超过10，或者不超过9或8或7或6或5或4。在一些实施方案中，每个抗CD20抗体平均与1到4个药物分子偶联，更具体的来说，平均连接2个药物分子。

在另一实施方案中，药物-连接子可以通过结合到半胱氨酸残基上的巯基偶联到抗CD20抗体上。每个抗CD20抗体通常包含许多半胱氨酸，但是它们中很多，如果并非所有，彼此形成二硫键，因此无法用于如此偶联。在一些实施方案中，因此，抗CD20抗体的一个或一个以上的二硫键通过与还原剂如2-巯基乙醇﹑二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)反应而断裂形成游离巯基(SH)。该反应可以跟踪和/或控制以便足够数量的二硫键断裂而能偶联，同时维持足够数量的二硫键而保持抗CD20抗体的结构稳定性。

在一些实施方案中，药物-连接子和抗CD20抗体上的半胱氨酸残基之间成键个数为1到10。在一些实施方案中，此类键的个数至少为 1，或至少为2或4。在一些实施方案中，如此形成的键的个数不超过 10，或者不超过9或8或7或6或5或4。在一些实施方案中，每个抗 CD20抗体通过半胱氨酸平均与2到4个药物分子偶联。

在一些实施方案中，药物分子通过赖氨酸和半胱氨酸混合残基偶联到抗CD20抗体。

抗CD20抗体可以通过修饰如在特定位点突变，以便引入额外的巯基化赖氨酸或半胱氨酸残基而允许适当的偶联。氨基酸修饰的方法在行业内是众所周知的。然后可以通过实验检测修饰后的抗CD20抗体的稳定性和抗原结合能力。在一些实施方案中，修饰过的CD20抗原结合单元然后可以用实验方法考察其稳定性和其抗原结合性能。在一些实施方案中，至少一个巯基化赖氨酸或半胱氨酸通过如此修饰而引入。在另一实施方案中，至少两个巯基化赖氨酸或半胱氨酸通过如此修饰而引入。在另一实施方案中，抗CD20抗体的Fc部分被改造， ADCC活性增强。

药物负载

抗CD20抗体上药物负载可以改变，这取决于很多因素如药物的效力、大小、抗CD20抗体的稳定性、抗CD20抗体上可用的能偶联的基团等。在一些实施方案中，1到10个类美登素药物分子和1个CD20 抗原结合单元分子偶联。在一些实施方案中，平均2到4个类美登素药物分子和1个CD20抗原结合单元分子偶联。在一些实施方案中，平均2.0个类美登素药物分子和1个CD20抗原结合单元分子偶联。

美登木素生物碱-连接子-抗CD20抗体的代谢物释放有效药剂

尽管不希望局限于任何理论，可以预期，式Ia到Ic任一项化合物一旦内吞，能被细胞内蛋白酶降解至具有细胞毒的类美登素部分组成的降解产物。在一些实施例中，化合物结构式为IVa、IVb或IVc:

或其盐，其中AA选自，但不局限于：

其中代表与分子其余部分的连接点，及本文所定义的其它变体。

治疗方法

在另一个实施方案中，本发明提供了一种或多种化合物用于制备治疗增殖、炎症或免疫疾病的药物的用途，例如，所述化合物为式 Ia-Ic、Id和式IVa-IVc中任一种化合物。

本发明化合物可以配制成药物组合物和适于所选择的给药途径的各种给药形式，即，口服或静脉内、肌内、局部或皮下等肠胃外给药。化合物的量会有所不同，取决于药物连接体的性质、药物负载、细胞表面引起内化作用的程度、药物的转导和释放、治疗的疾病、病人的情况，如年龄、性别、体重等，并可以通过本领域公知的方法来确定，例如，见美国专利4938949，将最终由主治医生或临床医生来决定。

通常，合适的剂量范围是约0.1～200毫克/千克，例如，连续52周中每1-4周每天静脉输注30-90分钟，每千克体重用药量为0.5毫克/ 千克～50毫克/千克、1.0毫克/千克～25毫克/千克、1.5毫克/千克～15毫克/千克或者1毫克/千克～10毫克/千克。在一些实例中，剂量从约1.0 毫克/天～100毫克/天，例如，从约2毫克/天至约5克/天，约10毫克/ 天至约1克/天，约20～500毫克/天，或在约50～100毫克/天。本发明化合物可以每日、每月用药，例如一天一次，持续用药1-3周或一个月。另一方面，本发明化合物可以周期给药，如先每天给药约5～21天，接下来1～7天不用药，如此，循环给药。

在另一些实施例中，初始给药量为1-4mg/kg静脉输注30-90分钟, 接下来的52周里每1-4周静脉输注30分钟以上，给药量为1-2mg/kg。在另一些实施例中，初始给药量为2-10mg/kg静脉输注30-90分钟，接下来的52周里每1-4周静脉输注30-90分钟，给药量为1-5mg/kg。

在一些实施例中，所述化合物与其他疗法联合应用。例如，所述化合物可与另外一种治疗方法一起应用于肿瘤的治疗，例如，放射治疗或本领域中已知的另一种抗癌剂。

在一些实施例中，本发明提供了式IVa化合物用于在有需要的患者中治疗增生、炎症或免疫疾病的药物的用途，所述式IVa的化合物是式Ia的化合物或其药学上可接受的盐给药后的代谢产物。

在一些实施例中，本发明提供了式IVb化合物用于在有需要的患者中治疗增生、炎症或免疫疾病的药物的用途，所述式IVb的化合物是式Ib的化合物或其药学上可接受的盐给药后的代谢产物。

在一些实施例中，本发明提供了式IVc化合物用于在有需要的患者中治疗增生、炎症或免疫疾病的药物的用途，所述式IVc的化合物是式Ic的化合物或其药学上可接受的盐给药后的代谢产物。

所述代谢化学反应是指身体内部(如，细胞、机体)发生的反应，一种化学物质转化为另一种化学物质。该转化可以通过代谢和/或化学过程，并且可以发生在一个步骤中，或通过两个或多个步骤。代谢的化学反应包括美登木素生物碱连接子和抗CD20抗体的偶联物中蛋白质或肽成分的降解反应。组成一个美登木素生物碱连接CD20抗原结合单元结合，如如通过在细胞内的蛋白质的抗体或抗体片段。

药物组合物

本发明提供了一些药物组合物，包括如本文所述的一种或多种组合物，例如，式Ia-Ic的任一种化合物的组合物，及其一种或多种药学上可接受的载体。所述组合物应包含至少0.1％的活性化合物。组合物的百分比可以改变，可能是一个给定的单位剂量组成的重量的2～90 ％。所述治疗效用的组合物中的活性化合物的量需要达到有效剂量水平。

适合于注射或输液的组合物可以包括药学上可接受的液体载体或赋形剂，如无菌水溶液或分散液，或适于临时配制成无菌注射或难溶溶剂，任选地包封在脂质体中的溶液或分散液含有活性成分的无菌粉末。药物组合物的其他形式包括外用制剂，如凝胶、软膏、霜剂、洗剂或贴剂等。所述药物组合物，除本文中提到的以外，还包括本领域公知、药学上可接受的载体；例如，雷明顿，药剂科学和实践，第20 版，2000年，利平科特·威廉斯&威尔金斯，(Editors:Gennaro,A.R., et al.)。

在另一个实施例中，本发明提供了一种制备药物组合物的方法，其特征在于：包括所述化合物的混合物，例如，式Ia-IVc中任一项的化合物及其药学上可接受的载体。混合的活性成分与药学上可接受的载体的方法在本领域中是公知技术，例如，将活性化合物与液体或细碎的固体载体或两者按规定比例均匀混合，然后，如果有必要，将所得混合物做成所需的形状。

在一些实施例中，式Ia-IVc中任一种化合物制备成注射剂，例如，在药物浓度为2-50mg/ml的水溶液中含有4-10mg/mL的氯化钠和/或 5-12mg/ml的醋酸钠，或者在药物浓度为2-50mg/ml的水溶液中含有 5-10mg/ml的氯化钠、1-5mg/mL的磷酸氢二钠七水合物、0.1～0.5mg/ml 的磷酸二氢钠一水合物。

在另一些实施例中，式Ia-IVc中任一种化合物制备成注射剂，例如，在药物浓度为2-100mg/ml的水溶液中含有0.5-1.0％mg/mL的氯化钠、0.05-0.10％的磷酸二氢钠二水合物、1.0～2.0％的磷酸氢二钠二水合物、0.01～0.05％的柠檬酸钠、0.10-0.20％的柠檬酸一水合物、1.0-2.0 ％的甘露醇、0.1％～0.2的聚山梨酯80和注射用水(参见USP标准)，氢氧化钠调节pH值。

方法

本发明的化合物可以由容易得到的起始物用如下常规方法和操作加以制备。其中给定的典型或优选方法条件(如反应温度﹑时间﹑反应物摩尔比﹑溶剂﹑压力等)，除非另有说明，可以理解为其它方法条件也可以使用。最佳反应条件可能随所用的特定反应物或溶剂而变化，但是这些条件可由熟悉该技术领域的科技人员用常规优化程序确定。

此外，显而易见，对熟悉该技术领域的科技人员，常规的保护基对避免某些官能团参与不想要的反应可能是必要的。各种官能团的合适保护基以及特定官能团保护和去保护合适条件为该技术领域的科技人员众所周知。例如由Greene,T.W.和Wuts,G.M.,《有机合成中的保护基团》(Protecting Groups in Organic Synthesis)，第三版，1999，Wiley，New York中所述的很多保护基及其中所引用的参考文献。

此外，本发明的化合物可能包含一个或一个以上手性中心。因此，若需要，此类化合物可以制备或分离得到纯立体异构体，即为单个对映异构体或非对映异构体或为立体异构体富集的混合物。除非另有特别说明，所有这些立体异构体(及其富集的混合物)都包含在本发明的范围之内。纯的立体异构体(或其富集混合物)可以使用如本技术领域熟知的光学活性起始物或立体选择性试剂加以制备。或者，此类外消旋混合物也可使用如手性柱色谱，手性差分试剂等加以分离。

下述反应的起始物质通常为已知化合物或者可以通过已知步骤或通过其明显的修改方案进行制备。例如，很多起始物可从供货商如 Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,Wisconsin,USA)﹑Bachem (Torrance,California,USA)﹑Emka-Chemce或Sigma(St.Louis,Missouri,USA)买到。其它起始物可以通过标准参考书如Fieser and Fieser's Reagentsfor Organic Synthesis,1-15卷(John Wiley and Sons)(1991)﹑Rodd's Chemistry ofCarbon Compounds,1-5卷及补卷(Elsevier Science Publishers)(1989)﹑OrganicReactions,1-40 卷(John Wiley and Sons)(1991)﹑March's Advanced OrganicChemistry，第四版(John Wiley and Sons)﹑及Larock's Comprehensive OrganicTransformations(VCH Publishers Inc.) (1989)所述的步骤或其明显的修改方案进行制备。

于此所述的各种起始物﹑中间体和化合物(包括立体异构体)可以用适当的常规技术如沉淀﹑过滤﹑结晶﹑蒸发﹑蒸馏和色谱分离和纯化。这些化合物可以通过常规方法如熔点﹑质谱﹑核磁共振和各种其它光谱分析方法加以鉴定。

偶合试剂包括基于碳二亚胺﹑銨盐和鏻盐试剂。碳二亚胺型试剂包括碳二亚胺如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)﹑N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-乙基-3-(3’-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI) 等。銨盐包括N,N,N',N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)六氟磷酸脲(HATU)﹑N,N,N',N'-四甲基-O-(苯并三氮唑-1-基)六氟磷酸脲 (HBTU)﹑N,N,N',N'-四甲基-O-(6-氯苯并三氮唑-1-基)六氟磷酸脲 (HCTU)﹑N,N,N',N'-四甲基-O-(苯并三氮唑-1-基)四氟硼酸脲(TBTU) ﹑N,N,N',N'-四甲基-O-(6-氯苯并三氮唑-1-基)四氟硼酸脲(TCTU)。鏻盐包括7-氮杂苯并三氮唑-1-基-氧基三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐(PyAOP)和苯并三氮唑-1-基-氧基三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐 (PyBOP)。酰胺形成步骤可以在极性溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)中进行并且也可包含有机碱如二异丙基乙胺(DIEA)或二甲氨基吡啶 (DMAP)。

例如，式Ia或Ib的化合物可以通过分别将式A或B的化合物(其中变量如本文所定义)与抗体在合适的溶剂如缓冲液中接触来制备。

下面实施例进一步阐述本发明的某些方面和帮助熟悉该技术领域的科技人员实行本发明。这些实施例绝不是被认为限制本发明的范围。

实施例1

美登醇(MDC)与Fmoc-N-甲基-L-丙氨酸的酯化反应(合成 Fmoc-N-Me-D/L-Ala-MDC)

称取美登醇(0.600g，1.062mmol)，Fmoc-N-甲基-L-丙氨酸(6.911 g，21.24mmol)，三氟甲磺酸钪(0.314g，0.637mmol)和DMAP(0.389 g，3.186mmol)置于250毫升Schlenck瓶，氮气保护下加入二氯甲烷 (100mL)，在-8℃搅拌0.5小时。逐滴加入DIC(2.949g，23.37mmol)，继续在-8℃搅拌反应0.5h，慢慢升温至室温，过滤回收催化剂，滤液用稀盐酸淬灭，二氯甲烷萃取，依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂。柱层析(硅胶，CH2Cl2/MeOH 30:1) 得到非对映异构体混合物Fmoc-N-Me-D/L-Ala-MDC，白色固体 (0.8385g，产率90.5％)。进一步柱层析(硅胶，CH2Cl2/MeOH 100:1 到20:1)得到两个纯的非对映异构体组分。Rf较大的组分确定是D- 氨酰基酯非对映异构体(Fmoc-N-Me-D-Ala-MDC)，Rf较小的组分确定是L-氨酰基酯非对映异构体(Fmoc-N-Me-L-Ala-MDC)。Fmoc-N-Me-L-Ala-MDC:白色固体(0.4262g，产率46.0％)，1H NMR (400MHz，CDCl3)：δ0.77(3H，s),1.22-1.32(6H，m)，1.40-1.48 (1H，m),1.63(3H，s)，2.13(1H,dd,J＝14.4，2.8Hz)，2.53(1H，dd,J ＝14.4,10.8Hz),2.64(3H，s),2.88(3H，s),3.00(1H，d，J＝9.6Hz)， 3.07(1H，d，J＝12.4Hz),3.35(3H，s),3.48(1H，d，J＝8.8Hz),3.59 (1H，d，J＝11.2Hz),3.97(3H，s),4.13-4.19(1H，m),4.15(1H，s),4.24 (1H，t，J＝10.8Hz),4.72-4.77(2H，m)，5.03(1H，q，J＝6.8Hz)， 5.65(1H，dd，J＝15.2，9.2Hz)，6.29(1H，br)，6.41(1H，dd，J＝15.2，11.2Hz)，6.52(1H，d，J＝1.2Hz)，6.70(1H，d，J＝10.8Hz)，6.79 (1H，d，J＝1.2Hz)，7.33(1H，t，J＝7.6Hz)，7.36(1H，t，J＝7.6Hz)， 7.39(1H，d，J＝7.6Hz)，7.49(1H，d，J＝7.6Hz)，7.70(1H，d，J＝ 7.6Hz)，7.72(1H，d，J＝7.6Hz)。LC-MS(M+Na+)计算值:894.3，实测值：894.3。Fmoc-N-Me-D-Ala-MDC：白色固体(0.3993g，产率 43.1％),1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ0.84(3H，s)，1.22-1.27 (3H，m),1.40-1.48(1H，m),1.51(3H，d，J＝7.6Hz)，1.67(3H， s)，2.20(1H，dd，J＝14.4，2.8Hz)，2.63(1H，dd，J＝14.4，12.4 Hz)，2.85(1H，d，J＝9.6Hz)，2.96(3H，s)，3.17(3H，s)， 3.20(1H，s)，3.24(3H，s)，3.40(1H，d，J＝9.2Hz)，3.51 (1H，d，J＝12.8Hz)，3.99(3H，s)，4.20-4.28(2H，m)， 4.38-4.43(2H，m)，4.80-4.98(2H，m)，5.80(1H，dd，J＝15.2， 11.2Hz)，6.18(1H，s)，6.25(1H，d，J＝10.8Hz)，6.40(1H，dd， J＝15.2，11.2Hz)，6.79(1H，d，J＝1.6Hz)，6.84(1H，d，J＝1.6 Hz)，7.32(2H，t，J＝7.6Hz)，7.41(2H，t，J＝7.6Hz)，7.61(2H，d，J＝7.6Hz)，7.77(2H，d，J＝7.6Hz)。LC-MS(M+Na+)计算值：894.3，实测值：894.3。

实施例2

去保护Fmoc-N-Me-D/L-Ala-MDC(合成N-Me-D/L-Ala-MDC)

Fmoc-N-Me-D/L-Ala-MDC(0.463g,0.5307mmol)溶在乙腈(200 mL)，加入哌啶(0.865g,10.15mmol)，室温搅拌4小时，加水淬灭，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，干燥得粗品。不需进一步纯化用于下步反应。LC-MS(M+H+) 计算值:650.3,实测值:650.3。Rt:3.96min。

实施例3

去保护Fmoc-N-Me-L-Ala-MDC(合成N-Me-L-Ala-MDC)

Fmoc-N-Me-L-Ala-MDC(0.463g,0.5307mmol)溶在乙腈(200 mL)，加入哌啶(0.865g,10.15mmol)，室温搅拌4小时，加水淬灭，二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，干燥得粗品。不需进一步纯化用于下步反应。LC-MS(M+H+) 计算值:650.3，实测值:650.3。Rt:3.96min。

实施例4

N-Me-D/L-Ala-MDC与6-马来酰亚胺基己酸(MA-ACP)缩合(合成D-3AA-MDC和L-3AA-MDC)

将上步制备的粗品N-Me-D/L-Ala-MDC(0.5307mmol)以及 MA-ACP(0.448g,2.123mmol)溶于DMF(25mL)，冰水浴冷却，加入EDC(0.407g,2.123mmol)。反应混合物室温搅拌过夜，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂。柱层析(硅胶，CH2Cl2/MeOH 30:1)得到粗品。制备HPLC(YMC C-18柱,250x20mm,S 10μm)进一步纯化得纯的两个非对映异构体 (Rt＝6.59min和6.98min)。Rt较大的组分确定是D-氨酰基酯非对映异构体(D-3AA-MDC，45.2％)，Rt较小的组分确定是L-氨酰基酯非对映异构体(L-3AA-MDC,54.8％)。L-3AA-MDC:白色固体 (0.1364g，两步总产率30.5％)，1H NMR(400MHz,CDCl3): δ0.79(3H，s)，1.17-1.32(3H，m)，1.27(3H，s),1.29(3H， s)，1.40-1.76(7H，m)，2.12-2.23(2H，m)，2.31-2.45(1H，m)， 2.59(1H，t，J＝12.8Hz)，2.82(3H，s)，3.01(1H，d，J＝9.6Hz)， 3.10(1H，d，J＝8.8Hz)，3.17(3H，s)，3.34(3H，s)，3.42 (2H，t，J＝6.8Hz)，3.48(2H，d，J＝6.8Hz)，3.62(1H，d， J＝12.8Hz)，3.97(3H,s)，4.27(1H，t，J＝11.2Hz)，4.76(1H， d，J＝11.6Hz)，5.36(1H，q，J＝6.8Hz)，5.65(1H，dd，J＝15.2， 9.2Hz)，6.25(1H，s)，6.41(1H，dd，J＝15.2，11.2Hz)，6.64 (1H，s)，6.65(2H，s)，6.72(1H，d，J＝11.2Hz)，6.82(1H， s)。LC-MS(M+Na+)计算值：865.3，实测值：865.3。Rt：6.59min。 D-3AA-MDC：白色固体(0.1128g，两步总产率25.2％)，1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ0.86(3H，s)，1.22-1.38(4H，m)，1.25(3H， d，J＝9.2Hz)，1.38-1.45(1H，m)，1.48(3H，d，J＝7.6Hz)，1.56-1.70(4H，m)，1.68(3H，s)，1.75(1H，d，J＝13.6Hz)， 2.19(1H，dd，J＝14.4，2.8Hz)，2.28-2.36(2H，m)，2.65(1H， dd，J＝14.2，12.0Hz),2.80(1H，d，J＝9.6Hz)，3.01(3H，s)，3.19(1H，d，J＝13.2Hz)，3.32(3H，s)，3.42(1H，d，J＝9.6 Hz)，3.47-3.54(3H，m)，3.98(3H，s)，4.29(1H，t，J＝10.4 Hz)，4.88(1H，dd，J＝11.8，3.2Hz)，5.07(1H，q，J＝7.6Hz)， 5.84(1H，dd，J＝15.2，9.2Hz)，6.23(1H，d,J＝11.2Hz)，6.27(1H， s)，6.41(1H，dd，J＝15.2，11.2Hz)，6.69(2H，s)，6.79(1H，d，J＝1.2Hz)，6.84(1H，d，J＝1.2Hz)。LC-MS(M+Na+)计算值： 865.3，实测值：865.3。Rt：6.98min。

实施例5

N-Me-L-Ala-MDC与MA-ACP缩合(合成L-3AA-MDC)

将上步制备的粗品N-Me-L-Ala-MDC(0.5307mmol)以及 MA-ACP(0.448g,2.123mmol)溶于DMF(25mL)，冰水浴冷却，加入EDC(0.407g,2.123mmol)。反应混合物室温搅拌过夜，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂。柱层析(硅胶，CH2Cl2/MeOH 30:1)得到预期的产品L-3AA-MDC: 白色固体(0.280g,两步总产率62.6％)1H NMR(400MHz,CDCl3): δ0.79(3H，s),1.17-1.32(3H，m),1.27(3H，s),1.29(3H，s)， 1.40-1.76(7H，m)，2.12-2.23(2H，m)，2.31-2.45(1H，m)，2.59 (1H，t，J＝12.8Hz)，2.82(3H，s)，3.01(1H，d，J＝9.6Hz)， 3.10(1H，d，J＝8.8Hz)，3.17(3H，s)，3.34(3H，s)，3.42(2H， t，J＝6.8Hz)，3.48(2H，d，J＝6.8Hz)，3.62(1H，d，J＝12.8Hz)， 3.97(3H,s)，4.27(1H，t，J＝11.2Hz)，4.76(1H，d，J＝11.6Hz)， 5.36(1H，q，J＝6.8Hz)，5.65(1H，dd，J＝15.2，9.2Hz)，6.25 (1H，s)，6.41(1H，dd，J＝15.2，11.2Hz)，6.64(1H，s)，6.65(2H，s)，6.72(1H，d，J＝11.2Hz)，6.82(1H，s)。LC-MS (M+Na+)计算值：865.3，实测值：865.3。Rt：6.59min。

实施例6

重组抗体表达和纯化

参照Wood et al.,J Immunol.145:3011(1990)等的方法，抗CD20 特异性的单克隆抗体在CHO细胞产生。含抗体基因的表达载体分别用常规的分子生物学方法构建，其中BAT4306抗体轻重链核苷酸序列分别见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。CHO-BAT(CHO-BAT细胞是 CHO-K1细胞株驯化筛选而成的适应悬浮生长的中国仓鼠卵巢细胞) 高产稳定细胞系的构建过程简单描述如下：宿主细胞悬浮生长于 CD-CHO培养基，取处于对数生长期的宿主细胞离心，重悬于新鲜的 CD-CHO培养基，计数并调节细胞密度到1.43×10⁷个/毫升，取600μl上述细胞悬液加入电击杯，然后加入已线性化的质粒40μg，用移液枪吸打使细胞与质粒混合均匀，其中BAT4306表达载体以适应悬浮生长的CHO-K1细胞细胞系为宿主细胞，生产的抗体命名为BAT4306。以适应悬浮生长的敲除α-(1,6)-岩藻糖基转移酶的细胞系 CHO-BAT-KF(保藏编号：CCTCC NO:C2017127；保藏日：2017.8.10，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学；分类命名为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-BAT-KF fut8(-/-))为宿主细胞，生产的抗体命名为 BAT4306F。用Bio-rad电转仪电击转化，仪器参数设定为：电容：960 μFD,电压：300V。通常电击时间为15-20毫秒为正常。把电击后的细胞立即重悬于37℃预热的CD-CHO培养基，每孔100μl分装于96 孔板，2-3天后加入等量的筛选培养基。测定96孔板细胞培养上清来测定抗体的表达水平。表达水平较高的克隆从96孔板转移到24孔板，待细胞生长到一定数量，把细胞转入6孔板，使每孔5ml培养基含2 ×10⁵个细胞，测定细胞的抗体产量和产率。通常20-30个克隆被转到摇瓶做进一步评价。最后5-8个表达量最高的克隆进行亚克隆和进一步的表达检测。

收获料液，通过低速离心使细胞和培养基分离，把离心上清高速离心进一步澄清。用蛋白A亲和纯化和离子交换纯化，使用的介质分别是GE公司生产的Mab Select SuRe和Capto S。

实施例7

抗CD20抗体BAT4306及BAT4306F与3AA-MDC的偶联

将抗CD20抗体BAT4306及BAT4306F用溶液A(20mM磷酸钠， 100mM NaCl和2mMEDTA，pH为7.4)稀释至8.0mg/mL，然后用 TCEP(3.2摩尔当量)还原。在37℃孵育60分钟后，用溶液B(10mM 琥珀酸，2mM EDTA，pH为7.4)超滤浓缩换液。巯基抗体值通过测定吸光度确定，通过巯基与DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)， Aldrich公司)的反应物，然后测定412nm处的吸收值来确定巯基的浓度。

偶联反应时DMA的浓度为10％。3AA-MDC(3AA-MDC)按实例4、5方法制备。3AA-MDC与巯基数的比率为1.5:1.0(摩尔当量)。将3AA-MDC加入已还原的抗体中，室温搅拌3小时后，加入5mM半胱氨酸继续搅拌1小时。反应混合物经阳离子交换柱纯化，产品经超滤浓缩换液后用0.22微米的滤器过滤，-80℃保存。抗体可以通过紫外吸收测得浓度，通过尺寸排阻色谱测定聚集率，通过反向高效液相色谱法测定偶联药物比率。本发明所用的所有单克隆抗体和ADCs均为超过98％的单体蛋白。

实施例8

Batansine-4306F抗体偶联物的抗细胞增殖抑制活性

三种抗CD20抗体BAT4306F，Batansine-4306、Batansine-4306F 对肿瘤细胞的生长抑制特性是使用CD20阳性的Raji细胞来评价的。简言之，10,000/孔的Raji细胞接种于96孔板，每孔100μL培养基， 37℃过夜生长，然后加入100μL含有不同浓度的抗CD20抗体BAT4306F，Batansine-4306、Batansine-4306F的培养基。72小时后，用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试剂进行相对细胞增殖分析。如图3 所示，抗体偶联物Batansine-4306F比未偶联的抗CD20抗体更有效的抑制了Raji细胞的生长。

实施例9

Batansine-4306F抗体偶联物ADCC增强特性

Batansine-4306F抗体偶联物ADCC增强实验通过对CD20表达阳性的Raji杀伤效果来评价的。收集对数生长期的靶细胞Raji，800转离心5min弃上清。加入无酚红RPMI1640培养液同上离心洗两次，用含2％FBS的无酚红RPMI1640培养液调整细胞密度为3×105个/ml，混匀加入圆底96孔板2-11列中，每孔50μl。用含2％FBS的无酚红RPMI1640培养液预稀释抗体至6μg/ml，再以1：5倍往下稀释，每个浓度设2个复孔，共设立8个梯度。以50μl/孔加入到圆底的96孔板 3-10列中，96孔板11列中加入50μl稀释液，置于37℃、5％CO2培养箱孵育30min。收集PBMC细胞，800转离心5min弃上清。加入无酚红RPMI1640培养液同上离心洗两次，用含2％FBS的无酚红 RPMI1640培养液调整细胞密度为2.5×106个/ml，混匀加入上述96 孔板3-11列中，每孔100μl(PBMC:Raji为16.7:1，样品的终浓度为 1500、300、60、12、2.4、0.48、0.096、0.0192ng/ml)。并设立靶细胞最大裂解孔、靶细胞自发释放孔、效应细胞自发释放孔、培养基背景孔及培养基校正孔，各3个复孔(96孔板的设计见6.)，置于37℃、5％CO2培养箱孵育4h；靶细胞最大裂解孔及培养基校正孔在检测前 45min加入20μl检测试剂盒中的裂解液。细胞培养板孵育4h后将96 孔板离心，250g离心4min，各孔吸取50μl上清至另一块平底96孔板中，每孔加入50μl LDH检测试剂，室温避光孵育20分钟，每孔加入 50μl终止液。以OD490nm为检测波长，于酶标仪测量其吸收值。根据公式：细胞杀伤毒性＝[(实验孔-培养基背景)-(零浓度实验孔-培养基背景)]/[(靶细胞最大值-培养基校正)-(靶细胞自发-培养基背景)] ×100％，计算细胞杀伤毒性，并用SoftMax软件分析处理实验数据；用GraphPad Prism5软件画剂量曲线图，以抗体浓度为横坐标，对应的细胞杀伤毒性百分比为纵坐标，选用四参数方程回归模型，得到四参数拟合曲线及IC50值。由下表可知，尽管通过ADCC效应最大的杀伤效应三种抗体一致，但在相同条件下，与Batansine-4306相比， ADCC增强的Batansine-4306F在较低的浓度下就能杀伤CD20阳性靶细胞的能力增强，有较低的IC50值。

不同抗CD20单抗对靶细胞ADCC作用比较

实施例10

BAT4306F、Batansine-4306、Batansine-4306F对CD20阳性的 Raji肿瘤模型的抗肿瘤作用评价

Batansine-4306F的抗癌特性是通过对CD20表达阳性的人Raji 肿瘤细胞在裸鼠体内的生长抑制效果来评价的。简单描述如下：Raji 细胞(中国科学院上海细胞库)生长于含10％的胎牛血清和添有2mM谷氨酰胺的1640培养基。收集Raji细胞重悬于PBS,使100μl体积含有 5×10^7细胞，取8-9周龄的雌性裸鼠，在其右腋注射200μl上述细胞悬液。当肿瘤体积达到150-200 mm3时开始分组给药，每组8只。 BAT4306F、Batansine-4306、Batansine-4306F三种受试物按每公斤体重5mg，按QW*4(PG-D0,7,14and 21)总共给药4次。给药方式是静脉注射，注射体积为每次10μl/g。肿瘤体积每周测定两次。第一次给药49天后测定肿瘤体积大小，动物被立即以无痛至死。在同等剂量(5mg/kg)下，Batansine-4306和Batansine-4306F抑制肿瘤的效果要显著优于BAT4306F；此外，相比于体外Batansine-4306F的增殖抑制活性强于Batansine-4306，Batansine-4306体内抑瘤效果与Batansine-4306F相当(图4)。

实施例11

BAT4306F、Batansine-4306、Batansine-4306F体外清除外周血B 细胞能力

通过静脉穿刺进行血液无菌采集，将采集的血液置于含肝素钠抗凝剂的采血管内。轻轻混匀，用移液器精确分装到EP管中，每管180ul。用PBS稀释样品BAT4306F、Batansine-4306、Batansine-4306F及无关对照Herceptin，设计三个浓度：500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml，每个浓度设2个复孔。取20ul稀释好的抗体加入到分装好的血液中，轻轻混匀，避免粘到管壁，抗体终浓度为50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml，并做阴性对照加入20ul PBS。置于37℃、5％CO2培养箱中孵育4h，然后进行荧光标记。取绝对计数管BDTruCOUNT tubes平衡至室温，用移液器吸取20μlBD Tritest CD3 FITC/CD19 PE/CD45PerCP Reagent加到绝对计数管中的金属网上方，注意不要碰到管底的磁珠颗粒。混匀已孵育4h的血液，用反吸法精确吸取50μl抗凝全血到计数管金属网上方的管壁上。盖上计数管盖，轻轻进行混合，在室温(20℃～25℃)避光孵育30min。向计数管中添加450μl的1×FACS溶血素，盖上计数管盖，轻轻进行混合，在室温(20℃～25℃)避光孵育 15min，上Accuri C6流式细胞仪进行分析。先找到磁珠群，设门为 R1；接着找CD45+细胞群，设门为P1，在P1门中收集10000个CD45+ 细胞进行分析CD19+及CD3+细胞情况，在CD19+细胞群中设门P2，此群细胞为B细胞群。用以下方程式分析实验数据：

绝对B细胞计数/ul＝(P2区域内细胞数/R1区域内绝对计数微球数) ×(试验微球总数/实验体积)；绝对B cell depletion百分比＝(1-样品中Bcell绝对数/阴性Bcell绝对数)*100％。结果显示如图8， Batansine-4306F耗竭B细胞的能力优于BAT4306F、Batansine-4306。

SEQUENCE LISTING

<110> 百奥泰生物科技（广州）有限公司

<120> CD20阳性疾病治疗的化合物及方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BAT4306F（抗CD20抗体轻链可变区）

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 2

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BAT4306F（抗CD20抗体重链）

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BAT4406F (抗CD20抗体轻链)

<400> 3

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BAT4406F (抗CD20抗体重链)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

Claims

1.一种包含有效量的抗CD20抗体BAT4306F的药物组合物，其中抗体BAT4306F的氨基酸序列表达于适应悬浮生产的CHO-BAT-KF细胞系。

2.一种癌症治疗方法，其包括向有需要的患者施用有效量的抗CD20抗体BAT4306F，其中抗体BAT4306F的氨基酸序列表达于适应悬浮生长的CHO-BAT-KF细胞系。

3.权利要求2的方法，其中所述癌症选自CD20阳性癌症，包括但不限于滤泡性淋巴瘤，弥散性大B淋巴细胞瘤，慢性淋巴细胞白血病。

4.一种增强针对肿瘤的抗CD20抗体BAT4306F的活性的方法，其包括针对免疫抑制受体加入第二或第三抗体以产生更有效的治疗。

5.式Ia的化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物,

其中

X为氢或卤素；

Y选自氢、C₁-C₆烷基、C₃-C₆环烷基和-C(＝O)R⁵；

R¹选自H、-OH、-OC(＝O)R⁵和-OR⁵基团；

R²为H或C₁-C₆烷基；

R³为甲基、-CH₂OH或-CH₂OC(＝O)R⁶；

R⁴为-OH或–SH；

R⁵为C₁-C₆烷基或苄基；

R⁶为C₁-C₆烷基、苯基或苄基；

R⁷为氢、C_1-6烷基或氨基酸侧链；

R⁸为氢或者C_1-6烷基；

n为0、1、2、3、4、5、6、7或8；

p选自1、2、3、4、5、6、7、8、9以及10；

Anti-CD20为抗CD20抗体。

6.权利要求5中的化合物为式Ib的化合物

或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

7.权利要求5中的化合物为式Ic的化合物

或其药学上可接受的盐或溶剂合物,

其中“Anti-CD20”为抗CD20抗体。

8.权利要求7中的化合物，其中偶联的药物N₂’-去乙酰基-N₂’-(6－马来酰亚胺基－1-氧代己基)-美登素是通过共价方式与抗体结合。

9.权利要求5-8中任一项的化合物，其中抗CD20抗体为包含BAT4306F在内的抗体或CD20抗原结合单元。

10.一种药物组合物，其包含权利要求5-9中任一项的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

11.一种在有需要的患者中治疗增殖性、炎症性或免疫性疾病或病症的方法，包括给予权利要求10的药物组合物的有效量的权利要求5-9中任一项的化合物。

12.一种增强权利要求5-9的抗CD20抗体或权利要求10的药物组合物对肿瘤的活性的方法，其包括加入第二或第三抗体增强免疫监视活性以产生更有效的治疗。

13.式IVa的化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗增生、炎症或免疫疾病或病症的药物中的用途：

其中式IVa的化合物是通过给CD20阳性病人治疗剂量的权利要求5的化合物或其药学上可接受的盐在体内代谢产生；其中AA是氨基酸、巯基氨基酸或半胱氨酸。

14.式IVb的化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗增生、炎症或免疫疾病或病症的药物中的用途：

其中式IVb的化合物是通过给CD20阳性病人治疗剂量的权利要求6的化合物或其药学上可接受的盐在体内代谢生成；其中AA是氨基酸、巯基氨基酸或半胱氨酸。

15.式IVc的化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗增生、炎症或免疫疾病或病症的药物中的用途：

其中式IVc的化合物是通过给CD20阳性病人治疗剂量的权利要求7的化合物或其药学上可接受的盐在体内代谢生成；其中AA是氨基酸、巯基氨基酸或半胱氨酸。

16.权利要求12-14中任一用途，其中AA为：

其中代表与分子其余部分的连接点。